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Neuroscience

Durchflusszytometrische Analyse multipler mitochondrialer Parameter in humaninduzierten pluripotenten Stammzellen und deren neuronalen und glialen Derivaten

Published: November 8, 2021 doi: 10.3791/63116
Automatic Translation
*1,2, *1,2,3,4, 1,2, 1,2
1Department of Clinical Medicine (K1), University of Bergen, 2Neuro-SysMed, Center of Excellence for Clinical Research in Neurological Diseases, Haukeland University Hospital, 3Department of Neurosurgery, Qilu Hospital and Institute of Brain and Brain-Inspired Science, Cheeloo College of Medicine, Shandong University, 4Shandong Key Laboratory of Brain Function Remodeling
* These authors contributed equally

Summary

Diese Studie berichtet über einen neuartigen Ansatz zur Messung mehrerer mitochondrialer Funktionsparameter basierend auf Durchflusszytometrie und Doppelfärbung mit zwei fluoreszierenden Reportern oder Antikörpern, um Veränderungen des mitochondrialen Volumens, des mitochondrialen Membranpotentials, des reaktiven Sauerstoffgehalts, der mitochondrialen Atmungskettenzusammensetzung und der mitochondrialen DNA zu erkennen.

Abstract

Mitochondrien sind wichtig für die Pathophysiologie vieler neurodegenerativer Erkrankungen. Änderungen des mitochondrialen Volumens, des mitochondrialen Membranpotentials (MMP), der mitochondrialen Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) und der Kopienzahl der mitochondrialen DNA (mtDNA) sind häufig Merkmale dieser Prozesse. Dieser Bericht beschreibt einen neuartigen, auf Durchflusszytometrie basierenden Ansatz zur Messung mehrerer mitochondrialer Parameter in verschiedenen Zelltypen, einschließlich humaner induzierter pluripotenter Stammzellen (iPSCs) und iPSC-abgeleiteter Neural- und Gliazellen. Diese flussbasierte Strategie verwendet lebende Zellen zur Messung des mitochondrialen Volumens, des MMP- und ROS-Spiegels sowie fixierte Zellen zur Schätzung von Komponenten der mitochondrialen Atmungskette (MRC) und mtDNA-assoziierte Proteine wie den mitochondrialen Transkriptionsfaktor A (TFAM).

Durch Co-Färbung mit fluoreszierenden Reportern, einschließlich MitoTracker Green (MTG), Tetramethylrhodaminethylester (TMRE) und MitoSox Red, können Veränderungen des mitochondrialen Volumens, des MMP und der mitochondrialen ROS quantifiziert und mit dem mitochondrialen Inhalt in Beziehung gesetzt werden. Die Doppelfärbung mit Antikörpern gegen MRC-Komplex-Untereinheiten und Translokase der äußeren Mitochondrienmembran 20 (TOMM20) ermöglicht die Beurteilung der MRC-Untereinheitsexpression. Da die Menge an TFAM proportional zur mtDNA-Kopienzahl ist, ergibt die Messung von TFAM pro TOMM20 eine indirekte Messung der mtDNA pro mitochondrialem Volumen. Das gesamte Protokoll kann innerhalb von 2-3 h durchgeführt werden. Wichtig ist, dass diese Protokolle die Messung mitochondrialer Parameter sowohl auf der Gesamtebene als auch auf der spezifischen Ebene pro mitochondrialem Volumen mittels Durchflusszytometrie ermöglichen.

Introduction

Mitochondrien sind essentielle Organellen, die in fast allen eukaryotischen Zellen vorhanden sind. Mitochondrien sind für die Energieversorgung verantwortlich, indem sie Adenosintriphosphat (ATP) durch oxidative Phosphorylierung produzieren und als metabolische Vermittler für Biosynthese und Stoffwechsel fungieren. Mitochondrien sind tief an vielen anderen wichtigen zellulären Prozessen beteiligt, wie ROS-Generierung, Zelltod und intrazellulärer Ca2+-Regulation. Mitochondriale Dysfunktion wurde mit verschiedenen neurodegenerativen Erkrankungen in Verbindung gebracht, darunter Parkinson-Krankheit (PD), Alzheimer-Krankheit (AD), Huntington-Krankheit (HD), Friedreich-Ataxie (FRDA) und amyotrophe Lateralsklerose (ALS)1. Es wird auch angenommen, dass eine erhöhte mitochondriale Dysfunktion und mtDNA-Anomalie zum menschlichen Altern beitragen 2,3.

Verschiedene Arten von mitochondrialer Dysfunktion treten bei neurodegenerativen Erkrankungen auf, und Veränderungen des mitochondrialen Volumens, der MMP-Depolarisation, der Produktion von ROS und Veränderungen der mtDNA-Kopienzahl sind häufig 4,5,6,7. Daher ist die Fähigkeit, diese und andere mitochondriale Funktionen zu messen, von großer Bedeutung, um Krankheitsmechanismen zu untersuchen und potenzielle Therapeutika zu testen. Darüber hinaus ist angesichts des Mangels an Tiermodellen, die menschliche neurodegenerative Erkrankungen originalgetreu nachbilden, die Etablierung geeigneter In-vitro-Modellsysteme, die die menschliche Krankheit in Gehirnzellen rekapitulieren, ein wichtiger Schritt zu einem besseren Verständnis dieser Krankheiten und zur Entwicklung neuer Therapien 2,3,8,9.

Humane iPS-Zellen können verwendet werden, um verschiedene Gehirnzellen zu erzeugen, einschließlich neuronaler und nicht-neuronaler Zellen (dh Gliazellen), und mitochondriale Schäden im Zusammenhang mit neurodegenerativen Erkrankungen wurden in beiden Zelltypengefunden 3,10,11,12,13. Geeignete Methoden zur iPSC-Differenzierung in neuronale und gliale Linien stehen zur Verfügung14,15,16. Diese Zellen bieten eine einzigartige Mensch-Patienten-Plattform für die In-vitro-Krankheitsmodellierung und das Arzneimittelscreening. Da diese von Patienten stammen, liefern iPSC-abgeleitete Neuronen und Gliazellen Krankheitsmodelle, die genauer widerspiegeln, was beim Menschen passiert.

Bisher gibt es nur wenige komfortable und zuverlässige Methoden zur Messung mehrerer mitochondrialer Funktionsparameter in iPS-Zellen, insbesondere lebenden Neuronen und Gliazellen. Der Einsatz der Durchflusszytometrie bietet dem Wissenschaftler ein leistungsfähiges Werkzeug zur Messung biologischer Parameter, einschließlich der mitochondrialen Funktion, in einzelnen Zellen. Dieses Protokoll liefert Details für die Erzeugung verschiedener Arten von Gehirnzellen, einschließlich neuraler Stammzellen (NSCs), Neuronen und glialer Astrozyten aus iPSCs, sowie neuartige durchflusszytometrische Ansätze zur Messung mehrerer mitochondrialer Parameter in verschiedenen Zelltypen, einschließlich iPSCs und iPSC-abgeleiteten Neural- und Gliazellen. Das Protokoll bietet auch eine Co-Färbestrategie für die Verwendung der Durchflusszytometrie zur Messung des mitochondrialen Volumens, MMP, mitochondrialen ROS-Spiegels, MRC-Komplexe und TFAM. Durch die Einbeziehung von Messungen des mitochondrialen Volumens oder der mitochondrialen Masse ermöglichen diese Protokolle auch die Messung sowohl des Gesamtniveaus als auch des spezifischen Niveaus pro mitochondrialer Einheit.

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Protocol

HINWEIS: In der Materialtabelle und der Zusatztabelle S1 finden Sie Rezepturen aller in diesem Protokoll verwendeten Medien und Lösungen.

1. Differenzierung humaner iPS-Zellen in NCSs, dopaminerge (DA) Neuronen und Astrozyten

  1. Matrixbeschichtete Platten vorbereiten.
    1. Eine Durchstechflasche mit 5 ml Matrix über Nacht auf Eis auftauen. Verdünnen Sie 1 ml Matrix mit 99 ml kaltem Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 (Advanced DMEM/F12) (1% Endkonzentration). Stellen Sie 1 ml Aliquots her und lagern Sie sie bei -20 °C.
    2. Die Matrixlösung bei 4 °C auftauen (kalt halten) und 6 Vertiefungen (1 ml pro Vertiefung in einer 6-Well-Platte) beschichten.
    3. Legen Sie die matrixbeschichtete Platte für 1 h in einen befeuchteten 5% CO2/95% Luftinkubator bei 37 °C. Nehmen Sie die Platte aus dem Inkubator und lassen Sie sie auf Raumtemperatur (RT) ausgleichen.
      HINWEIS: Es wird empfohlen, die Platte innerhalb von 3 Tagen nach der Beschichtung zu verwenden. Die beschichtete Platte kann jedoch bis zu 2 Wochen bei 4 °C gelagert werden. Denken Sie nur daran, es herauszunehmen und vor dem Gebrauch auf RT aufwärmen zu lassen. Für eine Langzeitlagerung 1 ml iPSC-Kulturmedium auf die beschichtete Platte geben, um ein Austrocknen der Matrix zu vermeiden.
  2. Auftauen von iPSCs
    1. Die matrixbeschichteten Platten bei RT oder im Inkubator bei 37 °C für 20-30 min vorwärmen. Die erforderliche Menge an iPSC-Kulturmedium bei RT vorwärmen.
    2. Mischen Sie 6 ml vorgewärmtes iPSC-Kulturmedium mit 12 μL Y-27632 ROCK-Inhibitor, um eine Endkonzentration von 10 μM zu erhalten.
    3. Die gefrorene Durchstechflasche mit iPSCs bei 37 °C in einem Wasserbad teilweise auftauen, bis ein kleines Stück Eis übrig bleibt.
    4. Geben Sie langsam 1 ml vorgewärmtes iPSC-Kulturmedium mit 12 μL ROCK-Inhibitor tropfenweise in die Zellen. Den flüssigen Inhalt der Durchstechflasche mit iPSCs tropfenweise in eine Vertiefung einer 6-Well-vorbeschichteten Platte mit einer 5-ml-Pipette überführen.
    5. Bewegen Sie die Platte in senkrechten Richtungen, um den Brunneninhalt zu mischen und die Platte in den Inkubator zurückzubringen. Wechseln Sie das iPSC-Kulturmedium nach 24 h nach dem Waschen mit Dulbeccos phosphatgepufferter Kochsalzlösung (DPBS) (1x) (Ca 2+/Mg2+-frei) (4 ml pro Vertiefung in einer 6-Well-Platte).
      HINWEIS: Fügen Sie ROCK-Hemmer nicht zu nachfolgenden Fütterungen hinzu. Wechseln Sie das iPSC-Kulturmedium täglich.
  3. Subkulturierung von iPSCs
    1. Die matrixbeschichteten Platten bei RT oder im Inkubator bei 37 °C für 20-30 min vorwärmen. Die erforderliche Menge an iPSC-Kulturmedium bei RT vorwärmen.
    2. Das Kulturmedium von den Platten mit den Zellen absaugen. Spülen Sie die iPSCs mit DPBS (1x) (Ca 2+/Mg2+-frei) (4 ml pro Vertiefung in einer 6-Well-Platte).
    3. Fügen Sie EDTA (0,5 mM) (1 ml pro Vertiefung in einer 6-Well-Platte) hinzu. Inkubieren Sie die Platten bei 37 °C, bis sich die Ränder der Kolonien aus dem Brunnen heben (normalerweise 3-5 min). Saugen Sie die EDTA ab.
    4. Fügen Sie vorgewärmtes iPSC-Kulturmedium (4 ml pro Vertiefung in einer 6-Well-Platte) hinzu und lösen Sie die iPSC-Kolonien einmal mit einer sterilen 10-ml-Pipette gewaltsam. Pipettieren Sie nicht auf und ab, da dies Zellklumpen in einzelne Zellen zerlegen kann.
    5. Der Inhalt jeder Vertiefung wird in zwei einzelne Vertiefungen in einer matrixbeschichteten 6-Well-Platte (2 ml pro Vertiefung in einer 6-Well-Platte) überführt und bei 37 °C inkubiert. Erzeugen Sie beim Pipettieren keine Blasen in der Suspension.
      HINWEIS: Schütteln Sie die Platte vorsichtig, bevor Sie sie im Inkubator aufbewahren. Das Split-Verhältnis kann 1:2 (eine Bohrung in 2 neue Bohrungen) bis 1:4 (eine Bohrung in 4 neue Bohrungen) betragen.
    6. Ersetzen Sie das Medium täglich, bis die Kolonien 60% Konfluenz mit guter Größe und Verbindungen erreichen.
  4. Neuronale Induktion und neuronale Vorläufergenerierung
    1. Bereiten Sie 500 ml chemisch definiertes Medium (CDM), 500 ml neuronales Induktionsmedium (NIM) und 500 ml neural stem cell serumfreies (NSC SF) Medium vor.
    2. Spülen Sie die Zellen mit DPBS (1x) (Ca 2+/Mg2+-frei) (4 ml pro Vertiefung in einer 6-Well-Platte) und fügen Sie NIM (3 ml pro Vertiefung in einer 6-Well-Platte) hinzu. Als Tag 0 eingerichtet.
    3. Ersetzen Sie das NIM (3 ml pro Vertiefung in einer 6-Well-Platte) an Tag 1, Tag 3 und Tag 4 und beobachten Sie täglich unter der Mikroskopie.
    4. An Tag 5 lösen Sie die neuronalen Rosetten wie unten beschrieben in die Suspensionskultur.
      1. Einmal vorsichtig mit DPBS (1x) (Ca 2+/Mg2+-frei) (4 ml pro Vertiefung in einer 6-Well-Platte) waschen. Fügen Sie Kollagenase IV hinzu (1 ml pro Vertiefung in einer 6-Well-Platte) und bewahren Sie sie 1 Minute in einem Inkubator auf. Die Kollagenase IV absaugen und einmal mit DPBS (1x) (4 ml pro Vertiefung in einer 6-Well-Platte) vorsichtig waschen.
      2. Fügen Sie 2 ml NSC SF Medium pro Vertiefung zu einer 6-Well-Platte hinzu. Lösen Sie die Zellen, indem Sie die Böden der Vertiefungen abkratzen, indem Sie Gitter mit einer 200-μL-Pipettenspitze zeichnen.
      3. Sammeln Sie die Zellsuspension von der 6-Well-Platte in eine 10 cm nicht haftende Schale. Erhöhen Sie das Volumen mit NSC SF Medium auf 12 ml.
      4. Schütteln Sie die nicht haftende Schale bei 65-85 U/min auf einem Orbitalschüttler in einem Inkubator, um eine Aggregation zu verhindern.
  5. DA-Neuronendifferenzierung
    1. An Tag 7 fügen Sie 12 ml CDM hinzu, ergänzt mit 100 ng / ml Fibroblasten-Wachstumsfaktor-8b (FGF-8b) und legen Sie die Schale auf den Orbitalschüttler im Inkubator.
    2. An den Tagen 8-13 das Medium alle 2 Tage wechseln und täglich unter der Mikroskopie beobachten.
    3. An Tag 14 fügen Sie 12 ml CDM hinzu, ergänzt mit 100 ng/ml FGF-8b und 1 μM Purmorphamin (PM). Stellen Sie die Schale auf den Orbitalschüttler im Inkubator.
    4. An den Tagen 15-20 wechseln Sie das Medium alle 2 Tage und beobachten die Zellen täglich unter der Mikroskopie.
    5. Durchlässigen Sie die Kugeln mechanisch, indem Sie 1000 μL-Spitzen verwenden, um die größeren Kugeln aufzubrechen.
      HINWEIS: Das Verhältnis kann 1:2 betragen (ein Gericht in 2 neue Gerichte).
  6. Beendigung der Differenzierung
    1. Beschichten Sie eine 6-Well-Platte oder Deckgläser mit Poly-L-Ornithin (PLO) und Laminin wie unten beschrieben.
      1. Beschichten Sie eine 6-Well-Platte mit 1 ml PLO pro Vertiefung und inkubieren Sie die Platte bei 37 °C für 20 min. Saugen Sie die PLO-Lösung ab.
      2. Sterilisieren Sie die Platte unter UV für 20 min. Spülen Sie die Vertiefungen zweimal mit DPBS (1x) (4 ml pro Vertiefung in einer 6-Well-Platte).
      3. 5 μg/ml Lamininlösung (1 ml pro Vertiefung in einer 6-Well-Platte) in die Vertiefung geben und bei 37 °C für 2 h inkubieren. Das Laminin absaugen und die Vertiefungen vor dem Plattieren einmal kurz mit DPBS (1x) (4 ml pro Vertiefung in einer 6-Well-Platte) waschen.
    2. Alle Kugeln (ab Schritt 1.5.5) in 50-ml-Röhrchen sammeln und mit DPBS (1x) nachfüllen. Bei 300 × g 5 min schleudern. Asspirieren Sie den Überstand.
    3. Inkubieren Sie mit 2 ml Zelldissoziationsreagenz (siehe Materialtabelle) für 10 min bei 37 °C im Wasserbad, gefolgt von sanfter Verreibung mit einer 200 μL Pipette (20-50 mal je nach Größe der Kugeln, Vermeidung von Blasenbildung).
    4. Neutralisieren Sie das Zelldissoziationsreagenz mit 2 ml Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) mit 10% fetalem Rinderserum (FBS) und zentrifugieren Sie das 50 ml konische Röhrchen mit den Zellen bei 300 × g für 5 min bei RT.
    5. Fügen Sie 1 ml CDM hinzu, ergänzt mit 10 ng / ml Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) und 10 ng / mL Gliazelllinien-abgeleitetem neurotrophem Faktor (GDNF), um die Zellpellets durch sanftes Pipettieren auf und ab zu resuspendieren, um Einzelzellsuspensionen zu erhalten.
    6. Die Lamininlösung wird von der Platte abgesaugt (Schritt 1.6.1.3), kurz mit DPBS (1x) (4 ml pro Vertiefung in einer 6-Well-Platte) abgesaugt und die Zellen (ab Schritt 1.6.5) in die vorbeschichteten Platten oder Deckgläser in 3 ml CDM gesät, ergänzt mit 10 ng/ml BDNF und 10 ng/ml GDNF. Füttern Sie die Zellen alle 4 Tage.
      HINWEIS: Unterscheidungskulturen können für viele Wochen bis zu 3 Monate beibehalten werden. Die neuronale Morphologie tritt in der Regel nach 2 Wochen nach Beendigung auf und kann ab diesem Zeitpunkt für nachgeschaltete Analysen verwendet werden. BDNF und GDNF sind für die Kultivierung für längere Pflege (bis zu 2 Monate) nicht notwendig.
  7. NSC-Erzeugung
    1. Matrixplatten beschichten.
    2. Sammeln Sie alle neuronalen Kugeln (generiert aus Schritt 1.4) in 50-ml-Röhrchen und füllen Sie sie mit DPBS (1x) (Ca 2+/Mg2+-frei) auf. Bei 300 × g 5 min drehen. Saugen Sie die Überstände ab.
    3. Die Pellets mit 2 mL Zelldissoziationsreagenz für 10 min bei 37 °C im Wasserbad inkubieren, gefolgt von einer sanften Verreibung mit einer 200 μL Pipette (20-50 mal je nach Größe der Kugeln, Vermeidung von Blasenbildung).
    4. Neutralisieren Sie mit 2 ml DMEM mit 10% FBS und zentrifugieren Sie die 50 ml konischen Röhrchen mit den Zellen bei 300 × g für 5 min bei RT. Resuspendieren Sie die Zellpellets, indem Sie vorsichtig auf und ab pipettieren, um einzellige Suspensionen zu erhalten.
    5. Die Matrixlösung aus einer vorbeschichteten Platte absaugen und die Zellen in die vorbeschichteten Platten in NSC SF Medium einsäen (3 ml pro Vertiefung in einer 6-Well-Platte). Füttern Sie die Zellen alle 2-3 Tage und teilen Sie die Zellen, wenn sie zusammenfließen.
      HINWEIS: Ab diesem Zeitpunkt können NSCs erweitert und eingefroren werden.
  8. Differenzierung von Glia-Astrozyten
    1. Astrozyten-Differenzierung von NSCs
      1. Bereiten Sie 500 ml Astrozyten-Differenzierungsmedium vor.
      2. Saat-NSCs auf Poly-D-Lysin (PDL)-beschichteten Platten/Deckgläsern mit NSC SF Medium.
      3. Am nächsten Tag spülen Sie die Zellen mit DPBS (1x) (Ca 2+/Mg2+-frei) (4 ml pro Vertiefung in einer 6-Well-Platte) und fügen Astrocyte Differentiation Medium (3 ml pro Vertiefung in einer 6-Well-Platte) hinzu. Als Tag 0 eingerichtet.
      4. Beobachten Sie die NSCs täglich unter dem Mikroskop und ersetzen Sie das Astrozytendifferenzierungsmedium (3 ml pro Vertiefung in einer 6-Well-Platte) alle 2 Tage von Tag 1 bis 27.
    2. Astrozyten-Reifung
      1. Astrozyten-Reifungsmedium vorbereiten.
      2. Am Tag 28 spülen Sie die Zellen mit DPBS (1x) (4 ml pro Vertiefung in einer 6-Well-Platte) und fügen Sie Astrozyten-Reifungsmedium (3 ml pro Vertiefung in einer 6-Well-Platte) hinzu.
      3. Beobachten Sie am Tag 29 und danach die Zellen täglich unter dem Mikroskop und ersetzen Sie das Astrozyten-Reifungsmedium (3 ml pro Vertiefung in einer 6-Well-Platte) alle 2 Tage.
      4. Nach einem Monat Reifung expandieren Sie die Zellen und kryokonservieren sie ab diesem Stadium.
        HINWEIS: Während dieser Phase erhöht sich die Anzahl der Zellen. Bei der Spaltung der Zellen sind PDL-beschichtete Deckgläser für die Kultivierung nicht notwendig.

2. Zellcharakterisierung durch Immunzytochemie und Immunfluoreszenzfärbung

  1. Am Ende der Kulturperiode die Deckgläser mit den Zellen auf eine 12-Well-Platte übertragen.
    Spülen Sie die Zellen zweimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) (1x) und inkubieren Sie für 10 min in 4% Paraformaldehyd (PFA) (0,5 ml pro Vertiefung in einer 12-Well-Platte) bei RT.
    HINWEIS: Die fixierte Probe kann mit 2 ml PBS (1x) abgedeckt und bei 4 °C gelagert werden, bis sie für die Immunfärbung erforderlich ist. PFA ist giftig und steht im Verdacht, Krebs zu verursachen. Verhindern Sie Haut- und Augenexposition und arbeiten Sie unter einem chemischen Abzug.
  2. Blockieren und permeabilisieren Sie die Zellen und inkubieren Sie mit Blockierpuffer, der PBS (1x), 0,3% Triton X-100 und 10% normales Ziegenserum für 1 h bei RT enthält.
  3. Inkubation mit primären Antikörpern im Blockierungspuffer über Nacht bei 4 °C: Färbung von iPSCs mit Anti-Oktamer-bindendem Transkriptionsfaktor 4 (Oct4) und anti-stage-spezifischem embryonalem Antigen-4 (SSEA4), NSCs mit anti-geschlechtsbestimmender Region Y box-2 (Sox2) und Anti-Nestin, neuronale Sphären mit anti-paired box-6 (Pax6) und Anti-Nestin, Astrozyten mit anti-glialem fibrillärem saurem Protein (GFAP) und Anti-S100-Calcium-bindendem Protein β (S100β) und DA-Neuronen mit Anti-Tyrosinhydroxylase (TH), Anti-β-III-Tubulin (Tuj 1), Anti-Synaptophysin und Anti-PSD-95 (0,5 ml primäre Antikörperlösung pro Vertiefung in einer 12-Well-Platte; Einzelheiten siehe Materialtabelle ).
  4. Die Proben mit PBS (1x) dreimal für jeweils 10 min unter leichtem Schaukeln waschen.
  5. Inkubieren Sie mit sekundärer Antikörperlösung (1:800 im Blockierpuffer, 0,5 ml Alexa Fluor Sekundärantikörperlösung pro Vertiefung in einer 12-Well-Platte) für 1 h bei RT mit leichtem Schaukeln.
  6. Inkubieren Sie die Zellen mit Hoechst 33342 (1:5.000, 0,5 ml pro Vertiefung in einer 12-Well-Platte) in PBS (1x) für 15 min bei RT, um die Kerne zu markieren.
  7. Montieren Sie die Zellen mit Montagemedium und trocknen Sie über Nacht bei RT für die Bildgebung unter einem Fluoreszenzmikroskop im Dunkeln. Siehe Ergänzende Abbildung S1 für die Mikroskopeinstellungen und -parameter.

3. Durchflusszytometrische Messung des mitochondrialen Volumens, MMP und mitochondrialen ROS in lebenden Zellen

  1. Säen Sie die Zellen separat in 4 Vertiefungen in einer 6-Well-Platte, bis die Zellen 50% -60% Konfluenz erreichen. Beschriften Sie diese vier Brunnen als #1, #2, #3 und #4.
  2. Am Ende der Kulturperiode 5 einzelne Färbelösungen (500 μL pro Vertiefung in einer 6-Well-Platte) wie folgt vorbereiten: #1 nur Kulturmedium (bis Vertiefung #1 enthält nur Zellen zur Kontrolle); #2-1 mit FCCP (100 μM); #2-2 mit FCCP (100 μM) + TMRE (100 nM) + MTG (150 nM) im Kulturmedium; #3 mit TMRE (100 nM) + MTG (150 nM) im Kulturmedium; #4 mit MitoSox Red (10 μM) + MTG (150 nM) in PBS (1x) mit 10% FBS. Siehe Abbildung 1A, Zusatztabelle S2 und Materialtabelle für Details zu diesen Verbindungen und dem Aufbau der Durchflusszytometrie.
    HINWEIS: Verwenden Sie das Kulturmedium, um die Färbelösung vorzubereiten. Erwärmen Sie das Medium und PBS (1x) bei RT vor dem Gebrauch. FCCP ist giftig; Verhindern Sie Haut- und Augenexposition und arbeiten Sie unter einem chemischen Abzug.
  3. Saugen Sie das Medium aus der #2-Welle ab und fügen Sie #2-1-Lösung hinzu (nur FCCP). Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C für 10 min.
  4. Saugen Sie das Medium aus #2 und #3 Wells ab und fügen Sie #2-2 Lösung (FCCP + TMRE + MTG) in der #2 Welle und #3 Lösung (TMRE + MTG) in #3 hinzu. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C für 45 min.
  5. Saugen Sie das Medium aus der #4-Welle ab und fügen Sie die #4-Lösung hinzu (MitoSox Red + MTG). Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C für 15 min.
  6. Saugen Sie das Medium aus allen Bohrlöchern ab. Mit PBS (1x) waschen (4 ml pro Vertiefung in einer 6-Well-Platte). Lösen Sie die Zellen mit 1 ml Zelldissoziationsreagenz (1 ml pro Vertiefung in einer 6-Well-Platte) bei 37 °C für 5 min. Neutralisieren Sie das Zelldissoziationsreagenz in 1 ml DMEM mit 10% FBS (2 ml pro Vertiefung in einer 6-Well-Platte).
  7. Sammeln Sie den Inhalt aller Vertiefungen in konischen 15-ml-Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 300 × g für 5 min. Waschen Sie die Pellets ein- bis zweimal mit PBS (1x).
  8. Die Überstände absaugen, aber etwa 100 μL in den Röhrchen belassen. Resuspendieren Sie die Zellpellets in 300 μL PBS (1x). Übertragen Sie die Zellen in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Halten Sie die Röhren bei RT im Dunkeln.
  9. Analysieren Sie die Zellen mit einem Durchflusszytometer (mit einer 3 blauen und 1 roten Laserkonfiguration). Erkennen Sie MTG in Filter 1 (FL1) mit einem 530/30-Bandpassfilter, TMRE in Filter 2 (FL2) mit dem Bandpassfilter 585/40 und MitoSox Red in Filter 3 (FL3) mit einem 510/580-Bandpassfilter.

4. Durchflusszytometrische Messung von MRC-komplexen Untereinheiten und TFAM in festen Zellen

  1. Am Ende der Kulturperiode lösen Sie die Zellen (~ 106) durch Zugabe des Zelldissoziationsreagenzes; Dann pelletieren und sammeln Sie die Zellen in einem 15-ml-Röhrchen. Die Zellen werden zweimal mit PBS (1x) durch Zentrifugieren bei 300 × g für 5 min gewaschen.
  2. Fixieren Sie die Zellen in 1,6% PFA (1 ml 1,6% PFA in einem 15 ml Röhrchen) bei RT für 10 min. Die Zellen werden zweimal mit PBS (1x) durch Zentrifugieren bei 300 × g für 5 min gewaschen.
  3. Permeabilisieren Sie die Zellen mit eiskaltem 90% Methanol (1 mL 90% Methanol in einem 15 ml Röhrchen) bei -20 °C für 20 min.
  4. Blockieren Sie die Proben in einem Blockierpuffer, der 0,3 M Glycin, 5% Ziegenserum und 1% Rinderserumalbumin (BSA) - Fraktion V in PBS (1x) enthält (1 ml Blockierpuffer in einem 15-ml-Röhrchen). Die Zellen werden zweimal mit PBS (1x) zentrifugiert (wie in Schritt 3.7).
  5. Inkubieren Sie die Zellen mit den folgenden primären Antikörpern für 30 min: Anti-NDUFB10 (1:1.000) zur Messung der Komplex-I-Untereinheit, Anti-Succinat-Dehydrogenase-Komplex-Flavoprotein-Untereinheit A (SDHA, 1:1.000) zur Messung der Komplex-II-Untereinheit und Anti-COX IV (1:1.000) zur Messung der komplexen IV-Untereinheit und Anti-TFAM-Antikörper konjugiert mit Alexa Fluor 488 (1:400). Färben Sie die gleiche Anzahl von Zellen separat mit Anti-TOMM20-Antikörpern, die mit Alexa Fluor 488 (1:400) konjugiert sind, für 30 min (1 ml primäre Antikörperlösung in einem 15-ml-Röhrchen; Details zu den Antikörpern finden Sie in der Materialtabelle ).
  6. Die Zellen mit PBS (1x) einmal bei Zentrifugation bei 300 × g für 5 min waschen. Fügen Sie sekundäre Antikörper (1:400) in Röhrchen mit NDUFB10, SDHA und COX IV hinzu und inkubieren Sie die Zellen mit diesen Lösungen für 30 min.
  7. Waschen Sie die Zellen einmal mit PBS (1x) durch Zentrifugieren bei 300 × g für 5 min. Die Überstände werden abgesaugt, wobei etwa 100 μL in den Röhrchen verbleiben. Resuspendieren Sie die Zellpellets in 300 μL PBS (1x). Übertragen Sie die Zellen in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, die im Dunkeln auf Eis aufbewahrt werden.
  8. Analysieren Sie die Zellen auf dem Durchflusszytometer (mit einer 3 blauen und 1 roten Laserkonfiguration). Erkennen Sie Signale in Filter 1 (FL1) mit einem 530/30-Bandpassfilter. Siehe Ergänzende Abbildung S2 für die Einstellungen und Parameter des Mikroskops.

5. Erfassung und Analyse der Durchflusszytometrie

  1. Verwenden Sie das nicht gefärbte Steuerrohr, um die Vorwärtsstreuflächen- (FSC-A) und Seitenstreuflächendiagramme (SSC-A) basierend auf der Größe und Komplexität der analysierten Zellpopulation festzulegen. Siehe Ergänzende Abbildung S2 für die Einstellungen und Parameter des Mikroskops.
    HINWEIS: Richten Sie nicht gefärbte Kontrollen für einzelne Zelltypen ein.
  2. Verwenden Sie die Nicht-Fleckenkontrollröhrchen, um die positiven Gatter auszuwählen, und verwenden Sie einfarbige Steuerröhren, um die spektrale Überlappung der Fluoreszenz-Spektralüberlappung zwischen MTG (Fluorophor-1 [FL-1]) und TMRE (FL-2) in der Mehrfarben-Durchflusszytometrie zu kompensieren. Verwenden Sie die Isotypkontrolle für die Negativkontrolle, um die Hintergrundfärbung in MRC- und TFAM-Proben zu überwachen. Verwenden Sie die FCCP-Röhre als Depolarisationskontrolle für die TMRE-Färbung.
  3. Gate aus Fremdkörpern, um stromführende Zellen und die Hauptansteuerung aus dem Vorwärts- und Seitenstreudiagramm auszuwählen (Abbildung 2A). Gate out-Dubletten unter Verwendung eines Vorwärtsstreuhöhen- (FSC-H) versus (vs.) FSC-A-Dichtediagramms, um Dubletten auszuschließen und auch ein Seitenstreuhöhendiagramm (SSC-H) vs. SSC-A-Diagramm zu konstruieren (Abbildung 2A).
  4. Datenerfassung (Durchflusszytometer)
    1. Verwenden Sie die ungefärbten oder isotypischen Proben als Negativkontrolle, um ein Tor über der Hauptpopulation der Einzelzellereignisse zu erstellen, während Sie SSC-A und die verschiedenen Filter (FL1, FL2, FL3, FL4) betrachten (Abbildung 1B und Abbildung 2B).
  5. Datenanalyse (CFlow Software)
    1. Kopieren Sie die Position der Gatter auf die gefärbten Zellproben und notieren Sie die Menge der positiv gefärbten Zellen für die positive Färbung.
    2. Wählen Sie für jede Zellsubpopulation ein Histogrammdiagramm aus und analysieren Sie die mediane Fluoreszenzintensität (MFI) der verschiedenen Filterkanäle (FL1, FL2, FL3, FL4) (x-Achse).
      1. Berechnen Sie die TMRE-Werte, indem Sie den MFI von FL2 von #2 FCCP-behandelten Zellen vom MFI von FL2 von #3 TMRE-gefärbten Proben in einem Histogramm subtrahieren, wie in Eq (1) unten.
        TMRE-Werte = MFI von FL2 aus #3 TMRE-gefärbten Proben - MFI von FL2 von #2 FCCP-behandelten Zellen (1)
      2. Berechnen Sie die spezifischen Werte für MMP und mitochondriale ROS durch MFI in TMRE oder MitoSox Red, wobei der mitochondriale Volumenindikator MTG dividiert wird.
      3. Berechnen Sie den spezifischen Wert für komplexe Untereinheiten und TFAM, indem Sie MFI in komplexer Expression oder TFAM verwenden, wobei der mitochondriale Volumenindikator TOMM20 dividiert wird.

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Representative Results

Eine schematische Beschreibung der Differenzierungsmethode und der durchflusszytometrischen Strategien ist in Abbildung 3 dargestellt. Humane iPS-Zellen werden in neuronale Rosetten differenziert und dann zur Differenzierung in neuronale Sphären in die Suspensionskultur gehoben. Neuronale Sphären werden weiter differenziert und zu DA-Neuronen gereift. Neuronale Kugeln werden in einzelne Zellen dissoziiert, um gliale Astrozyten zu erzeugen, die in Monoschichten als NSCs umplattiert und dann in Astrozyten differenziert werden. Dieses Protokoll bietet die Strategien, die für die Erfassung und Analyse der Proben durch Durchflusszytometrie zur Messung von MMP, mitochondrialem Volumen, mitochondrialen ROS-Spiegeln, Expressionsniveaus von MRC-komplexen Untereinheiten und TFAM (eine indirekte Messung der relativen mtDNA-Kopienzahl) erforderlich sind. Insbesondere wurde die Co-Färbung mit fluoreszierenden Reportern, TMRE und MTG, verwendet, um Veränderungen des MMP und des mitochondrialen Volumens zu erkennen und zu quantifizieren. Die Co-Färbung mit MitoSox Red und MTG ermöglicht die Messung der mitochondrialen ROS-Produktion in lebenden Zellen. Die Färbung mit Antikörpern gegen MRC-Komplex-Untereinheiten zusammen mit TOMM20 ermöglicht die Beurteilung der MRC und die Färbung von TFAM und TOMM20 zur indirekten Beurteilung der mtDNA-Kopienzahl. Wichtig ist, dass MTG und TOMM20 die Messung pro mitochondrialem Volumen ermöglichen und dem Einfluss des mitochondrialen Volumens auf diese Parameter entgegenwirken.

DA-Neuronen werden aus iPSCs durch duale SMAD-Hemmung erzeugt und FGF-8b und dem Sonic-Hedgehog (SHH)-Agonisten PM ausgesetzt, wie in Abbildung 4A gezeigt. Humane iPS-Zellen werden in iPSC-Kulturmedium auf matrixbeschichteten Platten ausgesät. Wenn die Zellen eine Konfluenz von 50% -80% erreichen, wird das Medium mit einem CDM, das mit SB431542, AMPK-Inhibitor, Verbindung C und N-Acetylcystein für 5 Tage ergänzt wird, in NIM umgewandelt. Nach 5 Tagen entwickeln sich die iPSCs (Abbildung 4B, a) zu einem neuronalen Epithelstadium mit klaren neuronalen Rosettenstrukturen (Abbildung 4B, b). An Tag 5 werden neuronale Kugeln erzeugt, indem das Neuralepithel in die Suspensionskultur gehoben und in NSC SF-Medium auf einem Orbitalshaker im Inkubator kultiviert wird. Runde, wohldefinierte Kugeln sind in Abbildung 4B, c dargestellt. Am Tag 7 wird das Medium in CDM umgewandelt, ergänzt mit 100 ng/ml FGF-8b. Am Tag 14 wird das Medium in das CDM umgewandelt, ergänzt mit 100 ng/mL FGF-8b und 1 μM PM. Am Tag 21 werden die Kugeln in einer Monoschicht in DA-Neuronen dissoziiert, indem sie in einzelne Zellen dissoziiert und in CDM kultiviert werden, ergänzt mit 10 ng / ml BDNF und 10 ng / ml GDNF in PLO und Laminin-beschichteten Platten / Deckgläsern. Neuronen (Abbildung 4B, e), die für 15-30 Tage gereift sind, werden weiterhin für mitochondriale Funktionsmessungen verwendet.

NSCs werden hergestellt, indem neuronale Kugeln in einzelne Zellen dissoziiert und dann in Monoschichten umplattiert werden, um Astrozyten zu erzeugen. Diese NSCs zeigen ein klassisches neuronales Vorläuferbild (Abbildung 4B, d). NSCs können in dieser Phase leicht erweitert und für die weitere Verwendung bereitgestellt werden. Um die Astrozytendifferenzierung einzuleiten, werden NSCs auf PDL-beschichtete Deckgläser in NSC SF-Medium plattiert. Am nächsten Tag wird das Medium für 28 Tage in ein Astrozytendifferenzierungsmedium umgewandelt. Nach 28 Tagen sind die differenzierten Astrozyten im Astrozytenreifungsmedium weiter gereift. In diesem Stadium sollten Astrozyten eine sternförmige Morphologie aufweisen (Abbildung 4B, f), und diese Zellen können erweitert und für die weitere Verwendung, einschließlich der Beurteilung der mitochondrialen Funktionalität, eingelagert werden.

Während der Differenzierung wird die Zellidentität durch Immunfluoreszenzfärbung bestätigt. In Abbildung 5A zeigt die Immunfärbung, dass die iPS-Zellen die spezifischen pluripotenten Marker SSEA4 und Oct4 exprimieren. Abbildung 5B zeigt, dass neuronale Sphären eine positive Färbung von Nestin und Pax6 aufweisen, während Abbildung 5C zeigt, dass iPSC-abgeleitete NSCs in Monoschichten eine positive Färbung von Nestin und Sox2 aufweisen. Um DA-Neuronen zu identifizieren, werden Zellen mit dem neuronalen Marker β III Tubulin (Tuj 1) und dem DA-neuronalen Marker Tyrosinhydroxylase (TH) angefärbt (Abbildung 6B). Darüber hinaus zeigen DA-Neuronen eine Färbung für die synaptischen Marker Synaptophysin und PSD-95, was ihre funktionellen synaptischen Verbindungen bestätigt (Abbildung 5B). Die Immunfärbung von iPSC-abgeleiteten Astrozyten zeigt die Expression der Astrozytenmarker, des sauren Gliafibrillenproteins (GFAP) und des S100-Calcium-bindenden Proteins β (S100β).

Die Untersuchung der mitochondrialen Funktion in differenzierten Neuronen und Astrozyten mittels Durchflusszytometrie wird wie oben in den Protokollabschnitten 3 und 4 beschrieben durchgeführt. Ein Durchflusszytometer wurde für die Datenerfassung und CFlow Sampler für die Datenanalyse verwendet, wie in Abbildung 1B gezeigt.

Abbildung 2 zeigt die Methode zum Gating lebender Einzelzellen. Tote Zellen und Zelltrümmer werden mithilfe eines FSC- vs. SSC-Diagramms ausgeschlossen (Abbildung 2A, a). Zelldubletten werden mit einem FSC-H vs. FSC-A-Diagramm (Abbildung 2A, b) ausgeschlossen, gefolgt von einem SSC-H vs. SSC-A-Diagramm (Abbildung 2A, c). Die Hintergrundfluoreszenz wird richtig beurteilt, wenn die negative Population eines bestimmten Zelltyps mit der positiven Population innerhalb desselben Zelltyps verglichen wird (Abbildung 2B, a). Bei MMP-Proben eliminiert die Behandlung der Zellen mit FCCP Störungen durch das mitochondriale Membranpotential und die TMRE-Färbung (Abbildung 2B, b).

Diese durchflusszytometrischen Ansätze wurden verwendet, um DA-Neuronen zu untersuchen, die aus den menschlichen iPS-Zellen erzeugt wurden, die Mutationen in der katalytischen Untereinheit der mitochondrialen DNA-Polymerase, POLG (W748S), tragen, und sie mit krankheitsfreien Proben zu vergleichen, die aus Detroit 551-Fibroblasten erzeugt wurden. Wie bereits berichtet4, zeigte diese Studie auch eine verminderte MMP und erhöhte spezifische mitochondriale ROS-Spiegel in POLG DA-Neuronen (Abbildung 7). Das mitochondriale Volumen, das Gesamt-MMP und das gesamte mitochondriale ROS-Niveau blieben jedoch unverändert. In Abbildung 8 zeigen die Ergebnisse eine Abnahme der spezifischen Komplex-I-Spiegel, niedrigere Gesamt- und spezifische TFAM-Spiegel, aber ähnliche spezifische Komplex-II-Spiegel in mutierten DA-Neuronen im Vergleich zu Kontrollen.

Dieser Ansatz wurde auch verwendet, um Astrozyten zu untersuchen, die aus den gleichen iPSC-Linien erzeugt wurden. Wie bereits berichtet7 und in Abbildung 9 gezeigt, zeigen die Ergebnisse, dass POLG-mutierte Astrozyten im Vergleich zu Kontrollen ein geringeres Gesamt- und spezifisches MMP, aber ein ähnliches mitochondriales Volumen und mitochondriales ROS sowie verringerte Spiegel spezifischer Komplexe I und IV aufwiesen (Abbildung 10). Es gab jedoch keine Veränderungen in den Gesamtspiegeln der Komplexe I und IV und keine Veränderung in den Gesamt- und spezifischen Konzentrationen von Komplex II in POLG-Astrozyten. Insgesamt deuten diese Daten darauf hin, dass die durchflusszytometrische Analyse mehrerer mitochondrialer Parameter eine erste Näherung darstellt, die für die Bewertung der mitochondrialen Funktion in Zellen wie iPSCs und ihren neuronalen und glialen Derivaten wertvoll ist.

Figure 1
Abbildung 1: Aufbau der Durchflusszytometrie. (A) MMP, mitochondriales Volumen und mitochondriale ROS-Färbung; (B) ein Beispiel für die Datenerfassung in einem C6-Durchflusszytometer. Abkürzungen: MMP = mitochondriales Membranpotential; ROS = reaktive Sauerstoffspezies; FCCP = Carbonylcyanid p-trifluormethoxyphenylhydrazon; TMRE = Tetramethylrhodaminethylester; MTG = MitoTracker Grün. Siehe auch Zusatztabelle S2. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: Gating-Strategien. (A) Datenerfassung; (B) die Histogramme der Fluoreszenz mit MTG- und TMRE-Färbung in lebenden Zellen. Abkürzungen: SSC-A = Seitenstreufläche; FSC-A = Vorwärtsstreufläche; SSC-H = Seitenstreuhöhe; FSC-H = Vorwärtsstreuhöhe; FL#-A = Fluorophor # Fläche; MTG = MitoTracker Grün; FCCP = Carbonylcyanid p-trifluormethoxyphenylhydrazon; TMRE = Tetramethylrhodaminethylester. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 3
Abbildung 3: Schematische Darstellung des Protokoll-Workflows. Abkürzungen: DA = dopaminerg; MMP = mitochondriales Membranpotential; ROS = reaktive Sauerstoffspezies; NDUFB 10 = NADH: Ubichinonoxidoreduktase-Untereinheit 10; SDHA = Succinat-Dehydrogenase-Komplex-Flavoprotein-Untereinheit A; COX IV = Cytochrom-c-Oxidase-Komplex IV; mtDNA = mitochondriale DNA; TFAM = mitochondrialer Transkriptionsfaktor A. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 4
Abbildung 4: iPSC-Differenzierung. (A) Flussdiagramm und (B) repräsentative Bilder für die Zellen aus verschiedenen Stadien während der Differenzierung, einschließlich iPSCs (a), neurale Rosette (b), neuronale Sphären (c), NSCs (d), DA-Neuronen (e) und Astrozyten (f). Maßstabsbalken = 25 μm. Abkürzungen: iPSC = induced pluripotent stem cell; NSC = neurale Stammzelle; DA = dopaminerg; SFM = serumfreies Medium; CDM = chemisch definiertes Medium; FGF-8b = Fibroblasten-Wachstumsfaktor-8b; PM = Purmorphamin; BDNF = brain-derived neurotrophic factor; GDNF = glial cell line-derived neurotrophic factor; PLO = Poly-L-Ornithin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 5
Abbildung 5: Repräsentative konfokale Bilder von iPSCs und ihren neuronalen Derivaten. (A) Immunfärbung von SSEA4 (rot) und Oct4 (grün) in iPSCs. (B) Immunfärbung von Nestin (rot) und Pax6 (grün) in iPSC-abgeleiteten Neuronenkugeln. (C) Immunfärbung von Nestin (rot) und Sox2 (grün) in iPSC-abgeleiteten NSCs. Kerne werden mit DAPI (blau) gefärbt. Maßstabsbalken = 50 μm. Abkürzungen: iPSCs = induced pluripotent stem cells; NSCs = neurale Stammzellen; SSEA4 = stadiumsspezifisches embryonales Antigen-4; Oct4 = Oktamer-bindender Transkriptionsfaktor 4; Pax6 = gepaarte Box-6; Sox2 = geschlechtsbestimmende Region Y Box-2; DAPI = 4',6-Diamidino-2-phenylindol. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 6
Abbildung 6: Repräsentative konfokale Bilder der iPSC-abgeleiteten Astrozyten und DA-Neuronen. (A) Immunfärbung von GFAP (rot) und S100β (grün) in iPSC-abgeleiteten Astrozyten. (B) Immunfärbung des neuronalen Abstammungsmarkers TH (grün), Tuj 1 (rot) und des neuronalen Funktionsmarkers Synaptophysin (grün) und PSD-95 (rot) in iPSC-abgeleiteten DA-Neuronen. Kerne werden mit DAPI (blau) angefärbt. Maßstabsbalken = 25 μm. Abkürzungen: iPSCs = induced pluripotent stem cells; GFAP = saures Gliafibrillenprotein; S100β = S100 Calcium-bindendes Protein β; Tuj 1 = β III Tubulin; PSD-95 = postsynaptisches Dichteprotein 95; DA = dopaminerg; DAPI = 4',6-Diamidino-2-phenylindol. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 7
Abbildung 7: Durchflusszytometrische Analyse für DA-Neuronen, die von einem Klon von iPS-Zellen von POLG-Patienten und einem Klon von Detroit 551-Kontroll-iPSCs abgeleitet wurden. (A) Mitochondriales Volumen, gemessen durch MTG, (B) Gesamt-MMP gemessen durch TMRE, (C) spezifisches MMP-Niveau berechnet durch Gesamt-TMRE/MTG, (D) Gesamtmitochondriale ROS, gemessen mit MitoSox Red, und (E ) spezifisches mitochondriales ROS-Niveau, berechnet durch GesamtmitoSox Red/MTG. Daten als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (REM) für die Anzahl der Proben (n ≥ 3 pro Klon). Daten, die mit der GraphPad Prism-Software analysiert und erzeugt werden. Der Mann-Whitney-U-Test wurde verwendet, um die statistische Signifikanz für Variablen zu bewerten. Signifikanz wird für P < 0,05 angegeben. *P < 0,05; ns, nicht signifikant. Abkürzungen: DA = dopaminerg; POLG = DNA-Polymerase-Untereinheit gamma; iPSCs = induzierte pluripotente Stammzellen; MMP = mitochondriales Membranpotential; ROS = reaktive Sauerstoffspezies; MTG = MitoTracker Grün; TMRE = Tetramethylrhodaminethylester. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 8
Abbildung 8: Durchflusszytometrische Analyse für Astrozyten, die von einem Klon von iPS-Zellen für POLG-Patienten und einem Klon von Detroit 551-Kontroll-iPS-Zellen stammen. (A) Mitochondriales Volumen, gemessen durch MTG, (B) Gesamt-MMP, gemessen durch TMRE, (C) spezifisches MMP-Niveau, berechnet durch Gesamt-TMRE/MTG, (D) Gesamt-Rmitochondriales ROS S, gemessen mit MitoSox Red, und (E ) spezifisches mitochondriales ROS-Niveau, berechnet durch GesamtmitoSox Red/MTG. Daten als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (REM) für die Anzahl der Proben (n ≥ 3 pro Klon). Daten, die mit der GraphPad Prism-Software analysiert und erzeugt werden. Der Mann-Whitney-U-Test wurde verwendet, um die statistische Signifikanz für Variablen zu bewerten. Signifikanz wird für P < 0,05 angegeben. *P < 0,05; ns, nicht signifikant. Abkürzungen: POLG = DNA-Polymerase-Untereinheit gamma; iPSC = induzierte pluripotente Stammzelle; MMP = mitochondriales Membranpotential; ROS = reaktive Sauerstoffspezies; MTG = MitoTracker Grün; TMRE = Tetramethylrhodaminethylester. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 9
Abbildung 9: Durchflusszytometrische Analyse für DA-Neuronen, die von einem Klon von iPS-Zellen für POLG-Patienten und einem Klon von Detroit 551-Kontroll-iPS-Zellen stammen. (A) Gesamtkomplex I gemessen mit NDUFB10, (B) spezifischer Komplex-I-Pegel, berechnet durch Gesamt-NDUFB10/TOMM20, (C) Gesamtkomplex II, gemessen durch SDHA, (D) spezifischer Komplex-II-Pegel, berechnet durch Gesamt-SDHA/TOMM20, (E) Gesamt-TFAM, gemessen mit TFAM, und (F) spezifischer TFAM-Spiegel, berechnet durch Gesamt-TFAM/TOMM20. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (REM) für die Anzahl der Proben (n ≥ 3 pro Klon) dargestellt. Daten, die mit der GraphPad Prism-Software analysiert und erzeugt werden. Mann-Whitney-U-Test zur Bewertung der statistischen Signifikanz für Variablen. Signifikanz wird für P < 0,05 angegeben. *P < 0,05; ns, nicht signifikant. Abkürzungen: DA = dopaminerg; POLG = DNA-Polymerase-Untereinheit gamma; iPSC = induzierte pluripotente Stammzelle; NDUFB10 = NADH: Ubichinonoxidoreduktase-Untereinheit 10; TOMM20 = Translokase der äußeren Mitochondrienmembran 20; SDHA = Succinat-Dehydrogenase-Komplex-Flavoprotein-Untereinheit A; TFAM = mitochondrialer Transkriptionsfaktor A. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 10
Abbildung 10: Durchflusszytometrische Analyse für Astrozyten, die von einem Klon von POLG-Patienten-iPS-Zellen und einem Klon von Detroit 551-Kontroll-iPS-Zellen abgeleitet wurden. (A) Gesamtkomplex I gemessen mit NDUFB10, (B) spezifischer Komplex-I-Spiegel, berechnet als Gesamt-NDUFB10/TOMM20, (C) Gesamtkomplex II, gemessen mit SDHA, (D) spezifischer Komplex-II-Spiegel, berechnet durch SDHA/TOMM20, (E) Gesamtkomplex IV, gemessen mit COX IV, (F) spezifischer komplexer IV-Gehalt, berechnet nach COX IV/TOMM20, (G) Gesamt-TFAM, gemessen mit TFAM, und (H) spezifischer TFAM-Gehalt, berechnet durch Gesamt-TFAM/TOMM20. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (REM) für die Anzahl der Proben (n ≥ 3 pro Klon) dargestellt. Daten, die mit der GraphPad Prism-Software analysiert und erzeugt werden. Der Mann-Whitney-U-Test wurde verwendet, um die statistische Signifikanz für Variablen zu bewerten. Signifikanz wird für P < 0,05 angegeben. *P < 0,05; ** P < 0,01; ns, nicht signifikant. Abkürzungen: POLG = DNA-Polymerase-Untereinheit gamma; iPSC = induzierte pluripotente Stammzelle; NDUFB10 = NADH: Ubichinonoxidoreduktase-Untereinheit 10; TOMM20 = Translokase der äußeren Mitochondrienmembran 20; SDHA = Succinat-Dehydrogenase-Komplex-Flavoprotein-Untereinheit A; TFAM = mitochondrialer Transkriptionsfaktor A; COX IV = Cytochrom-c-Oxidase-Komplex IV. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Ergänzende Abbildung S1: Einstellungen des konfokalen Laser-Scanning-Fluoreszenzmikroskops und Schritte zur Aufnahme. (A) Wählen Sie das Konfigurationswerkzeug und wählen Sie den richtigen Lasertyp aus Aktuell verfügbarer Laser und stellen Sie seine Leistung ein. (B) Wählen Sie Capturere-Acquisition Mode-SEQ und wählen Sie den entsprechenden Fluoreszenzwellenlängen-Fotomodus aus der Datenbank aus. (C) Wählen Sie Sequential Scan-Load und importieren Sie den entsprechenden Modus. (D) Wählen Sie das 40-fache Objektiv und fügen Sie es tropfenweise hinzu. (E) Spezifische Einstellparameter für die Aufnahme von Fotos bei verschiedenen Wellenlängen. (F) Legen Sie Fotoparameter fest, zeigen Sie eine Vorschau an und speichern Sie das Foto. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung S2: Schritte und Einstellungen für die Durchflusszytometrie. (A) Öffnen Sie die Cflow-Software, wählen Sie das Dateiwerkzeug und wählen Sie CFlow-Datei oder -Vorlage öffnen. (B) Richten Sie 40000 Ereignisse ein und wählen Sie das Tor aus, das nur die aktiven Einzelzellen im Bereich "Run Limits" enthält. Wählen Sie im Bedienfeld "Fluidik" die Option "Mittlere Geschwindigkeit". (C) Wählen Sie FSC-A vs. FSC-A plot (a) für die Einrichtung des Haupt-Gatings. Wählen Sie FSC-A vs. FSC-H plot (b) und SSC-A vs. SSC-H plot (c), um Dubletten auszuschließen. Wählen Sie die entsprechenden Filter aus, z. B. FL1 oder FL2, und verwenden Sie FL1-A vs. FSC-A-Diagramm (d) oder FL2-A vs. FSC-A-Diagramm, um die positiven Ereignisse beim Ausführen der nicht gefärbten Zellen zu zeichnen. (D) Stellen Sie die gleichen Parameter ein, zeigen Sie eine Vorschau an, führen Sie die gefärbten Proben aus und speichern Sie das Foto. Siehe auch Zusatztabelle S2. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Zusatztabelle S1: Medien- und Lösungsrezepte. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Zusatztabelle S2: Einrichtung für die durchflusszytometrische Färbung. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

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Discussion

Hierin befinden sich Protokolle zur Erzeugung von iPSC-abgeleiteten Neuronen und Astrozyten und zur Bewertung mehrerer Aspekte der mitochondrialen Funktion mittels Durchflusszytometrie. Diese Protokolle ermöglichen eine effiziente Umwandlung menschlicher iPS-Zellen in Neuronen und Glia-Astrozyten und die detaillierte Charakterisierung der mitochondrialen Funktion, hauptsächlich in lebenden Zellen. Die Protokolle bieten auch eine auf der Durchflusszytometrie basierende Strategie zur Erfassung und Analyse mehrerer mitochondrialer Funktionen, einschließlich Volumen-, MMP- und mitochondrialer ROS-Spiegel in lebenden Zellen und MRC-Komplexen sowie TFAM in fixierten Zellen. Insbesondere erlauben diese Protokolle die Schätzung sowohl der Gesamt- als auch der spezifischen Werte pro mitochondrialem Volumen. Während diese Strategie mitochondriale Dysfunktion bei einer bekannten mitochondrialen Erkrankung (POLG) in DA-Neuronen und Astrozyten erkennt, sind diese Techniken auf jede Art von Zelle und Krankheit anwendbar. Darüber hinaus ist das Protokoll robust und reproduzierbar. Mehrere frühere Studien haben dieses Protokoll erfolgreich angewendet, um die mitochondrialen Veränderungen in Fibroblasten, iPSCs, NSCs, DA-Neuronen und Astrozyten 2,3,13,17 zu analysieren.

Es gibt einige kritische Punkte, die bei der Ausführung dieses Protokolls zu beachten sind. Um eine konsistente und hocheffiziente Differenzierung zu gewährleisten, ist es entscheidend, die Umwandlung mit hochwertigen iPSCs (Zellen mit <5% differenzierten Zellen) einzuleiten. Obwohl andere kommerziell erhältliche definierte Medien gültige Alternativen sein können, ging diese Studie nicht auf die Alternativen ein. Da die Zusammensetzung des Mediums und klonale Unterschiede der iPSC-Linien sowohl die Proliferation der Ausgangszellpopulation als auch die Differenzierungseffizienz beeinflussen können, erfordert die Anpassung dieses Protokolls an andere Erhaltungsmedien wahrscheinlich eine Optimierung.

Die Beziehung zwischen MTG- und MMP-Fluoreszenz wurde bereits untersucht3. Dies ist wichtig, da die MTG-Fluoreszenz sowohl unabhängig von18 als auch empfindlich gegenüber MMP 19,20 ist. In früheren Studien, in denen iPS-Zellen mit unterschiedlichen TMRE-Konzentrationen titriert und mit 150 nM MTG co-gefärbt wurden, blieb der MTG-Spiegel bei niedrigeren TMRE-Konzentrationen (5-100 nM) gleich, während bei höheren TMRE-Konzentrationen (über 100 nM) ein vermindertes MTG-Signal beobachtet wurde. Daher wurden 100 nM TMRE und 150 nM MTG gewählt, um den spezifischen MMP zu messen. Da diese Beziehung zellspezifisch sein kann, muss die Korrelation zwischen MTG- und MMP-Fluoreszenz bewertet werden, bevor MTG- und TMRE-Doppelfärbung zur Messung von MMP verwendet wird.

Die Zelldichte kann auch die mitochondriale Funktion und den Zellstoffwechsel beeinflussen. In dieser Studie wurden zelldichteabhängige Veränderungen der MMP beobachtet, was auch in anderen Studien gezeigt wurde21. Daher ist es wichtig, eine ähnliche Zelldichte in allen Proben zu wählen - nicht zu hoch oder zu niedrig -, um die Variation bei der Erstellung des Co-Färbeprotokolls für verschiedene Zelltypen zu minimieren. Im Vergleich zu anderen mikroskopiebasierten Assays hat die Durchflusszytometrie die Vorteile der Geschwindigkeit und Reproduzierbarkeit bei der Analyse einer großen Anzahl von Zellen. Bei der Analyse mikroskopischer Bilder wird die Verzerrung der Forscher die Ergebnisse bis zu einem gewissen Grad verzerren, was bei der Durchflusszytometrie kein Problem darstellt. Darüber hinaus benötigt die Durchflusszytometrie-Analyse weniger als eine Million Zellen, und die Analyse einer Probe dauert nur wenige Minuten, was bedeutet, dass Dutzende von Proben in 1-2 h analysiert werden können. Diese Technik kann auch auf eine Vielzahl von Zelltypen angewendet werden, einschließlich solcher anderer neurodegenerativer Erkrankungen, und sollte daher nützlich sein, um Mechanismen zu verstehen und potenzielle Therapeutika bei verschiedenen neurodegenerativen Erkrankungen zu testen.

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Disclosures

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Acknowledgments

Wir danken dem Molecular Imaging Centre und der Flow Cytometry Core Facility an der Universität Bergen in Norwegen. Diese Arbeit wurde durch Mittel des Norwegian Research Council (Förderkennzeichen: 229652), Rakel og Otto Kr.Bruuns legat und des China Scholarship Council (Projektnummer: 201906220275) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
anti-Oct4 Abcam ab19857, RRID:AB_445175 Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody.
anti-SSEA4 Abcam ab16287, RRID:AB_778073 Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 594 goat anti-mouse IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11005) as secondary antibody.
anti-Sox2 Abcam ab97959, RRID:AB_2341193 Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody.
anti-Pax6 Abcam ab5790, RRID:AB_305110 Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody.
anti-Nestin Santa Cruz Biotechnology sc-23927, RRID:AB_627994 Primary Antibody; use as 1:50, 20 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 594 goat anti-mouse IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11005) as secondary antibody.
anti-GFAP Abcam ab4674, RRID:AB_304558 Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution;  use Alexa Fluor ® 594 goat anti-chicken IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11042) as secondary antibody.
anti-S100β  conjugated with Alexa Fluor 488 Abcam ab196442, RRID:AB_2722596 Primary Antibody; use as 1:400, 2.5 μL in 1000 μL staining solution;
anti-TH Abcam ab75875, RRID:AB_1310786 Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody.
anti-Tuj 1 Abcam ab78078, RRID:AB_2256751 Primary Antibody; use as 1:1000, 1 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 594 goat anti-mouse IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11005) as secondary antibody.
anti-Synaptophysin Abcam ab32127, RRID:AB_2286949 Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody.
anti-PSD-95 Abcam ab2723, RRID:AB_303248 Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution;  use Alexa Fluor ® 594 goat anti-chicken IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11042) as secondary antibody.
anti-TFAM conjugated with Alexa Fluor 488 Abcam ab198308 Primary Antibody; use as 1:400, 2.5 μL in 1000 μL staining solution; use mouse monoclonal IgG2b  Alexa Fluor® 488 as an isotype control.
anti-TOMM20 conjugated with Alexa Fluor 488 Santa Cruz Biotechnology Cat# sc-17764 RRID:AB_628381 Primary Antibody; use as 1:400, 2.5 μL in 1000 μL staining solution; use mouse monoclonal IgG2a  Alexa Fluor® 488 as an isotype control.
anti-NDUFB10 Abcam ab196019 Primary Antibody; use as 1:1000, 1 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody; use rabbit monoclonal IgG as an isotype control.
anti-SDHA Abcam ab137040 Primary Antibody; use as 1:1000, 1 μL in 1000 μL staining solution;  use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody; use rabbit monoclonal IgG as an isotype control.
anti-COX IV Abcam ab14744, RRID:AB_301443 Primary Antibody; use as 1:1000, 1 μL in 1000 μL staining solution; use  Alexa Fluor ® 488 goat anti-mouse IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11001) as secondary antibody; use mouse monoclonal IgG as an isotype control.
Activin A PeproTech 120-14E Astrocyte differentiation medium ingredient
ABM Basal Medium Lonza CC-3187 Basal medium for astrocyte culture
AGM SingleQuots Supplement Pack Lonza CC-4123 Supplement for astrocyte culture
Antibiotic-Antimycotic Thermo Fisher Scientific 15240062 CDM ingredient
Advanced DMEM/F-12 Thermo Fisher Scientific 12634010 Basal medium for dilute Geltrex
Bovine Serum Albumin Europa Bioproducts EQBAH62-1000 Blocking agent to prevent non-specific binding of antibodies in immunostaining assays and CDM ingredient
BDNF PeproTech 450-02 DA neurons medium ingredient
B-27 Supplement Thermo Fisher Scientific 17504044 Astrocyte differentiation medium ingredient
BD Accuri C6 Plus Flow Cytometer BD Biosciences, USA
Chemically Defined Lipid Concentrate Thermo Fisher Scientific 11905031 CDM ingredient
Collagenase IV Thermo Fisher Scientific 17104019 Reagent for gentle dissociation of human iPSCs
CCD Microscope Camera Leica DFC3000 G Leica Microsystems, Germany
Corning non-treated culture dishes Sigma-Aldrich CLS430589 Suspension culture
DPBS Thermo Fisher Scientific 14190250 Used for a variety of cell culture wash
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement Thermo Fisher Scientific 10565018 Astrocyte differentiation basal Medium
EDTA Thermo Fisher Scientific 15575020 Reagent for gentle dissociation of human iPSCs
Essential 8 Basal Medium Thermo Fisher Scientific A1516901 Basal medium for iPSC culture
Essential 8 Supplement (50X) Thermo Fisher Scientific A1517101 Supplement for iPSC culture
EGF Recombinant Human Protein Thermo Fisher Scientific PHG0314 Supplement for NSC culture
FGF-basic (AA 10–155) Recombinant Human Protein Thermo Fisher Scientific PHG0024 Supplement for NSC culture
Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich 12103C Medium ingredient
FGF-basic PeproTech 100-18B Astrocyte differentiation medium ingredient
FCCP Abcam ab120081 Eliminates mitochondrial membrane potential and TMRE staining
Fluid aspiration system BVC control Vacuubrand, Germany
Formaldehyde (PFA) 16% Thermo Fisher Scientific 28908 Cell fixation
Geltrex Thermo Fisher Scientific A1413302 Used for attachment and maintenance of human iPSCs
GlutaMAX Supplement Thermo Fisher Scientific 35050061 Supplement for NSC culture
GDNF Peprotech 450-10 DA neurons medium ingredient
Glycine Sigma-Aldrich G8898 Used for blocking buffer
Ham's F-12 Nutrient Mix Thermo Fisher Scientific 31765027 Basal medium for CDM
Heregulin beta-1 human Sigma-Aldrich SRP3055 Astrocyte differentiation medium ingredient
Hoechst 33342 Thermo Fisher Scientific H1399 Stain the nuclei for confocal image
Heracell 150i CO2 Incubators Fisher Scientific, USA
IMDM Thermo Fisher Scientific 21980032 Basal medium for CDM
Insulin Roche 1376497 CDM ingredient
InSolution AMPK Inhibitor Sigma-Aldrich 171261 Neural induction medium ingredient
Insulin-like Growth Factor-I human Sigma-Aldrich I3769 Astrocyte differentiation medium ingredient
KnockOut DMEM/F-12 medium Thermo Fisher Scientific 12660012 Basal medium for NSC culture
Laminin Sigma-Aldrich L2020 Promotes attachment and growth of neural cells in vitro
Leica TCS SP8 STED confocal microscope Leica Microsystems, Germany
Monothioglycerol Sigma-Aldrich M6145 CDM ingredient
MitoTracker Green FM Thermo Fisher Scientific M7514 Used for mitochondrial volume indicator
MitoSox Red Thermo Fisher Scientific M36008 Used for mitochondrial ROS indicator
N-Acetyl-L-cysteine Sigma-Aldrich A7250 Neural induction medium ingredient
N-2 Supplement Thermo Fisher Scientific 17502048 Astrocyte differentiation medium ingredient
Normal goat serum Thermo Fisher Scientific PCN5000 Used for blocking buffer
Orbital shakers - SSM1 Stuart Equipment, UK
Poly-L-ornithine solution Sigma-Aldrich P4957 Promotes attachment and growth of neural cells in vitro
Poly-D-lysine hydrobromide Sigma-Aldrich P7405 Promotes attachment and growth of neural cells in vitro
Purmorphamine STEMCELL Technologies 72204 Promotes DA neuron differentiation
ProLong Gold Antifade Mountant Thermo Fisher Scientific P36930 Mounting the coverslip for confocal image
PBS 1x Thermo Fisher Scientific 18912014 Used for a variety of wash
Recombinant Human/Mouse FGF-8b Protein R&D Systems 423-F8-025/CF Promotes DA neuron differentiation
SB 431542 Tocris Bioscience TB1614-GMP Neural Induction Medium ingredient
StemPro Neural Supplement Thermo Fisher Scientific A10508-01 Supplement for NSCs culture
TrypLE Express Enzyme Thermo Fisher Scientific 12604013 Cell dissociation reagent
Transferrin Roche 652202 CDM ingredient
TRITON X-100 VWR International 9002-93-1 Used for cells permeabilization in immunostaining assays
TMRE Abcam ab113852 Used for mitochondrial membrane potential staining
Water Bath Jb Academy Basic Jba5 JBA5 Grant Instruments Grant Instruments, USA

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References

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Neurowissenschaften Ausgabe 177
Durchflusszytometrische Analyse multipler mitochondrialer Parameter in humaninduzierten pluripotenten Stammzellen und deren neuronalen und glialen Derivaten
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Liang, K. X., Chen, A., Kristiansen, … More

Liang, K. X., Chen, A., Kristiansen, C. K., Bindoff, L. A. Flow Cytometric Analysis of Multiple Mitochondrial Parameters in Human Induced Pluripotent Stem Cells and Their Neural and Glial Derivatives. J. Vis. Exp. (177), e63116, doi:10.3791/63116 (2021).

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