Summary
우리는 인간 췌장암 세포의 초음파 유도 주사와 초음파 영상에 의한 생체 내 종양 성장의 후속 모니터링에 의해 최소 침습 동종 췌장암 모델을 생성하는 프로토콜을 제시합니다.
Abstract
췌장암(PCa)은 전 세계적으로 가장 치명적인 암 유형 중 하나입니다. PCa 악성 종양의 원인은 주로 내재적 인 악성 행동과 치료 치료에 대한 높은 내성에 의존합니다. 실제로 많은 노력에도 불구하고 표준 화학 요법과 혁신적인 표적 요법은 전임상 평가에서 임상 환경으로 옮겨 졌을 때 실질적으로 실패했습니다. 이 시나리오에서, 새로 개발된 약물을 시험하기 위해서는 PCa의 생체 내 특성을 더 잘 모방한 전임상 마우스 모델의 개발이 절실히 필요하다. 본 프로토콜은 인간 췌장 종양 세포의 초음파 유도 주사에 의해 수득된 동소성 이종이식으로 대표되는 PCa의 마우스 모델을 생성하는 방법을 기술한다. 이러한 신뢰할 수 있고 최소 침습적 프로토콜을 사용하여 초음파(미국) 영상으로 모니터링할 수 있는 종양 덩어리의 생체 내 생착 및 발달에 대한 증거도 제공합니다. 여기에 설명 된 PCa 모델의 주목할만한 측면은 시간이 지남에 따라 종양 덩어리의 느린 발달이며, 이는 약리학 적 치료의 시작점을 정확하게 식별하고 치료 적 개입의 효과를보다 잘 모니터링 할 수 있습니다. 또한 여기에 설명 된 기술은 고통과 고통을 최소화하고 연구에서 동물의 복지를 직접적으로 향상시키기 때문에 3R 원칙을 구현 한 예입니다.
Introduction
PCa와 가장 흔한 형태인 췌장 유관 아데노암종(PDAC)은 1,2단계에관계없이 1년 생존율이 20% 미만이고 5년 생존율이 8%인 암 관련 사망의 가장 흔한 원인 중 하나입니다. 이 질병은 거의 항상 치명적이며, 발병률이 감소하는 다른 암 유형과 달리 발병률은 향후 몇 년 동안 지속적으로 증가 할 것으로 예상됩니다3. 늦은 암 발견, 빠른 진행 경향 및 특정 요법의 부족과 같은 요인은 PCa4의 나쁜 예후를 초래합니다. 보다 정확한 전임상 마우스 모델의 개발 덕분에 암 연구에서 큰 발전을 이루었습니다. 이 모델은 암의 기저에 있는 분자 메커니즘의 이해와새로운 치료법 개발에 적절한 통찰력을 제공했습니다5. 이러한 발전은 최근의 큰 노력에도 불구하고 현재의 화학 요법1에 내성을 유지하는 PCa에 제대로 적용되지 않습니다. 이러한 이유로 환자의 전망을 개선하기 위한 새로운 접근 방식의 개발이 필수적입니다.
수년에 걸쳐 오늘날 가장 널리 사용되는 모델 인 이종 이식편을 포함하여 많은 PCa 마우스 모델이 개발되었습니다5. 이종 이식 모델은 이식 된 종양 세포의 위치에 따라 피하 이종 및 동교로 분류됩니다. 피하 이종 이종 이식편은 달성하기가 더 쉽고 저렴하지만 PCa의 특정 특징 (즉, 섬유 성 조직의 축적, 저산소증, 산도 및 혈관 신생을 특징으로하는 특이한 종양 미세 환경)을 놓치고 있습니다 6,7. 이것은 피하 이종 이식편이 종종 치료 적 치료를위한 강력한 데이터를 제공하지 못하여 임상 환경으로 번역 될 때 실패로 이어지는 이유를 설명합니다8. 반면에, 동종 이종 이식편은 종양 미세 환경과 더 유사하여 질병의 자연적 발달을 더 잘 모방합니다. 또한, 동종 이종 이식편은 전이 과정 및 피하 모델에서 거의 발생하지 않는 PCa의 침습적 특징을 연구하는 데 더 적합합니다9. 전반적으로, 동종 이종이식 마우스 모델은 오늘날 전임상 약물 시험 9,10을 수행하는 것이 바람직하다. 동종 이종 이식편은 일반적으로 세포 또는 매우 작은 종양 조직 조각을 췌장에 이식하기 위해 수술 절차에 의존합니다. 실제로, PCa의 수술 모델에 기초한 여러 논문이 지난 수십 년 동안 발표되었다11. 그러나 동종 종양 모델을 수립하기위한 수술 절차의 품질과 결과는 작업자의 기술적 기술에 크게 좌우됩니다. 번역 임상 접근법을위한 성공적인 동종 포토픽 PCa 이종 이식을위한 또 다른 핵심 포인트는 예측 가능한 성장 동역학으로 국소 질환을 확립 할 수있는 가능성입니다.
이러한 문제를 해결하기 위해 여기에서는 면역 결핍 마우스의 췌장 꼬리에 인간 PCa 세포를 초음파(미국) 유도 주사하여 동종 PCa 이종 이식편을 생산하는 혁신적인 절차를 설명합니다. 이 절차에서는 신뢰할 수 있는 PCa 마우스 모델을 생성합니다. 종양 성장은 미국 영상 에 의해 생체 내에서 이어집니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
현재 프로토콜은 승인 번호 843/2020-PR로 이탈리아 보건부의 승인을 받았습니다. 무균 상태를 보장하기 위해, 동물들은 플로렌스 대학의 연구 동물 사육장(Ce.S.A.L.)의 장벽실 내에서 유지되었다. 모든 절차는 마우스가 플로렌스 대학 (이탈리아)의 LIGeMA 시설에 수용된 동일한 공간에서 수행되었다.
1. 세포 준비
- 2% L-글루타민과 10% 소 태아 혈청(FBS)이 보충된 Dulbecco의 변형 독수리 배지(DMEM)가 포함된 100mm 페트리 접시에서 PCa 세포주의 PCa 세포를 배양합니다.
- 세포를 5%CO2로 37°C에서 노르옥시아에서 인큐베이션한다.
- 트립신으로 세포를 분리하십시오. 계수하고, 접종 1시간 전에 20 μL의 PBS 중 1 x 106 세포를 재현탁시켰다.
2. 초음파 유도 주사 (US-GI)를위한 마우스 준비
참고: 다음 단계는 멸균 조건에서 수행되었습니다. 마취 시작부터 마우스 플랫폼에서 마우스를 제거 할 때까지 미국 유도 주사의 전체 절차는 완전한 마우스 회복을 위해 약 10-12 분에 5 분이 걸립니다.
- 개입 직전에 카르프로펜(NSAID)을 최종 용량 5mg/kg으로 피하(sc) 투여하거나 트라마돌을 27G 바늘이 있는 투베르쿨린 주사기를 사용하여 최종 용량 5mg/kg으로 투여합니다.
참고: 본 프로토콜을 위해, 20마리의 무흉선 누드-Foxn1nu 암컷 마우스를 사용하였다. 마우스는 8 주령이었고 무게는 20-22g이었습니다. - 이미저를 켜고 변환기 패널의 응용 프로그램 메뉴에서 마우스(소형) 복부 를 선택합니다. B-모드(밝기 모드) 이미징 창이 나타나고 시스템이 B-모드 데이터를 수집할 준비가 되었는지 확인합니다.
주: B 모드는 시스템의 기본 이미징 모드입니다. 시스템은 에코 신호 진폭을 기반으로 밝기 수준을 할당하여 2차원(2D) 보기로 에코를 표시합니다. B-모드는 해부학적 구조를 찾는 데 가장 효과적인 모드입니다.- 스터디 브라우저로 이동합니다.
- 새 스터디를 선택하고 스터디 이름과 정보(예: 스터디 날짜 등)를 입력합니다.
- 시리즈 이름에 필요한 모든 정보(예: 동물 균주, ID, 생년월일 등)를 입력합니다.
- 완료를 누릅니다. 이 프로그램은 B 모드 이미징을 위한 준비가 되었습니다.
- 2 L/min의 O2 가스 유동을 갖는 4% 이소플루란을 사용하여 마취 유도 챔버에서 마우스를 마취시킨다.
알림: 적절한 마취에는 약 4분이면 충분합니다(분당 약 50-60회 호흡). - 마우스가 마취되면 마취기의 연결을 변경하여 이소플루란이 마우스 취급 테이블 쪽으로 향하도록 합니다.
- 마취된 마우스를 오른쪽 옆구리에 놓고 코뿔에 주둥이를 대고 취급 테이블(37°C에서 가열)에 올려 마우스가 0.8L/min의 O2 가스 흐름을 갖는 2% 이소플루란을 사용하여 마취되도록 합니다(그림 1A).
- 마취 중 건조를 방지하기 위해 마우스의 눈에 인공 눈물 한 방울을 바르십시오.
- 오른손, 오른발, 꼬리를 접착 거즈로 동물 플랫폼의 전극 패드에 단단히 테이프로 붙입니다.
참고: 마우스의 호흡수와 심전도(ECG)는 전극 패드를 통해 기록됩니다.
3. US-GI 방법에 의한 췌장에 PANC1 세포 주입
- 70 % 에탄올로 마우스 피부를 살균하고 접착 거즈를 사용하여 왼쪽 옆구리의 피부를 펴십시오.
알림: 피부를 늘린 상태로 유지하는 것은 바늘 삽입에 대한 저항을 줄이고 바늘 변형을 방지하는 데 중요합니다. - 20mL 주사기 (바늘없이)를 사용하여 마우스의 복부와 왼쪽 옆구리에 초음파 젤을 바르십시오.
- US 변환기의 높이 조절 손잡이를 사용하여 변환기를 내려 마우스의 왼쪽 측면을 터치하고 동물의 몸에 가로로 놓습니다.
- 변환기를 움직여 B-Mode 이미징을 사용하여 변환기 디스플레이의 췌장을 시각화합니다(그림 1B).
- 30mm 28G 바늘을 사용하여 20μL의 PBS에 현탁된 1 x 106 개의 PANC1 세포를 포함하는 50μL Hamilton 주사기를 준비하고 적절한 홀더에 주사기를 놓습니다(그림 1C).
알림: 사용하기 전에 주사기 바늘을 70 % 에탄올로 5-10 분 동안 소독하십시오. - 홀더 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 바늘 경사가 위를 향하고 초음파 변환기와 동일한 평면에 있는 상태에서 주사기를 마우스 피부로 내리고 변환기와 45° 각도를 형성합니다(그림 1D).
참고: 이 단계부터 디스플레이에서 미국 이미지를 모니터링하여 진행합니다. - 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 피부에 구멍을 뚫고 주사기 바늘을 췌장에 삽입하고 디스플레이에서 미국 이미지를 관찰하여 궤적을 따릅니다(그림 1E).
알림: 주사하기 전에 췌장의 꼬리를 비장 뒤에 있고 왼쪽 신장에 가까운 기준으로 삼으십시오. - 바늘이 췌장에 삽입되면 주사기 플런저에 일정한 압력을 가하여 세포가 포함된 20μL 볼루스를 췌장에 직접 주입합니다(그림 1F).
알림: 올바른 주사 절차는 췌장에 작은 거품이 있고 바늘 끝에서 거의 보이지 않는 저 에코 생성 유체의 흐름에 의해 확인됩니다. - 전체 볼 루스를 주입 한 후 바늘을 5-10 초 동안 그대로 둔 다음 천천히 수축시킵니다.
- US 변환기를 제거하고 측면에서 젤을 청소한 다음 마우스를 새 케이지에 넣습니다. 동물이 흉골 누운 자세를 유지하기에 충분한 의식을 회복 할 때까지 관찰하십시오.
4.3D 마우스의 췌장 종양 모니터링을 위한 미국 영상
참고: 종양 발달 평가는 미국 유도 주사에 사용된 것과 동일한 도구를 사용하여 세포 주입 후 8일부터 수행되었습니다( 재료 표에 나열됨). 따라서 시스템 점화 (단계 2.2.), 마취 (단계 2.3-2.6) 및 동물 플랫폼상의 마우스 배치 (단계 2.7)와 같은 일부 절차는 프로토콜에서 위에서 설명한 것과 완전히 일치합니다.
- 미국 이미징을 시작하기 전에 그림 2A와 같이 워크스테이션을 설정합니다.
- 변환기를 3D 모터 시스템에 고정합니다(그림 2A).
- 이미저를 켜고 스터디 브라우저에서 새 스터디를 선택합니다.
- 마우스를 마취 유도 챔버 (4 % 이소 플루 란)에 놓습니다.
- 마취된 마우스를 마취 튜브에 주둥이로 37°C에서 가열된 취급 테이블에 오른쪽 옆구리에 놓고 이소플루란을 2%로 줄입니다(그림 2B).
참고: 동일한 해부학적 참조를 유지하기 위해 마우스를 미국 유도 주사와 동일한 위치에 배치하는 것이 중요합니다. - 마우스의 눈에 수의사 연고 한 방울을 바르십시오.
- 마우스의 복부와 왼쪽 옆구리에 초음파 젤 층을 바르십시오.
- 55MHz 변환기를 가로 방향으로 배치하여 췌장이 대략 중앙에 오도록 왼쪽 측면 피부를 터치합니다(그림 2C).
- 3D 모터를 사용하여 횡 방향으로 전체 췌장의 이미지를 획득하고 획득 당 90-100 프레임을 수집하는 것이 이상적입니다 (프레임 수는 개인 선택에 따라 다를 수 있음).
- 이미저 터치패드에서 3D 모터 위치를 선택합니다.
- 양쪽 사지에서 전체 췌장의 이미지를 획득하기 위해 커서를 움직여 스캔 거리를 나타냅니다.
- 프레임 스캔을 선택하고 3D 획득을 시작합니다.
- 3D 이미징이 완료되면 변환기를 제거하고 피부에서 젤을 닦은 다음 마우스를 새 케이지에 넣어 복구합니다. 동물이 흉골 누운 자세를 유지하기에 충분한 의식을 회복 할 때까지 관찰하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
상기 기재된 프로토콜에 따라, 마우스를 먼저 이소플루란 챔버에서 마취시키고, 동물 플랫폼 상에 놓았다(도 1A). 췌장은 초음파 영상으로 시각화되었습니다 (그림 1B). 50μL 해밀턴 주사기에 20μL의 PBS에 현탁된 1 x 106 PANC1 세포를 로딩하고 바늘 홀더에 놓았습니다(그림 1C). 주사기와 미국 변환기 사이의 최적 각도는 45°였습니다(그림 1D). 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 주사기 바늘을 췌장에 삽입하고 그 궤적을 미국 이미저 디스플레이에서 관찰했습니다(그림 1E). 그런 다음 종양 세포의 20μL 볼루스를 췌장에 주입하고(그림 1F) 10초 후에 바늘을 수축시켰습니다. 접종 중 일정한 압력 적용, 세포 주입 후 일시 중지, 경사각이 30°인 얇은 바늘 사용과 같이 세포의 반동 및 복강으로의 후속 누출을 방지하기 위한 관련 조치를 추구했습니다. 미국 유도 주사 후, 마우스의 체중을 매일 모니터링하여 절차로 인한 스트레스 징후를 평가했습니다. 주사된 마우스의 무게에는 유의한 변화가 관찰되지 않았다.
이어서, 3D US 이미징을 적용하여 종양 세포 생착 및 종양 발달을 모니터링하였다. 첫 번째 이미지 획득은 세포 주입 후 8일째에 수행되었으며, 이어서 매주 획득(총 6회 획득)이 수행되었습니다. 이미징 동안, 동물을 온난화 된 (37 ° C) 플랫폼의 오른쪽 측면에 놓고 이소 플루 란 가스 흡입 (4 %에서 유도 용량 및 2 %에서 유지 용량)에 의해 마취시켰다 (그림 2). 3D 획득은 변환기가 축에 수직인 다양한 섹션에서 복부를 스캔할 수 있도록 하는 3D 모터를 사용하여 B 모드에서 수행되었습니다. 일련의 2D 이미지를 얻은 다음 분석 소프트웨어로 조립하여 장기의 3D 해부학 적 이미지를 재구성했습니다 (3D 재 렌더링). 3D 이미징을 수행하려면 마우스 호흡 단계를 3D 스캔 획득과 동기화해야 했습니다. 프로토콜의 재현성은 20 마리 중 16 마리 (80 %)에서 8 일째부터 췌장 꼬리의 저 에코 형성 구조 (어두운 색으로 표시됨) 인 종양 덩어리의 존재에 의해 확인되었습니다 (그림 3A). 4 마리의 마우스 (동물의 20 %)에서, 주사 2 주 후에 종양 덩어리의 발생이 관찰되었다. 이 잠복기는 췌장에 바늘을 삽입하는 차선의 절차로 거슬러 올라갈 수 있으며, 이로 인해 세포가 복막으로 누출되었습니다.
도 3B는 미국 유도 주사 마우스 모델의 미국 영상화에 의해 평가된 평균 종양 부피 (n=16)를 도시한 것이다. 마지막 미국 획득 다음날, 마우스를 먼저CO2 흡입에 의해 안락사시킨 다음 자궁 경부 탈구에 의해 안락사시켰다. 복강을 검사하고 종양 덩어리를 조직 학적 분석을 위해 이식했습니다 (그림 3C-E).
그림 1: 동종 PCa 마우스 모델 구축을 위한 미국 안내 방법 . (A) 마우스를 37 ° C에서 가열 된 특수 지지대의 오른쪽 측면에 놓습니다. (B) 미국 변환기는 비장 수준에서 동물의 몸에 가로로 위치하며 췌장은 B- 모드에서 시각화됩니다. 마우스 복부의 측면도는 비장 (2)과 왼쪽 신장 (3) 사이의 췌장 (1)을 보여줍니다. 스케일 바: 2 mm. (C) 해밀턴 주사기를 적절한 홀더에 놓습니다. (D)이 상황에서 변환기 (2)와 주사기 (1)는 45 ° 각도를 형성하도록 배치됩니다. (E) 주사기 (1)의 바늘은 비장 바로 아래의 췌장 꼬리에 삽입됩니다. 스케일 바: 2 mm. (F) 28 G 바늘이 있는 해밀턴 주사기를 사용하여 20 μL의 PBS에 1 x 106 PANC1 세포를 포함하는 볼루스를 췌장 꼬리에 주입합니다. 스케일 바: 2 mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 마우스의 췌장 종양을 모니터링하는 데 사용되는 이미징 워크스테이션 . (A) 미국 이미징을 위한 작업장. (1) 55 MHz 변환기; (2) 마우스 처리 테이블; (3) 3D 모터; (4) 미국 변환기의 높이 제어 손잡이. (B) 마우스를 마취관 (1)에 주둥이로 취급 테이블의 오른쪽 측면에 놓고 피부를 펴고 오른쪽 옆구리에 미젤을 바릅니다. (c) 트랜스듀서는 마우스 피부에 닿도록 낮추고 동물 몸에 가로로 위치시킨다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 마우스 췌장에서 동소성 PCa 이종이식 발달. (A) 에코 유도 세포 주입 후 발달된 종양 덩어리의 2D US 이미지 획득. 종양의 발달은 세포 주입 8 일 후 미국 영상으로 모니터링 한 다음 44 일까지 일주일에 한 번 획득하여 총 6 건의 획득을 수행합니다. 종양은 췌장 실질에서 저 에코 생성 구조로 나타납니다. 저 에코 생성 구조는 주변 실질 또는 인접한 구조에 비해 강도가 감소 된 메아리가있는 영역으로 초음파 학적으로 표현됩니다. 스케일 바: 2 mm. (B) PANC1 세포로부터 유래된 동소성 PDAC의 종양 부피의 시간 경과. (c) 세포 주입 후 43일째에 종양 덩어리의 미영상 획득. 스케일 바: 2 mm.3D 종양 덩어리의 재렌더링이 삽입된 곳에 도시되어 있다. (D) 영상화 후, 동물을 안락사시키고, 부검 검사를 수행한다. (1) 종양 질량; (2) 건강한 췌장의 작은 부분; (3) 비장; (4) 위; (5) 간. 스케일 바: 5 mm. (E) 4x 배율에서 종양 덩어리의 헤마톡실린 및 에오신 염색. 스케일 바: 200 μm. 패널의 오른쪽 상단에는 췌장 acinar 세포가 여전히 보이는 종양 덩어리가 삽입되어 있습니다. 40배 확대. 스케일 바: 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
미국 영상화의 사용이 클리닉에서 널리 퍼져 있지만, 많은 전임상 마우스 모델에서의 종양 발달은 일반적으로 생체발광 영상화11을 사용하여 기술된다. 후자는 종양 생착 및 확장을 평가하는 간접적인 방법이며 신뢰할 수 있는 종양 성장 동역학을 제공하지 않습니다. 본 연구에서는 세포 주입을 수행하고 종양 발달을 모니터링하기 위해 US 이미징을 적용했습니다. 우리가 설명한 프로토콜과 우리가 제공 한 결과는 PCa 연구에서 관련 돌파구를 나타냅니다.
췌장 종양 세포의 주입을 위해 여기에 기술된 미국 유도 방법은 최소 침습적이며, 일반적으로 동종 PCa 마우스 모델을 확립하기 위해 적용되는 수술 절차로 인한 많은 단점을 극복할 수 있게 한다. 수술 절차로 인한 사망률이나 부작용에 대한 징후가 문헌에 빠져 있지만, 우리의 경험에 따르면 수술 방법은 낮은 비율 (약 10 %)에서 수술 후 사망률이 높고 동물의 고통이 잦아 일정 회복 시간이 필요합니다12. 또한 수술 후 적용된 바늘은 이미징 절차의 올바른 적용을 방해합니다. 이로 인해 품질이 매우 낮은 미국 이미지가 수집되어 잔향 및 그림자 영역과 같은 아티팩트로 인한 부정확한 데이터 외삽이 발생합니다. 이러한 모든 사실을 고려할 때, 동종 마우스 모델의 확립을 위해 수술 절차가 필요하지 않은 방법이 선호되며 전임상 연구 목적으로 강력히 권장됩니다. 또한 최소 침습적이기 때문에 세포 접종에서 회복 시간이 더 빠르고 미국 유도 방법에서 동물의 고통이 최소화됩니다. 큰 장점은 미국 유도 방법이 다른 마취 방법 (예 : 케타민 / 자일 라진 용액)에 비해 더 빠른 유도 및 회복, 심혈관 기능 및 뇌 혈류 자동 조절에 대한 상대적으로 적은 절약 효과를 허용하는 이소 플루 란 마취의 사용과 호환된다는 것입니다. 전반적으로, 이소플루란의 무시할 수 있는 대사는 마취 관리에 특히 유용하게 만든다13. 실제로, 시술이 끝난 후 약 5 분 후에 동물은 흉골 누운 상태를 유지하기에 충분한 의식을 회복합니다. 또한 마우스는 통증을 최소화하기 위해 진통제 (carprofen)를 사전 치료하고 있으며 신속하고 완전한 회복으로 인해 수술 후 치료가 필요하지 않습니다.
그럼에도 불구하고 절차에서 고려해야 할 몇 가지 중요한 문제 해결 단계가 있습니다. 접종할 세포의 수는 1 x 106 세포를 초과해서는 안 되며 세포 접종량은 췌장 밖으로 세포가 누출될 위험을 피하기 위해 20μL를 초과해서는 안 됩니다. 세포 주입은 세포 활력의 감소를 피하기 위해 분리 직후에 수행해야합니다. 세포 주입 후 췌장에서 세포가 누출되는 것을 방지하기 위해 바늘을 제거하기 전에 최소 10 초 동안 기다려야합니다.
본 프로토콜의 가장 중요한 측면 중 하나는 동물 플랫폼 상의 마우스의 위치에 관한 것이다. 마우스는 동물 취급 테이블에 오른쪽에 누워 있어야하며 피부를 늘려야합니다. 주사하는 동안 피부가 제대로 늘어나지 않으면 바늘이 췌장을 뚫고 들어가기 위해 고군분투하며 세포가 췌장 밖으로 유출 될 위험이 있습니다. PCa 마우스 모델을 생산하기 위한 초음파 유도 주사는 2011년 Huynh et al.에 의해 처음 기술되었다14. 여기에서는 이러한 모델을 생성하는 데 적합한 방법론에 중점을 두고 재현 가능하게 만드는 모든 단계를 자세히 설명했습니다. 또한 Huynh et al.14와 비교하여 지난 5 년 동안 발생한 미국 기술의 발전과 관련된 몇 가지 혁신을 도입했습니다. 본 프로토콜에서는 뻣뻣한 바늘과 30°의 경사각을 가진 해밀턴 주사기를 사용하여 세포 주입 중에 더 나은 정확도를 얻고 세포 누출을 최소화할 것을 강력히 권장합니다. 마지막으로, 미국 유도 주사 동안, 마우스는 동물 플랫폼에 오른쪽에 고정되었고, Huynh et al.14 마우스는 등쪽 누운 상태에 놓였다. 마우스의 측면 위치는 비장 바로 아래의 췌장 꼬리를 시각화 할 수있게하여 세포 주입 중에 시각적 참조 (그림 1B) 역할을하여 기술의 재현성을 보장합니다.
다른 기술과 마찬가지로 미국 안내 절차에도 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 가장 큰 한계는 몸과 머리가 다른 장기로 덮여 있고 바늘에 도달하기 어렵 기 때문에 췌장의 꼬리에서만 주사를 수행 할 수 있다는 것입니다. 또한, 종양 성장을 모니터링하기 위해 미국 영상을 사용하는 것과 관련된 또 다른 한계는 접종 6주 후 종양 덩어리가 너무 커지면 전체 종양 덩어리를 시각화할 수 없다는 것입니다(그림 3C-E). 그러나 이러한 많은 양은 질병의 임상 경과를 모방하지 않습니다.
여기에 설명된 프로토콜로 얻은 PCa 모델의 또 다른 이점은 종양 덩어리의 느린 세포 생착 및 성장입니다(그림 3B). 이는 약리학적 개입의 출발점을 정확하게 식별하고 시간 경과에 따른 치료적 개입의 효과를 더 잘 모니터링하는 데 이상적입니다.
마지막으로, 설명 된 기술은 고통, 고통, 고통 또는 지속적인 피해를 최소화하는 기술 및 절차 개발을 포함하는 3R 원칙의 구현 사례이며 연구에서 동물의 복지를 직접 향상시킵니다.
미국 유도 주사에 의해 얻어진 PCa 모델의 향후 응용은 적절한 치료 치료 또는 치료 조합의 개발을 목표로하는 연구를 포함한다. 실제로, 이러한 혁신적인 생체내 기술의 사용은 소분자, 예를 들어 항체, 항체 단편 및 항체-약물 접합체(ADC)의 사용과 결합될 수 있으며, 이는 테라그노스틱 접근법과 함께 사용될 수 있다. 후자는 우리 그룹이 최근 연구에서 입증 한 바와 같이 치료 목적으로 단독으로 사용할 수 있습니다15 또는 적절한 형광단 접합 후, 종양 성장을 모니터링하기 위해.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 작업은 Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC, 보조금 번호 15627, IG 21510 및 IG 19766)가 AA, PRIN 이탈리아 대학 및 연구부 (MIUR)에 지원했습니다. 혁신적인 치료 전략(LIONESS) 20174TB8KW에서 AA, pHioniC로 암의 이온 채널 네트워크에 대한 기본 지식 활용: 유럽 연합의 Horizon 2020은 AA에 813834 부여하지 않습니다. CD는 이탈리아 ID 24020에 대한 AIRC 펠로우십의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm Petri dish | Sarstedt, Germany | P5856 | |
| 3D-Mode package | Visualsonics Fujifilm, Italy | Includes the 3D Motor; necessary for volumetric imaging | |
| Aquasonic 100, Sonypack 5 lt Ultrasound Transmission Gel | PARKER LABORATORIES, INC. | 150 | Gel for ultrasound |
| Athymic Mice (Nude-Foxn1nu) | ENVIGO, Italy | 69 | 20 females, 8 weeks old, Athymic Nude-Foxn1nu, 20-22 g body weight |
| CO2 Incubator Function Line | Heraeus Instruments, Germany | BB16-ICN2 | |
| Display of ECG, Respiration Waveform and body temperature | Visualsonics Fujifilm, Italy | 11426 | |
| DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) | Euroclone Spa, Italy | ECM0101L | |
| DPBS (Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline) | Euroclone Spa, Italy | ECB4004L | |
| Eppendorf (1.5mL) | Sarstedt, Germany | 72.690.001 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Euroclone Spa, Italy | ECS0170L | |
| Hamilton Needle Pointstyle 4, lenght 30 mm, 28 Gauge | Permax S.r.l., Italy | 7803-02 | |
| Hamilton Syringe 705RM 50 µL | Permax S.r.l., Italy | 7637-01 | |
| Isoflo (250 mL) | Ecuphar | 7081219 | |
| L-glutamine 100X | Euroclone Spa, Italy | ECB3000D | |
| Mouse Handling table II | Visualsonics Fujifilm, Italy | 50249 | |
| MX550D: 55 MHz MX Series Transducer | Visualsonics Fujifilm, Italy | 51069 | Ultrasound Transducers |
| Oxygen/isofluorane mixer | Angelo Franceschini S.r.l. | LFY-I-5A | |
| PANC1 cell line | American Type Culture Collection (ATCC), USA | CRL-1469 | |
| Rimadyl (carprofen) | Pfizer | 11319 | 20 mL, injection solution |
| Trypsin-EDTA 1X in PBS | Euroclone Spa, Italy | ECB3052D | |
| Vet ointment for eyes, Systane nighttime | Alcon | 509/28555-1 | |
| Vevo Compact Dual Anesthesia System (Tabletop Version) | Visualsonics Fujifilm, Italy | VS-12055 | complete with gas chamber |
| Vevo Imaging Station 2 | Visualsonics Fujifilm, Italy | VS-11983 | Imaging WorkStation 1 plus Imaging Station Extension with injection mount |
| Vevo Lab | Visualsonics Fujifilm, Italy | VS-20034 | Data Analysis Software |
| Vevo LAZR-X Photoacoustic Imaging System | Visualsonics Fujifilm, Italy | VS-20054 | Includes analytic software package for B-mode |
| Vevo Photoacoustic Enclosure | Visualsonics Fujifilm, Italy | 53157 |
References
- Zeng, S., et al.
- Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).
- Rahib, L., et al. Projecting cancer incidence and deaths to 2030: The unexpected burden of thyroid, liver, and pancreas cancers in the united states. Cancer Research. 74 (11), 2913-2921 (2014).
- Rawla, P., Sunkara, T., Gaduputi, V. Epidemiology of pancreatic cancer: Global trends, etiology and risk factors. World Journal of Oncology. 10 (1), 10 (2019).
- Herreros-Villanueva, M., Hijona, E., Cosme, A., Bujanda, L.
- Hofschroer, V., et al. Ion channels orchestrate pancreatic ductal adenocarcinoma progression and therapy. Frontiers in Pharmacology. 11, 586599 (2021).
- Adamska, A., Domenichini, A., Falasca, M. Pancreatic ductal adenocarcinoma: Current and evolving therapies. International Journal of Molecular Sciences. 18 (7), 1338 (2017).
- Qiu, W., Su, G. H. Development of orthotopic pancreatic tumor mouse models. Methods in Molecular Biology. 980, 215-223 (2013).
- Killion, J. J., Radinsky, R., Fidler, I. J. Orthotopic models are necessary to predict therapy of transplantable tumors in mice. Cancer Metastasis Reviews. 17 (3), 279-284 (1998).
- Qiu, W., Su, G. H. Challenges and advances in mouse modeling for human pancreatic tumorigenesis and metastasis. Cancer and Metastasis Reviews. 32 (1-2), 83-107 (2013).
- Erstad, D. J., et al. Orthotopic and heterotopic murine models of pancreatic cancer and their different responses to FOLFIRINOX chemotherapy. DMM Disease Models and Mechanisms. 11 (7), (2018).
- Lottini, T., et al. Micro-ultrasound, non-linear contrast mode with microbubbles and Optical Flow software tool: together for a new translational method in the study of the tumoral rheology microenvironment. WMIC 2017: Imaging the Future from Molecules to Medicine. , (2017).
- Ludders, J. W. Advantages and guidelines for using isoflurane. The Veterinary Clinics of North America Small Animal Practice. 22 (2), 328-331 (1992).
- Huynh, S., et al. Development of an orthotopic human pancreatic cancer xenograft model using ultrasound guided injection of cells. PLoS One. 6 (5), 20330 (2011).
- Duranti, C., et al. Harnessing the hERG1/β1 Integrin Complex via a Novel Bispecific Single-chain Antibody: An Effective Strategy against Solid Cancers. Molecular Cancer Therapeutics. 20 (8), 1338-1349 (2021).
