Summary
我们提出了一种方案，通过超声引导下注射人胰腺癌细胞并随后通过超声成像监测 体内 肿瘤生长来生成微创原位胰腺癌模型。
Abstract
胰腺癌（PCa）是全球最致命的癌症类型之一。PCa恶性肿瘤的原因主要依赖于其内在的恶性行为和对治疗的高耐药性。事实上，尽管做出了许多努力，但标准化疗和创新靶向疗法在从临床前评估转移到临床环境时都失败了。在这种情况下，迫切需要开发更好地模拟PCa 体内 特征的临床前小鼠模型来测试新开发的药物。本协议描述了一种生成PCa小鼠模型的方法，该方法由通过超声引导下注射人胰腺肿瘤细胞获得的原位异种移植物表示。使用这种可靠和微创的方案，我们还提供了 体内 植入和肿瘤肿块发展的证据，可以通过超声（US）成像进行监测。这里描述的PCa模型的一个值得注意的方面是肿瘤肿块随着时间的推移缓慢发展，这允许精确识别药物治疗的起点并更好地监测治疗干预的效果。此外，这里描述的技术是实施3R原则的一个例子，因为它最大限度地减少了疼痛和痛苦，并直接改善了研究中动物的福利。
Introduction
PCa及其最常见的形式胰腺导管腺癌（PDAC）是癌症相关死亡的最常见原因之一，无论1，2阶段如何，1年生存率低于20%，5年生存率为8%。这种疾病几乎总是致命的，预计其发病率在未来几年将继续增长，不像其他癌症类型，其发病率正在下降3。癌症检测晚期、快速进展趋势和缺乏特异性治疗等因素导致 PCa4 预后不良。由于开发了更准确的临床前小鼠模型，癌症研究取得了巨大进展。这些模型为理解癌症背后的分子机制和开发新疗法提供了适当的见解5。这些进展不适用于PCa，尽管最近做出了巨大努力，但PCa仍然对当前的化疗疗法具有抗性1。由于这些原因，开发改善患者前景的新方法是强制性的。
多年来，已经开发了许多PCa小鼠模型，包括异种移植物，这是当今使用最广泛的模型5。异种移植模型分为皮下异位和原位，具体取决于植入肿瘤细胞的位置。皮下异位异种移植更容易且更便宜，但错过了PCa的某些特征（即，特殊的肿瘤微环境，其特征是纤维化组织的积累，缺氧，酸度和血管生成）6，7。这就解释了为什么皮下异种移植物往往无法为治疗提供可靠的数据，导致在转化为临床环境时失败8。另一方面，原位异种移植物与肿瘤微环境更相似，从而更好地模仿疾病的自然发展。此外，原位异种移植物更适合研究PCa的转移过程和侵袭性特征，这在皮下模型9中几乎不会发生。总体而言，原位异种移植小鼠模型目前优选进行临床前药物测试9，10。原位异种移植物通常依靠外科手术将细胞或非常小的肿瘤组织碎片植入胰腺。事实上，在过去的几十年里，已经发表了几篇基于PCa手术模型的论文11。然而，用于建立原位肿瘤模型的外科手术的质量和结果在很大程度上取决于操作者的技术技能。用于转化临床方法的成功原位PCa异种移植的另一个关键点是建立具有可预测生长动力学的局部疾病的可能性。
为了解决这些问题，我们在这里描述了一种生产原位PCa异种移植物的创新程序，利用超声（US）引导的人PCa细胞注射到免疫缺陷小鼠的胰腺尾部。此过程将生成可靠的 PCa 鼠标模型。肿瘤生长在 体内 通过US成像进行。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
本协议已获得意大利卫生部的批准，授权号为843/2020-PR。为了确保无菌条件，动物被保存在佛罗伦萨大学研究动物动物园（Ce.S.A.L.）的屏障室内。所有程序均在佛罗伦萨大学（意大利）LIGeMA设施中饲养小鼠的同一空间中进行。
1. 细胞制备
- 在含有 Dulbecco 改良鹰培养基 （DMEM） 的 100 mm 培养皿中培养来自 PCa 细胞系的 PCa 细胞，该培养皿补充有 2% L-谷氨酰胺和 10% 胎牛血清 （FBS）。
- 将细胞在37°C的常氧中用5%CO2孵育。
- 用胰蛋白酶分离细胞。计数，并在接种前 1 小时将 1 x 106 个细胞重悬于 20 μL PBS 中。
2. 超声引导下注射（US-GI）的小鼠制备
注意：以下步骤在无菌条件下进行。US引导注射的整个过程，从麻醉开始到将小鼠从动物平台上取出，大约需要10-12分钟加上5分钟才能完全恢复小鼠。
- 在干预之前，使用带有27G针头的结核菌素注射器以5mg / kg的终剂量皮下注射卡洛芬（NSAID）或终剂量为5mg / kg的曲马多。
注意：对于本协议，使用20只无胸腺裸狐1nu 雌性小鼠。小鼠8周龄，体重20-22克。 - 打开成像仪，在换能器面板的应用菜单中选择 鼠标（小）腹部 。确保出现B模式（亮度模式）成像窗口，并且系统已准备好获取B模式数据。
注：B模式是系统的默认成像模式。系统通过根据回波信号幅度分配亮度级别，在二维 （2D） 视图中显示回波。B模式是定位解剖结构的最有效模式。- 转到 学习浏览器。
- 选择 “新建 研究”并键入研究名称和信息，即研究日期等。
- 在系列名称中填写所有必要的信息，即动物品系、ID、出生日期等。
- 点击 完成;该程序已准备好进行B模式成像。
- 使用4%异氟醚在麻醉诱导室中麻醉小鼠，气体流量为O2的2L / min。
注意：大约 4 分钟足以进行适当的麻醉（每分钟呼吸约 50-60 次）。 - 麻醉小鼠后，改变麻醉机的连接，将异氟醚引导至小鼠处理台。
- 将麻醉小鼠放在其右翼的处理台上（在37°C下加热），其鼻子在鼻锥中，以确保使用2%异氟醚麻醉小鼠，气体流量为0.8L / min的O2 （图1A）。
- 在小鼠的眼睛上滴一滴人工泪液，以防止麻醉时干燥。
- 用粘性纱布将右手、右脚和尾巴牢固地粘在动物平台上的电极垫上。
注意：鼠标的呼吸频率和心电图（ECG）通过电极垫记录。
3.US-GI法在胰腺中注射PANC1细胞
- 用70%乙醇消毒小鼠皮肤，并使用粘性纱布保持左胁皮肤伸展。
注意：保持皮肤伸展对于减少针头插入的阻力和防止针头变形很重要。 - 使用20mL注射器（没有针头）在小鼠的腹部和左胁上应用超声凝胶。
- 使用美国换能器的高度控制旋钮，降低换能器以接触鼠标的左翼，并将其横向放置在动物的身体上。
- 移动换能器以使用B模式成像在换能器显示屏上可视化胰腺（图1B）。
- 用30 mm 28 G针头制备50 μL汉密尔顿注射器，其中包含悬浮在20μLPBS中的1 x 106 PANC1细胞，并将注射器放在适当的支架上（图1C）。
注意：使用前，用70%乙醇消毒注射器针头5-10分钟。 - 使用支架显微操纵器，将注射器降低到小鼠皮肤上，针头斜面朝上并与超声换能器处于同一平面，与换能器形成45°的角度（图1D）。
注：从此步骤开始，继续监视显示屏上的美国图像。 - 使用显微操纵器，穿孔皮肤并将注射器针头插入胰腺并观察显示器上的美国图像，以跟踪其轨迹（图1E）。
注意：注射前，以胰尾为参考，位于脾脏后面，靠近左肾。 - 将针头插入胰腺后，通过在注射器柱塞上施加恒定压力，将含有细胞的 20 μL 推注物直接注入胰腺（图 1F）。
注意：通过胰腺中存在小气泡和低回声液体的流动来检查正确的注射程序，从针尖几乎看不到。 - 注射整个推注后将针头留在原位5-10秒，然后慢慢缩回。
- 取下美国换能器，从侧面清洁凝胶，然后将鼠标单独放在新的笼子中。观察动物，直到它恢复足够的意识以维持胸骨卧位。
4.3D US成像监测小鼠胰腺肿瘤
注意：肿瘤发展的评估是在细胞注射后8天开始进行的，使用与US引导注射相同的仪器（列在 材料表中）。因此，一些程序，例如系统点火（步骤2.2.），麻醉（步骤2.3.-2.6.）和小鼠放置在动物平台上（步骤2.7.），完全符合上述协议中描述的内容。
- 在开始美国映像之前，请如图 2A 所示设置工作站。
- 将换能器固定在3D电机系统上（图2A）。
- 打开成像仪，然后在研究浏览器上选择新建研究。
- 将小鼠置于麻醉诱导室（4%异氟醚）中。
- 将麻醉小鼠放在其右翼，放在37°C加热的处理台上，其鼻子在麻醉管中，并将异氟醚降低至2%（图2B）。
注意：重要的是将鼠标放置在与US引导注射相同的位置，以保持相同的解剖参考。 - 在老鼠的眼睛上涂抹一滴兽医软膏。
- 在小鼠的腹部和左胁上涂上一层超声凝胶。
- 将55 MHz换能器横向放置以接触左胁皮肤，使胰腺大致居中（图2C）。
- 使用3D马达在横向方向上采集整个胰腺的图像，理想情况下每次采集收集90-100帧（帧数可能因个人选择而异）。
- 在成像器触摸板上选择 3D 电机位置 。
- 通过移动光标从双肢获取整个胰腺的图像来指示扫描距离。
- 选择 扫描帧 并开始 3D 采集。
- 完成3D成像后，取出换能器，从皮肤上清洁凝胶，然后将小鼠单独放在新的笼子中以进行恢复。观察动物，直到它恢复足够的意识以维持胸骨卧位。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
按照上述方案，首先将小鼠麻醉在异氟醚室中，并放置在动物平台上（图1A）。用超声成像观察胰腺（图1B）。将 50 μL 汉密尔顿注射器装载 1 x 106 PANC1 细胞，悬浮在 20 μL PBS 中并放置在针架上（图 1C）。注射器和US换能器之间的最佳角度为45°（图1D）。使用显微操纵器，将注射器针头插入胰腺，并在美国成像仪显示器上观察其轨迹（图1E）。然后将20μL肿瘤细胞推注到胰腺中（图1F），10秒后将针头缩回。采取了相关措施以防止细胞反冲并随后泄漏到腹膜腔中，例如在接种期间施加恒定压力，细胞注射后暂停以及使用具有30°斜角的细针。在美国引导的注射后，每天监测小鼠的体重，以评估由于手术引起的任何压力迹象。未观察到注射小鼠体重的显着变化。
然后应用3D US成像来监测肿瘤细胞植入和肿瘤发展。第一次图像采集在细胞注射后第8天进行，然后每周采集（总共6次采集）。在成像过程中，将动物放置在加热（37°C）平台上的右侧，并通过吸入异氟烷气体（诱导剂量为4%，维持剂量为2%）进行麻醉（图2）。3D采集是在B模式下使用3D电机进行的，该电机允许换能器扫描垂直于其轴线的各个部分的腹部。获得一系列2D图像，然后由分析软件组装，重建器官的3D解剖图像（3D重新渲染）。为了进行3D成像，有必要将小鼠呼吸阶段与3D扫描的采集同步。从第8天开始，在20只（80%）动物中的16只（图3A）中，胰尾中存在肿瘤肿块（一种低回声结构（用深色表示），证实了该方案的可重复性（图3A）。在四只小鼠（20%的动物）中，在注射后2周观察到肿瘤肿块的发展。这种潜伏期可以追溯到针头插入胰腺的次优程序，这导致细胞泄漏到腹膜中。
图3B显示了通过US引导的注射小鼠模型的US成像评估的平均肿瘤体积（n = 16）。在美国最后一次收购后的第二天，小鼠首先通过吸入CO2被安乐死，然后通过颈椎脱位。检查腹腔并取出肿瘤肿块进行组织学分析（图3C-E）。
图1：用于建立原位PCa小鼠模型的US指导方法 。 （A）将鼠标放置在右翼在37°C下加热的特殊支架上。 （B）US换能器在脾脏水平上横向位于动物身体，胰腺以B模式可视化。小鼠腹部的侧腹视图显示了脾脏（2）和左肾（3）之间的胰腺（1）。比例尺：2毫米。 （C） 将汉密尔顿注射器放置在适当的支架上。（D）在这种情况下，换能器（2）和注射器（1）的位置形成45°的角度。（E）注射器的针头（1）插入胰尾，就在脾脏下方。比例尺：2毫米。 （F） 使用带有 28 G 针头的汉密尔顿注射器将含有 20 μL PBS 中的 1 x 106 PANC1 细胞的推注注射到胰尾。比例尺：2毫米。 请点击此处查看此图的大图。
图2：用于监测小鼠胰腺肿瘤的成像工作站 。 （A）美国成像工作场所。（1） 55兆赫换能器;（2）鼠标处理台;（3）3D电机;（4）美式换能器的高度控制旋钮。（B）将小鼠放在右胁放在处理台上，鼻子在麻醉管中（1），拉伸皮肤，将US凝胶涂在右胁上。（C）降低换能器以接触小鼠皮肤并横向定位到动物身体。 请点击此处查看此图的大图。
图3：小鼠胰腺中原位PCa异种移植物的发展 。 （A）超声引导细胞注射后肿瘤肿块的2D US图像采集。细胞注射8天后用US成像监测肿瘤的发展，然后每周采集一次，直到第44天，总共6次采集。肿瘤由胰腺实质中的低回声结构表示。与周围的实质或邻近结构相比，低回声结构的回声表示为回波强度降低的区域。比例尺：2毫米。 （B）源自PANC1细胞的原位PDAC肿瘤体积的时间过程。（C）细胞注射后第43天肿瘤肿块的US成像获取。比例尺：2毫米.3D插图中显示了肿瘤肿块的重新渲染。（D）成像后，对动物实施安乐死，并进行尸检。（1）肿瘤肿块;（2）健康胰腺的一小部分;（3）脾脏;（4）胃;（5）肝脏。比例尺：5毫米。 （E）苏木精和伊红在4倍放大倍率下对肿瘤肿块进行染色。比例尺：200 μm。在面板的右上方，胰腺腺泡细胞仍然可见的肿瘤肿块的插图;40倍放大倍率。比例尺：100 μm。 请点击这里查看此图的大图。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
尽管US成像在临床上的应用很普遍，但许多临床前小鼠模型中的肿瘤发展通常使用生物发光成像来描述11。后者是评估肿瘤植入和扩增的间接方法，它也不能提供可靠的肿瘤生长动力学。在本研究中，我们已将US成像应用于进行细胞注射以及监测肿瘤发展。我们描述的协议和我们提供的结果代表了PCa研究的相关突破。
这里描述的用于胰腺肿瘤细胞注射的US引导方法是微创的，并且允许克服由外科手术引起的许多缺点，通常用于建立原位PCa小鼠模型。尽管文献中没有关于外科手术引起的死亡率或副作用的指征，但我们的经验表明，手术方法在低比例（约10%）的病例中产生较高的术后死亡率，动物经常遭受痛苦，需要一定的恢复时间12。此外，手术后缝合的缝线阻碍了成像程序的正确应用。这导致采集的美国图像质量非常差，导致伪影（如混响和阴影区域）导致数据外推不准确。考虑到所有这些事实，优选一种不需要外科手术来建立原位小鼠模型的方法，并强烈建议用于临床前研究目的。此外，由于是微创的，细胞接种的恢复时间更快，在美国指导的方法中，动物的痛苦最小。一个很大的优点是，与其他麻醉方法（即氯胺酮/甲苯噻嗪溶液）相比，美国引导的方法与异氟烷麻醉的使用兼容，异氟烷麻醉允许更快的诱导和恢复，对心血管功能和脑血流自动调节的保留作用相对较小。总体而言，异氟醚的代谢可以忽略不计，使其在麻醉剂管理中特别有用13。事实上，在手术结束后大约5分钟，动物恢复了足够的意识来维持胸骨卧位。此外，小鼠预先用镇痛药（卡洛芬）给药以尽量减少疼痛，并且由于快速和完全恢复，不需要术后治疗。
但是，必须考虑过程中的一些关键故障排除步骤。要接种的细胞数不得超过1 x 106 个细胞，细胞接种物的体积不得大于20μL，以避免细胞从胰腺泄漏的风险。细胞注射应在脱离后立即进行，以避免细胞活力下降。细胞注射后，有必要等待至少10秒才能取下针头，以避免细胞从胰腺中泄漏出来。
本协议最关键的方面之一涉及小鼠在动物平台上的定位。鼠标必须右侧躺在动物处理台上，并且必须拉伸皮肤。如果在注射过程中皮肤没有正确拉伸，针头将难以刺穿并进入胰腺，有细胞溢出胰腺的风险。超声引导注射以产生PCa小鼠模型由Huynh等人在2011年首次描述14。在这里，我们专注于适合生成此类模型的方法，详细描述了使其可重现的所有步骤。此外，与Huynh等人14相比，我们引入了一些主要与过去5年美国技术进步相关的创新。在本协议中，强烈建议使用具有硬针头和30°斜角的汉密尔顿注射器，以便在细胞注射过程中获得更好的准确性并最大限度地减少细胞泄漏。最后，在US引导的注射过程中，将小鼠固定在动物平台上的右侧，而在Huynh等人中，将小鼠置于 背卧中。鼠标的侧面位置允许可视化胰腺的尾巴，就在脾脏下方，在细胞注射期间充当视觉参考（图1B），确保该技术的可重复性。
与其他技术一样，美国指导的程序也存在一些局限性。最大的限制是注射只能在胰腺的尾部进行，因为身体和头部被其他器官覆盖，很难用针头到达。此外，与使用US成像监测肿瘤生长相关的另一个限制是，在接种6周后，当肿瘤肿块变得太大时，无法可视化整个肿瘤肿块（图3C-E）。虽然，如此大的体积不能模仿疾病的临床过程。
使用此处描述的方案获得的PCa模型的另一个优点是肿瘤肿块的缓慢细胞植入和生长（图3B）。这是精确确定药物干预起点和更好地监测治疗干预效果的理想选择。
最后，所描述的技术是实施3R原则的一个例子，涉及技术的改进和程序的开发，最大限度地减少疼痛，痛苦，痛苦或持久的伤害，直接改善研究中动物的福利。
通过美国引导注射获得的PCa模型的未来应用包括旨在开发适当的治疗方法或治疗组合的研究。事实上，这种创新的 体内 技术的使用可以与小分子的使用相结合，例如抗体、抗体片段和抗体-药物偶联物（ADC），采用治疗不可知的方法。后者可以单独用于治疗目的，正如我们的小组在我们最近的工作15 或适当的荧光团偶联之后所证明的那样，目的是监测肿瘤生长。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了意大利协会（AIRC，批准号15627，IG 21510和IG 19766）对PRIN意大利大学和研究部（MIUR）的AA的支持。利用癌症中离子通道网络的基本知识进行创新治疗策略（LIONESS）20174TB8KW至AA，pHioniC：欧盟的地平线2020授予AA无813834。CD得到了AIRC意大利ID 24020奖学金的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm Petri dish | Sarstedt, Germany | P5856 | |
| 3D-Mode package | Visualsonics Fujifilm, Italy | Includes the 3D Motor; necessary for volumetric imaging | |
| Aquasonic 100, Sonypack 5 lt Ultrasound Transmission Gel | PARKER LABORATORIES, INC. | 150 | Gel for ultrasound |
| Athymic Mice (Nude-Foxn1nu) | ENVIGO, Italy | 69 | 20 females, 8 weeks old, Athymic Nude-Foxn1nu, 20-22 g body weight |
| CO2 Incubator Function Line | Heraeus Instruments, Germany | BB16-ICN2 | |
| Display of ECG, Respiration Waveform and body temperature | Visualsonics Fujifilm, Italy | 11426 | |
| DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) | Euroclone Spa, Italy | ECM0101L | |
| DPBS (Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline) | Euroclone Spa, Italy | ECB4004L | |
| Eppendorf (1.5mL) | Sarstedt, Germany | 72.690.001 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Euroclone Spa, Italy | ECS0170L | |
| Hamilton Needle Pointstyle 4, lenght 30 mm, 28 Gauge | Permax S.r.l., Italy | 7803-02 | |
| Hamilton Syringe 705RM 50 µL | Permax S.r.l., Italy | 7637-01 | |
| Isoflo (250 mL) | Ecuphar | 7081219 | |
| L-glutamine 100X | Euroclone Spa, Italy | ECB3000D | |
| Mouse Handling table II | Visualsonics Fujifilm, Italy | 50249 | |
| MX550D: 55 MHz MX Series Transducer | Visualsonics Fujifilm, Italy | 51069 | Ultrasound Transducers |
| Oxygen/isofluorane mixer | Angelo Franceschini S.r.l. | LFY-I-5A | |
| PANC1 cell line | American Type Culture Collection (ATCC), USA | CRL-1469 | |
| Rimadyl (carprofen) | Pfizer | 11319 | 20 mL, injection solution |
| Trypsin-EDTA 1X in PBS | Euroclone Spa, Italy | ECB3052D | |
| Vet ointment for eyes, Systane nighttime | Alcon | 509/28555-1 | |
| Vevo Compact Dual Anesthesia System (Tabletop Version) | Visualsonics Fujifilm, Italy | VS-12055 | complete with gas chamber |
| Vevo Imaging Station 2 | Visualsonics Fujifilm, Italy | VS-11983 | Imaging WorkStation 1 plus Imaging Station Extension with injection mount |
| Vevo Lab | Visualsonics Fujifilm, Italy | VS-20034 | Data Analysis Software |
| Vevo LAZR-X Photoacoustic Imaging System | Visualsonics Fujifilm, Italy | VS-20054 | Includes analytic software package for B-mode |
| Vevo Photoacoustic Enclosure | Visualsonics Fujifilm, Italy | 53157 |
References
- Zeng, S., et al.
- Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).
- Rahib, L., et al. Projecting cancer incidence and deaths to 2030: The unexpected burden of thyroid, liver, and pancreas cancers in the united states. Cancer Research. 74 (11), 2913-2921 (2014).
- Rawla, P., Sunkara, T., Gaduputi, V. Epidemiology of pancreatic cancer: Global trends, etiology and risk factors. World Journal of Oncology. 10 (1), 10 (2019).
- Herreros-Villanueva, M., Hijona, E., Cosme, A., Bujanda, L.
- Hofschroer, V., et al. Ion channels orchestrate pancreatic ductal adenocarcinoma progression and therapy. Frontiers in Pharmacology. 11, 586599 (2021).
- Adamska, A., Domenichini, A., Falasca, M. Pancreatic ductal adenocarcinoma: Current and evolving therapies. International Journal of Molecular Sciences. 18 (7), 1338 (2017).
- Qiu, W., Su, G. H. Development of orthotopic pancreatic tumor mouse models. Methods in Molecular Biology. 980, 215-223 (2013).
- Killion, J. J., Radinsky, R., Fidler, I. J. Orthotopic models are necessary to predict therapy of transplantable tumors in mice. Cancer Metastasis Reviews. 17 (3), 279-284 (1998).
- Qiu, W., Su, G. H. Challenges and advances in mouse modeling for human pancreatic tumorigenesis and metastasis. Cancer and Metastasis Reviews. 32 (1-2), 83-107 (2013).
- Erstad, D. J., et al. Orthotopic and heterotopic murine models of pancreatic cancer and their different responses to FOLFIRINOX chemotherapy. DMM Disease Models and Mechanisms. 11 (7), (2018).
- Lottini, T., et al. Micro-ultrasound, non-linear contrast mode with microbubbles and Optical Flow software tool: together for a new translational method in the study of the tumoral rheology microenvironment. WMIC 2017: Imaging the Future from Molecules to Medicine. , (2017).
- Ludders, J. W. Advantages and guidelines for using isoflurane. The Veterinary Clinics of North America Small Animal Practice. 22 (2), 328-331 (1992).
- Huynh, S., et al. Development of an orthotopic human pancreatic cancer xenograft model using ultrasound guided injection of cells. PLoS One. 6 (5), 20330 (2011).
- Duranti, C., et al. Harnessing the hERG1/β1 Integrin Complex via a Novel Bispecific Single-chain Antibody: An Effective Strategy against Solid Cancers. Molecular Cancer Therapeutics. 20 (8), 1338-1349 (2021).
