Summary
We presenteren een protocol om een minimaal invasief orthotopisch pancreaskankermodel te genereren door echogeleide injectie van menselijke pancreaskankercellen en de daaropvolgende monitoring van tumorgroei in vivo door echografie.
Abstract
Alvleesklierkanker (PCa) vertegenwoordigt een van de dodelijkste kankersoorten wereldwijd. De redenen voor PCa-maligniteit zijn voornamelijk afhankelijk van het intrinsieke kwaadaardige gedrag en de hoge weerstand tegen therapeutische behandelingen. Inderdaad, ondanks vele inspanningen hebben zowel standaard chemotherapie als innovatieve doeltherapieën aanzienlijk gefaald toen ze van preklinische evaluatie naar de klinische setting werden verplaatst. In dit scenario is de ontwikkeling van preklinische muismodellen die de in vivo kenmerken van PCa beter nabootsen dringend nodig om nieuw ontwikkelde geneesmiddelen te testen. Het huidige protocol beschrijft een methode om een muismodel van PCa te genereren, vertegenwoordigd door een orthotopisch xenograft verkregen door echogeleide injectie van menselijke pancreastumorcellen. Met behulp van zo'n betrouwbaar en minimaal invasief protocol leveren we ook bewijs van in vivo engraftment en ontwikkeling van tumormassa's, die kunnen worden gevolgd door echografie (VS) beeldvorming. Een opmerkelijk aspect van het hier beschreven PCa-model is de langzame ontwikkeling van de tumormassa's in de loop van de tijd, wat een nauwkeurige identificatie van het startpunt voor farmacologische behandelingen en een betere monitoring van de effecten van therapeutische interventies mogelijk maakt. Bovendien is de hier beschreven techniek een voorbeeld van implementatie van de 3V-principes, omdat het pijn en lijden minimaliseert en het welzijn van dieren in onderzoek direct verbetert.
Introduction
PCa, en de meest voorkomende vorm, het Pancreatic Ductal Adeno Carcinoma (PDAC), is een van de meest voorkomende oorzaken van kankergerelateerde sterfte met een 1-jaarsoverleving van minder dan 20% en een 5-jaarsoverleving van 8%, ongeacht het stadium 1,2. De ziekte is bijna altijd dodelijk en de incidentie ervan zal naar verwachting de komende jaren voortdurend groeien, in tegenstelling tot andere soorten kanker, waarvan de incidentie afneemt3. Factoren zoals late detectie van kanker, de neiging tot snelle progressie en het ontbreken van specifieke therapieën leiden tot een slechte prognose van PCa4. Grote vooruitgang in kankeronderzoek is verkregen, dankzij de ontwikkeling van nauwkeurigere preklinische muismodellen. De modellen hebben passende inzichten opgeleverd voor het begrip van het moleculaire mechanisme dat ten grondslag ligt aan kanker en voor de ontwikkeling van nieuwe behandelingen5. Deze vooruitgang is slecht van toepassing op PCa, dat ondanks grote recente inspanningen resistent blijft tegen de huidige chemotherapeutische therapieën1. Om deze redenen is de ontwikkeling van nieuwe benaderingen om de vooruitzichten van patiënten te verbeteren noodzakelijk.
In de loop der jaren zijn er veel PCa-muismodellen ontwikkeld, waaronder xenografts, de meest gebruikte modellen tegenwoordig5. Xenograftmodellen worden geclassificeerd als subcutaan heterotopisch en orthotopisch, afhankelijk van de locatie van de geïmplanteerde tumorcellen. Subcutane heterotope xenografts zijn gemakkelijker en goedkoper te bereiken, maar missen bepaalde karakteristieke kenmerken van PCa (d.w.z. de eigenaardige tumormicro-omgeving, gekenmerkt door de accumulatie van fibrotisch weefsel, hypoxie, zuurgraad en angiogenese)6,7. Dit verklaart waarom subcutane xenografts vaak geen robuuste gegevens leveren voor therapeutische behandelingen die tot mislukkingen leiden wanneer ze worden vertaald naar de klinische setting8. Aan de andere kant lijken orthotopische xenografts meer op de micro-omgeving van de tumor, wat leidt tot een betere nabootsing van de natuurlijke ontwikkeling van de ziekte. Bovendien zijn orthotopische xenografts meer geschikt voor het bestuderen van het metastatische proces en de invasieve kenmerken van PCa, die bijna niet voorkomen in subcutane modellen9. Over het algemeen hebben orthotopische xenograft muismodellen tegenwoordig de voorkeur om preklinische drugstests uit te voeren 9,10. Orthotopische xenografts vertrouwen meestal op chirurgische procedures om cellen of zeer kleine tumorweefselstukken in de alvleesklier te implanteren. Inderdaad, verschillende artikelen op basis van chirurgische modellen van PCa zijn gepubliceerd in de afgelopen decennia11. De kwaliteit en de uitkomst van de chirurgische procedure voor het opzetten van een orthotopisch tumormodel zijn echter sterk afhankelijk van de technische vaardigheden van de operator. Een ander belangrijk punt voor een succesvol orthotopisch PCa-xenograft voor een translationele klinische benadering is de mogelijkheid om gelokaliseerde ziekte vast te stellen met voorspelbare groeikinetiek.
Om deze problemen aan te pakken, beschrijven we hier een innovatieve procedure om een orthotopisch PCa-xenograft te produceren, waarbij gebruik wordt gemaakt van echografie (VS) -geleide injectie van menselijke PCa-cellen in de staart van de pancreas bij immunodeficiënte muizen. Deze procedure genereert een betrouwbaar PCa-muismodel. De tumorgroei wordt in vivo gevolgd door Amerikaanse beeldvorming.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het huidige protocol kreeg goedkeuring van het Italiaanse ministerie van Volksgezondheid met het autorisatienummer 843/2020-PR. Om aseptische omstandigheden te garanderen, werden de dieren in de barrièreruimte van het onderzoeksdier vivarium (Ce.S.A.L.) van de Universiteit van Florence gehouden. Alle procedures werden uitgevoerd in dezelfde ruimte waar de muizen werden gehuisvest in de LIGeMA-faciliteit van de Universiteit van Florence (Italië).
1. Celvoorbereiding
- Kweek PCa-cellen uit de PCa-cellijn in een petrischaaltje van 100 mm met Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 2% L-glutamine en 10% Foetaal Runderserum (FBS).
- Incubeer de cellen in normoxie bij 37 °C met 5% CO2.
- Maak de cellen los met trypsine. Tel en resuspensieer 1 x 106 cellen in 20 μL PBS, 1 uur vóór inenting.
2. Muisvoorbereiding voor echogeleide injectie (US-GI)
OPMERKING: De volgende stappen werden uitgevoerd onder steriele omstandigheden. De hele procedure van door de VS geleide injectie, vanaf het begin van de anesthesie totdat de muis van het dierplatform wordt verwijderd, duurt ongeveer 10-12 minuten plus 5 minuten voor volledig muisherstel.
- Dien vlak voor de interventie carprofen (NSAID) subcutaan (s.c.) toe in een einddosis van 5 mg/kg of tramadol in een einddosis van 5 mg/kg met behulp van een tuberculinespuit met een naald van 27 G.
OPMERKING: Voor het huidige protocol werden 20 Athymic Nude-Foxn1nu vrouwelijke muizen gebruikt. De muizen waren 8 weken oud en wogen 20-22 g. - Schakel de imager in en selecteer Muis (Klein) Buik in het toepassingsmenu van het transducerpaneel. Zorg ervoor dat het beeldvenster B-Mode (Helderheidsmodus) wordt weergegeven en dat het systeem klaar is om B-Mode-gegevens te verkrijgen.
OPMERKING: B-Mode is de standaard beeldverwerkingsmodus van het systeem. Het systeem geeft echo's weer in een tweedimensionale (2D) weergave door een helderheidsniveau toe te wijzen op basis van de amplitude van het echosignaal. B-Mode is de meest effectieve modus voor het lokaliseren van anatomische structuren.- Ga naar de studiebrowser.
- Selecteer Nieuwe studie en typ de naam en informatie van het onderzoek, d.w.z. de datum van het onderzoek, enz.
- Vul alle benodigde informatie in de serienaam in, d.w.z. diersoort, ID, geboortedatum, enz.
- Tik op Gereed; het programma is klaar voor B-mode imaging.
- Verdoof de muis in de anesthesie-inductiekamer met behulp van 4% isofluraan met een gasstroom van 2 L/min O2.
OPMERKING: Ongeveer 4 minuten zijn voldoende voor een goede anesthesie (ademhaling rond 50-60 ademhalingen per minuut). - Zodra de muis is verdoofd, wijzigt u de verbinding van de anesthetische machine om de isofluraan naar de muisbehandelingstafel te leiden.
- Plaats de verdoofde muis op zijn rechterflank op de behandeltafel (verwarmd bij 37 °C) met zijn snuit in een neuskegel om ervoor te zorgen dat de muis wordt verdoofd met 2% isofluraan met een gasstroom van 0,8 l/min O2 (figuur 1A).
- Breng een druppel kunstmatige tranen aan op de ogen van de muis om uitdroging te voorkomen tijdens de narcose.
- Plak de rechterhand, rechtervoet en staart stevig vast op de elektrodepads op het dierenplatform met zelfklevend gaas.
OPMERKING: De ademhalingsfrequentie en het elektrocardiogram (ECG) van de muis worden geregistreerd via de elektrodepads.
3. Injectie van PANC1-cellen in de alvleesklier volgens de US-GI-methode
- Ontsmet de muizenhuid met 70% ethanol en houd de huid van de linkerflank uitgerekt met behulp van zelfklevend gaas.
OPMERKING: Het is belangrijk om de huid uitgerekt te houden om de weerstand tegen het inbrengen van de naald te verminderen en om naaldvervormingen te voorkomen. - Breng ultrasone gel aan op de buik en linkerflank van de muis met behulp van een spuit van 20 ml (zonder de naald).
- Gebruik de hoogteregelknop van de Amerikaanse transducer om de linkerflank van de muis aan te raken en plaats deze dwars op het lichaam van het dier.
- Verplaats de transducer om de alvleesklier op het display van de transducer te visualiseren met behulp van B-Mode imaging (figuur 1B).
- Bereid een Hamilton-spuit van 50 μL, met 1 x 106 PANC1-cellen gesuspendeerd in 20 μL PBS, met een naald van 30 mm 28 G en plaats de spuit op de juiste houder (figuur 1C).
OPMERKING: Ontsmet voor gebruik de naald van de spuit met 70% ethanol gedurende een periode van 5-10 minuten. - Gebruik de houdermicromanipulator om de spuit op de huid van de muis te laten zakken, met de naald schuin naar boven en in hetzelfde vlak als de ultrasone transducer, waarbij u een hoek van 45° vormt met de transducer (figuur 1D).
OPMERKING: Ga vanaf deze stap verder met het controleren van het Amerikaanse beeld op het scherm. - Gebruik de micromanipulator om de huid te perforeren en de naald van de spuit in de alvleesklier te steken en het Amerikaanse beeld op het display te observeren om het traject te volgen (figuur 1E).
OPMERKING: Neem vóór de injectie de staart van de alvleesklier als referentie die zich achter de milt en dicht bij de linker nier bevindt. - Zodra de naald in de alvleesklier is ingebracht, injecteert u een bolus van 20 μL met de cellen rechtstreeks in de alvleesklier door constante druk uit te oefenen op de zuiger van de spuit (figuur 1F).
OPMERKING: De juiste injectieprocedure wordt gecontroleerd door de aanwezigheid van een kleine bel in de pancreas en de stroom van hypoechogene vloeistof, die nauwelijks zichtbaar is vanaf de naaldpunt. - Laat de naald 5-10 s op zijn plaats nadat de hele bolus is geïnjecteerd en trek deze vervolgens langzaam in.
- Verwijder de Amerikaanse transducer, reinig de gel van de flank en plaats de muis alleen in een nieuwe kooi. Observeer het dier totdat het weer voldoende bewustzijn heeft gekregen om de strengale lighouding te behouden.
4.3D Amerikaanse beeldvorming voor het monitoren van pancreastumoren bij muizen
OPMERKING: De evaluatie van de tumorontwikkeling werd uitgevoerd vanaf 8 dagen na de celinjectie, met hetzelfde instrument dat werd gebruikt voor de door de VS geleide injectie (vermeld in de tabel met materialen). Daarom komen sommige procedures, zoals de systeemontsteking (stap 2.2.), anesthesie (stappen 2.3. - 2.6.) en muisplaatsing op het dierenplatform (stap 2.7.), volledig overeen met wat hierboven in het protocol is beschreven.
- Voordat u de Amerikaanse beeldvorming start, stelt u het werkstation in zoals weergegeven in figuur 2A.
- Bevestig de transducer op het 3D-motorsysteem (figuur 2A).
- Schakel de imager in en selecteer New Study in de Study Browser.
- Plaats de muis in de inductiekamer van de anesthesie (4% isofluraan).
- Plaats de verdoofde muis op zijn rechterflank op de bij 37 °C verwarmde behandeltafel met zijn snuit in de verdovingsbuis en reduceer isofluraan tot 2% (figuur 2B).
OPMERKING: Het is belangrijk dat de muis in dezelfde positie wordt geplaatst als de door de VS geleide injectie, om dezelfde anatomische referenties te behouden. - Breng een druppel vetzalf aan op de ogen van de muis.
- Breng een laag ultrasone gel aan op de buik en linkerflank van de muis.
- Plaats de 55 MHz transducer in de transversale oriëntatie om de linkerflankhuid zodanig aan te raken dat de alvleesklier ongeveer gecentreerd is (figuur 2C).
- Gebruik de 3D-motor om beelden van de hele alvleesklier in de transversale oriëntatie te verkrijgen, idealiter 90-100 frames per acquisitie verzamelen (aantal frames kan variëren afhankelijk van persoonlijke keuze).
- Selecteer de 3D-motorpositie op het touchpad van de imager.
- Geef de scanafstand aan door de cursor te bewegen om beelden van de hele alvleesklier van beide ledematen te verkrijgen.
- Selecteer Frames scannen en begin met 3D-acquisitie.
- Zodra 3D-beeldvorming is voltooid, verwijdert u de transducer, reinigt u de gel van de huid en plaatst u de muis alleen in een nieuwe kooi voor herstel. Observeer het dier totdat het weer voldoende bewustzijn heeft gekregen om de strengale lighouding te behouden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Volgens het hierboven beschreven protocol werden muizen eerst verdoofd in een isofluraankamer en op het dierenplatform geplaatst (figuur 1A). De alvleesklier werd gevisualiseerd met echografie (figuur 1B). Een Hamilton-spuit van 50 μL werd geladen met 1 x 106 PANC1-cellen, gesuspendeerd in 20 μL PBS en op de naaldhouder geplaatst (figuur 1C). De optimale hoek tussen de spuit en de Amerikaanse transducer was 45° (figuur 1D). Met behulp van de micromanipulator werd de naald van de spuit in de alvleesklier ingebracht en werd het traject ervan waargenomen op het Amerikaanse imagerdisplay (figuur 1E). Een bolus van 20 μL tumorcellen werd vervolgens in de alvleesklier geïnjecteerd (figuur 1F) en na 10 s werd de naald ingetrokken. Relevante acties om de terugslag van cellen en hun daaropvolgende lekkage in de peritoneale holte te voorkomen, werden nagestreefd, zoals het uitoefenen van een constante druk tijdens de inenting, pauzeren na celinjectie en het gebruik van een dunne naald met een schuine hoek van 30 °. Na de door de VS geleide injectie werd het gewicht van muizen elke dag gecontroleerd om eventuele tekenen van stress als gevolg van de procedure te beoordelen. Er werd geen significante verandering in het gewicht van geïnjecteerde muizen waargenomen.
3D US imaging werd vervolgens toegepast om tumorceltransplantatie en tumorontwikkeling te volgen. De eerste beeldacquisitie werd uitgevoerd op dag 8 na celinjectie, gevolgd door wekelijkse acquisities (voor een totaal van 6 acquisities). Tijdens de beeldvorming werden de dieren op de rechterflank op het verwarmde (37 °C) platform geplaatst en verdoofd door inademing van isofluraangas (inductiedosis bij 4% en onderhoudsdosis bij 2%) (figuur 2). De 3D-acquisitie werd uitgevoerd in B-modus met behulp van de 3D-motor waarmee de transducer de buik in verschillende secties kan scannen, loodrecht op zijn as. Een reeks 2D-beelden werd verkregen, die vervolgens door de analysesoftware werden samengesteld en het 3D-anatomische beeld van het orgaan reconstrueerden (3D-re-rendering). Om 3D-beeldvorming uit te voeren, was het noodzakelijk om de ademfasen van de muis te synchroniseren met de verwerving van de 3D-scan. De reproduceerbaarheid van het protocol werd bevestigd door de aanwezigheid van de tumormassa, een hypo-echogene structuur (weergegeven met donkere kleuren) in de staart van de pancreas, vanaf dag 8, bij 16 van de 20 (80%) dieren (figuur 3A). Bij vier muizen (20% van de dieren) werd de ontwikkeling van tumormassa 2 weken na de injectie waargenomen. Deze latentie kan worden herleid tot een suboptimale procedure van naaldinbrenging in de alvleesklier, die lekkage van cellen in het peritoneum veroorzaakte.
Figuur 3B toont het gemiddelde tumorvolume (n = 16) geëvalueerd door Amerikaanse beeldvorming van het us-guided injection mouse model. De dag na de laatste Amerikaanse overname werden muizen eerst geëuthanaseerd door CO 2-inademing en vervolgens door cervicale dislocatie. De buikholte werd onderzocht en de tumormassa's werden geëxplanteerd voor histologische analyse (figuur 3C-E).
Figuur 1: Door de VS geleide methode voor het opstellen van een orthotopisch PCa-muismodel. (A) De muis wordt op de rechterflank geplaatst op een speciale steun die wordt verwarmd bij 37 °C. (B) De Amerikaanse transducer bevindt zich dwars op het dierlijke lichaam ter hoogte van de milt en de alvleesklier wordt gevisualiseerd in B-modus. Het flankaanzicht van de buik van de muis toont de alvleesklier (1) tussen de milt (2) en de linker nier (3). Weegschaalbalk: 2 mm. (C) De Hamilton-spuit wordt op de juiste houder geplaatst. (D) In deze situatie worden de transducer (2) en de spuit (1) onder een hoek van 45° geplaatst. (E) De naald van de spuit (1) wordt ingebracht in de staart van de alvleesklier, net onder de milt. Schaalbalk: 2 mm. (F) Een bolus met 1 x 106 PANC1-cellen in 20 μL PBS wordt in de staart van de alvleesklier geïnjecteerd met behulp van een Hamilton-spuit met een naald van 28 G. Schaalbalk: 2 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Beeldvormingswerkstation dat wordt gebruikt voor het monitoren van pancreastumoren bij muizen. (A) Werkplek voor Amerikaanse beeldvorming. (1) 55 MHz transducer; (2) Muis handling tabel; (3) 3D-motor; (4) Hoogte controle knop van de Amerikaanse transducer. (B) De muis wordt op zijn rechterflank op de behandeltafel geplaatst met zijn snuit in de verdovingsbuis (1), de huid wordt uitgerekt en de Amerikaanse gel wordt op de rechterflank aangebracht. (C) De transducer wordt neergelaten om de huid van de muis aan te raken en dwars op het lichaam van het dier geplaatst. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Ontwikkeling van orthotopisch PCa xenograft in de alvleesklier van de muis. (A) 2D US beeldacquisitie van de tumormassa ontwikkeld na echogeleide celinjectie. De ontwikkeling van de tumor wordt gevolgd met Amerikaanse beeldvorming na 8 dagen celinjectie, gevolgd door eenmaal per week acquisitie tot dag 44, voor een totaal van 6 acquisities. De tumor wordt vertegenwoordigd door een hypo-echogene structuur in het pancreasparenchym. De hypo-echogene structuur wordt echografisch weergegeven door een gebied met echo's van verminderde intensiteit, vergeleken met het omringende parenchym of een naburige structuur. Schaalbalk: 2 mm. (B) Tijdsverloop van het tumorvolume van orthotopische PDAC afgeleid van PANC1-cellen. (C) Amerikaanse beeldvormingsverwerving van een tumormassa op dag 43 na celinjectie. Schaalbalk: 2 mm.3D de tumormassa opnieuw wordt weergegeven in de inzet. (D) Na beeldvorming worden de dieren geëuthanaseerd en wordt obductieonderzoek uitgevoerd. (1) Tumormassa; (2) Een klein deel van een gezonde alvleesklier; (3) Milt; (4) Maag; (5) Lever. Schaalbalk: 5 mm. (E) Hematoxyline en eosinekleuring van de tumormassa bij 4x vergroting. Schaalbalk: 200 μm. Aan de rechterkant van het paneel, inzet van de tumormassa waarin pancreasacinaire cellen nog zichtbaar zijn; 40x vergroting. Schaalbalk: 100 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hoewel het gebruik van Amerikaanse beeldvorming wijdverspreid is in de kliniek, wordt tumorontwikkeling in veel preklinische muismodellen meestal beschreven met behulp van bioluminescente beeldvorming11. Dit laatste is een indirecte manier om tumortransplantatie en -expansie te evalueren en het biedt ook geen betrouwbare tumorgroeikinetiek. In de huidige studie hebben we Amerikaanse beeldvorming toegepast voor het uitvoeren van celinjectie en voor het monitoren van tumorontwikkeling. Het protocol dat we hebben beschreven en de resultaten die we hebben verstrekt, vertegenwoordigen een relevante doorbraak in PCa-onderzoek.
De door de VS geleide methode die hier wordt beschreven voor de injectie van pancreastumorcellen is minimaal invasief en maakt het mogelijk om veel nadelen te overwinnen die worden veroorzaakt door de chirurgische procedure, die meestal wordt toegepast om een orthotopisch PCa-muismodel vast te stellen. Hoewel indicaties over het sterftecijfer of bijwerkingen als gevolg van de chirurgische ingreep ontbreken in de literatuur, suggereert onze ervaring dat de chirurgische methode in een laag percentage van de gevallen een hogere postoperatieve mortaliteit produceert (ongeveer 10%), met frequent dierenleed, waarvoor een bepaalde hoeveelheid hersteltijd nodig is12. Bovendien verhinderen de hechtingen die na de operatie worden aangebracht de juiste toepassing van beeldvormingsprocedures. Dit resulteert in de verwerving van Amerikaanse afbeeldingen met een zeer slechte kwaliteit, wat leidt tot onnauwkeurige gegevensextrapolatie veroorzaakt door artefacten, zoals galm en schaduwgebieden. Rekening houdend met al deze feiten, heeft een methode die geen chirurgische ingreep nodig heeft voor het opzetten van een orthotopisch muismodel de voorkeur en wordt sterk aanbevolen voor preklinische onderzoeksdoeleinden. Bovendien is de hersteltijd van celinenting, omdat het minimaal invasief is, sneller en is het dierenleed minimaal in de door de VS geleide methode. Een groot voordeel is dat de door de VS geleide methode compatibel is met het gebruik van isofluraan-anesthesie die snellere inductie en herstel mogelijk maakt, relatief minder spaarzaam effect op de cardiovasculaire functie en cerebrale bloedstroomautoregulatie, in vergelijking met andere methoden van anesthesie (d.w.z. ketamine / xylazine-oplossing). Over het algemeen maakt het verwaarloosbare metabolisme van isofluraan het bijzonder nuttig bij anesthesiebeheer13. Inderdaad, ongeveer 5 minuten na het einde van de procedure krijgen dieren voldoende bewustzijn om sternale lighouding te behouden. Bovendien worden muizen vooraf behandeld met een analgeticum (carprofen) om pijn te minimaliseren en zijn er geen postoperatieve behandelingen nodig vanwege het snelle en volledige herstel.
Niettemin zijn er enkele cruciale stappen voor probleemoplossing in de procedure die moeten worden overwogen. Het aantal te enten cellen mag niet groter zijn dan 1 x 106 cellen en het volume van het entmateriaal mag niet groter zijn dan 20 μL om het risico van cellekkage uit de alvleesklier te voorkomen. Celinjectie moet onmiddellijk na hun loslating worden uitgevoerd om een afname van de celvitaliteit te voorkomen. Na celinjectie is het noodzakelijk om minstens 10 s te wachten voordat u de naald verwijdert om het lekken van cellen uit de pancreas te voorkomen.
Een van de meest kritische aspecten van het huidige protocol betreft de positionering van de muis op het dierenplatform. De muis moet op zijn rechterzij op de tafel liggen en de huid moet worden uitgerekt. Als de huid niet goed wordt uitgerekt tijdens de injectie, zal de naald moeite hebben om de alvleesklier te doorboren en binnen te dringen, met het risico dat cellen uit de alvleesklier morsen. De echogeleide injectie om een PCa-muismodel te produceren werd voor het eerst beschreven door Huynh et al. in 201114. Hier hebben we ons gericht op de methodologie die geschikt is om een dergelijk model te produceren, waarbij we in detail alle stappen beschrijven om het reproduceerbaar te maken. Bovendien hebben we, in vergelijking met Huynh et al.14, enkele innovaties geïntroduceerd die voornamelijk verband houden met de vooruitgang in de Amerikaanse technologie die zich in de afgelopen 5 jaar heeft voorgedaan. In het huidige protocol wordt het gebruik van een Hamilton-spuit met een stijve naald en een schuine hoek van 30° sterk aanbevolen om een betere nauwkeurigheid te verkrijgen tijdens celinjectie en om cellekkage te minimaliseren. Ten slotte werden tijdens de door de VS geleide injectie muizen aan de rechterkant op het dierenplatform bevestigd, terwijl in Huynh et al.14 muizen in dorsale lighouding werden geplaatst. De zijpositie van de muis maakt het mogelijk om de staart van de alvleesklier te visualiseren, net onder de milt, die fungeert als een visuele referentie (figuur 1B) tijdens de celinjectie, waardoor de reproduceerbaarheid van de techniek wordt gewaarborgd.
Net als bij andere technieken zijn er ook enkele beperkingen met de door de VS geleide procedure. De grootste beperking is dat de injectie alleen in de staart van de alvleesklier kan worden uitgevoerd, omdat het lichaam en het hoofd bedekt zijn door andere organen en moeilijk te bereiken zijn met de naald. Bovendien is een andere beperking die verband houdt met het gebruik van Amerikaanse beeldvorming om tumorgroei te volgen, het onvermogen om de hele tumormassa te visualiseren wanneer deze te groot wordt, na 6 weken inenting (figuur 3C-E). Hoewel dergelijke grote volumes het klinische verloop van de ziekte niet nabootsen.
Een ander voordeel van het PCa-model verkregen met het hier beschreven protocol is de langzame celtransplantatie en groei van de tumormassa's (figuur 3B). Dit is ideaal voor een nauwkeurige identificatie van het startpunt voor farmacologische interventie en een betere monitoring van de effecten van therapeutische interventies in de loop van de tijd.
Ten slotte is de beschreven techniek een voorbeeld van de implementatie van de 3V-principes met betrekking tot de verfijning van de techniek en de ontwikkeling van procedures die pijn, lijden, angst of blijvende schade minimaliseren, waardoor het welzijn van de dieren in onderzoek direct wordt verbeterd.
Toekomstige toepassingen van het PCa-model verkregen door de door de VS geleide injectie omvatten studies gericht op de ontwikkeling van geschikte therapeutische behandelingen of behandelingscombinaties. In feite zou het gebruik van dergelijke innovatieve in vivo technieken kunnen worden gekoppeld aan het gebruik van kleine moleculen, bijvoorbeeld antilichamen, antilichaamfragmenten en antilichaam-geneesmiddelconjugaten (ADC), met een theragnostische benadering. Dit laatste kan alleen worden gebruikt, voor therapeutische doeleinden, zoals onze groep heeft aangetoond in ons recente werk15 of na een goede fluorofoorconjugatie, met als doel de tumorgroei te volgen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC, subsidie nr. 15627, IG 21510 en IG 19766) aan AA, PRIN Italiaans Ministerie van Universiteit en Onderzoek (MIUR). Leveraging basic knowledge of ion channel network in cancer for innovative therapeutic strategies (LIONESS) 20174TB8KW to AA, pHioniC: European Union's Horizon 2020 grant No 813834 to AA. CD werd ondersteund door een AIRC-beurs voor Italië ID 24020.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm Petri dish | Sarstedt, Germany | P5856 | |
| 3D-Mode package | Visualsonics Fujifilm, Italy | Includes the 3D Motor; necessary for volumetric imaging | |
| Aquasonic 100, Sonypack 5 lt Ultrasound Transmission Gel | PARKER LABORATORIES, INC. | 150 | Gel for ultrasound |
| Athymic Mice (Nude-Foxn1nu) | ENVIGO, Italy | 69 | 20 females, 8 weeks old, Athymic Nude-Foxn1nu, 20-22 g body weight |
| CO2 Incubator Function Line | Heraeus Instruments, Germany | BB16-ICN2 | |
| Display of ECG, Respiration Waveform and body temperature | Visualsonics Fujifilm, Italy | 11426 | |
| DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) | Euroclone Spa, Italy | ECM0101L | |
| DPBS (Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline) | Euroclone Spa, Italy | ECB4004L | |
| Eppendorf (1.5mL) | Sarstedt, Germany | 72.690.001 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Euroclone Spa, Italy | ECS0170L | |
| Hamilton Needle Pointstyle 4, lenght 30 mm, 28 Gauge | Permax S.r.l., Italy | 7803-02 | |
| Hamilton Syringe 705RM 50 µL | Permax S.r.l., Italy | 7637-01 | |
| Isoflo (250 mL) | Ecuphar | 7081219 | |
| L-glutamine 100X | Euroclone Spa, Italy | ECB3000D | |
| Mouse Handling table II | Visualsonics Fujifilm, Italy | 50249 | |
| MX550D: 55 MHz MX Series Transducer | Visualsonics Fujifilm, Italy | 51069 | Ultrasound Transducers |
| Oxygen/isofluorane mixer | Angelo Franceschini S.r.l. | LFY-I-5A | |
| PANC1 cell line | American Type Culture Collection (ATCC), USA | CRL-1469 | |
| Rimadyl (carprofen) | Pfizer | 11319 | 20 mL, injection solution |
| Trypsin-EDTA 1X in PBS | Euroclone Spa, Italy | ECB3052D | |
| Vet ointment for eyes, Systane nighttime | Alcon | 509/28555-1 | |
| Vevo Compact Dual Anesthesia System (Tabletop Version) | Visualsonics Fujifilm, Italy | VS-12055 | complete with gas chamber |
| Vevo Imaging Station 2 | Visualsonics Fujifilm, Italy | VS-11983 | Imaging WorkStation 1 plus Imaging Station Extension with injection mount |
| Vevo Lab | Visualsonics Fujifilm, Italy | VS-20034 | Data Analysis Software |
| Vevo LAZR-X Photoacoustic Imaging System | Visualsonics Fujifilm, Italy | VS-20054 | Includes analytic software package for B-mode |
| Vevo Photoacoustic Enclosure | Visualsonics Fujifilm, Italy | 53157 |
References
- Zeng, S., et al.
- Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).
- Rahib, L., et al. Projecting cancer incidence and deaths to 2030: The unexpected burden of thyroid, liver, and pancreas cancers in the united states. Cancer Research. 74 (11), 2913-2921 (2014).
- Rawla, P., Sunkara, T., Gaduputi, V. Epidemiology of pancreatic cancer: Global trends, etiology and risk factors. World Journal of Oncology. 10 (1), 10 (2019).
- Herreros-Villanueva, M., Hijona, E., Cosme, A., Bujanda, L.
- Hofschroer, V., et al. Ion channels orchestrate pancreatic ductal adenocarcinoma progression and therapy. Frontiers in Pharmacology. 11, 586599 (2021).
- Adamska, A., Domenichini, A., Falasca, M. Pancreatic ductal adenocarcinoma: Current and evolving therapies. International Journal of Molecular Sciences. 18 (7), 1338 (2017).
- Qiu, W., Su, G. H. Development of orthotopic pancreatic tumor mouse models. Methods in Molecular Biology. 980, 215-223 (2013).
- Killion, J. J., Radinsky, R., Fidler, I. J. Orthotopic models are necessary to predict therapy of transplantable tumors in mice. Cancer Metastasis Reviews. 17 (3), 279-284 (1998).
- Qiu, W., Su, G. H. Challenges and advances in mouse modeling for human pancreatic tumorigenesis and metastasis. Cancer and Metastasis Reviews. 32 (1-2), 83-107 (2013).
- Erstad, D. J., et al. Orthotopic and heterotopic murine models of pancreatic cancer and their different responses to FOLFIRINOX chemotherapy. DMM Disease Models and Mechanisms. 11 (7), (2018).
- Lottini, T., et al. Micro-ultrasound, non-linear contrast mode with microbubbles and Optical Flow software tool: together for a new translational method in the study of the tumoral rheology microenvironment. WMIC 2017: Imaging the Future from Molecules to Medicine. , (2017).
- Ludders, J. W. Advantages and guidelines for using isoflurane. The Veterinary Clinics of North America Small Animal Practice. 22 (2), 328-331 (1992).
- Huynh, S., et al. Development of an orthotopic human pancreatic cancer xenograft model using ultrasound guided injection of cells. PLoS One. 6 (5), 20330 (2011).
- Duranti, C., et al. Harnessing the hERG1/β1 Integrin Complex via a Novel Bispecific Single-chain Antibody: An Effective Strategy against Solid Cancers. Molecular Cancer Therapeutics. 20 (8), 1338-1349 (2021).
