Summary
نقدم بروتوكولا لإنشاء نموذج سرطان البنكرياس التقويمي طفيف التوغل عن طريق الحقن الموجه بالموجات فوق الصوتية لخلايا سرطان البنكرياس البشرية والمراقبة اللاحقة لنمو الورم في الجسم الحي عن طريق التصوير بالموجات فوق الصوتية.
Abstract
يمثل سرطان البنكرياس (PCa) أحد أكثر أنواع السرطان فتكا في جميع أنحاء العالم. تعتمد أسباب الورم الخبيث PCa بشكل أساسي على سلوكه الخبيث الجوهري ومقاومته العالية للعلاجات العلاجية. في الواقع ، على الرغم من العديد من الجهود ، فشل كل من العلاج الكيميائي القياسي والعلاجات المستهدفة المبتكرة بشكل كبير عند الانتقال من التقييم قبل السريري إلى الإعداد السريري. في هذا السيناريو ، هناك حاجة ماسة إلى تطوير نماذج الفئران قبل السريرية التي تحاكي بشكل أفضل خصائص PCa في الجسم الحي لاختبار الأدوية المطورة حديثا. يصف البروتوكول الحالي طريقة لتوليد نموذج فأر من PCa ، يمثله طعم أجنبي تقويمي يتم الحصول عليه عن طريق الحقن الموجه بالموجات فوق الصوتية لخلايا ورم البنكرياس البشري. باستخدام مثل هذا البروتوكول الموثوق به والأقل بضعا ، نقدم أيضا دليلا على التطعيمات في الجسم الحي وتطور كتل الورم ، والتي يمكن مراقبتها عن طريق التصوير بالموجات فوق الصوتية (الولايات المتحدة). أحد الجوانب الجديرة بالملاحظة في نموذج PCa الموصوف هنا هو التطور البطيء لكتل الورم بمرور الوقت ، مما يسمح بتحديد دقيق لنقطة البداية للعلاجات الدوائية ومراقبة أفضل لآثار التدخلات العلاجية. علاوة على ذلك ، فإن التقنية الموضحة هنا هي مثال على تنفيذ مبادئ 3Rs لأنها تقلل من الألم والمعاناة وتحسن بشكل مباشر رفاهية الحيوانات في البحث.
Introduction
يعد PCa ، وشكله الأكثر شيوعا ، سرطان البنكرياس القنوي (PDAC) ، أحد أكثر أسباب الوفاة المرتبطة بالسرطان شيوعا مع معدل بقاء لمدة عام واحد أقل من 20٪ ومعدل بقاء لمدة 5 سنوات يبلغ 8٪ ، بغض النظر عن المرحلة 1,2. يكون المرض مميتا دائما تقريبا ، ومن المتوقع أن ينمو حدوثه باستمرار في السنوات القادمة ، على عكس أنواع السرطان الأخرى ، التي ينخفض معدل حدوثها3. عوامل مثل الكشف المتأخر عن السرطان ، وميل التقدم السريع ، وعدم وجود علاجات محددة تؤدي إلى سوء تشخيص PCa4. تم الحصول على تقدم كبير في أبحاث السرطان ، وذلك بفضل تطوير نماذج أكثر دقة للفئران قبل السريرية. قدمت النماذج رؤى مناسبة لفهم الآلية الجزيئية الكامنة وراء السرطان وتطوير علاجات جديدة5. تنطبق هذه التطورات بشكل سيئ على PCa ، والتي ، على الرغم من الجهود الكبيرة الأخيرة ، لا تزال مقاومة للعلاجات الكيميائية الحالية1. لهذه الأسباب ، فإن تطوير مناهج جديدة لتحسين آفاق المرضى أمر إلزامي.
على مر السنين ، تم تطوير العديد من نماذج الماوس PCa ، بما في ذلك xenografts ، والتي هي النماذج الأكثر استخداما في الوقت الحاضر5. تصنف نماذج Xenograft على أنها غير متجانسة تحت الجلد وتقويم العظام ، اعتمادا على موقع الخلايا السرطانية المزروعة. الطعوم الخارجية غير المتجانسة تحت الجلد أسهل وأرخص في تحقيقها ولكنها تفتقد بعض السمات المميزة ل PCa (أي البيئة المكروية للورم الغريبة ، والتي تتميز بتراكم الأنسجة الليفية ، ونقص الأكسجة ، والحموضة ، وتكوين الأوعية)6,7. وهذا ما يفسر سبب فشل الطعوم الخارجية تحت الجلد في كثير من الأحيان في توفير بيانات قوية للعلاجات العلاجية مما يؤدي إلى الفشل عند ترجمتها إلى الإعداد السريري8. من ناحية أخرى ، تشبه الطعوم الخارجية التقويمية البيئة المكروية للورم عن كثب ، مما يؤدي إلى محاكاة أفضل للتطور الطبيعي للمرض. بالإضافة إلى ذلك ، تعتبر الطعوم الخارجية التقويمية أكثر ملاءمة لدراسة العملية النقيلية والسمات الغازية ل PCa ، والتي لا تحدث تقريبا في النماذج تحت الجلد9. بشكل عام ، تفضل نماذج فأر xenograft التقويمية في الوقت الحاضر لإجراء اختبار المخدرات قبل السريري 9,10. عادة ما تعتمد الطعوم الخارجية التقويمية على الإجراءات الجراحية لزرع خلايا أو قطع صغيرة جدا من أنسجة الورم في البنكرياس. في الواقع ، تم نشر العديد من الأوراق البحثية القائمة على النماذج الجراحية ل PCa في العقود القليلة الماضية11. ومع ذلك ، فإن جودة ونتائج الإجراء الجراحي لإنشاء نموذج ورم تقويمي تعتمد بشدة على المهارة الفنية للمشغل. نقطة رئيسية أخرى لنجاح تقويم العظام PCa xenograft لنهج سريري متعدية هي إمكانية إنشاء مرض موضعي مع حركية نمو يمكن التنبؤ بها.
لمعالجة هذه المشكلات ، نصف هنا إجراء مبتكرا لإنتاج طعم أجنبي PCa تقويمي ، مستغلا الحقن الموجه بالموجات فوق الصوتية (الولايات المتحدة) لخلايا PCa البشرية في ذيل البنكرياس في الفئران التي تعاني من نقص المناعة. يقوم هذا الإجراء بإنشاء نموذج ماوس PCa موثوق. يتبع نمو الورم في الجسم الحي التصوير الأمريكي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
حصل البروتوكول الحالي على موافقة من وزارة الصحة الإيطالية برقم ترخيص 843/2020-PR. من أجل ضمان ظروف معقمة ، تم الاحتفاظ بالحيوانات داخل غرفة الحاجز في حظيرة البحث (Ce.S.A.L.) بجامعة فلورنسا. تم تنفيذ جميع الإجراءات في نفس المكان الذي تم فيه إيواء الفئران في منشأة LIGeMA بجامعة فلورنسا (إيطاليا).
1. إعداد الخلية
- خلايا PCa المزروعة من خط خلايا PCa في طبق بتري 100 مم يحتوي على وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) المكمل ب 2٪ L-glutamine و 10٪ مصل الأبقار الجنينية (FBS).
- احتضان الخلايا في normoxia عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.
- افصل الخلايا بالتربسين. عد ، وأعد تعليق 1 × 106 خلايا في 20 ميكرولتر من PBS ، 1 ساعة قبل التلقيح.
2. إعداد الماوس للحقن الموجه بالموجات فوق الصوتية (US-GI)
ملاحظة: تم تنفيذ الخطوات التالية تحت ظروف معقمة. يستغرق الإجراء الكامل للحقن الموجه من الولايات المتحدة ، من بداية التخدير حتى إزالة الماوس من منصة الحيوان ، حوالي 10-12 دقيقة بالإضافة إلى 5 دقائق لاستعادة الفئران بالكامل.
- قبل التدخل مباشرة، يتم تطبيق كاربروفين (NSAID) تحت الجلد (s.c.) بجرعة نهائية مقدارها 5 ملغ/ كغ أو ترامادول بجرعة نهائية مقدارها 5 ملغ/ كغ باستخدام حقنة السل بإبرة عيار 27 غ.
ملاحظة: بالنسبة للبروتوكول الحالي ، تم استخدام 20 أنثى من أنثى Athymic Nude-Foxn1nu . كان عمر الفئران 8 أسابيع ووزنها 20-22 جم. - قم بتشغيل جهاز التصوير وحدد الماوس (صغير) البطن في قائمة التطبيق من لوحة محول الطاقة. تأكد من ظهور نافذة التصوير B-Mode (وضع السطوع) ، وأن النظام جاهز للحصول على بيانات B-Mode.
ملاحظة: B-Mode هو وضع التصوير الافتراضي للنظام. يعرض النظام الأصداء في عرض ثنائي الأبعاد (2D) من خلال تعيين مستوى سطوع بناء على سعة إشارة الصدى. B-Mode هو الوضع الأكثر فعالية لتحديد الهياكل التشريحية.- انتقل إلى متصفح الدراسة.
- حدد دراسة جديدة واكتب اسم الدراسة ومعلوماتها ، أي تاريخ الدراسة ، إلخ.
- املأ جميع المعلومات الضرورية في اسم السلسلة ، أي سلالة الحيوان ، والمعرف ، وتاريخ الميلاد ، وما إلى ذلك.
- اضغط على تم; البرنامج جاهز للتصوير في الوضع B.
- تخدير الفأر في غرفة التخدير الحثي باستخدام 4٪ إيزوفلوران مع تدفق غاز 2 لتر / دقيقة من O2.
ملاحظة: حوالي 4 دقائق كافية للتخدير المناسب (التنفس حوالي 50-60 نفسا في الدقيقة). - بمجرد تخدير الماوس ، قم بتغيير اتصال آلة التخدير لتوجيه الأيزوفلوران نحو طاولة مناولة الماوس.
- ضع الفأر المخدر على جانبه الأيمن على طاولة المناولة (يتم تسخينه عند 37 درجة مئوية) مع خطمه في مخروط الأنف لضمان تخدير الماوس باستخدام 2٪ إيزوفلوران مع تدفق غاز 0.8 لتر / دقيقة من O2 (الشكل 1 أ).
- ضع قطرة من الدموع الاصطناعية على عيون الفأر لمنع الجفاف أثناء التخدير.
- قم بلصق اليد اليمنى والقدم اليمنى والذيل بإحكام على وسادات القطب على منصة الحيوان بشاش لاصق.
ملاحظة: يتم تسجيل معدل تنفس الماوس ومخطط كهربية القلب (ECG) من خلال وسادات القطب الكهربائي.
3. حقن خلايا PANC1 في البنكرياس بطريقة US-GI
- تعقيم جلد الفأر مع 70 ٪ من الإيثانول والحفاظ على جلد الجناح الأيسر ممتدة باستخدام الشاش اللاصق.
ملاحظة: الحفاظ على تمدد الجلد مهم لتقليل مقاومة إدخال الإبرة ومنع تشوهات الإبرة. - ضع جل الموجات فوق الصوتية على البطن والجناح الأيسر للفأر باستخدام حقنة سعة 20 مل (بدون الإبرة).
- باستخدام مقبض التحكم في الارتفاع لمحول الطاقة الأمريكي ، قم بخفض محول الطاقة للمس الجانب الأيسر من الماوس ووضعه بشكل عرضي على جسم الحيوان.
- حرك الترجام لتصور البنكرياس على شاشة الترجام باستخدام تصوير B-Mode (الشكل 1B).
- قم بإعداد حقنة هاملتون سعة 50 ميكرولتر ، تحتوي على 1 × 106 خلايا PANC1 معلقة في 20 ميكرولتر من PBS ، بإبرة 30 مم 28 جم ووضع المحقنة على الحامل المناسب (الشكل 1C).
ملاحظة: قبل الاستخدام ، قم بتعقيم إبرة المحقنة بنسبة 70٪ من الإيثانول لمدة 5-10 دقائق. - باستخدام الحامل micromanipulator ، قم بخفض المحقنة إلى جلد الماوس ، مع وجه شطبة الإبرة لأعلى وفي نفس مستوى محول الطاقة بالموجات فوق الصوتية ، لتشكيل زاوية 45 درجة مع محول الطاقة (الشكل 1D).
ملاحظة: من هذه الخطوة فصاعدا ، تابع من خلال مراقبة صورة الولايات المتحدة على الشاشة. - باستخدام micromanipulator ، قم بثقب الجلد وأدخل إبرة المحقنة في البنكرياس ولاحظ الصورة الأمريكية على الشاشة ، لمتابعة مسارها (الشكل 1E).
ملاحظة: قبل الحقن ، خذ ذيل البنكرياس كمرجع يقع خلف الطحال وقريب من الكلية اليسرى. - بمجرد إدخال الإبرة في البنكرياس ، قم بحقن بلعة 20 ميكرولتر تحتوي على الخلايا مباشرة في البنكرياس عن طريق الضغط المستمر على مكبس المحقنة (الشكل 1F).
ملاحظة: يتم فحص إجراء الحقن الصحيح من خلال وجود فقاعة صغيرة في البنكرياس وتدفق السائل الناقص المنشأ ، والذي بالكاد يمكن رؤيته من طرف الإبرة. - اترك الإبرة في مكانها لمدة 5-10 ثوان بعد حقن البلعة بأكملها ، ثم اسحبها ببطء.
- قم بإزالة محول الطاقة الأمريكي ، ونظف الجل من الجناح ، وضع الماوس بمفرده في قفص جديد. راقب الحيوان حتى يستعيد وعيه الكافي للحفاظ على الاستلقاء القصي.
4.3D التصوير الأمريكي لمراقبة أورام البنكرياس في الفئران
ملاحظة: تم إجراء تقييم تطور الورم بدءا من 8 أيام بعد حقن الخلايا ، باستخدام نفس الأداة المستخدمة في الحقن الموجه من الولايات المتحدة (المدرجة في جدول المواد). ومن ثم ، فإن بعض الإجراءات ، مثل اشتعال النظام (الخطوة 2.2) ، والتخدير (الخطوات 2.3. - 2.6) ، ووضع الماوس على منصة الحيوان (الخطوة 2.7.) ، تتطابق تماما مع ما تم وصفه أعلاه في البروتوكول.
- قبل بدء التصوير في الولايات المتحدة ، قم بإعداد محطة العمل كما هو موضح في الشكل 2 أ.
- إصلاح محول الطاقة على نظام المحرك 3D (الشكل 2A).
- قم بتشغيل المصور وحدد دراسة جديدة على متصفح الدراسة.
- ضع الماوس في غرفة تحريض التخدير (4٪ إيزوفلوران).
- ضع الفأر المخدر على جانبه الأيمن على طاولة المناولة ساخنة عند 37 درجة مئوية مع خطمها في أنبوب التخدير وتقليل الأيزوفلوران إلى 2٪ (الشكل 2 ب).
ملاحظة: من المهم أن يتم وضع الماوس في نفس وضع الحقن الموجه من الولايات المتحدة ، للحفاظ على نفس المراجع التشريحية. - ضع قطرة من مرهم الطبيب البيطري على عيون الماوس.
- ضع طبقة من هلام الموجات فوق الصوتية على بطن الفأر والخاصرة اليسرى.
- ضع محول الطاقة 55 ميجاهرتز في الاتجاه العرضي للمس جلد الجناح الأيسر بحيث يكون البنكرياس متمركزا تقريبا (الشكل 2C).
- استخدم محرك 3D للحصول على صور للبنكرياس بأكمله في الاتجاه العرضي ، وجمع 90-100 إطار لكل عملية اكتساب (قد يختلف عدد الإطارات حسب الاختيار الشخصي).
- حدد موضع محرك 3D على لوحة اللمس الخاصة بالتصوير.
- أشر إلى مسافة المسح عن طريق تحريك المؤشر للحصول على صور للبنكرياس بأكمله من كلا الطرفين.
- حدد إطارات المسح الضوئي وابدأ اكتساب 3D.
- بمجرد الانتهاء من التصوير 3D ، قم بإزالة محول الطاقة ، وتنظيف الجل من الجلد ، ووضع الماوس وحده في قفص جديد للتعافي. راقب الحيوان حتى يستعيد وعيه الكافي للحفاظ على الاستلقاء القصي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
باتباع البروتوكول الموصوف أعلاه ، تم تخدير الفئران أولا في غرفة إيزوفلوران ، ووضعها على منصة الحيوان (الشكل 1 أ). تم تصوير البنكرياس بالتصوير بالموجات فوق الصوتية (الشكل 1 ب). تم تحميل حقنة هاملتون سعة 50 ميكرولتر بخلايا 1 × 106 PANC1 معلقة في 20 ميكرولتر من PBS ووضعها على حامل الإبرة (الشكل 1C). كانت الزاوية المثلى بين المحقنة ومحول الطاقة الأمريكي 45 درجة (الشكل 1 د). باستخدام micromanipulator ، تم إدخال إبرة الحقنة في البنكرياس ولوحظ مسارها على شاشة التصوير الأمريكية (الشكل 1E). ثم تم حقن بلعة 20 ميكرولتر من الخلايا السرطانية في البنكرياس (الشكل 1F) وبعد 10 ثوان تم سحب الإبرة. تم اتباع الإجراءات ذات الصلة لمنع ارتداد الخلايا وتسربها اللاحق إلى التجويف البريتوني ، مثل تطبيق ضغط ثابت أثناء التلقيح ، والتوقف بعد حقن الخلايا ، واستخدام إبرة رفيعة بزاوية شطبة 30 درجة. بعد الحقن الموجه من الولايات المتحدة ، تمت مراقبة وزن الفئران كل يوم لتقييم أي علامات إجهاد بسبب الإجراء. لم يلاحظ أي تغيير كبير في وزن الفئران المحقونة.
ثم تم تطبيق التصوير الأمريكي 3D لمراقبة تطعيم الخلايا السرطانية وتطور الورم. تم إجراء أول عملية اقتناء للصورة في اليوم 8 بعد حقن الخلايا ، تليها عمليات اكتساب أسبوعية (لما مجموعه 6 عمليات استحواذ). أثناء التصوير ، تم وضع الحيوانات على الجانب الأيمن على المنصة الدافئة (37 درجة مئوية) وتخديرها عن طريق استنشاق غاز الأيزوفلوران (جرعة الحث عند 4٪ وجرعة الصيانة عند 2٪) (الشكل 2). تم إجراء الاستحواذ ثلاثي الأبعاد في الوضع B باستخدام محرك ثلاثي الأبعاد يسمح لمحول الطاقة بمسح البطن في أقسام مختلفة ، عموديا على محوره. تم الحصول على سلسلة من الصور ثنائية الأبعاد ، والتي تم تجميعها بعد ذلك بواسطة برنامج التحليل ، وإعادة بناء الصورة التشريحية ثلاثية الأبعاد للجهاز (إعادة تقديم 3D). لإجراء التصوير ثلاثي الأبعاد ، كان من الضروري مزامنة مراحل تنفس الماوس مع الحصول على الفحص ثلاثي الأبعاد. تم تأكيد استنساخ البروتوكول من خلال وجود كتلة الورم ، وهي بنية ناقصة المنشأ (ممثلة بألوان داكنة) في ذيل البنكرياس ، بدءا من اليوم 8 ، في 16 من أصل 20 (80 ٪) من الحيوانات (الشكل 3 أ). في أربعة فئران (20 ٪ من الحيوانات) ، لوحظ تطور كتلة الورم بعد أسبوعين من الحقن. يمكن إرجاع هذا الكمون إلى إجراء دون المستوى الأمثل لإدخال الإبرة في البنكرياس ، مما تسبب في تسرب الخلايا إلى الصفاق.
يوضح الشكل 3B متوسط حجم الورم (n = 16) الذي تم تقييمه بواسطة التصوير الأمريكي لنموذج فأر الحقن الموجه من الولايات المتحدة. في اليوم التالي لآخر عملية استحواذ في الولايات المتحدة ، تم القتل الرحيم للفئران أولا عن طريق استنشاق CO2 ثم عن طريق خلع عنق الرحم. تم فحص تجويف البطن وزرع كتل الورم للتحليل النسيجي (الشكل 3C-E).
الشكل 1: طريقة موجهة من الولايات المتحدة لإنشاء نموذج فأر PCa تقويمي . (أ) يوضع الماوس على الجهة اليمنى على دعامة خاصة مسخنة عند 37 درجة مئوية. (ب) يقع محول الطاقة الأمريكي بشكل عرضي على جسم الحيوان على مستوى الطحال ويتم تصور البنكرياس في الوضع B. يظهر منظر الجناح لبطن الفأر البنكرياس (1) بين الطحال (2) والكلى اليسرى (3). شريط المقياس: 2 مم. (ج) يتم وضع حقنة هاملتون على الحامل المناسب. (د) في هذه الحالة، يوضع الترجام (2) والمحقنة (1) بزاوية مقدارها 45 درجة. ه: تدخل إبرة المحقنة (1) في ذيل البنكرياس، أسفل الطحال مباشرة. شريط المقياس: 2 مم. (F) يتم حقن بلعة تحتوي على 1 × 106 خلايا PANC1 في 20 ميكرولتر من PBS في ذيل البنكرياس ، باستخدام حقنة هاملتون بإبرة 28 جرام. شريط المقياس: 2 مم. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: محطة عمل التصوير المستخدمة لرصد أورام البنكرياس في الفئران . (أ) مكان العمل للتصوير في الولايات المتحدة. (1) محول 55 ميغاهيرتز ؛ (2) طاولة مناولة الماوس. (3) محرك ثلاثي الأبعاد ؛ (4) مقبض التحكم في الارتفاع لمحول الطاقة الأمريكي. (ب) يوضع الفأر على خاصرته اليمنى على طاولة المناولة مع وضع خطمه في أنبوب التخدير (1) ، ويتمدد الجلد ، ويوضع الجل الأمريكي على الجهة اليمنى. (ج) يخفض الترجام ليلمس جلد الفأر ويوضع بشكل عرضي مع جسم الحيوان. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: تطور الطعم الخارجي PCa التقويمي في بنكرياس الفأر . (أ) الحصول على صورة 2D الأمريكية لكتلة الورم التي تم تطويرها بعد حقن الخلايا الموجهة بالصدى. تتم مراقبة تطور الورم بالتصوير الأمريكي بعد 8 أيام من حقن الخلايا ، يليه اكتساب مرة واحدة في الأسبوع حتى اليوم 44 ، ليصبح المجموع 6 عمليات استحواذ. يتم تمثيل الورم بهيكل ناقص المنشأ في حمة البنكرياس. يتم تمثيل بنية hypo-echogenic بشكل صدى من قبل منطقة ذات أصداء ذات كثافة منخفضة ، مقارنة مع الحمة المحيطة أو بنية مجاورة. شريط المقياس: 2 مم. (ب) المسار الزمني لحجم الورم من PDAC التقويمي المشتق من خلايا PANC1. (ج) اكتساب التصوير الأمريكي لكتلة الورم في اليوم 43 بعد حقن الخلايا. شريط المقياس: 2 مم.3D تظهر إعادة تجسيد كتلة الورم في الجزء الداخلي. (د) بعد التصوير، يتم القتل الرحيم للحيوانات، ويتم إجراء فحص التشريح. (1) كتلة الورم. (2) جزء صغير من البنكرياس السليم. (3) الطحال. (4) المعدة. (5) الكبد. شريط المقياس: 5 مم. (ه) تلطيخ الهيماتوكسيلين ويوزين لكتلة الورم عند تكبير 4x. شريط المقياس: 200 ميكرومتر. على الجانب العلوي الأيمن من اللوحة ، أقحم كتلة الورم التي لا تزال فيها خلايا البنكرياس العنيبية مرئية ؛ تكبير 40x. شريط المقياس: 100 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
على الرغم من أن استخدام التصوير الأمريكي منتشر على نطاق واسع في العيادة ، إلا أن تطور الورم في العديد من نماذج الفئران قبل السريرية يوصف عادة باستخدام التصوير الحيوي11. هذا الأخير هو وسيلة غير مباشرة لتقييم التهاب الورم وتوسعه ، كما أنه لا يوفر حركية نمو الورم الموثوقة. في هذه الدراسة ، قمنا بتطبيق التصوير الأمريكي لإجراء حقن الخلايا وكذلك لمراقبة تطور الورم. يمثل البروتوكول الذي وصفناه والنتائج التي قدمناها طفرة ذات صلة في أبحاث PCa.
الطريقة الموجهة من الولايات المتحدة الموصوفة هنا لحقن خلايا ورم البنكرياس هي طفيفة التوغل وتسمح بالتغلب على العديد من العيوب الناجمة عن الإجراء الجراحي ، والتي يتم تطبيقها عادة لإنشاء نموذج فأر PCa تقويم العظام. على الرغم من أن المؤشرات على معدل الوفيات أو الآثار الجانبية بسبب الإجراء الجراحي مفقودة في الأدبيات ، إلا أن تجربتنا تشير إلى أن الطريقة الجراحية تنتج معدل وفيات أعلى بعد الجراحة في نسبة منخفضة من الحالات (حوالي 10٪) ، مع معاناة متكررة للحيوانات ، تتطلب قدرا معينا من وقت الشفاء12. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الغرز المطبقة بعد الجراحة تمنع التطبيق الصحيح لإجراءات التصوير. ينتج عن هذا الحصول على صور أمريكية بجودة رديئة للغاية ، مما يؤدي إلى استقراء بيانات غير دقيق ناتج عن القطع الأثرية ، مثل مناطق الصدى والظلال. مع أخذ كل هذه الحقائق في الاعتبار ، يفضل استخدام طريقة لا تحتاج إلى إجراء جراحي لإنشاء نموذج فأر تقويمي ويوصى به بشدة لأغراض البحث قبل السريري. علاوة على ذلك ، نظرا لكونها طفيفة التوغل ، فإن وقت التعافي من تلقيح الخلايا يكون أسرع ومعاناة الحيوانات ضئيلة في الطريقة الموجهة من الولايات المتحدة. ميزة كبيرة هي أن الطريقة الموجهة من الولايات المتحدة متوافقة مع استخدام تخدير إيزوفلوران الذي يسمح بتحريض وتعافي أسرع ، وتأثير أقل تجنيبا نسبيا على وظيفة القلب والأوعية الدموية والتنظيم الذاتي لتدفق الدم الدماغي ، مقارنة بطرق التخدير الأخرى (أي محلول الكيتامين / الزيلازين). بشكل عام ، فإن التمثيل الغذائي الضئيل للأيزوفلوران يجعله مفيدا بشكل خاص في إدارة التخدير13. في الواقع ، بعد حوالي 5 دقائق من نهاية الإجراء ، تستعيد الحيوانات وعيها الكافي للحفاظ على الاستلقاء القصي. بالإضافة إلى ذلك ، يتم علاج الفئران مسبقا باستخدام مسكن (كاربروفين) لتقليل الألم ، ولا توجد علاجات ضرورية بعد الجراحة بسبب الشفاء السريع والكامل.
ومع ذلك ، هناك بعض خطوات استكشاف الأخطاء وإصلاحها الحاسمة في الإجراء التي يجب مراعاتها. يجب ألا يتجاوز عدد الخلايا المراد تلقيحها 1 × 106 خلايا ويجب ألا يزيد حجم لقاح الخلية عن 20 ميكرولتر لتجنب خطر تسرب الخلايا من البنكرياس. يجب إجراء حقن الخلايا مباشرة بعد انفصالها ، لتجنب انخفاض حيوية الخلية. بعد حقن الخلايا ، من الضروري الانتظار لمدة 10 ثوان على الأقل قبل إزالة الإبرة لتجنب تسرب الخلايا من البنكرياس.
يتعلق أحد أهم جوانب البروتوكول الحالي بوضع الفأر على منصة الحيوان. يجب أن يكون الفأر مستلقيا على جانبه الأيمن على طاولة مناولة الحيوانات ويجب شد الجلد. إذا لم يتم شد الجلد بشكل صحيح أثناء الحقن ، فسوف تكافح الإبرة لاختراق البنكرياس ودخوله ، مع خطر تسرب الخلايا من البنكرياس. تم وصف الحقن الموجه بالموجات فوق الصوتية لإنتاج نموذج ماوس PCa لأول مرة بواسطة Huynh et al. في 201114. هنا ، ركزنا على المنهجية المناسبة لإنتاج مثل هذا النموذج ، ووصفنا بالتفصيل جميع الخطوات لجعله قابلا للتكرار. علاوة على ذلك ، مقارنة ب Huynh et al.14 ، قدمنا بعض الابتكارات المتعلقة بشكل أساسي بالتطورات في التكنولوجيا الأمريكية التي حدثت في آخر 5 سنوات. في البروتوكول الحالي ، يوصى بشدة باستخدام حقنة هاملتون بإبرة صلبة وزاوية شطبة تبلغ 30 درجة للحصول على دقة أفضل أثناء حقن الخلايا وتقليل تسرب الخلايا. أخيرا ، أثناء الحقن الموجه من الولايات المتحدة ، تم تثبيت الفئران على جانبها الأيمن على منصة الحيوان ، بينما في Huynh et al.14 تم وضع الفئران في الاستلقاء الظهري. يسمح الموضع الجانبي للماوس بتصور ذيل البنكرياس ، أسفل الطحال مباشرة ، والذي يعمل كمرجع مرئي (الشكل 1B) أثناء حقن الخلية ، مما يضمن استنساخ التقنية.
كما هو الحال مع التقنيات الأخرى ، هناك أيضا بعض القيود على الإجراء الموجه من الولايات المتحدة. القيد الأكبر هو أنه لا يمكن إجراء الحقن إلا في ذيل البنكرياس لأن الجسم والرأس مغطى بأعضاء أخرى ويصعب الوصول إليهما بالإبرة. علاوة على ذلك ، هناك قيد آخر مرتبط باستخدام التصوير الأمريكي لمراقبة نمو الورم وهو عدم القدرة على تصور كتلة الورم بأكملها عندما تصبح كبيرة جدا ، بعد 6 أسابيع من التلقيح (الشكل 3C-E). على الرغم من أن هذه الكميات الكبيرة لا تحاكي المسار السريري للمرض.
ميزة أخرى لنموذج PCa الذي تم الحصول عليه باستخدام البروتوكول الموصوف هنا هي بطء الخلايا ونمو كتل الورم (الشكل 3 ب). هذا مثالي لتحديد دقيق لنقطة البداية للتدخل الدوائي ومراقبة أفضل لآثار التدخلات العلاجية بمرور الوقت.
أخيرا ، تعد التقنية الموصوفة مثالا على تنفيذ مبادئ 3Rs التي تنطوي على تحسين التقنية وتطوير الإجراءات التي تقلل من الألم أو المعاناة أو الضيق أو الضرر الدائم ، مما يحسن بشكل مباشر رفاهية الحيوانات في البحث.
تشمل التطبيقات المستقبلية لنموذج PCa الذي تم الحصول عليه عن طريق الحقن الموجه من الولايات المتحدة دراسات تهدف إلى تطوير علاجات علاجية مناسبة أو مجموعات علاجية. في الواقع ، يمكن أن يقترن استخدام مثل هذه التقنيات المبتكرة في الجسم الحي باستخدام جزيئات صغيرة ، على سبيل المثال ، الأجسام المضادة ، وشظايا الأجسام المضادة ، واتحادات الأجسام المضادة والأدوية (ADC) ، مع نهج علاجي. يمكن استخدام هذا الأخير بمفرده ، لأغراض علاجية ، كما أظهرت مجموعتنا في عملنا الأخير15 أو بعد اقتران فلوروفور مناسب ، بهدف مراقبة نمو الورم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من قبل Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC ، المنحة رقم 15627 ، IG 21510 ، و IG 19766) إلى AA ، PRIN وزارة الجامعة والبحوث الإيطالية (MIUR). الاستفادة من المعرفة الأساسية لشبكة القنوات الأيونية في السرطان للاستراتيجيات العلاجية المبتكرة (LIONESS) 20174TB8KW إلى AA ، pHioniC: منحة الاتحاد الأوروبي Horizon 2020 No 813834 إلى AA. تم دعم CD من خلال زمالة AIRC لمعرف إيطاليا 24020.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm Petri dish | Sarstedt, Germany | P5856 | |
| 3D-Mode package | Visualsonics Fujifilm, Italy | Includes the 3D Motor; necessary for volumetric imaging | |
| Aquasonic 100, Sonypack 5 lt Ultrasound Transmission Gel | PARKER LABORATORIES, INC. | 150 | Gel for ultrasound |
| Athymic Mice (Nude-Foxn1nu) | ENVIGO, Italy | 69 | 20 females, 8 weeks old, Athymic Nude-Foxn1nu, 20-22 g body weight |
| CO2 Incubator Function Line | Heraeus Instruments, Germany | BB16-ICN2 | |
| Display of ECG, Respiration Waveform and body temperature | Visualsonics Fujifilm, Italy | 11426 | |
| DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) | Euroclone Spa, Italy | ECM0101L | |
| DPBS (Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline) | Euroclone Spa, Italy | ECB4004L | |
| Eppendorf (1.5mL) | Sarstedt, Germany | 72.690.001 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Euroclone Spa, Italy | ECS0170L | |
| Hamilton Needle Pointstyle 4, lenght 30 mm, 28 Gauge | Permax S.r.l., Italy | 7803-02 | |
| Hamilton Syringe 705RM 50 µL | Permax S.r.l., Italy | 7637-01 | |
| Isoflo (250 mL) | Ecuphar | 7081219 | |
| L-glutamine 100X | Euroclone Spa, Italy | ECB3000D | |
| Mouse Handling table II | Visualsonics Fujifilm, Italy | 50249 | |
| MX550D: 55 MHz MX Series Transducer | Visualsonics Fujifilm, Italy | 51069 | Ultrasound Transducers |
| Oxygen/isofluorane mixer | Angelo Franceschini S.r.l. | LFY-I-5A | |
| PANC1 cell line | American Type Culture Collection (ATCC), USA | CRL-1469 | |
| Rimadyl (carprofen) | Pfizer | 11319 | 20 mL, injection solution |
| Trypsin-EDTA 1X in PBS | Euroclone Spa, Italy | ECB3052D | |
| Vet ointment for eyes, Systane nighttime | Alcon | 509/28555-1 | |
| Vevo Compact Dual Anesthesia System (Tabletop Version) | Visualsonics Fujifilm, Italy | VS-12055 | complete with gas chamber |
| Vevo Imaging Station 2 | Visualsonics Fujifilm, Italy | VS-11983 | Imaging WorkStation 1 plus Imaging Station Extension with injection mount |
| Vevo Lab | Visualsonics Fujifilm, Italy | VS-20034 | Data Analysis Software |
| Vevo LAZR-X Photoacoustic Imaging System | Visualsonics Fujifilm, Italy | VS-20054 | Includes analytic software package for B-mode |
| Vevo Photoacoustic Enclosure | Visualsonics Fujifilm, Italy | 53157 |
References
- Zeng, S., et al.
- Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).
- Rahib, L., et al. Projecting cancer incidence and deaths to 2030: The unexpected burden of thyroid, liver, and pancreas cancers in the united states. Cancer Research. 74 (11), 2913-2921 (2014).
- Rawla, P., Sunkara, T., Gaduputi, V. Epidemiology of pancreatic cancer: Global trends, etiology and risk factors. World Journal of Oncology. 10 (1), 10 (2019).
- Herreros-Villanueva, M., Hijona, E., Cosme, A., Bujanda, L.
- Hofschroer, V., et al. Ion channels orchestrate pancreatic ductal adenocarcinoma progression and therapy. Frontiers in Pharmacology. 11, 586599 (2021).
- Adamska, A., Domenichini, A., Falasca, M. Pancreatic ductal adenocarcinoma: Current and evolving therapies. International Journal of Molecular Sciences. 18 (7), 1338 (2017).
- Qiu, W., Su, G. H. Development of orthotopic pancreatic tumor mouse models. Methods in Molecular Biology. 980, 215-223 (2013).
- Killion, J. J., Radinsky, R., Fidler, I. J. Orthotopic models are necessary to predict therapy of transplantable tumors in mice. Cancer Metastasis Reviews. 17 (3), 279-284 (1998).
- Qiu, W., Su, G. H. Challenges and advances in mouse modeling for human pancreatic tumorigenesis and metastasis. Cancer and Metastasis Reviews. 32 (1-2), 83-107 (2013).
- Erstad, D. J., et al. Orthotopic and heterotopic murine models of pancreatic cancer and their different responses to FOLFIRINOX chemotherapy. DMM Disease Models and Mechanisms. 11 (7), (2018).
- Lottini, T., et al. Micro-ultrasound, non-linear contrast mode with microbubbles and Optical Flow software tool: together for a new translational method in the study of the tumoral rheology microenvironment. WMIC 2017: Imaging the Future from Molecules to Medicine. , (2017).
- Ludders, J. W. Advantages and guidelines for using isoflurane. The Veterinary Clinics of North America Small Animal Practice. 22 (2), 328-331 (1992).
- Huynh, S., et al. Development of an orthotopic human pancreatic cancer xenograft model using ultrasound guided injection of cells. PLoS One. 6 (5), 20330 (2011).
- Duranti, C., et al. Harnessing the hERG1/β1 Integrin Complex via a Novel Bispecific Single-chain Antibody: An Effective Strategy against Solid Cancers. Molecular Cancer Therapeutics. 20 (8), 1338-1349 (2021).
