Summary
Presentiamo un protocollo per generare un modello di carcinoma pancreatico ortotopico minimamente invasivo mediante iniezione ecoguidata di cellule tumorali pancreatiche umane e il successivo monitoraggio della crescita tumorale in vivo mediante imaging ecografico.
Abstract
Il cancro del pancreas (PCa) rappresenta uno dei tipi di cancro più mortali in tutto il mondo. Le ragioni della malignità del PCa si basano principalmente sul suo comportamento maligno intrinseco e sull'elevata resistenza ai trattamenti terapeutici. Infatti, nonostante molti sforzi, sia la chemioterapia standard che le terapie target innovative hanno sostanzialmente fallito quando sono passate dalla valutazione preclinica all'ambiente clinico. In questo scenario, lo sviluppo di modelli murini preclinici che imitino meglio le caratteristiche in vivo del PCa è urgentemente necessario per testare farmaci di nuova concezione. Il presente protocollo descrive un metodo per generare un modello murino di PCa, rappresentato da uno xenotrapianto ortotopico ottenuto mediante iniezione ecoguidata di cellule tumorali pancreatiche umane. Utilizzando un protocollo così affidabile e minimamente invasivo, forniamo anche prove di attecchimento in vivo e sviluppo di masse tumorali, che possono essere monitorate mediante imaging ad ultrasuoni (US). Un aspetto degno di nota del modello PCa qui descritto è il lento sviluppo delle masse tumorali nel tempo, che consente di identificare con precisione il punto di partenza per i trattamenti farmacologici e un migliore monitoraggio degli effetti degli interventi terapeutici. Inoltre, la tecnica qui descritta è un esempio di implementazione dei principi delle 3R poiché riduce al minimo il dolore e la sofferenza e migliora direttamente il benessere degli animali nella ricerca.
Introduction
PCa, e la sua forma più comune, l'adenocarcinoma duttale pancreatico (PDAC), è una delle cause più comuni di morte correlata al cancro con un tasso di sopravvivenza a 1 anno inferiore al 20% e un tasso di sopravvivenza a 5 anni dell'8%, indipendentemente dallo stadio 1,2. La malattia è quasi sempre fatale e si prevede che la sua incidenza crescerà continuamente nei prossimi anni, a differenza di altri tipi di cancro, la cui incidenza è in calo3. Fattori come la diagnosi tardiva del cancro, la tendenza alla rapida progressione e la mancanza di terapie specifiche portano a una prognosi sfavorevole diPCa 4. Sono stati ottenuti grandi progressi nella ricerca sul cancro, grazie allo sviluppo di modelli murini preclinici più accurati. I modelli hanno fornito approfondimenti appropriati per la comprensione del meccanismo molecolare alla base del cancro e per lo sviluppo di nuovi trattamenti5. Questi progressi si applicano male al PCa, che, nonostante i grandi sforzi recenti, rimane resistente alle attuali terapie chemioterapiche1. Per questi motivi, lo sviluppo di nuovi approcci per migliorare le prospettive dei pazienti è obbligatorio.
Nel corso degli anni, sono stati sviluppati molti modelli di topi PCa, tra cui xenotrapianti, che sono i modelli più utilizzati al giorno d'oggi5. I modelli di xenotrapianto sono classificati come eterotopici sottocutanei e ortotopici, a seconda della posizione delle cellule tumorali impiantate. Gli xenotrapianti eterotopici sottocutanei sono più facili ed economici da realizzare, ma mancano di alcune caratteristiche del PCa (cioè il peculiare microambiente tumorale, caratterizzato dall'accumulo di tessuto fibrotico, ipossia, acidità e angiogenesi)6,7. Questo spiega perché gli xenotrapianti sottocutanei spesso non riescono a fornire dati solidi per i trattamenti terapeutici che portano a fallimenti quando vengono tradotti nel contesto clinico8. D'altra parte, gli xenotrapianti ortotopici assomigliano più da vicino al microambiente tumorale, portando a una migliore imitazione dello sviluppo naturale della malattia. Inoltre, gli xenotrapianti ortotopici sono più adatti per studiare il processo metastatico e le caratteristiche invasive di PCa, che quasi non si verificano nei modelli sottocutanei9. Nel complesso, i modelli murini di xenotrapianto ortotopico sono oggi preferiti per eseguire test farmacologici preclinici 9,10. Gli xenotrapianti ortotopici di solito si basano su procedure chirurgiche per impiantare cellule o pezzi di tessuto tumorale molto piccoli nel pancreas. In effetti, diversi articoli basati su modelli chirurgici di PCa sono stati pubblicati negli ultimi decenni11. Tuttavia, la qualità e l'esito della procedura chirurgica per l'istituzione di un modello tumorale ortotopico dipendono fortemente dalla capacità tecnica dell'operatore. Un altro punto chiave per un efficace xenotrapianto ortotopico di PCa per un approccio clinico traslazionale è la possibilità di stabilire una malattia localizzata con una cinetica di crescita prevedibile.
Per affrontare questi problemi, qui descriviamo una procedura innovativa per produrre uno xenotrapianto ortotopico di PCa, sfruttando l'iniezione guidata da ultrasuoni (USA) di cellule PCa umane nella coda del pancreas in topi immunodeficienti. Questa procedura genera un modello di mouse PCa affidabile. La crescita tumorale è seguita in vivo dall'imaging statunitense.
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Protocol
Il presente protocollo ha ricevuto l'approvazione del Ministero della Salute italiano con il numero di autorizzazione 843/2020-PR. Al fine di garantire condizioni asettiche, gli animali sono stati mantenuti all'interno della sala di barriera del vivaio di ricerca (Ce.S.A.L.) dell'Università di Firenze. Tutte le procedure sono state eseguite nello stesso spazio in cui i topi erano ospitati presso la struttura LIGeMA dell'Università di Firenze (Italia).
1. Preparazione delle cellule
- Colture di cellule PCa dalla linea cellulare PCa in una capsula di Petri da 100 mm contenente il Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco integrato con il 2% di L-glutammina e il 10% di siero bovino fetale (FBS).
- Incubare le cellule in normoxia a 37 °C con 5% di CO2.
- Staccare le cellule con tripsina. Contare e risospendere 1 x 106 cellule in 20 μL di PBS, 1 ora prima dell'inoculazione.
2. Preparazione del mouse per l'iniezione guidata da ultrasuoni (US-GI)
NOTA: i seguenti passaggi sono stati eseguiti in condizioni sterili. L'intera procedura di iniezione guidata dagli Stati Uniti, dall'inizio dell'anestesia fino a quando il topo non viene rimosso dalla piattaforma animale, richiede circa 10-12 minuti più 5 minuti per il recupero completo del topo.
- Poco prima dell'intervento, somministrare carprofen (FANS) per via sottocutanea (s.c.) alla dose finale di 5 mg/kg o tramadolo alla dose finale di 5 mg/kg utilizzando una siringa per tubercolina con ago da 27 G.
NOTA: Per il presente protocollo, sono stati utilizzati 20 topi femmina Athymic Nude-Foxn1nu . I topi avevano 8 settimane e pesavano 20-22 g. - Accendere l'imager e selezionare Mouse (Small) Addominale dal menu dell'applicazione dal pannello del trasduttore. Assicurarsi che venga visualizzata la finestra di imaging B-Mode (Brightness Mode) e che il sistema sia pronto per acquisire i dati B-Mode.
NOTA: B-Mode è la modalità di imaging predefinita del sistema. Il sistema visualizza gli echi in una vista bidimensionale (2D) assegnando un livello di luminosità in base all'ampiezza del segnale dell'eco. B-Mode è la modalità più efficace per localizzare strutture anatomiche.- Vai al browser di studio.
- Selezionare Nuovo studio e digitare il nome e le informazioni dello studio, ad esempio la data dello studio, ecc.
- Inserisci tutte le informazioni necessarie nel nome della serie, ad esempio ceppo animale, ID, data di nascita, ecc.
- Tocca Fine; il programma è pronto per l'imaging B-mode.
- Anestetizzare il topo nella camera di induzione dell'anestesia utilizzando isoflurano al 4% con un flusso di gas di 2 L/min di O2.
NOTA: Circa 4 minuti sono sufficienti per una corretta anestesia (respirazione di circa 50-60 respiri al minuto). - Una volta che il mouse è anestetizzato, cambiare la connessione della macchina anestetica per dirigere l'isoflurano verso il tavolo di manipolazione del mouse.
- Posizionare il topo anestetizzato sul fianco destro sul tavolo di manipolazione (riscaldato a 37 °C) con il muso in un cono nasale per assicurarsi che il topo sia anestetizzato utilizzando isoflurano al 2% con un flusso di gas di 0,8 L/min di O2 (Figura 1A).
- Applicare una goccia di lacrime artificiali sugli occhi del topo per prevenire la secchezza durante l'anestesia.
- Fissare saldamente la mano destra, il piede destro e la coda sui cuscinetti degli elettrodi sulla piattaforma animale con una garza adesiva.
NOTA: La frequenza respiratoria e l'elettrocardiogramma (ECG) del topo vengono registrati attraverso i cuscinetti degli elettrodi.
3. Iniezione di cellule PANC1 nel pancreas con metodo US-GI
- Disinfettare la pelle del topo con etanolo al 70% e mantenere la pelle del fianco sinistro tesa usando una garza adesiva.
NOTA: Mantenere la pelle tesa è importante per ridurre la resistenza all'inserimento dell'ago e per prevenire le deformazioni dell'ago. - Applicare il gel per ultrasuoni sull'addome e sul fianco sinistro del mouse utilizzando una siringa da 20 ml (senza l'ago).
- Utilizzando la manopola di controllo dell'altezza del trasduttore statunitense, abbassare il trasduttore per toccare il fianco sinistro del mouse e posizionarlo trasversalmente al corpo dell'animale.
- Spostare il trasduttore per visualizzare il pancreas sul display del trasduttore utilizzando l'imaging B-Mode (Figura 1B).
- Preparare una siringa Hamilton da 50 μL, contenente 1 x 106 cellule PANC1 sospese in 20 μL di PBS, con un ago da 30 mm da 28 G e posizionare la siringa sul supporto appropriato (Figura 1C).
NOTA: Prima dell'uso, disinfettare l'ago della siringa con etanolo al 70% per un periodo di 5-10 minuti. - Utilizzando il micromanipolatore del supporto, abbassare la siringa sulla pelle del topo, con la smussatura dell'ago rivolta verso l'alto e sullo stesso piano del trasduttore a ultrasuoni, formando un angolo di 45° con il trasduttore (Figura 1D).
NOTA: da questo passaggio in poi, procedere monitorando l'immagine statunitense sul display. - Utilizzando il micromanipolatore, perforare la pelle e inserire l'ago della siringa nel pancreas e osservare l'immagine degli Stati Uniti sul display, per seguire la sua traiettoria (Figura 1E).
NOTA: Prima dell'iniezione, prendere la coda del pancreas come riferimento che si trova dietro la milza e vicino al rene sinistro. - Una volta inserito l'ago nel pancreas, iniettare un bolo da 20 μL contenente le cellule direttamente nel pancreas applicando una pressione costante sullo stantuffo della siringa (Figura 1F).
NOTA: La corretta procedura di iniezione viene controllata dalla presenza di una piccola bolla nel pancreas e dal flusso di liquido ipoecogeno, che è appena visibile dalla punta dell'ago. - Lasciare l'ago in posizione per 5-10 secondi dopo l'iniezione dell'intero bolo, quindi ritrarlo lentamente.
- Rimuovere il trasduttore USA, pulire il gel dal fianco e posizionare il mouse da solo in una nuova gabbia. Osservare l'animale fino a quando non ha riacquistato sufficiente coscienza per mantenere la recumbency sternale.
4.3D Imaging statunitense per il monitoraggio dei tumori pancreatici nei topi
NOTA: La valutazione dello sviluppo del tumore è stata eseguita a partire da 8 giorni dopo l'iniezione cellulare, utilizzando lo stesso strumento utilizzato per l'iniezione guidata dagli Stati Uniti (elencato nella Tabella dei materiali). Quindi, alcune procedure, come l'accensione del sistema (fase 2.2.), l'anestesia (fasi 2.3. - 2.6.) e il posizionamento del mouse sulla piattaforma animale (fase 2.7.), corrispondono pienamente a quanto descritto sopra nel protocollo.
- Prima di avviare la creazione di immagini negli Stati Uniti, configurare la workstation come illustrato nella Figura 2A.
- Fissare il trasduttore sul sistema motore 3D (Figura 2A).
- Accendere l'imager e selezionare Nuovo studio nel browser degli studi.
- Posizionare il topo nella camera di induzione dell'anestesia (isoflurano al 4%).
- Posizionare il topo anestetizzato sul fianco destro sul tavolo di manipolazione riscaldato a 37 °C con il muso nel tubo anestetico e ridurre l'isoflurano al 2% (Figura 2B).
NOTA: è importante che il topo sia posto nella stessa posizione dell'iniezione guidata dagli Stati Uniti, per mantenere gli stessi riferimenti anatomici. - Applicare una goccia di unguento veterinario sugli occhi del topo.
- Applicare uno strato di gel per ultrasuoni sull'addome del topo e sul fianco sinistro.
- Posizionare il trasduttore a 55 MHz nell'orientamento trasversale per toccare la pelle del fianco sinistro in modo che il pancreas sia approssimativamente centrato (Figura 2C).
- Utilizzare il motore 3D per acquisire immagini dell'intero pancreas con orientamento trasversale, raccogliendo idealmente 90-100 fotogrammi per acquisizione (il numero di fotogrammi può variare a seconda della scelta personale).
- Selezionare la posizione del motore 3D sul touchpad dell'imager.
- Indicare la distanza di scansione spostando il cursore per acquisire immagini dell'intero pancreas da entrambe le estremità.
- Selezionare Scan Frames (Scansione fotogrammi ) e avviare l'acquisizione 3D.
- Una volta terminata l'imaging 3D, rimuovere il trasduttore, pulire il gel dalla pelle e posizionare il mouse da solo in una nuova gabbia per il recupero. Osservare l'animale fino a quando non ha riacquistato sufficiente coscienza per mantenere la recumbency sternale.
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Representative Results
Seguendo il protocollo sopra descritto, i topi sono stati prima anestetizzati in una camera di isoflurano e posti sulla piattaforma animale (Figura 1A). Il pancreas è stato visualizzato con ecografia (Figura 1B). Una siringa Hamilton da 50 μL è stata caricata con 1 x 106 cellule PANC1 sospese in 20 μL di PBS e posizionate sul supporto dell'ago (Figura 1C). L'angolo ottimale tra la siringa e il trasduttore statunitense era di 45° (Figura 1D). Utilizzando il micromanipolatore, l'ago della siringa è stato inserito nel pancreas e la sua traiettoria è stata osservata sul display dell'imager statunitense (Figura 1E). Un bolo di 20 μL di cellule tumorali è stato quindi iniettato nel pancreas (Figura 1F) e dopo 10 s l'ago è stato retratto. Sono state perseguite azioni rilevanti per prevenire il rinculo delle cellule e la loro successiva fuoriuscita nella cavità peritoneale, come l'applicazione di una pressione costante durante l'inoculazione, la pausa dopo l'iniezione cellulare e l'uso di un ago sottile con un angolo di smussatura di 30°. Dopo l'iniezione guidata dagli Stati Uniti, il peso dei topi è stato monitorato ogni giorno per valutare eventuali segni di stress dovuti alla procedura. Non è stato osservato alcun cambiamento significativo nel peso dei topi iniettati.
L'imaging 3D US è stato quindi applicato per monitorare l'attecchimento delle cellule tumorali e lo sviluppo del tumore. La prima acquisizione di immagini è stata eseguita il giorno 8 dopo l'iniezione cellulare, seguita da acquisizioni settimanali (per un totale di 6 acquisizioni). Durante l'imaging, gli animali sono stati posti sul fianco destro sulla piattaforma riscaldata (37 °C) e anestetizzati mediante inalazione di gas isoflurano (dose di induzione al 4% e dose di mantenimento al 2%) (Figura 2). L'acquisizione 3D è stata eseguita in modalità B utilizzando il motore 3D che consente al trasduttore di scansionare l'addome in varie sezioni, perpendicolari al suo asse. Sono state ottenute una serie di immagini 2D, che sono state poi assemblate dal software di analisi, ricostruendo l'immagine anatomica 3D dell'organo (re-rendering 3D). Per eseguire l'imaging 3D, è stato necessario sincronizzare le fasi del respiro del mouse con l'acquisizione della scansione 3D. La riproducibilità del protocollo è stata confermata dalla presenza della massa tumorale, una struttura ipo-ecogenica (rappresentata con colori scuri) nella coda del pancreas, a partire dal giorno 8, in 16 animali su 20 (80%) (Figura 3A). In quattro topi (20% degli animali), lo sviluppo della massa tumorale è stato osservato 2 settimane dopo l'iniezione. Questa latenza potrebbe essere ricondotta a una procedura sub-ottimale di inserimento dell'ago nel pancreas, che ha causato la perdita di cellule nel peritoneo.
La figura 3B mostra il volume medio del tumore (n = 16) valutato mediante imaging statunitense del modello murino di iniezione guidata dagli Stati Uniti. Il giorno dopo l'ultima acquisizione negli Stati Uniti, i topi sono stati eutanizzati prima per inalazione di CO2 e poi per lussazione cervicale. La cavità addominale è stata esaminata e le masse tumorali sono state espiantate per l'analisi istologica (Figura 3C-E).
Figura 1: Metodo guidato dagli Stati Uniti per la creazione di un modello murino PCa ortotopico . (A) Il topo è posto sul fianco destro su un supporto speciale riscaldato a 37 °C. (B) Il trasduttore US si trova trasversalmente al corpo animale a livello della milza e il pancreas viene visualizzato in modalità B. La vista laterale dell'addome del topo mostra il pancreas (1) tra la milza (2) e il rene sinistro (3). Barra scala: 2 mm. (C) La siringa di Hamilton viene posizionata sull'apposito supporto. (D) In questa situazione, il trasduttore (2) e la siringa (1) sono posizionati formando un angolo di 45°. (E) L'ago della siringa (1) è inserito nella coda del pancreas, appena sotto la milza. Barra scala: 2 mm. (F) Un bolo contenente 1 x 106 cellule PANC1 in 20 μL di PBS viene iniettato nella coda del pancreas, utilizzando una siringa di Hamilton con un ago da 28 G. Barra scala: 2 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Workstation di imaging utilizzata per il monitoraggio dei tumori pancreatici nei topi . (A) Luogo di lavoro per l'imaging negli Stati Uniti. (1) trasduttore a 55 MHz; (2) Tabella di gestione del mouse; (3) Motore 3D; (4) Manopola di controllo dell'altezza del trasduttore statunitense. (B) Il topo viene posizionato sul fianco destro sul tavolo di manipolazione con il muso nel tubo anestetico (1), la pelle viene allungata e il gel US viene applicato sul fianco destro. (C) Il trasduttore è abbassato per toccare la pelle del topo e posizionato trasversalmente al corpo dell'animale. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Sviluppo di xenotrapianto ortotopico PCa nel pancreas di topo . (A) Acquisizione di immagini 2D US della massa tumorale sviluppata dopo iniezione cellulare eco-guidata. Lo sviluppo del tumore viene monitorato con imaging US dopo 8 giorni di iniezione cellulare, seguita da acquisizione una volta alla settimana fino al giorno 44, per un totale di 6 acquisizioni. Il tumore è rappresentato da una struttura ipo-ecogenica nel parenchima pancreatico. La struttura ipo-ecogenica è rappresentata ecograficamente da un'area con echi di intensità ridotta, rispetto al parenchima circostante o ad una struttura vicina. Barra scala: 2 mm. (B) Decorso temporale del volume tumorale del PDAC ortotopico derivato da cellule PANC1. (C) Acquisizione di imaging US di una massa tumorale al giorno 43 dopo l'iniezione cellulare. Barra della scala: 2 mm.3D il ri-rendering della massa tumorale è mostrato nel riquadro. (D) Dopo l'imaging, gli animali vengono eutanasizzati, e viene eseguito l'esame necroscopico. (1) Massa tumorale; (2) Una piccola porzione di un pancreas sano; (3) Milza; (4) Stomaco; (5) Fegato. Barra scala: 5 mm. (E) Colorazione di ematossilina ed eosina della massa tumorale con ingrandimento 4x. Barra scala: 200 μm. Sul lato superiore destro del pannello, inserto della massa tumorale in cui sono ancora visibili le cellule acinose pancreatiche; Ingrandimento 40x. Barra scala: 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
Sebbene l'uso dell'imaging statunitense sia diffuso nella clinica, lo sviluppo del tumore in molti modelli murini preclinici è solitamente descritto utilizzando l'imaging bioluminescente11. Quest'ultimo è un modo indiretto per valutare l'attecchimento e l'espansione del tumore e inoltre non fornisce una cinetica di crescita tumorale affidabile. Nel presente studio, abbiamo applicato l'imaging statunitense per eseguire l'iniezione cellulare e per monitorare lo sviluppo del tumore. Il protocollo che abbiamo descritto e i risultati che abbiamo fornito rappresentano una svolta rilevante nella ricerca PCa.
Il metodo guidato dagli Stati Uniti qui descritto per l'iniezione di cellule tumorali pancreatiche è minimamente invasivo e consente di superare molti inconvenienti causati dalla procedura chirurgica, che di solito viene applicata per stabilire un modello murino PCa ortotopico. Sebbene in letteratura manchino indicazioni sul tasso di mortalità o sugli effetti collaterali dovuti alla procedura chirurgica, la nostra esperienza suggerisce che il metodo chirurgico produce una maggiore mortalità postoperatoria in una bassa percentuale di casi (circa il 10%), con frequenti sofferenze degli animali, che richiedono una certa quantità di tempo di recupero12. Inoltre, i punti applicati dopo l'intervento chirurgico impediscono la corretta applicazione delle procedure di imaging. Ciò si traduce nell'acquisizione di immagini statunitensi di qualità molto scadente, portando a un'estrapolazione imprecisa dei dati causata da artefatti, come il riverbero e le regioni d'ombra. Prendendo in considerazione tutti questi fatti, un metodo che non richiede una procedura chirurgica per la creazione di un modello murino ortotopico è preferito e fortemente raccomandato per scopi di ricerca preclinica. Inoltre, essendo minimamente invasivo, il tempo di recupero dall'inoculazione cellulare è più veloce e la sofferenza dell'animale è minima nel metodo guidato dagli Stati Uniti. Un grande vantaggio è che il metodo guidato dagli Stati Uniti è compatibile con l'uso dell'anestesia isoflurana che consente un'induzione e un recupero più rapidi, un effetto relativamente meno parsimonioso sulla funzione cardiovascolare e sull'autoregolazione del flusso sanguigno cerebrale, rispetto ad altri metodi di anestesia (cioè soluzione di ketamina / xilazina). Nel complesso, il metabolismo trascurabile dell'isoflurano lo rende particolarmente utile nella gestione anestetica13. Infatti, circa 5 minuti dopo la fine della procedura, gli animali riacquistano sufficiente coscienza per mantenere la recumbency sternale. Inoltre, i topi sono pre-medicati con un analgesico (carprofene) per ridurre al minimo il dolore e non sono necessari trattamenti post-operatori a causa del recupero rapido e completo.
Tuttavia, ci sono alcuni passaggi cruciali per la risoluzione dei problemi nella procedura che devono essere considerati. Il numero di cellule da inoculare non deve superare 1 x 106 cellule e il volume dell'inoculo cellulare non deve essere superiore a 20 μL per evitare il rischio di fuoriuscita di cellule dal pancreas. L'iniezione cellulare deve essere eseguita immediatamente dopo il loro distacco, per evitare una diminuzione della vitalità cellulare. Dopo l'iniezione cellulare, è necessario attendere almeno 10 s prima di rimuovere l'ago per evitare la fuoriuscita di cellule dal pancreas.
Uno degli aspetti più critici del presente protocollo riguarda il posizionamento del topo sulla pedana animale. Il topo deve essere sdraiato sul lato destro sul tavolo di manipolazione degli animali e la pelle deve essere tesa. Se la pelle non è adeguatamente tesa durante l'iniezione, l'ago farà fatica a perforare ed entrare nel pancreas, con il rischio che le cellule fuoriescano dal pancreas. L'iniezione guidata da ultrasuoni per produrre un modello murino PCa è stata descritta per la prima volta da Huynh et al. nel 201114. Qui, ci siamo concentrati sulla metodologia adatta a produrre un tale modello, descrivendo in dettaglio tutti i passaggi per renderlo riproducibile. Inoltre, rispetto a Huynh et al.14, abbiamo introdotto alcune innovazioni principalmente legate ai progressi tecnologici statunitensi avvenuti negli ultimi 5 anni. Nel presente protocollo, l'uso di una siringa di Hamilton con un ago rigido e un angolo di smussatura di 30° è fortemente raccomandato per ottenere una migliore precisione durante l'iniezione cellulare e per ridurre al minimo la perdita di cellule. Infine, durante l'iniezione guidata dagli Stati Uniti, i topi sono stati fissati sul lato destro sulla piattaforma animale, mentre in Huynh et al.14 i topi sono stati posti in posizione dorsale sdraiata. La posizione laterale del topo permette di visualizzare la coda del pancreas, appena sotto la milza, che funge da riferimento visivo (Figura 1B) durante l'iniezione cellulare, garantendo la riproducibilità della tecnica.
Come con altre tecniche, ci sono anche alcune limitazioni con la procedura guidata dagli Stati Uniti. La più grande limitazione è che l'iniezione può essere eseguita solo nella coda del pancreas perché il corpo e la testa sono coperti da altri organi e sono difficili da raggiungere con l'ago. Inoltre, un'altra limitazione associata all'uso dell'imaging statunitense per monitorare la crescita del tumore è l'incapacità di visualizzare l'intera massa tumorale quando diventa troppo grande, dopo 6 settimane di inoculazione (Figura 3C-E). Tuttavia, volumi così grandi non imitano il decorso clinico della malattia.
Un altro vantaggio del modello PCa ottenuto con il protocollo qui descritto è il lento attecchimento cellulare e la crescita delle masse tumorali (Figura 3B). Questo è ideale per identificare con precisione il punto di partenza per l'intervento farmacologico e un migliore monitoraggio degli effetti degli interventi terapeutici nel tempo.
Infine, la tecnica descritta è un esempio di implementazione dei principi delle 3R che coinvolgono il perfezionamento della tecnica e lo sviluppo di procedure che riducono al minimo il dolore, la sofferenza, l'angoscia o il danno duraturo, migliorando direttamente il benessere degli animali nella ricerca.
Le future applicazioni del modello PCa ottenuto dall'iniezione guidata dagli Stati Uniti includono studi volti allo sviluppo di appropriati trattamenti terapeutici o combinazioni di trattamento. Infatti, l'uso di tali tecniche innovative in vivo potrebbe essere accoppiato con l'uso di piccole molecole, ad esempio anticorpi, frammenti di anticorpi e coniugati anticorpo-farmaco (ADC), con un approccio teragnostico. Quest'ultimo potrebbe essere utilizzato da solo, a scopo terapeutico, come il nostro gruppo ha dimostrato nel nostro recente lavoro15 o dopo una corretta coniugazione fluorofora, con l'obiettivo di monitorare la crescita tumorale.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dall'Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC, grant n. 15627, IG 21510 e IG 19766) ad AA, PRIN Ministero dell'Università e della Ricerca (MIUR). Sfruttando le conoscenze di base della rete di canali ionici nel cancro per strategie terapeutiche innovative (LIONESS) 20174TB8KW to AA, pHioniC: European Union's Horizon 2020 grant No 813834 to AA. CD è stato supportato da una borsa di studio AIRC per l'Italia ID 24020.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm Petri dish | Sarstedt, Germany | P5856 | |
| 3D-Mode package | Visualsonics Fujifilm, Italy | Includes the 3D Motor; necessary for volumetric imaging | |
| Aquasonic 100, Sonypack 5 lt Ultrasound Transmission Gel | PARKER LABORATORIES, INC. | 150 | Gel for ultrasound |
| Athymic Mice (Nude-Foxn1nu) | ENVIGO, Italy | 69 | 20 females, 8 weeks old, Athymic Nude-Foxn1nu, 20-22 g body weight |
| CO2 Incubator Function Line | Heraeus Instruments, Germany | BB16-ICN2 | |
| Display of ECG, Respiration Waveform and body temperature | Visualsonics Fujifilm, Italy | 11426 | |
| DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) | Euroclone Spa, Italy | ECM0101L | |
| DPBS (Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline) | Euroclone Spa, Italy | ECB4004L | |
| Eppendorf (1.5mL) | Sarstedt, Germany | 72.690.001 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Euroclone Spa, Italy | ECS0170L | |
| Hamilton Needle Pointstyle 4, lenght 30 mm, 28 Gauge | Permax S.r.l., Italy | 7803-02 | |
| Hamilton Syringe 705RM 50 µL | Permax S.r.l., Italy | 7637-01 | |
| Isoflo (250 mL) | Ecuphar | 7081219 | |
| L-glutamine 100X | Euroclone Spa, Italy | ECB3000D | |
| Mouse Handling table II | Visualsonics Fujifilm, Italy | 50249 | |
| MX550D: 55 MHz MX Series Transducer | Visualsonics Fujifilm, Italy | 51069 | Ultrasound Transducers |
| Oxygen/isofluorane mixer | Angelo Franceschini S.r.l. | LFY-I-5A | |
| PANC1 cell line | American Type Culture Collection (ATCC), USA | CRL-1469 | |
| Rimadyl (carprofen) | Pfizer | 11319 | 20 mL, injection solution |
| Trypsin-EDTA 1X in PBS | Euroclone Spa, Italy | ECB3052D | |
| Vet ointment for eyes, Systane nighttime | Alcon | 509/28555-1 | |
| Vevo Compact Dual Anesthesia System (Tabletop Version) | Visualsonics Fujifilm, Italy | VS-12055 | complete with gas chamber |
| Vevo Imaging Station 2 | Visualsonics Fujifilm, Italy | VS-11983 | Imaging WorkStation 1 plus Imaging Station Extension with injection mount |
| Vevo Lab | Visualsonics Fujifilm, Italy | VS-20034 | Data Analysis Software |
| Vevo LAZR-X Photoacoustic Imaging System | Visualsonics Fujifilm, Italy | VS-20054 | Includes analytic software package for B-mode |
| Vevo Photoacoustic Enclosure | Visualsonics Fujifilm, Italy | 53157 |
References
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