Summary
Vi præsenterer en protokol til at generere en minimalt invasiv ortopisk kræft i bugspytkirtlen ved ultralydstyret injektion af humane kræftceller i bugspytkirtlen og den efterfølgende overvågning af tumorvækst in vivo ved ultralydsbilleddannelse.
Abstract
Kræft i bugspytkirtlen (PCa) repræsenterer en af de dødeligste kræftformer på verdensplan. Årsagerne til PCa-malignitet er hovedsageligt afhængige af dets iboende ondartede adfærd og høje modstand mod terapeutiske behandlinger. På trods af mange bestræbelser har både standard kemoterapi og innovative målterapier faktisk i væsentlig grad mislykkedes, når de flyttes fra præklinisk evaluering til den kliniske indstilling. I dette scenarie er der et presserende behov for udvikling af prækliniske musemodeller, der bedre efterligner in vivo-egenskaber ved PCa for at teste nyudviklede lægemidler. Den nuværende protokol beskriver en metode til at generere en musemodel af PCa, repræsenteret af en ortopisk xenograft opnået ved ultralydstyret injektion af humane bugspytkirteltumorceller. Ved hjælp af en sådan pålidelig og minimalt invasiv protokol giver vi også bevis for in vivo-engraftment og udvikling af tumormasser, som kan overvåges ved ultralyd (US) billeddannelse. Et bemærkelsesværdigt aspekt af PCa-modellen beskrevet her er den langsomme udvikling af tumormasserne over tid, hvilket muliggør præcis identifikation af udgangspunktet for farmakologiske behandlinger og bedre overvågning af virkningerne af terapeutiske interventioner. Desuden er den teknik, der er beskrevet her, et eksempel på implementering af 3R-principperne, da den minimerer smerte og lidelse og direkte forbedrer dyrenes velfærd i forskning.
Introduction
PCa og dens mest almindelige form, Pancreatic Ductal Adeno Carcinoma (PDAC), er en af de mest almindelige årsager til kræftrelateret død med en 1-års overlevelsesrate lavere end 20% og en 5-årig overlevelsesrate på 8%, uanset stadium 1,2. Sygdommen er næsten altid dødelig, og dens forekomst forventes at vokse kontinuerligt i de næste år, i modsætning til andre kræftformer, hvis forekomst er faldende3. Faktorer som sen kræftdetektion, tendensen til hurtig progression og mangel på specifikke terapier fører til en dårlig prognose forPCa 4. Der er opnået store fremskridt inden for kræftforskning takket være udviklingen af mere nøjagtige prækliniske musemodeller. Modellerne har givet passende indsigt i forståelsen af den molekylære mekanisme, der ligger til grund for kræft, og til udviklingen af nye behandlinger5. Disse fremskridt gælder dårligt for PCa, som på trods af stor nylig indsats forbliver resistent over for nuværende kemoterapeutiske terapier1. Af disse grunde er det obligatorisk at udvikle nye tilgange til forbedring af patienternes udsigter.
I årenes løb er der udviklet mange PCa-musemodeller, herunder xenografts, som er de mest anvendte modeller i dag5. Xenograft-modeller klassificeres som subkutane heterotopiske og orthotopiske afhængigt af placeringen af de implanterede tumorceller. Subkutane heterotopiske xenotransplantater er lettere og billigere at opnå, men savner visse karakteristiske træk ved PCa (dvs. det ejendommelige tumormikromiljø, der er karakteriseret ved akkumulering af fibrotisk væv, hypoxi, surhed og angiogenese)6,7. Dette forklarer, hvorfor subkutane xenotransplantater ofte ikke leverer robuste data til terapeutiske behandlinger, der fører til fejl, når de oversættes til den kliniske indstilling8. På den anden side ligner ortopiske xenotransplantater tumormikromiljøet tættere, hvilket fører til bedre efterligning af sygdommens naturlige udvikling. Derudover er ortopiske xenografter mere egnede til at studere den metastatiske proces og de invasive egenskaber ved PCa, som næsten ikke forekommer i subkutane modeller9. Samlet set foretrækkes ortopiske xenograftmusemodeller i dag at udføre præklinisk lægemiddeltest 9,10. Ortopiske xenotransplantater er normalt afhængige af kirurgiske procedurer for at implantere enten celler eller meget små tumorvævsstykker i bugspytkirtlen. Faktisk er flere papirer baseret på kirurgiske modeller af PCa blevet offentliggjort i de sidste par årtier11. Kvaliteten og resultatet af den kirurgiske procedure til etablering af en ortopisk tumormodel afhænger imidlertid stærkt af operatørens tekniske færdigheder. Et andet nøglepunkt for en vellykket orthotopisk PCa xenograft for en translationel klinisk tilgang er muligheden for at etablere lokaliseret sygdom med forudsigelig vækstkinetik.
For at løse disse problemer beskriver vi her en innovativ procedure til fremstilling af en ortopisk PCa xenograft, der udnytter ultralyd (US) -guidet injektion af humane PCa-celler i halen af bugspytkirtlen i immundefekte mus. Denne procedure genererer en pålidelig PCa-musemodel. Tumorvæksten efterfølges in vivo af amerikansk billeddannelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Den nuværende protokol modtog godkendelse fra det italienske sundhedsministerium med autorisationsnummer 843/2020-PR. For at sikre aseptiske forhold blev dyrene opretholdt inde i barriererummet i forskningsdyret vivarium (Ce.S.A.L.) ved universitetet i Firenze. Alle procedurer blev udført i samme rum, hvor musene blev anbragt på LIGeMA-anlægget ved universitetet i Firenze (Italien).
1. Celle forberedelse
- Kultur PCa-celler fra PCa-cellelinjen i en 100 mm petriskål indeholdende Dulbeccos modificerede Eagle Medium (DMEM) suppleret med 2% L-glutamin og 10% føtalt kvægserum (FBS).
- Inkubere cellerne i normoxia ved 37 °C med 5% CO2.
- Fjern cellerne med trypsin. Der tælles, og 1 x 106 celler resuspenderes i 20 μL PBS, 1 time før podning.
2. Musforberedelse til ultralydstyret injektion (US-GI)
BEMÆRK: Følgende trin blev udført under sterile forhold. Hele proceduren med amerikansk guidet injektion, fra begyndelsen af anæstesien, indtil musen fjernes fra dyreplatformen, tager omkring 10-12 minutter plus 5 minutter for fuldstændig musegendannelse.
- Lige før interventionen administreres carprofen (NSAID) subkutant (s.c.) i en endelig dosis på 5 mg/kg eller tramadol ved en slutdosis på 5 mg/kg ved anvendelse af en tuberkulinsprøjte med en 27 G nål.
BEMÆRK: Til den nuværende protokol blev der anvendt 20 Athymic Nude-Foxn1nu hunmus. Musene var 8 uger gamle og vejede 20-22 g. - Tænd for billedkameraet, og vælg Mus (lille) Abdominal i applikationsmenuen fra transducerpanelet. Sørg for, at billedvinduet B-tilstand (lysstyrketilstand) vises, og at systemet er klar til at hente B-tilstandsdata.
BEMÆRK: B-Mode er systemets standardbilledtilstand. Systemet viser ekkoer i en todimensionel (2D) visning ved at tildele et lysstyrkeniveau baseret på ekkosignalamplituden. B-Mode er den mest effektive tilstand til lokalisering af anatomiske strukturer.- Gå til undersøgelsesbrowseren.
- Vælg Ny undersøgelse , og skriv studienavn og oplysninger, dvs. dato for undersøgelsen osv.
- Udfyld alle de nødvendige oplysninger i serienavnet, dvs. dyrestamme, ID, fødselsdato osv.
- Tryk på Udført; programmet er klar til B-mode billeddannelse.
- Anæstetik musen i anæstesiinduktionskammeret ved hjælp af 4% isofluran med en gasstrøm på 2 L/min afO2.
BEMÆRK: Ca. 4 minutter er tilstrækkelige til korrekt anæstesi (vejrtrækning omkring 50-60 vejrtrækninger pr. Minut). - Når musen er bedøvet, skal du ændre forbindelsen til bedøvelsesmaskinen for at rette isofluranen mod musens håndteringsbord.
- Placer den bedøvede mus på højre flanke på håndteringsbordet (opvarmet til 37 °C) med snuden i en næsekegle for at sikre, at musen bedøves ved hjælp af 2% isofluran med en gasstrøm på 0,8 L/min af O2 (figur 1A).
- Påfør en dråbe kunstige tårer på musens øjne for at forhindre tørhed, mens du er under anæstesi.
- Tape højre hånd, højre fod og hale fast på elektrodepuderne på dyreplatformen med klæbende gasbind.
BEMÆRK: Musens respirationshastighed og elektrokardiogram (EKG) registreres gennem elektrodepuderne.
3. Injektion af PANC1-celler i bugspytkirtlen ved US-GI-metode
- Desinficer musehuden med 70% ethanol og hold huden på venstre flanke strakt ved hjælp af klæbende gasbind.
BEMÆRK: Det er vigtigt at holde huden strakt for at reducere modstanden mod indsættelse af nålen og for at forhindre nåledeformationer. - Påfør ultralydsgel på maven og venstre flanke af musen ved hjælp af en 20 ml sprøjte (uden nålen).
- Brug højdekontrolknappen på den amerikanske transducer til at sænke transduceren for at røre musens venstre flanke og placere den på tværs af dyrets krop.
- Flyt transduceren for at visualisere bugspytkirtlen på transducerdisplayet ved hjælp af B-Mode-billeddannelse (figur 1B).
- Der fremstilles en 50 μL Hamilton-sprøjte, der indeholder 1 x 106 PANC1-celler suspenderet i 20 μL PBS, med en 30 mm 28 G-nål, og sprøjten anbringes på den relevante holder (figur 1C).
BEMÆRK: Før brug skal du desinficere sprøjtenålen med 70% ethanol i en periode på 5-10 minutter. - Brug holderens mikromanipulator til at sænke sprøjten til musehuden med nålens skrå opad og i samme plan som ultralydstransduceren og danner en vinkel på 45 ° med transduceren (figur 1D).
BEMÆRK: Fra dette trin og fremefter skal du fortsætte med at overvåge det amerikanske billede på displayet. - Brug mikromanipulatoren til at perforere huden og indsætte sprøjtenålen i bugspytkirtlen og observere det amerikanske billede på displayet for at følge dets bane (figur 1E).
BEMÆRK: Før injektion skal du tage halen af bugspytkirtlen som en reference, der er placeret bag milten og tæt på venstre nyre. - Når nålen er indsat i bugspytkirtlen, injiceres en 20 μL bolus indeholdende cellerne direkte i bugspytkirtlen ved at anvende konstant tryk på sprøjtestemplet (figur 1F).
BEMÆRK: Den korrekte injektionsprocedure kontrolleres ved tilstedeværelsen af en lille boble i bugspytkirtlen og strømmen af hypoechogen væske, som næppe er synlig fra nålespidsen. - Lad nålen være på plads i 5-10 s, efter at hele bolus er injiceret, og træk den derefter langsomt tilbage.
- Fjern den amerikanske transducer, rengør gelen fra flanken, og placer musen alene i et nyt bur. Overhold dyret, indtil det har genvundet tilstrækkelig bevidsthed til at opretholde sternal recumbency.
4.3D Amerikansk billeddannelse til overvågning af bugspytkirteltumorer hos mus
BEMÆRK: Evalueringen af tumorudvikling blev udført fra 8 dage efter celleinjektionen ved hjælp af det samme instrument, der blev brugt til den amerikanske guidede injektion (angivet i materialetabellen). Derfor matcher nogle procedurer, såsom systemantændelsen (trin 2.2.), anæstesi (trin 2.3. - 2.6.) og museplacering på dyreplatformen (trin 2.7.), fuldt ud det, der blev beskrevet ovenfor i protokollen.
- Før du starter den amerikanske billeddannelse, skal du indstille arbejdsstationen som vist i figur 2A.
- Fastgør transduceren på 3D-motorsystemet (figur 2A).
- Tænd for billedapparatet, og vælg Ny undersøgelse i undersøgelsesbrowseren.
- Placer musen i anæstesiinduktionskammeret (4% isofluran).
- Placer den bedøvede mus på højre flanke på håndteringsbordet opvarmet ved 37 °C med snuden i bedøvelsesrøret, og reducer isofluran til 2% (figur 2B).
BEMÆRK: Det er vigtigt, at musen placeres i samme position som den US-guidede injektion for at opretholde de samme anatomiske referencer. - Påfør en dråbe dyrlægesalve på musens øjne.
- Påfør et lag ultralydsgel på musens mave og venstre flanke.
- Placer 55 MHz-transduceren i tværretningen for at berøre venstre flankehud, således at bugspytkirtlen er omtrent centreret (figur 2C).
- Brug 3D-motoren til at erhverve billeder af hele bugspytkirtlen i tværretningen, ideelt set samle 90-100 billeder pr. Erhvervelse (antallet af rammer kan variere afhængigt af personligt valg).
- Vælg 3D-motorpositionen på kameraets touchpad.
- Angiv scanningsafstanden ved at flytte markøren for at få billeder af hele bugspytkirtlen fra begge ekstremiteter.
- Vælg Scan rammer, og begynd 3D-anskaffelse.
- Når 3D-billeddannelsen er færdig, skal du fjerne transduceren, rense gelen fra huden og placere musen alene i et nyt bur til genopretning. Overhold dyret, indtil det har genvundet tilstrækkelig bevidsthed til at opretholde sternal recumbency.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter den ovenfor beskrevne protokol blev mus først bedøvet i et isoflurankammer og anbragt på dyreplatformen (figur 1A). Bugspytkirtlen blev visualiseret med ultralydsbilleddannelse (figur 1B). En 50 μL Hamilton sprøjte blev fyldt med 1 x 106 PANC1 celler suspenderet i 20 μL PBS og anbragt på nåleholderen (figur 1C). Den optimale vinkel mellem sprøjten og den amerikanske transducer var 45° (figur 1D). Ved hjælp af mikromanipulatoren blev sprøjtenålen indsat i bugspytkirtlen, og dens bane blev observeret på det amerikanske billeddisplay (figur 1E). En 20 μL bolus af tumorceller blev derefter injiceret i bugspytkirtlen (figur 1F), og efter 10 s blev nålen trukket tilbage. Relevante handlinger for at forhindre rekyl af celler og deres efterfølgende lækage i bughulen blev forfulgt, såsom at anvende et konstant tryk under podningen, pause efter celleinjektion og bruge en tynd nål med en 30 ° skrå vinkel. Efter den amerikansk guidede injektion blev musens vægt overvåget hver dag for at vurdere eventuelle tegn på stress på grund af proceduren. Der blev ikke observeret nogen signifikant ændring i vægten af injicerede mus.
3D US-billeddannelse blev derefter anvendt til overvågning af tumorcelletransplantation og tumorudvikling. Den første billedoptagelse blev udført på dag 8 efter celleinjektion, efterfulgt af ugentlige opkøb (for i alt 6 opkøb). Under billeddannelse blev dyrene anbragt på højre flanke på den opvarmede (37 °C) platform og bedøvet ved indånding af isoflurangas (induktionsdosis ved 4% og vedligeholdelsesdosis ved 2%) (figur 2). 3D-erhvervelsen blev udført i B-tilstand ved hjælp af 3D-motoren, der gør det muligt for transduceren at scanne maven i forskellige sektioner vinkelret på dens akse. Der blev opnået en række 2D-billeder, som derefter blev samlet af analysesoftwaren og rekonstruerede det 3D-anatomiske billede af orglet (3D-gengivelse). For at udføre 3D-billeddannelse var det nødvendigt at synkronisere musens åndedrætsfaser med erhvervelsen af 3D-scanningen. Reproducerbarheden af protokollen blev bekræftet af tilstedeværelsen af tumormassen, en hypo-ekkogen struktur (repræsenteret med mørke farver) i halen af bugspytkirtlen, begyndende på dag 8, hos 16 ud af 20 (80%) dyr (figur 3A). Hos fire mus (20% af dyrene) blev udviklingen af tumormasse observeret 2 uger efter injektionen. Denne latenstid kunne spores tilbage til en suboptimal procedure for nåleindsættelse i bugspytkirtlen, hvilket forårsagede lækage af celler i bughinden.
Figur 3B viser det gennemsnitlige tumorvolumen (n = 16) evalueret ved amerikansk billeddannelse af den amerikansk guidede injektionsmusemodel. Dagen efter det sidste amerikanske opkøb blev mus aflivet først ved CO2 -indånding og derefter ved cervikal dislokation. Bughulen blev undersøgt, og tumormasserne blev explantet til histologisk analyse (figur 3C-E).
Figur 1: USA-guidet metode til etablering af en ortopisk PCa-musemodel . (A) Musen placeres på højre flanke på en særlig understøtning opvarmet ved 37 °C. (B) Den amerikanske transducer er placeret på tværs af dyrekroppen på miltniveau, og bugspytkirtlen visualiseres i B-tilstand. Flankebilledet af musemaven viser bugspytkirtlen (1) mellem milten (2) og venstre nyre (3). Skalastang: 2 mm. (C) Hamilton-sprøjten placeres på den relevante holder. (D) I denne situation er transduceren (2) og sprøjten (1) placeret i en vinkel på 45°. (E) Sprøjtens nål (1) indsættes i bugspytkirtlens hale lige under milten. Skalastang: 2 mm. (F) En bolus indeholdende 1 x 106 PANC1-celler i 20 μL PBS injiceres i bugspytkirtlens hale ved hjælp af en Hamilton-sprøjte med en 28 G-nål. Skalastang: 2 mm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Billedbehandlingsarbejdsstation, der bruges til overvågning af bugspytkirteltumorer hos mus . (A) Arbejdsplads til amerikansk billeddannelse. 1) 55 MHz transducer (2) Tabel til håndtering af mus; (3) 3D-motor; (4) Højdekontrolknap på amerikansk transducer. (B) Musen placeres på sin højre flanke på håndteringsbordet med snuden i bedøvelsesrøret (1), huden strækkes, og US gel påføres på højre flanke. (C) Transduceren sænkes for at røre musehuden og placeres på tværs af dyrekroppen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Udvikling af ortopisk PCa xenograft i musens bugspytkirtel . (A) 2D amerikansk billedoptagelse af tumormassen udviklet efter ekkostyret celleinjektion. Udviklingen af tumoren overvåges med amerikansk billeddannelse efter 8 dages celleinjektion, efterfulgt af en gang om ugen erhvervelse indtil dag 44, i alt 6 erhvervelser. Tumoren er repræsenteret af en hypo-ekkogen struktur i bugspytkirtlen parenchyma. Den hypo-ekkogene struktur er ekkografisk repræsenteret af et område med ekko af reduceret intensitet sammenlignet med det omgivende parenchyma eller en nærliggende struktur. Skalastang: 2 mm. (B) Tidsforløb af tumorvolumenet af ortopisk PDAC afledt af PANC1-celler. (C) Amerikansk billeddannelse af en tumormasse på dag 43 efter celleinjektion. Skalabjælke: 2 mm.3D gengengivelse af tumormassen er vist i indsatsen. (D) Efter billeddannelse aflives dyrene, og obduktion udføres. (1) Tumor masse; (2) En lille del af en sund bugspytkirtel; (3) Milt; (4) Mave; (5) Lever. Skalastang: 5 mm. (E) Hematoxylin og eosin farvning af tumormassen ved 4x forstørrelse. Skala bar: 200 μm. På højre overside af panelet, indsat af tumormassen, hvor bugspytkirtlen acinarceller stadig er synlige; 40x forstørrelse. Skala bar: 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Selvom brugen af amerikansk billeddannelse er udbredt i klinikken, beskrives tumorudvikling i mange prækliniske musemodeller normalt ved hjælp af bioluminescerende billeddannelse11. Sidstnævnte er en indirekte måde at evaluere tumor engraftment og ekspansion, og det giver heller ikke en pålidelig tumorvækst kinetik. I denne undersøgelse har vi anvendt amerikansk billeddannelse til udførelse af celleinjektion samt til overvågning af tumorudvikling. Den protokol, vi har beskrevet, og de resultater, vi har leveret, repræsenterer et relevant gennembrud i PCa-forskning.
Den amerikanske guidede metode, der er beskrevet her til injektion af bugspytkirteltumorceller, er minimalt invasiv og gør det muligt at overvinde mange ulemper forårsaget af den kirurgiske procedure, som normalt anvendes til at etablere en ortopisk PCa-musemodel. Selvom indikationer på dødelighed eller bivirkninger på grund af det kirurgiske indgreb mangler i litteraturen, tyder vores erfaring på, at den kirurgiske metode producerer højere postoperativ dødelighed i en lav procentdel af tilfælde (ca. 10%) med hyppig lidelse hos dyr, hvilket kræver en vis mængde restitutionstid12. Derudover forhindrer stingene, der påføres efter operationen, korrekt anvendelse af billeddannelsesprocedurer. Dette resulterer i erhvervelse af amerikanske billeder med meget dårlig kvalitet, hvilket fører til unøjagtig dataekstrapolering forårsaget af artefakter, såsom efterklang og skyggeområder. Under hensyntagen til alle disse fakta foretrækkes en metode, der ikke har brug for en kirurgisk procedure til etablering af en ortopisk musemodel, og anbefales kraftigt til prækliniske forskningsformål. Desuden er genopretningstiden fra cellepodning minimalt invasiv, og dyrenes lidelse er minimal i den USA-guidede metode. En stor fordel er, at den USA-guidede metode er kompatibel med brugen af isofluranbedøvelse, som muliggør hurtigere induktion og genopretning, relativt mindre sparsom effekt på kardiovaskulær funktion og cerebral blodgennemstrømningsautoregulering sammenlignet med andre anæstesimetoder (dvs. ketamin / xylazinopløsning). Samlet set gør den ubetydelige metabolisme af isofluran det særligt nyttigt i bedøvelsesbehandling13. Faktisk genvinder dyrene ca. 5 minutter efter forsøgets afslutning tilstrækkelig bevidsthed til at opretholde sternal recumbency. Derudover er mus præmedicineret med et smertestillende middel (carprofen) for at minimere smerte, og ingen postoperative behandlinger er nødvendige på grund af den hurtige og fuldstændige genopretning.
Ikke desto mindre er der nogle afgørende fejlfindingstrin i proceduren, der skal overvejes. Antallet af celler, der skal podes, må ikke overstige 1 x 106 celler, og mængden af cellepodekultur må ikke være større end 20 μL for at undgå risiko for cellelækage ud af bugspytkirtlen. Celleinjektion skal udføres umiddelbart efter deres løsrivelse for at undgå et fald i cellens vitalitet. Efter celleinjektion er det nødvendigt at vente i mindst 10 s, før nålen fjernes for at undgå lækage af celler ud af bugspytkirtlen.
Et af de mest kritiske aspekter af den nuværende protokol vedrører placeringen af musen på dyreplatformen. Musen skal ligge på højre side på dyrets håndteringsbord, og skindet skal strækkes. Hvis huden ikke strækkes ordentligt under injektionen, vil nålen kæmpe for at gennembore og komme ind i bugspytkirtlen med risiko for, at celler spildes ud af bugspytkirtlen. Den ultralydsstyrede injektion til fremstilling af en PCa-musemodel blev først beskrevet af Huynh et al. i 201114. Her fokuserede vi på den metode, der var egnet til at producere en sådan model, og beskrev detaljeret alle trin for at gøre den reproducerbar. Desuden har vi sammenlignet med Huynh et al.14 introduceret nogle innovationer, der hovedsageligt er relateret til de fremskridt inden for amerikansk teknologi, der fandt sted i de sidste 5 år. I den nuværende protokol anbefales det kraftigt at bruge en Hamilton-sprøjte med en stiv nål og en skrå vinkel på 30° for at opnå bedre nøjagtighed under celleinjektion og for at minimere cellelækage. Endelig blev mus under den USA-guidede injektion fastgjort på højre side på dyreplatformen, mens 14 mus i Huynh et al. blev placeret i dorsal recumbency. Musens sideposition gør det muligt at visualisere halen af bugspytkirtlen lige under milten, som fungerer som en visuel reference (figur 1B) under celleinjektionen, hvilket sikrer reproducerbarheden af teknikken.
Som med andre teknikker er der også nogle begrænsninger med den USA-guidede procedure. Den største begrænsning er, at injektionen kun kan udføres i bugspytkirtlens hale, fordi kroppen og hovedet er dækket af andre organer og er vanskelige at nå med nålen. Desuden er en anden begrænsning forbundet med brugen af amerikansk billeddannelse til overvågning af tumorvækst manglende evne til at visualisere hele tumormassen, når den bliver for stor, efter 6 ugers podning (figur 3C-E). Selvom sådanne store mængder ikke efterligner sygdommens kliniske forløb.
En anden fordel ved PCa-modellen opnået med protokollen beskrevet her er den langsomme celleindkapsling og vækst af tumormasserne (figur 3B). Dette er ideelt til præcis identifikation af udgangspunktet for farmakologisk intervention og bedre overvågning af virkningerne af terapeutiske interventioner over tid.
Endelig er den beskrevne teknik et eksempel på implementering af 3R-principperne, der involverer forfining af teknik og udvikling af procedure, der minimerer smerte, lidelse, nød eller varig skade, hvilket direkte forbedrer dyrenes velfærd i forskning.
Fremtidige anvendelser af PCa-modellen opnået ved den USA-guidede injektion omfatter undersøgelser rettet mod udvikling af passende terapeutiske behandlinger eller behandlingskombinationer. Faktisk kunne brugen af sådanne innovative in vivo-teknikker kombineres med brugen af små molekyler, f.eks. antistoffer, antistoffragmenter og antistof-lægemiddelkonjugater (ADC), med en teragnostisk tilgang. Sidstnævnte kunne bruges alene til terapeutiske formål, som vores gruppe har vist i vores nylige arbejde15 eller efter en ordentlig fluorophorkonjugation med det formål at overvåge tumorvækst.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC, tilskud nr. 15627, IG 21510 og IG 19766) til AA, PRIN Italiensk ministerium for universitet og forskning (MIUR). Udnyttelse af grundlæggende viden om ionkanalnetværk inden for kræft til innovative terapeutiske strategier (LIONESS) 20174TB8KW til AA, pHioniC: Den Europæiske Unions Horizon 2020-tilskud nr. 813834 til AA. CD blev støttet af et AIRC-stipendium til Italien ID 24020.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm Petri dish | Sarstedt, Germany | P5856 | |
| 3D-Mode package | Visualsonics Fujifilm, Italy | Includes the 3D Motor; necessary for volumetric imaging | |
| Aquasonic 100, Sonypack 5 lt Ultrasound Transmission Gel | PARKER LABORATORIES, INC. | 150 | Gel for ultrasound |
| Athymic Mice (Nude-Foxn1nu) | ENVIGO, Italy | 69 | 20 females, 8 weeks old, Athymic Nude-Foxn1nu, 20-22 g body weight |
| CO2 Incubator Function Line | Heraeus Instruments, Germany | BB16-ICN2 | |
| Display of ECG, Respiration Waveform and body temperature | Visualsonics Fujifilm, Italy | 11426 | |
| DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) | Euroclone Spa, Italy | ECM0101L | |
| DPBS (Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline) | Euroclone Spa, Italy | ECB4004L | |
| Eppendorf (1.5mL) | Sarstedt, Germany | 72.690.001 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Euroclone Spa, Italy | ECS0170L | |
| Hamilton Needle Pointstyle 4, lenght 30 mm, 28 Gauge | Permax S.r.l., Italy | 7803-02 | |
| Hamilton Syringe 705RM 50 µL | Permax S.r.l., Italy | 7637-01 | |
| Isoflo (250 mL) | Ecuphar | 7081219 | |
| L-glutamine 100X | Euroclone Spa, Italy | ECB3000D | |
| Mouse Handling table II | Visualsonics Fujifilm, Italy | 50249 | |
| MX550D: 55 MHz MX Series Transducer | Visualsonics Fujifilm, Italy | 51069 | Ultrasound Transducers |
| Oxygen/isofluorane mixer | Angelo Franceschini S.r.l. | LFY-I-5A | |
| PANC1 cell line | American Type Culture Collection (ATCC), USA | CRL-1469 | |
| Rimadyl (carprofen) | Pfizer | 11319 | 20 mL, injection solution |
| Trypsin-EDTA 1X in PBS | Euroclone Spa, Italy | ECB3052D | |
| Vet ointment for eyes, Systane nighttime | Alcon | 509/28555-1 | |
| Vevo Compact Dual Anesthesia System (Tabletop Version) | Visualsonics Fujifilm, Italy | VS-12055 | complete with gas chamber |
| Vevo Imaging Station 2 | Visualsonics Fujifilm, Italy | VS-11983 | Imaging WorkStation 1 plus Imaging Station Extension with injection mount |
| Vevo Lab | Visualsonics Fujifilm, Italy | VS-20034 | Data Analysis Software |
| Vevo LAZR-X Photoacoustic Imaging System | Visualsonics Fujifilm, Italy | VS-20054 | Includes analytic software package for B-mode |
| Vevo Photoacoustic Enclosure | Visualsonics Fujifilm, Italy | 53157 |
References
- Zeng, S., et al. Chemoresistance in pancreatic cancer. International Journal of Molecular Sciences. 20 (18), 4504 (2019).
- Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).
- Rahib, L., et al. Projecting cancer incidence and deaths to 2030: The unexpected burden of thyroid, liver, and pancreas cancers in the united states. Cancer Research. 74 (11), 2913-2921 (2014).
- Rawla, P., Sunkara, T., Gaduputi, V. Epidemiology of pancreatic cancer: Global trends, etiology and risk factors. World Journal of Oncology. 10 (1), 10 (2019).
- Herreros-Villanueva, M., Hijona, E., Cosme, A., Bujanda, L. Mouse models of pancreatic cancer. World Journal of Gastroenterology. 18 (12), 1286-1294 (2012).
- Hofschroer, V., et al. Ion channels orchestrate pancreatic ductal adenocarcinoma progression and therapy. Frontiers in Pharmacology. 11, 586599 (2021).
- Adamska, A., Domenichini, A., Falasca, M. Pancreatic ductal adenocarcinoma: Current and evolving therapies. International Journal of Molecular Sciences. 18 (7), 1338 (2017).
- Qiu, W., Su, G. H. Development of orthotopic pancreatic tumor mouse models. Methods in Molecular Biology. 980, 215-223 (2013).
- Killion, J. J., Radinsky, R., Fidler, I. J. Orthotopic models are necessary to predict therapy of transplantable tumors in mice. Cancer Metastasis Reviews. 17 (3), 279-284 (1998).
- Qiu, W., Su, G. H. Challenges and advances in mouse modeling for human pancreatic tumorigenesis and metastasis. Cancer and Metastasis Reviews. 32 (1-2), 83-107 (2013).
- Erstad, D. J., et al. Orthotopic and heterotopic murine models of pancreatic cancer and their different responses to FOLFIRINOX chemotherapy. DMM Disease Models and Mechanisms. 11 (7), (2018).
- Lottini, T., et al. Micro-ultrasound, non-linear contrast mode with microbubbles and Optical Flow software tool: together for a new translational method in the study of the tumoral rheology microenvironment. WMIC 2017: Imaging the Future from Molecules to Medicine. , (2017).
- Ludders, J. W. Advantages and guidelines for using isoflurane. The Veterinary Clinics of North America Small Animal Practice. 22 (2), 328-331 (1992).
- Huynh, S., et al. Development of an orthotopic human pancreatic cancer xenograft model using ultrasound guided injection of cells. PLoS One. 6 (5), 20330 (2011).
- Duranti, C., et al. Harnessing the hERG1/β1 Integrin Complex via a Novel Bispecific Single-chain Antibody: An Effective Strategy against Solid Cancers. Molecular Cancer Therapeutics. 20 (8), 1338-1349 (2021).
