Summary
Wir präsentieren ein Protokoll zur Erstellung eines minimalinvasiven orthotopen Bauchspeicheldrüsenkrebsmodells durch ultraschallgesteuerte Injektion menschlicher Bauchspeicheldrüsenkrebszellen und die anschließende Überwachung des Tumorwachstums in vivo durch Ultraschallbildgebung.
Abstract
Bauchspeicheldrüsenkrebs (PCa) stellt eine der tödlichsten Krebsarten weltweit dar. Die Gründe für die PCa-Malignität liegen hauptsächlich in ihrem intrinsischen bösartigen Verhalten und der hohen Resistenz gegen therapeutische Behandlungen. Trotz vieler Bemühungen haben sowohl die Standardchemotherapie als auch innovative Zieltherapien erheblich versagt, wenn sie von der präklinischen Bewertung in die klinische Umgebung überführt wurden. In diesem Szenario ist die Entwicklung präklinischer Mausmodelle, die die in vivo Eigenschaften von PCa besser nachahmen, dringend erforderlich, um neu entwickelte Medikamente zu testen. Das vorliegende Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Erzeugung eines Mausmodells von PCa, dargestellt durch ein orthotopes Xenograft, das durch ultraschallgesteuerte Injektion menschlicher Pankreastumorzellen erhalten wird. Mit einem solchen zuverlässigen und minimal-invasiven Protokoll liefern wir auch den Nachweis der In-vivo-Anpflanzung und der Entwicklung von Tumormassen, die durch Ultraschall (US) -Bildgebung überwacht werden können. Ein bemerkenswerter Aspekt des hier beschriebenen PCa-Modells ist die langsame Entwicklung der Tumormassen im Laufe der Zeit, die eine genaue Identifizierung des Ansatzpunktes für pharmakologische Behandlungen und eine bessere Überwachung der Wirkung therapeutischer Interventionen ermöglicht. Darüber hinaus ist die hier beschriebene Technik ein Beispiel für die Umsetzung der 3R-Prinzipien, da sie Schmerzen und Leiden minimiert und das Wohlergehen von Tieren in der Forschung direkt verbessert.
Introduction
PCa und seine häufigste Form, das Pankreasduktale Adenokarzinom (PDAC), ist eine der häufigsten krebsbedingten Todesursachen mit einer 1-Jahres-Überlebensrate von weniger als 20% und einer 5-Jahres-Überlebensrate von 8%, unabhängig vom Stadium 1,2. Die Krankheit verläuft fast immer tödlich, und ihre Inzidenz wird in den nächsten Jahren voraussichtlich kontinuierlich zunehmen, im Gegensatz zu anderen Krebsarten, deren Inzidenz abnimmt3. Faktoren wie die späte Krebserkennung, die Tendenz zur schnellen Progression und das Fehlen spezifischer Therapien führen zu einer schlechten Prognose vonPCa 4. Dank der Entwicklung genauerer präklinischer Mausmodelle wurden große Fortschritte in der Krebsforschung erzielt. Die Modelle haben geeignete Einblicke in das Verständnis des molekularen Mechanismus geliefert, der Krebs zugrunde liegt, und in die Entwicklung neuer Therapien5. Diese Fortschritte treffen schlecht auf PCa zu, das trotz großer Bemühungen in jüngster Zeit gegen aktuelle chemotherapeutische Therapien resistent bleibt1. Aus diesen Gründen ist die Entwicklung neuartiger Ansätze zur Verbesserung der Patientenperspektiven zwingend erforderlich.
Im Laufe der Jahre wurden viele PCa-Mausmodelle entwickelt, darunter Xenotransplantate, die heutzutage die am weitesten verbreiteten Modelle sind5. Xenograft-Modelle werden je nach Lage der implantierten Tumorzellen als subkutan heterotopisch und orthotopisch klassifiziert. Subkutane heterotope Xenotransplantate sind einfacher und billiger zu erreichen, übersehen aber bestimmte charakteristische Merkmale von PCa (d.h. die eigentümliche Tumormikroumgebung, die durch die Ansammlung von fibrotischem Gewebe, Hypoxie, Säure und Angiogenese gekennzeichnet ist)6,7. Dies erklärt, warum subkutane Xenotransplantate oft keine robusten Daten für therapeutische Behandlungen liefern, was bei der Translation in das klinische Umfeld zu Misserfolgen führt8. Auf der anderen Seite ähneln orthotope Xenotransplantate der Tumormikroumgebung stärker, was zu einer besseren Nachahmung der natürlichen Entwicklung der Krankheit führt. Darüber hinaus sind orthotope Xenotransplantate besser geeignet, um den metastatischen Prozess und die invasiven Merkmale von PCa zu untersuchen, die in subkutanen Modellen fast nicht auftreten9. Insgesamt werden orthotope Xenograft-Mausmodelle heutzutage bevorzugt, um präklinische Arzneimitteltests durchzuführen 9,10. Orthotope Xenotransplantate verlassen sich normalerweise auf chirurgische Verfahren, um entweder Zellen oder sehr kleine Tumorgewebestücke in die Bauchspeicheldrüse zu implantieren. Tatsächlich wurden in den letzten Jahrzehnten mehrere Arbeiten veröffentlicht, die auf chirurgischen Modellen von PCa basieren11. Die Qualität und das Ergebnis des chirurgischen Eingriffs zur Etablierung eines orthotopen Tumormodells hängen jedoch stark von den technischen Fähigkeiten des Bedieners ab. Ein weiterer wichtiger Punkt für ein erfolgreiches orthotopes PCa-Xenograft für einen translationalen klinischen Ansatz ist die Möglichkeit, lokalisierte Erkrankungen mit vorhersagbarer Wachstumskinetik festzustellen.
Um diese Probleme anzugehen, beschreiben wir hier ein innovatives Verfahren zur Herstellung eines orthotopen PCa-Xenotransplantats, das die ultraschallgesteuerte (US)-gesteuerte Injektion menschlicher PCa-Zellen in den Schwanz der Bauchspeicheldrüse bei immundefizienten Mäusen nutzt. Dieses Verfahren generiert ein zuverlässiges PCa-Mausmodell. Das Tumorwachstum wird in vivo von der US-Bildgebung verfolgt.
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Protocol
Das vorliegende Protokoll wurde vom italienischen Gesundheitsministerium mit der Zulassungsnummer 843/2020-PR genehmigt. Um aseptische Bedingungen zu gewährleisten, wurden die Tiere im Barriereraum des Forschungstiervivariums (Ce.S.A.L.) der Universität Florenz gehalten. Alle Eingriffe wurden in demselben Raum durchgeführt, in dem die Mäuse in der LIGeMA-Einrichtung der Universität Florenz (Italien) untergebracht waren.
1. Zellpräparation
- Kultur von PCa-Zellen aus der PCa-Zelllinie in einer 100 mm Petrischale mit Dulbeccos modifiziertem Adlermedium (DMEM), ergänzt mit 2% L-Glutamin und 10% Fetal Bovine Serum (FBS).
- Inkubieren Sie die Zellen in Normoxia bei 37 °C mit 5%CO2.
- Lösen Sie die Zellen mit Trypsin. Zählen und resuspendieren Sie 1 x 106 Zellen in 20 μL PBS, 1 h vor der Impfung.
2. Mauspräparation für die ultraschallgesteuerte Injektion (US-GI)
HINWEIS: Die folgenden Schritte wurden unter sterilen Bedingungen durchgeführt. Das gesamte Verfahren der US-geführten Injektion, vom Beginn der Anästhesie bis zur Entfernung der Maus von der Tierplattform, dauert etwa 10-12 Minuten plus 5 Minuten für eine vollständige Mauserholung.
- Kurz vor dem Eingriff Carprofen (NSAID) subkutan (s.c.) in einer Enddosis von 5 mg/kg oder Tramadol in einer Enddosis von 5 mg/kg mit einer Tuberkulinspritze mit einer 27 G-Nadel verabreichen.
HINWEIS: Für das vorliegende Protokoll wurden 20 Athymic Nude-Foxn1nu weibliche Mäuse verwendet. Die Mäuse waren 8 Wochen alt und wogen 20-22 g. - Schalten Sie den Imager ein und wählen Sie im Anwendungsmenü des Wandlerbereichs die Option Maus (klein) Bauch . Stellen Sie sicher, dass das Fenster B-Mode (Helligkeitsmodus) angezeigt wird und das System bereit ist, B-Mode-Daten zu erfassen.
HINWEIS: Der B-Modus ist der Standard-Imaging-Modus des Systems. Das System zeigt Echos in einer zweidimensionalen (2D) Ansicht an, indem es eine Helligkeitsstufe basierend auf der Amplitude des Echosignals zuweist. B-Mode ist der effektivste Modus zur Lokalisierung anatomischer Strukturen.- Rufen Sie den Studienbrowser auf.
- Wählen Sie Neue Studie und geben Sie den Namen und die Informationen der Studie ein, z. B. Datum der Studie usw.
- Geben Sie alle notwendigen Informationen im Seriennamen ein, d. H. Tierstamm, ID, Geburtsdatum usw.
- Tippen Sie auf Fertig; das Programm ist bereit für die B-Mode-Bildgebung.
- Betäuben Sie die Maus in der Anästhesieinduktionskammer mit 4% Isofluran mit einem Gasfluss von 2 l / min vonO2.
HINWEIS: Ungefähr 4 Minuten sind ausreichend für die richtige Anästhesie (Atmung ca. 50-60 Atemzüge pro Minute). - Sobald die Maus betäubt ist, ändern Sie die Verbindung des Anästhesiegeräts, um das Isofluran in Richtung der Maushandhabungstabelle zu lenken.
- Legen Sie die betäubte Maus an der rechten Flanke mit der Schnauze in einem Nasenkegel auf den (auf 37 °C erhitzten) Handlingtisch, um sicherzustellen, dass die Maus mit 2% Isofluran mit einem Gasfluss von 0,8 l/minO2 betäubt wird (Abbildung 1A).
- Tragen Sie einen Tropfen künstlicher Tränen auf die Augen der Maus auf, um Trockenheit während der Narkose zu verhindern.
- Kleben Sie die rechte Hand, den rechten Fuß und den Schwanz mit Klebegaze fest auf die Elektrodenpads auf der Tierplattform.
HINWEIS: Die Atemfrequenz der Maus und das Elektrokardiogramm (EKG) werden über die Elektrodenpads aufgezeichnet.
3. Injektion von PANC1-Zellen in die Bauchspeicheldrüse mittels US-GI-Methode
- Desinfizieren Sie die Maushaut mit 70% Ethanol und halten Sie die Haut der linken Flanke mit Klebegaze gestreckt.
HINWEIS: Es ist wichtig, die Haut gedehnt zu halten, um den Widerstand gegen das Einführen der Nadel zu verringern und Nadelverformungen zu vermeiden. - Tragen Sie Ultraschallgel mit einer 20-ml-Spritze (ohne Nadel) auf den Bauch und die linke Flanke der Maus auf.
- Senken Sie den Schallkopf mit dem Höhenregler des US-Wandlers ab, um die linke Flanke der Maus zu berühren, und platzieren Sie ihn quer zum Körper des Tieres.
- Bewegen Sie den Schallkopf, um die Bauchspeicheldrüse auf dem Display des Schallkopfes mithilfe der B-Mode-Bildgebung zu visualisieren (Abbildung 1B).
- Bereiten Sie eine 50-μL-Hamilton-Spritze mit 1 x 106 PANC1-Zellen in 20 μl PBS mit einer 30-mm-28-G-Nadel vor und legen Sie die Spritze auf den entsprechenden Halter (Abbildung 1C).
HINWEIS: Vor der Verwendung desinfizieren Sie die Spritzennadel mit 70% Ethanol für einen Zeitraum von 5-10 Minuten. - Senken Sie die Spritze mit dem Mikromanipulator des Halters auf die Maushaut, wobei die Nadelabschrägung nach oben und in derselben Ebene wie der Ultraschallwandler liegt, wobei ein Winkel von 45° mit dem Schallkopf gebildet wird (Abbildung 1D).
HINWEIS: Fahren Sie ab diesem Schritt fort, indem Sie das US-Bild auf dem Display überwachen. - Perforieren Sie die Haut mit dem Mikromanipulator, führen Sie die Spritzennadel in die Bauchspeicheldrüse ein und beobachten Sie das US-Bild auf dem Display, um seiner Flugbahn zu folgen (Abbildung 1E).
HINWEIS: Nehmen Sie vor der Injektion den Schwanz der Bauchspeicheldrüse als Referenz, der sich hinter der Milz und in der Nähe der linken Niere befindet. - Sobald die Nadel in die Bauchspeicheldrüse eingeführt wurde, injizieren Sie einen 20 μL Bolus, der die Zellen enthält, direkt in die Bauchspeicheldrüse, indem Sie konstanten Druck auf den Spritzenkolben ausüben (Abbildung 1F).
HINWEIS: Das korrekte Injektionsverfahren wird durch das Vorhandensein einer kleinen Blase in der Bauchspeicheldrüse und den Fluss von hypoechogener Flüssigkeit überprüft, die von der Nadelspitze aus kaum sichtbar ist. - Lassen Sie die Nadel für 5-10 s an Ort und Stelle, nachdem der gesamte Bolus injiziert wurde, und ziehen Sie sie dann langsam zurück.
- Entfernen Sie den US-Wandler, reinigen Sie das Gel von der Flanke und setzen Sie die Maus allein in einen neuen Käfig. Beobachten Sie das Tier, bis es wieder genügend Bewusstsein erlangt hat, um die sternale Liege aufrechtzuerhalten.
4.3D US-Bildgebung zur Überwachung von Pankreastumoren bei Mäusen
HINWEIS: Die Bewertung der Tumorentwicklung wurde ab 8 Tagen nach der Zellinjektion mit dem gleichen Instrument durchgeführt, das für die US-geführte Injektion verwendet wurde (aufgeführt in der Materialtabelle). Daher stimmen einige Verfahren, wie die Systemzündung (Schritt 2.2.), die Anästhesie (Schritte 2.3. - 2.6.) und die Platzierung der Maus auf der Tierplattform (Schritt 2.7.), vollständig mit dem überein, was oben im Protokoll beschrieben wurde.
- Bevor Sie mit dem US-Imaging beginnen, richten Sie die Arbeitsstation wie in Abbildung 2A dargestellt ein.
- Befestigen Sie den Aufnehmer am 3D-Motorsystem (Abbildung 2A).
- Schalten Sie den Imager ein und wählen Sie im Studienbrowser Neue Studie aus.
- Legen Sie die Maus in die Anästhesie-Induktionskammer (4% Isofluran).
- Legen Sie die betäubte Maus auf der rechten Flanke mit der Schnauze im Narkoserohr auf den auf 37 °C erhitzten Handlingtisch und reduzieren Sie Isofluran auf 2% (Abbildung 2B).
HINWEIS: Es ist wichtig, dass die Maus in die gleiche Position wie die US-geführte Injektion gebracht wird, um die gleichen anatomischen Referenzen beizubehalten. - Tragen Sie einen Tropfen Tierarztsalbe auf die Augen der Maus auf.
- Tragen Sie eine Schicht Ultraschallgel auf den Bauch und die linke Flanke der Maus auf.
- Positionieren Sie den 55-MHz-Wandler in der Querausrichtung, um die linke Flankenhaut so zu berühren, dass die Bauchspeicheldrüse annähernd zentriert ist (Abbildung 2C).
- Verwenden Sie den 3D-Motor, um Bilder der gesamten Bauchspeicheldrüse in der Querausrichtung aufzunehmen, idealerweise 90-100 Bilder pro Aufnahme (die Anzahl der Bilder kann je nach persönlicher Wahl variieren).
- Wählen Sie die 3D-Motorposition auf dem Imager-Touchpad.
- Geben Sie die Scanentfernung an, indem Sie den Cursor bewegen, um Bilder der gesamten Bauchspeicheldrüse von beiden Extremitäten aufzunehmen.
- Wählen Sie Scan Frames (Bilder scannen ) und beginnen Sie mit der 3D-Aufnahme.
- Sobald die 3D-Bildgebung abgeschlossen ist, entfernen Sie den Schallkopf, reinigen Sie das Gel von der Haut und legen Sie die Maus allein in einen neuen Käfig zur Wiederherstellung. Beobachten Sie das Tier, bis es wieder genügend Bewusstsein erlangt hat, um die sternale Liege aufrechtzuerhalten.
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Representative Results
Nach dem oben beschriebenen Protokoll wurden die Mäuse zunächst in einer Isoflurankammer betäubt und auf die Tierplattform gesetzt (Abbildung 1A). Die Bauchspeicheldrüse wurde mit Ultraschallbildgebung sichtbar gemacht (Abbildung 1B). Eine 50 μL Hamilton-Spritze wurde mit 1 x 106 PANC1-Zellen beladen, die in 20 μL PBS suspendiert und auf den Nadelhalter gelegt wurden (Abbildung 1C). Der optimale Winkel zwischen der Spritze und dem US-Schallkopf betrug 45° (Abbildung 1D). Mit dem Mikromanipulator wurde die Spritzennadel in die Bauchspeicheldrüse eingeführt und ihre Flugbahn auf dem US-Imager-Display beobachtet (Abbildung 1E). Ein 20 μL Bolus von Tumorzellen wurde dann in die Bauchspeicheldrüse injiziert (Abbildung 1F) und nach 10 s wurde die Nadel zurückgezogen. Relevante Maßnahmen zur Verhinderung des Rückstoßes von Zellen und deren anschließendem Austreten in die Peritonealhöhle wurden verfolgt, wie z.B. die Anwendung eines konstanten Drucks während der Impfung, die Pause nach der Zellinjektion und die Verwendung einer dünnen Nadel mit einem Fasenwinkel von 30°. Nach der US-geführten Injektion wurde das Gewicht der Mäuse täglich überwacht, um Anzeichen von Stress aufgrund des Verfahrens zu beurteilen. Es wurde keine signifikante Veränderung des Gewichts der injizierten Mäuse beobachtet.
Die 3D-US-Bildgebung wurde dann angewendet, um das Engraftment und die Tumorentwicklung von Tumorzellen zu überwachen. Die erste Bildaufnahme wurde am 8. Tag nach der Zellinjektion durchgeführt, gefolgt von wöchentlichen Aufnahmen (für insgesamt 6 Aufnahmen). Während der Bildgebung wurden die Tiere auf der rechten Flanke auf die erwärmte (37 °C) Plattform gesetzt und durch Einatmen von Isoflurangas (Induktionsdosis bei 4% und Erhaltungsdosis bei 2%) betäubt (Abbildung 2). Die 3D-Erfassung wurde im B-Modus mit dem 3D-Motor durchgeführt, der es dem Wandler ermöglicht, den Bauch in verschiedenen Abschnitten senkrecht zu seiner Achse zu scannen. Es wurde eine Reihe von 2D-Bildern erhalten, die dann von der Analysesoftware zusammengesetzt wurden, um das anatomische 3D-Bild des Organs zu rekonstruieren (3D-Rerendering). Um die 3D-Bildgebung durchzuführen, war es notwendig, die Atemphasen der Maus mit der Aufnahme des 3D-Scans zu synchronisieren. Die Reproduzierbarkeit des Protokolls wurde durch das Vorhandensein der Tumormasse, einer hypo-echogenen Struktur (dargestellt mit dunklen Farben) im Schwanz der Bauchspeicheldrüse, ab Tag 8 bei 16 von 20 (80%) Tieren bestätigt (Abbildung 3A). Bei vier Mäusen (20% der Tiere) wurde die Entwicklung von Tumormasse 2 Wochen nach der Injektion beobachtet. Diese Latenz konnte auf ein suboptimales Verfahren des Nadeleinführens in die Bauchspeicheldrüse zurückgeführt werden, das ein Austreten von Zellen in das Peritoneum verursachte.
Abbildung 3B zeigt das mittlere Tumorvolumen (n = 16), das durch US-Bildgebung des US-geführten Injektionsmausmodells ausgewertet wurde. Am Tag nach der letzten US-Akquisition wurden Mäuse zuerst durch CO2 -Inhalation und dann durch zervikale Dislokation eingeschläfert. Die Bauchhöhle wurde untersucht und die Tumormassen zur histologischen Analyse explantiert (Abbildung 3C-E).
Abbildung 1: US-geführte Methode zur Etablierung eines orthotopen PCa-Mausmodells . (A) Die Maus wird auf der rechten Flanke auf einer speziellen, auf 37 °C erhitzten Stütze platziert. (B) Der US-Schallkopf befindet sich quer zum Tierkörper auf Höhe der Milz und die Bauchspeicheldrüse wird im B-Modus visualisiert. Die Flankenansicht des Mausabdomens zeigt die Bauchspeicheldrüse (1) zwischen Milz (2) und linker Niere (3). Maßstabsstab: 2 mm. (C) Die Hamilton-Spritze wird auf den entsprechenden Halter gelegt. (D) In dieser Situation werden der Schallkopf (2) und die Spritze (1) in einem Winkel von 45° positioniert. (E) Die Nadel der Spritze (1) wird in den Schwanz der Bauchspeicheldrüse eingeführt, direkt unter der Milz. Maßstabsstab: 2 mm. (F) Ein Bolus, der 1 x 106 PANC1-Zellen in 20 μL PBS enthält, wird mit einer Hamilton-Spritze mit einer 28-G-Nadel in den Schwanz der Bauchspeicheldrüse injiziert. Maßstabsleiste: 2 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Bildgebende Workstation zur Überwachung von Pankreastumoren bei Mäusen . (A) Arbeitsplatz für US-Bildgebung. (1) 55-MHz-Wandler; (2) Maushandhabungstabelle; (3) 3D-Motor; (4) Höhenregler des US-Wandlers. (B) Die Maus wird auf der rechten Flanke mit der Schnauze im Anästhesieröhrchen (1) auf den Handhabungstisch gelegt, die Haut wird gedehnt und das US-Gel wird auf die rechte Flanke aufgetragen. (C) Der Schallkopf wird abgesenkt, um die Maushaut zu berühren, und quer zum Tierkörper positioniert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Entwicklung des orthotopen PCa-Xenografts in der Bauchspeicheldrüse der Maus . (A) 2D-US-Bildaufnahme der Tumormasse, die nach echogesteuerter Zellinjektion entwickelt wurde. Die Entwicklung des Tumors wird mit US-Bildgebung nach 8 Tagen Zellinjektion überwacht, gefolgt von einer einmal wöchentlichen Akquisition bis zum 44. Tag, für insgesamt 6 Akquisitionen. Der Tumor wird durch eine hypoechogene Struktur im Pankreasparenchym dargestellt. Die hypoechogene Struktur wird echographisch durch einen Bereich mit Echos reduzierter Intensität im Vergleich zum umgebenden Parenchym oder einer benachbarten Struktur dargestellt. Maßstabsbalken: 2 mm. (B) Zeitlicher Verlauf des Tumorvolumens des orthotopen PDAC aus PANC1-Zellen. (C) US-Bildgebungsaufnahme einer Tumormasse am Tag 43 nach Zellinjektion. Maßstabsbalken: 2 mm.3D Re-Rendering der Tumormasse ist im Einschub dargestellt. (D) Nach der Bildgebung werden die Tiere eingeschläfert und eine Nekropsieuntersuchung durchgeführt. (1) Tumormasse; (2) Eine kleine Portion einer gesunden Bauchspeicheldrüse; (3) Milz; (4) Magen; (5) Leber. Maßstabsleiste: 5 mm. (E) Hämatoxylin- und Eosinfärbung der Tumormasse bei 4-facher Vergrößerung. Maßstabsleiste: 200 μm. Auf der rechten Oberseite des Panels, Einschub der Tumormasse, in der noch Pankreas-Azinuszellen sichtbar sind; 40-fache Vergrößerung. Maßstabsleiste: 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Obwohl der Einsatz der US-Bildgebung in der Klinik weit verbreitet ist, wird die Tumorentwicklung in vielen präklinischen Mausmodellen in der Regel mittels biolumineszierender Bildgebung beschrieben11. Letzteres ist ein indirekter Weg, um die Tumortransplantation und -expansion zu bewerten, und es bietet auch keine zuverlässige Tumorwachstumskinetik. In der vorliegenden Studie haben wir die US-Bildgebung sowohl zur Durchführung der Zellinjektion als auch zur Überwachung der Tumorentwicklung eingesetzt. Das von uns beschriebene Protokoll und die von uns gelieferten Ergebnisse stellen einen relevanten Durchbruch in der PCa-Forschung dar.
Die hier beschriebene US-geführte Methode zur Injektion von Tumorzellen der Bauchspeicheldrüse ist minimalinvasiv und ermöglicht es, viele Nachteile zu überwinden, die durch den chirurgischen Eingriff verursacht werden, der normalerweise zur Erstellung eines orthotopen PCa-Mausmodells angewendet wird. Obwohl in der Literatur Hinweise auf Mortalitätsrate oder Nebenwirkungen aufgrund des chirurgischen Eingriffs fehlen, deutet unsere Erfahrung darauf hin, dass die chirurgische Methode in einem geringen Prozentsatz der Fälle (ca. 10%) eine höhere postoperative Mortalität mit häufigem Tierleid hervorruft, was eine gewisse Erholungszeit erfordert12. Darüber hinaus verhindern die nach der Operation angewendeten Stiche die korrekte Anwendung bildgebender Verfahren. Dies führt zur Aufnahme von US-Bildern mit sehr schlechter Qualität, was zu einer ungenauen Datenextrapolation führt, die durch Artefakte wie Nachhall und Schattenbereiche verursacht wird. Unter Berücksichtigung all dieser Fakten wird eine Methode, die keinen chirurgischen Eingriff zur Etablierung eines orthotopen Mausmodells benötigt, bevorzugt und für präklinische Forschungszwecke dringend empfohlen. Darüber hinaus ist die Genesungszeit nach der Zellinokulation minimalinvasiv und das Tierleiden in der US-geführten Methode minimal. Ein großer Vorteil ist, dass die US-geführte Methode mit der Verwendung von Isofluran-Anästhesie kompatibel ist, die eine schnellere Induktion und Genesung, relativ weniger schonende Wirkung auf die kardiovaskuläre Funktion und die Autoregulation des zerebralen Blutflusses im Vergleich zu anderen Anästhesiemethoden (dh Ketamin / Xylazin-Lösung) ermöglicht. Insgesamt macht der vernachlässigbare Metabolismus von Isofluran es besonders nützlich bei der Anästhesiebehandlung13. Tatsächlich erlangen die Tiere etwa 5 Minuten nach dem Ende des Eingriffs wieder ein ausreichendes Bewusstsein, um die sternale Liege aufrechtzuerhalten. Darüber hinaus werden Mäuse mit einem Analgetikum (Carprofen) vorbehandelt, um Schmerzen zu minimieren, und aufgrund der schnellen und vollständigen Genesung sind keine postoperativen Behandlungen erforderlich.
Dennoch gibt es einige entscheidende Schritte zur Fehlerbehebung im Verfahren, die beachtet werden müssen. Die Anzahl der zu beimpfenden Zellen darf 1 x 106 Zellen nicht überschreiten und das Volumen des Zellinokulums darf nicht größer als 20 μL sein, um das Risiko eines Zellaustritts aus der Bauchspeicheldrüse zu vermeiden. Die Zellinjektion sollte unmittelbar nach ihrer Ablösung durchgeführt werden, um eine Abnahme der Zellvitalität zu vermeiden. Nach der Zellinjektion ist es notwendig, mindestens 10 s zu warten, bevor die Nadel entfernt wird, um das Austreten von Zellen aus der Bauchspeicheldrüse zu vermeiden.
Einer der kritischsten Aspekte des vorliegenden Protokolls betrifft die Positionierung der Maus auf der Tierplattform. Die Maus muss auf der rechten Seite auf dem Tierbehandlungstisch liegen und die Haut muss gestreckt werden. Wenn die Haut während der Injektion nicht richtig gedehnt wird, wird die Nadel Schwierigkeiten haben, die Bauchspeicheldrüse zu durchbohren und in die Bauchspeicheldrüse einzudringen, mit dem Risiko, dass Zellen aus der Bauchspeicheldrüse austreten. Die ultraschallgeführte Injektion zur Herstellung eines PCa-Mausmodells wurde erstmals 2011 von Huynh et al. beschrieben14. Hier konzentrierten wir uns auf die Methodik, die geeignet ist, ein solches Modell zu erstellen, und beschreiben detailliert alle Schritte, um es reproduzierbar zu machen. Darüber hinaus haben wir im Vergleich zu Huynh et al.14 einige Innovationen eingeführt, die hauptsächlich mit den Fortschritten in der US-Technologie in den letzten 5 Jahren zusammenhängen. Im vorliegenden Protokoll wird die Verwendung einer Hamilton-Spritze mit einer steifen Nadel und einem Fasenwinkel von 30° dringend empfohlen, um eine bessere Genauigkeit während der Zellinjektion zu erzielen und Zellleckagen zu minimieren. Schließlich wurden während der US-gesteuerten Injektion Mäuse auf der rechten Seite auf der Tierplattform gesichert, während in Huynh et al.14 Mäuse in dorsale Liege gelegt wurden. Die seitliche Position der Maus ermöglicht es, den Schwanz der Bauchspeicheldrüse direkt unter der Milz sichtbar zu machen, der während der Zellinjektion als visuelle Referenz dient (Abbildung 1B) und die Reproduzierbarkeit der Technik gewährleistet.
Wie bei anderen Techniken gibt es auch beim US-geführten Verfahren einige Einschränkungen. Die größte Einschränkung besteht darin, dass die Injektion nur im Schwanz der Bauchspeicheldrüse durchgeführt werden kann, da Körper und Kopf von anderen Organen bedeckt sind und mit der Nadel schwer zu erreichen sind. Darüber hinaus ist eine weitere Einschränkung im Zusammenhang mit der Verwendung der US-Bildgebung zur Überwachung des Tumorwachstums die Unfähigkeit, die gesamte Tumormasse sichtbar zu machen, wenn sie nach 6 Wochen Impfung zu groß wird (Abbildung 3C-E). Obwohl solche großen Volumina den klinischen Verlauf der Krankheit nicht nachahmen.
Ein weiterer Vorteil des PCa-Modells, das mit dem hier beschriebenen Protokoll erhalten wird, ist die langsame Zelltransplantation und das Wachstum der Tumormassen (Abbildung 3B). Dies ist ideal, um den Ausgangspunkt für pharmakologische Interventionen genau zu identifizieren und die Wirkung therapeutischer Interventionen im Laufe der Zeit besser zu überwachen.
Schließlich ist die beschriebene Technik ein Beispiel für die Umsetzung der 3R-Prinzipien, die die Verfeinerung der Technik und die Entwicklung von Verfahren beinhalten, die Schmerzen, Leiden, Ängste oder dauerhafte Schäden minimieren und das Wohlergehen der Tiere in der Forschung direkt verbessern.
Zukünftige Anwendungen des PCa-Modells, das durch die US-geführte Injektion erhalten wurde, umfassen Studien, die auf die Entwicklung geeigneter therapeutischer Behandlungen oder Behandlungskombinationen abzielen. Tatsächlich könnte die Verwendung solcher innovativen In-vivo-Techniken mit der Verwendung kleiner Moleküle, z. B. Antikörper, Antikörperfragmente und Antikörper-Wirkstoff-Konjugate (ADC), mit einem theragnostischen Ansatz gekoppelt werden. Letzteres könnte allein, für therapeutische Zwecke, wie unsere Gruppe in unserer jüngsten Arbeit15 gezeigt hat, oder nach einer geeigneten Fluorophor-Konjugation mit dem Ziel der Überwachung des Tumorwachstums verwendet werden.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC, Grant No. 15627, IG 21510 und IG 19766) an AA, PRIN Italian Ministry of University and Research (MIUR) unterstützt. Leveraging basic knowledge of ion channel network in cancer for innovative therapeutic strategies (LIONESS) 20174TB8KW to AA, pHioniC: European Union's Horizon 2020 grant No 813834 to AA. CD wurde durch ein AIRC-Stipendium für Italien ID 24020 unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm Petri dish | Sarstedt, Germany | P5856 | |
| 3D-Mode package | Visualsonics Fujifilm, Italy | Includes the 3D Motor; necessary for volumetric imaging | |
| Aquasonic 100, Sonypack 5 lt Ultrasound Transmission Gel | PARKER LABORATORIES, INC. | 150 | Gel for ultrasound |
| Athymic Mice (Nude-Foxn1nu) | ENVIGO, Italy | 69 | 20 females, 8 weeks old, Athymic Nude-Foxn1nu, 20-22 g body weight |
| CO2 Incubator Function Line | Heraeus Instruments, Germany | BB16-ICN2 | |
| Display of ECG, Respiration Waveform and body temperature | Visualsonics Fujifilm, Italy | 11426 | |
| DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) | Euroclone Spa, Italy | ECM0101L | |
| DPBS (Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline) | Euroclone Spa, Italy | ECB4004L | |
| Eppendorf (1.5mL) | Sarstedt, Germany | 72.690.001 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Euroclone Spa, Italy | ECS0170L | |
| Hamilton Needle Pointstyle 4, lenght 30 mm, 28 Gauge | Permax S.r.l., Italy | 7803-02 | |
| Hamilton Syringe 705RM 50 µL | Permax S.r.l., Italy | 7637-01 | |
| Isoflo (250 mL) | Ecuphar | 7081219 | |
| L-glutamine 100X | Euroclone Spa, Italy | ECB3000D | |
| Mouse Handling table II | Visualsonics Fujifilm, Italy | 50249 | |
| MX550D: 55 MHz MX Series Transducer | Visualsonics Fujifilm, Italy | 51069 | Ultrasound Transducers |
| Oxygen/isofluorane mixer | Angelo Franceschini S.r.l. | LFY-I-5A | |
| PANC1 cell line | American Type Culture Collection (ATCC), USA | CRL-1469 | |
| Rimadyl (carprofen) | Pfizer | 11319 | 20 mL, injection solution |
| Trypsin-EDTA 1X in PBS | Euroclone Spa, Italy | ECB3052D | |
| Vet ointment for eyes, Systane nighttime | Alcon | 509/28555-1 | |
| Vevo Compact Dual Anesthesia System (Tabletop Version) | Visualsonics Fujifilm, Italy | VS-12055 | complete with gas chamber |
| Vevo Imaging Station 2 | Visualsonics Fujifilm, Italy | VS-11983 | Imaging WorkStation 1 plus Imaging Station Extension with injection mount |
| Vevo Lab | Visualsonics Fujifilm, Italy | VS-20034 | Data Analysis Software |
| Vevo LAZR-X Photoacoustic Imaging System | Visualsonics Fujifilm, Italy | VS-20054 | Includes analytic software package for B-mode |
| Vevo Photoacoustic Enclosure | Visualsonics Fujifilm, Italy | 53157 |
References
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