Summary
Apresentamos um protocolo para gerar um modelo de câncer de pâncreas ortotópico minimamente invasivo por injeção guiada por ultrassom de células cancerígenas pancreáticas humanas e o subsequente monitoramento do crescimento tumoral in vivo por ultrassonografia.
Abstract
O câncer de pâncreas (PCa) representa um dos tipos de câncer mais mortais em todo o mundo. As razões para a malignidade da PCa dependem principalmente de seu comportamento maligno intrínseco e alta resistência a tratamentos terapêuticos. De fato, apesar de muitos esforços, tanto a quimioterapia padrão quanto as terapias-alvo inovadoras falharam substancialmente quando movidas da avaliação pré-clínica para o ambiente clínico. Nesse cenário, o desenvolvimento de modelos pré-clínicos de camundongos que imitassem melhor as características in vivo da PCa é urgentemente necessário para testar medicamentos recém-desenvolvidos. O presente protocolo descreve um método para gerar um modelo de PCa em camundongo, representado por um xenoenxerto ortotópico obtido por injeção guiada por ultrassom de células tumorais pancreáticas humanas. Usando um protocolo tão confiável e minimamente invasivo, também fornecemos evidências de enxerto in vivo e desenvolvimento de massas tumorais, que podem ser monitoradas por ultrassonografia (US). Um aspecto digno de nota do modelo de PCa aqui descrito é o lento desenvolvimento das massas tumorais ao longo do tempo, o que permite a identificação precisa do ponto de partida para tratamentos farmacológicos e um melhor monitoramento dos efeitos das intervenções terapêuticas. Além disso, a técnica aqui descrita é um exemplo de implementação dos princípios 3R, uma vez que minimiza a dor e o sofrimento e melhora diretamente o bem-estar dos animais em pesquisa.
Introduction
A PCa, e sua forma mais comum, o adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC), é uma das causas mais comuns de morte relacionada ao câncer, com uma taxa de sobrevida de 1 ano inferior a 20% e uma taxa de sobrevida de 5 anos de 8%, independentemente do estágio 1,2. A doença é quase sempre fatal, e sua incidência está prevista para crescer continuamente nos próximos anos, ao contrário de outros tipos de câncer, cuja incidência está em declínio3. Fatores como a detecção tardia do câncer, a tendência de rápida progressão e a falta de terapias específicas levam a um mau prognóstico da PCa4. Grandes avanços na pesquisa do câncer foram obtidos, graças ao desenvolvimento de modelos pré-clínicos mais precisos de camundongos. Os modelos forneceram insights apropriados para a compreensão do mecanismo molecular subjacente ao câncer e para o desenvolvimento de novos tratamentos5. Esses avanços se aplicam pouco à PCa, que, apesar dos grandes esforços recentes, permanece resistente às atuais terapias quimioterápicas1. Por estas razões, o desenvolvimento de novas abordagens para melhorar as perspectivas dos doentes é obrigatório.
Ao longo dos anos, muitos modelos de camundongos PCa foram desenvolvidos, incluindo xenoenxertos, que são os modelos mais utilizados atualmente5. Os modelos de xenoenxerto são classificados em heterotópicos subcutâneos e ortotópicos, dependendo da localização das células tumorais implantadas. Os xenoenxertos heterotópicos subcutâneos são mais fáceis e baratos de serem realizados, mas perdem certas características da PCa (ou seja, o microambiente tumoral peculiar, caracterizado pelo acúmulo de tecido fibrótico, hipóxia, acidez e angiogênese)6,7. Isso explica por que os xenoenxertos subcutâneos muitas vezes não fornecem dados robustos para tratamentos terapêuticos que levam a falhas quando traduzidos para o ambiente clínico8. Por outro lado, os xenoenxertos ortotópicos se assemelham mais ao microambiente tumoral, levando a uma melhor imitação do desenvolvimento natural da doença. Além disso, os xenoenxertos ortotópicos são mais adequados para estudar o processo metastático e as características invasivas da PCa, que quase não ocorrem em modelos subcutâneos9. De modo geral, os modelos ortotópicos de camundongos xenoenxertos são hoje preferidos para a realização de testes pré-clínicos de drogas 9,10. Os xenoenxertos ortotópicos geralmente dependem de procedimentos cirúrgicos para implantar células ou pedaços de tecido tumoral muito pequenos no pâncreas. De fato, vários trabalhos baseados em modelos cirúrgicos de PCa têm sido publicados nas últimas décadas11. No entanto, a qualidade e o resultado do procedimento cirúrgico para o estabelecimento de um modelo de tumor ortotópico dependem fortemente da habilidade técnica do operador. Outro ponto-chave para um xenoenxerto ortotópico de PCa bem-sucedido para uma abordagem clínica translacional é a possibilidade de estabelecer doença localizada com cinética de crescimento previsível.
Para resolver essas questões, aqui descrevemos um procedimento inovador para produzir um xenoenxerto ortotópico de PCa, explorando a injeção guiada por ultrassom (US) de células PCa humanas na cauda do pâncreas em camundongos imunodeficientes. Este procedimento gera um modelo de mouse PCa confiável. O crescimento do tumor é seguido in vivo por imagens de US .
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Protocol
O presente protocolo recebeu aprovação do Ministério da Saúde italiano com o número de autorização 843/2020-PR. A fim de garantir condições assépticas, os animais foram mantidos dentro da sala de barreira do biotério animal de pesquisa (Ce.S.A.L.) da Universidade de Florença. Todos os procedimentos foram realizados no mesmo espaço onde os camundongos foram alojados nas instalações do LIGeMA da Universidade de Florença (Itália).
1. Preparação da célula
- Cultivar células PCa da linhagem celular PCa em uma placa de Petri de 100 mm contendo o Meio Águia Modificado (DMEM) de Dulbecco suplementado com 2% de L-glutamina e 10% de Soro Fetal Bovino (FBS).
- Incubar as células em normóxia a 37 °C com 5% de CO2.
- Desprenda as células com tripsina. Contar, e ressuspender 1 x 106 células em 20 μL de PBS, 1 h antes da inoculação.
2. Preparação do rato para injeção guiada por ultrassom (US-GI)
NOTA: As etapas a seguir foram realizadas em condições estéreis. Todo o procedimento de injeção guiada por US, desde o início da anestesia até que o rato seja removido da plataforma animal, leva cerca de 10-12 min mais 5 min para a recuperação completa do rato.
- Imediatamente antes da intervenção, administrar carprofeno (AINE) por via subcutânea (s.c.) numa dose final de 5 mg/kg ou tramadol numa dose final de 5 mg/kg utilizando uma seringa tuberculína com uma agulha de 27 G.
NOTA: Para o presente protocolo, foram utilizadas 20 fêmeas de fêmea Athymic Nude-Foxn1nu . Os ratos tinham 8 semanas de idade e pesavam 20-22 g. - Ligue o gerador de imagens e selecione Mouse (Small) Abdominal no menu de aplicação no painel do transdutor. Certifique-se de que a janela de imagem do Modo B (Modo de Brilho) seja exibida e que o sistema esteja pronto para adquirir dados do Modo B.
NOTA: O modo B é o modo de imagem padrão do sistema. O sistema exibe ecos em uma visão bidimensional (2D), atribuindo um nível de brilho com base na amplitude do sinal de eco. O modo B é o modo mais eficaz para localizar estruturas anatômicas.- Vá para o Navegador de Estudo.
- Selecione Novo Estudo e digite o nome e as informações do estudo, ou seja, a data do estudo, etc.
- Preencha todas as informações necessárias no Nome da Série, ou seja, estirpe animal, ID, data de nascimento, etc.
- Toque em Concluído; o programa está pronto para imagens de modo B.
- Anestesiar o camundongo na câmara de indução anestésica utilizando isoflurano a 4% com fluxo gasoso de 2 L/min de O2.
NOTA: Aproximadamente 4 min são suficientes para a anestesia adequada (respirando em torno de 50-60 respirações por minuto). - Uma vez que o mouse esteja anestesiado, altere a conexão da máquina anestésica para direcionar o isoflurano em direção à mesa de manuseio do mouse.
- Colocar o rato anestesiado no flanco direito sobre a mesa de manuseamento (aquecida a 37 °C) com o focinho num cone nasal para garantir que o rato é anestesiado com isoflurano a 2% com um fluxo de gás de 0,8 L/min de O2 (Figura 1A).
- Aplique uma gota de lágrimas artificiais nos olhos do rato para evitar a secura durante a anestesia.
- Cole a mão direita, o pé direito e a cauda firmemente nas almofadas do eletrodo na plataforma animal com gaze adesiva.
NOTA: A taxa de respiração do rato e o eletrocardiograma (ECG) são registados através das almofadas dos eléctrodos.
3. Injeção de células PANC1 no pâncreas pelo método US-GI
- Higienize a pele do rato com etanol a 70% e mantenha a pele do flanco esquerdo esticada usando gaze adesiva.
NOTA: Manter a pele esticada é importante para reduzir a resistência à inserção da agulha e prevenir deformações da agulha. - Aplique gel de ultrassom no abdômen e no flanco esquerdo do camundongo usando uma seringa de 20 mL (sem a agulha).
- Usando o botão de controle de altura do transdutor US, abaixe o transdutor para tocar o flanco esquerdo do mouse e coloque-o transversalmente ao corpo do animal.
- Mova o transdutor para visualizar o pâncreas na tela do transdutor usando imagens em modo B (Figura 1B).
- Preparar uma seringa Hamilton de 50 μL, contendo 1 x 106 células PANC1 suspensas em 20 μL de PBS, com uma agulha 28 G de 30 mm e colocar a seringa no suporte adequado (Figura 1C).
NOTA: Antes de usar, higienize a agulha da seringa com etanol a 70% por um período de 5-10 minutos. - Utilizando o micromanipulador do suporte, abaixe a seringa até a pele do rato, com o bisel da agulha virado para cima e no mesmo plano do transdutor de ultrassom, formando um ângulo de 45° com o transdutor (Figura 1D).
NOTA: A partir desta etapa, prossiga monitorando a imagem dos EUA na tela. - Usando o micromanipulador, perfurar a pele e inserir a agulha da seringa no pâncreas e observar a imagem de US no visor, para acompanhar sua trajetória (Figura 1E).
NOTA: Antes da injeção, tome a cauda do pâncreas como uma referência que está localizada atrás do baço e perto do rim esquerdo. - Uma vez que a agulha é inserida no pâncreas, injete um bolo de 20 μL contendo as células diretamente no pâncreas, aplicando pressão constante no êmbolo da seringa (Figura 1F).
NOTA: O procedimento de injeção correto é verificado pela presença de uma pequena bolha no pâncreas e pelo fluxo de líquido hipoecogênico, que é pouco visível da ponta da agulha. - Deixe a agulha no lugar por 5-10 s após a injeção de todo o bolo e, em seguida, retire-a lentamente.
- Remova o transdutor de US, limpe o gel do flanco e coloque o rato sozinho numa nova gaiola. Observe o animal até que ele tenha recuperado a consciência suficiente para manter a decúbito esternal.
4.3D US para monitoramento de tumores pancreáticos em camundongos
NOTA: A avaliação do desenvolvimento tumoral foi realizada a partir de 8 dias após a injeção celular, utilizando-se o mesmo instrumento utilizado para a injeção guiada por US ( listado na Tabela de Materiais). Assim, alguns procedimentos, como a ignição do sistema (etapa 2.2.), a anestesia (etapas 2.3. - 2.6.) e a colocação do rato na plataforma animal (etapa 2.7.), correspondem plenamente ao que foi descrito acima no protocolo.
- Antes de iniciar a geração de imagens dos EUA, configure a estação de trabalho como mostra a Figura 2A.
- Fixe o transdutor no sistema motor 3D (Figura 2A).
- Ative o gerador de imagens e selecione Novo Estudo no Navegador de Estudo.
- Coloque o rato na câmara de indução da anestesia (isoflurano a 4%).
- Colocar o rato anestesiado no flanco direito sobre a mesa de manuseamento aquecida a 37 °C com o focinho no tubo anestésico e reduzir o isoflurano para 2% (Figura 2B).
NOTA: É importante que o rato seja colocado na mesma posição que a injeção guiada por US, para manter as mesmas referências anatómicas. - Aplique uma gota de pomada veterinária nos olhos do rato.
- Aplique uma camada de gel de ultrassom no abdômen e no flanco esquerdo do rato.
- Posicione o transdutor de 55 MHz na orientação transversal para tocar a pele do flanco esquerdo de modo que o pâncreas esteja aproximadamente centrado (Figura 2C).
- Use o motor 3D para adquirir imagens de todo o pâncreas na orientação transversal, idealmente reunindo 90-100 quadros por aquisição (o número de quadros pode variar dependendo da escolha pessoal).
- Selecione a Posição do motor 3D no touchpad do gerador de imagens.
- Indique a distância de varredura movendo o cursor para adquirir imagens de todo o pâncreas de ambas as extremidades.
- Selecione Digitalizar quadros e inicie a aquisição 3D.
- Uma vez que a imagem 3D é feita, remova o transdutor, limpe o gel da pele e coloque o mouse sozinho em uma nova gaiola para recuperação. Observe o animal até que ele tenha recuperado a consciência suficiente para manter a decúbito esternal.
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Representative Results
Seguindo o protocolo descrito acima, os camundongos foram primeiramente anestesiados em uma câmara de isoflurano e colocados na plataforma animal (Figura 1A). O pâncreas foi visualizado por ultrassonografia (Figura 1B). Uma seringa Hamilton de 50 μL foi carregada com 1 x 106 células PANC1 suspensas em 20 μL de PBS e colocada no suporte da agulha (Figura 1C). O ângulo ótimo entre a seringa e o transdutor US foi de 45° (Figura 1D). Utilizando-se o micromanipulador, a agulha da seringa foi inserida no pâncreas e sua trajetória foi observada no visor do imageador US (Figura 1E). Um bolus de 20 μL de células tumorais foi então injetado no pâncreas (Figura 1F) e após 10 s a agulha foi retraída. Ações relevantes para evitar o recuo das células e seu subsequente vazamento para a cavidade peritoneal foram realizadas, como a aplicação de uma pressão constante durante a inoculação, a pausa após a injeção celular e o uso de uma agulha fina com ângulo de chanfro de 30°. Após a injeção guiada pelos EUA, o peso dos ratos foi monitorado todos os dias para avaliar quaisquer sinais de estresse devido ao procedimento. Nenhuma mudança significativa no peso dos camundongos injetados foi observada.
A US 3D foi então aplicada para monitorar o enxerto de células tumorais e o desenvolvimento do tumor. A primeira aquisição de imagem foi realizada no 8º dia após a injeção celular, seguida de aquisições semanais (para um total de 6 aquisições). Durante a imagem, os animais foram colocados no flanco direito sobre a plataforma aquecida (37 °C) e anestesiados por inalação de gás isoflurano (dose de indução a 4% e dose de manutenção a 2%) (Figura 2). A aquisição 3D foi realizada em modo B utilizando o motor 3D que permite ao transdutor escanear o abdome em várias seções, perpendiculares ao seu eixo. Uma série de imagens 2D foram obtidas, que foram então montadas pelo software de análise, reconstruindo a imagem anatômica 3D do órgão (re-renderização 3D). Para a realização de imagens 3D, foi necessário sincronizar as fases de respiração do mouse com a aquisição da digitalização 3D. A reprodutibilidade do protocolo foi confirmada pela presença da massa tumoral, estrutura hipoecogênica (representada com cores escuras) na cauda do pâncreas, a partir do 8º dia, em 16 dos 20 (80%) animais (Figura 3A). Em quatro camundongos (20% dos animais), o desenvolvimento de massa tumoral foi observado 2 semanas após a injeção. Essa latência pode ser rastreada até um procedimento sub-ótimo de inserção de agulha no pâncreas, que causou vazamento de células no peritônio.
A Figura 3B mostra o volume médio do tumor (n = 16) avaliado por US por imagem do modelo de camundongo injetável guiado por US. No dia seguinte à última aquisição nos EUA, os camundongos foram eutanasiados primeiro por inalação de CO2 e depois por luxação cervical. A cavidade abdominal foi examinada e as massas tumorais foram explantadas para análise histológica (Figura 3C-E).
Figura 1: Método guiado por US para o estabelecimento de um modelo de rato PCa ortotópico . (A) O rato é colocado no flanco direito num suporte especial aquecido a 37 °C. (B) O transdutor de US está localizado transversalmente ao corpo do animal ao nível do baço e o pâncreas é visualizado em modo B. A vista do flanco do abdômen do rato mostra o pâncreas (1) entre o baço (2) e o rim esquerdo (3). Barra de escala: 2 mm. (C) A seringa Hamilton é colocada no suporte apropriado. (D) Nesta situação, o transdutor (2) e a seringa (1) estão posicionados formando um ângulo de 45°. (E) A agulha da seringa (1) é inserida na cauda do pâncreas, logo abaixo do baço. Barra de escala: 2 mm. (F) Um bolo contendo 1 x 106 células PANC1 em 20 μL de PBS é injetado na cauda do pâncreas, usando uma seringa Hamilton com uma agulha de 28 G. Barra de escala: 2 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Estação de trabalho de imagem usada para monitorar tumores pancreáticos em camundongos . (A) Local de trabalho para imagens dos EUA. (1) Transdutor de 55 MHz; (2) Tabela de manuseio do mouse; (3) Motor 3D; (4) Botão de controle de altura do transdutor dos EUA. (B) O rato é colocado no flanco direito sobre a mesa de manuseamento com o focinho no tubo anestésico (1), a pele é esticada e o gel US é aplicado no flanco direito. (C) O transdutor é abaixado para tocar a pele do rato e posicionado transversalmente ao corpo do animal. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Desenvolvimento de xenoenxerto ortotópico de PCa no pâncreas do camundongo . (A) Aquisição de imagem US 2D da massa tumoral desenvolvida após injeção de células guiadas por eco. O desenvolvimento do tumor é monitorado com US após 8 dias de injeção celular, seguido de aquisição uma vez por semana até o dia 44, para um total de 6 aquisições. O tumor é representado por uma estrutura hipo-ecogênica no parênquima pancreático. A estrutura hipo-ecogênica é ecograficamente representada por uma área com ecos de intensidade reduzida, em comparação com o parênquima circundante ou uma estrutura vizinha. Barra de escala: 2 mm. (B) Curso temporal do volume tumoral de PDAC ortotópico derivado de células PANC1. (C) Aquisição por imagem por US de uma massa tumoral no dia 43 após a injeção celular. Barra de escala: 2 mm.3D re-renderização da massa tumoral é mostrada na inserção. (D) Após a imagem, os animais são sacrificados e o exame de necropsia é realizado. (1) Massa tumoral; (2) Uma pequena porção de um pâncreas saudável; (3) Baço; (4) Estômago; (5) Fígado. Barra de escala: 5 mm. (E) Coloração de hematoxilina e eosina da massa tumoral com ampliação de 4x. Barra de escala: 200 μm. No lado superior direito do painel, inserção da massa tumoral na qual as células acinares pancreáticas ainda são visíveis; Ampliação de 40x. Barra de escala: 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Embora o uso de US imaging seja difundido na clínica, o desenvolvimento tumoral em muitos modelos pré-clínicos de camundongos é geralmente descrito usando imagens bioluminescentes11. Este último é uma maneira indireta de avaliar o enxerto e a expansão do tumor e também não fornece uma cinética de crescimento tumoral confiável. No presente estudo, aplicamos a US imaging para a realização de injeção celular, bem como para o monitoramento do desenvolvimento tumoral. O protocolo que descrevemos e os resultados que fornecemos representam um avanço relevante na pesquisa de PCa.
O método guiado por US descrito aqui para a injeção de células tumorais pancreáticas é minimamente invasivo e permite superar muitas desvantagens causadas pelo procedimento cirúrgico, que geralmente é aplicado para estabelecer um modelo ortotópico de camundongo PCa. Embora não existam na literatura indicações sobre taxa de mortalidade ou efeitos colaterais decorrentes do procedimento cirúrgico, nossa experiência sugere que o método cirúrgico produz maior mortalidade pós-operatória em baixo percentual de casos (em torno de 10%), com sofrimento animal frequente, exigindo certa quantidade de tempo de recuperação12. Além disso, os pontos aplicados após a cirurgia impedem a correta aplicação dos procedimentos de imagem. Isso resulta na aquisição de imagens norte-americanas com péssima qualidade, levando a extrapolação de dados imprecisa causada por artefatos, como regiões de reverberação e sombras. Levando todos esses fatos em consideração, um método que não necessite de um procedimento cirúrgico para o estabelecimento de um modelo de camundongo ortotópico é preferido e fortemente recomendado para fins de pesquisa pré-clínica. Além disso, sendo minimamente invasivo, o tempo de recuperação da inoculação celular é mais rápido e o sofrimento do animal é mínimo no método guiado pelos EUA. Uma grande vantagem é que o método guiado por US é compatível com o uso de anestesia com isoflurano, o que permite uma indução e recuperação mais rápidas, efeito relativamente menos poupador na função cardiovascular e na autorregulação do fluxo sanguíneo cerebral, em comparação com outros métodos de anestesia (ou seja, solução de cetamina/xilazina). De modo geral, o metabolismo insignificante do isoflurano o torna particularmente útil no manejo anestésico13. De fato, cerca de 5 minutos após o término do procedimento, os animais recuperam a consciência suficiente para manter a decúbito esternal. Além disso, os ratos são pré-medicados com um analgésico (carprofeno) para minimizar a dor, e nenhum tratamento pós-operatório é necessário devido à recuperação rápida e completa.
No entanto, existem algumas etapas cruciais de solução de problemas no procedimento que devem ser consideradas. O número de células a inocular não deve exceder 1 x 106 células e o volume de inóculo celular não deve ser superior a 20 μL para evitar o risco de fuga celular para fora do pâncreas. A injeção celular deve ser realizada imediatamente após o seu descolamento, para evitar uma diminuição da vitalidade celular. Após a injeção celular, é necessário esperar pelo menos 10 s antes de remover a agulha para evitar o vazamento de células para fora do pâncreas.
Um dos aspectos mais críticos do presente protocolo diz respeito ao posicionamento do rato na plataforma animal. O rato deve estar deitado do lado direito sobre a mesa de manuseamento do animal e a pele deve ser esticada. Se a pele não for devidamente esticada durante a injeção, a agulha terá dificuldade em perfurar e entrar no pâncreas, com o risco de as células se derramarem para fora do pâncreas. A injeção guiada por ultrassom para produzir um modelo de camundongo PCa foi descrita pela primeira vez por Huynh et al. em 201114. Aqui, nos concentramos na metodologia adequada para produzir tal modelo, descrevendo em detalhes todas as etapas para torná-lo reprodutível. Além disso, em comparação com Huynh et al.14, introduzimos algumas inovações relacionadas principalmente aos avanços da tecnologia norte-americana ocorridos nos últimos 5 anos. No presente protocolo, o uso de uma seringa Hamilton com agulha rígida e ângulo de chanfro de 30° é fortemente recomendado para obter melhor precisão durante a injeção celular e minimizar o vazamento celular. Finalmente, durante a injeção guiada por US, os camundongos foram fixados em seu lado direito na plataforma animal, enquanto em Huynh et al.14 os camundongos foram colocados em decúbito dorsal. A posição lateral do camundongo permite visualizar a cauda do pâncreas, logo abaixo do baço, que atua como referência visual (Figura 1B) durante a injeção celular, garantindo a reprodutibilidade da técnica.
Tal como acontece com outras técnicas, também existem algumas limitações com o procedimento guiado pelos EUA. A maior limitação é que a injeção pode ser realizada apenas na cauda do pâncreas, porque o corpo e a cabeça são cobertos por outros órgãos e são difíceis de alcançar com a agulha. Além disso, outra limitação associada ao uso de US para monitorar o crescimento do tumor é a incapacidade de visualizar toda a massa tumoral quando ela se torna muito grande, após 6 semanas de inoculação (Figura 3C-E). Embora, tais grandes volumes não imitem o curso clínico da doença.
Outra vantagem do modelo de PCa obtido com o protocolo aqui descrito é o enxerto celular lento e o crescimento das massas tumorais (Figura 3B). Isso é ideal para a identificação precisa do ponto de partida para a intervenção farmacológica e melhor monitoramento dos efeitos das intervenções terapêuticas ao longo do tempo.
Por fim, a técnica descrita é um exemplo de implementação dos princípios dos 3Rs envolvendo o refinamento da técnica e o desenvolvimento de procedimento que minimiza a dor, o sofrimento, a angústia ou os danos duradouros, melhorando diretamente o bem-estar dos animais em pesquisa.
Aplicações futuras do modelo PCa obtido pela injeção guiada por US incluem estudos voltados para o desenvolvimento de tratamentos terapêuticos apropriados ou combinações de tratamentos. De fato, o uso de tais técnicas inovadoras in vivo poderia ser acoplado ao uso de pequenas moléculas, por exemplo, anticorpos, fragmentos de anticorpos e conjugados anticorpo-droga (ADC), com uma abordagem teragnóstica. Este último poderia ser utilizado isoladamente, para fins terapêuticos, como nosso grupo demonstrou em nosso trabalho recente15 ou após uma conjugação adequada de fluoróforos, com o objetivo de monitorar o crescimento tumoral.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC, subvenção n.º 15627, IG 21510 e IG 19766) à AA, PRIN Italian Ministry of University and Research (MIUR). Alavancando o conhecimento básico da rede de canais iônicos em câncer para estratégias terapêuticas inovadoras (LIONESS) 20174TB8KW a AA, pHioniC: Concessão Horizonte 2020 da União Europeia No 813834 a AA. O CD foi apoiado por uma bolsa AIRC para a Itália ID 24020.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm Petri dish | Sarstedt, Germany | P5856 | |
| 3D-Mode package | Visualsonics Fujifilm, Italy | Includes the 3D Motor; necessary for volumetric imaging | |
| Aquasonic 100, Sonypack 5 lt Ultrasound Transmission Gel | PARKER LABORATORIES, INC. | 150 | Gel for ultrasound |
| Athymic Mice (Nude-Foxn1nu) | ENVIGO, Italy | 69 | 20 females, 8 weeks old, Athymic Nude-Foxn1nu, 20-22 g body weight |
| CO2 Incubator Function Line | Heraeus Instruments, Germany | BB16-ICN2 | |
| Display of ECG, Respiration Waveform and body temperature | Visualsonics Fujifilm, Italy | 11426 | |
| DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) | Euroclone Spa, Italy | ECM0101L | |
| DPBS (Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline) | Euroclone Spa, Italy | ECB4004L | |
| Eppendorf (1.5mL) | Sarstedt, Germany | 72.690.001 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Euroclone Spa, Italy | ECS0170L | |
| Hamilton Needle Pointstyle 4, lenght 30 mm, 28 Gauge | Permax S.r.l., Italy | 7803-02 | |
| Hamilton Syringe 705RM 50 µL | Permax S.r.l., Italy | 7637-01 | |
| Isoflo (250 mL) | Ecuphar | 7081219 | |
| L-glutamine 100X | Euroclone Spa, Italy | ECB3000D | |
| Mouse Handling table II | Visualsonics Fujifilm, Italy | 50249 | |
| MX550D: 55 MHz MX Series Transducer | Visualsonics Fujifilm, Italy | 51069 | Ultrasound Transducers |
| Oxygen/isofluorane mixer | Angelo Franceschini S.r.l. | LFY-I-5A | |
| PANC1 cell line | American Type Culture Collection (ATCC), USA | CRL-1469 | |
| Rimadyl (carprofen) | Pfizer | 11319 | 20 mL, injection solution |
| Trypsin-EDTA 1X in PBS | Euroclone Spa, Italy | ECB3052D | |
| Vet ointment for eyes, Systane nighttime | Alcon | 509/28555-1 | |
| Vevo Compact Dual Anesthesia System (Tabletop Version) | Visualsonics Fujifilm, Italy | VS-12055 | complete with gas chamber |
| Vevo Imaging Station 2 | Visualsonics Fujifilm, Italy | VS-11983 | Imaging WorkStation 1 plus Imaging Station Extension with injection mount |
| Vevo Lab | Visualsonics Fujifilm, Italy | VS-20034 | Data Analysis Software |
| Vevo LAZR-X Photoacoustic Imaging System | Visualsonics Fujifilm, Italy | VS-20054 | Includes analytic software package for B-mode |
| Vevo Photoacoustic Enclosure | Visualsonics Fujifilm, Italy | 53157 |
References
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