Summary
Nous présentons un protocole pour générer un modèle orthotopique de cancer du pancréas mini-invasif par injection guidée par ultrasons de cellules cancéreuses du pancréas humain et la surveillance ultérieure de la croissance tumorale in vivo par imagerie échographique.
Abstract
Le cancer du pancréas (PCa) représente l’un des types de cancer les plus meurtriers au monde. Les raisons de la malignité PCa reposent principalement sur son comportement malin intrinsèque et sa résistance élevée aux traitements thérapeutiques. En effet, malgré de nombreux efforts, la chimiothérapie standard et les thérapies cibles innovantes ont considérablement échoué lorsqu’elles sont passées de l’évaluation préclinique au cadre clinique. Dans ce scénario, le développement de modèles murins précliniques imitant mieux les caractéristiques in vivo du PCa est nécessaire de toute urgence pour tester les médicaments nouvellement développés. Le présent protocole décrit une méthode pour générer un modèle murin de PCa, représenté par une xénogreffe orthotopique obtenue par injection guidée par ultrasons de cellules tumorales pancréatiques humaines. En utilisant un protocole aussi fiable et peu invasif, nous fournissons également des preuves de greffe in vivo et de développement de masses tumorales, qui peuvent être surveillées par imagerie par ultrasons (US). Un aspect notable du modèle PCa décrit ici est le développement lent des masses tumorales au fil du temps, ce qui permet une identification précise du point de départ des traitements pharmacologiques et un meilleur suivi des effets des interventions thérapeutiques. De plus, la technique décrite ici est un exemple de mise en œuvre des principes des 3R puisqu’elle minimise la douleur et la souffrance et améliore directement le bien-être des animaux en recherche.
Introduction
Le PCa, et sa forme la plus courante, le carcinome adéno canalaire pancréatique (PDAC), est l’une des causes les plus fréquentes de décès liés au cancer avec un taux de survie à 1 an inférieur à 20% et un taux de survie à 5 ans de 8%, quel que soit le stade 1,2. La maladie est presque toujours mortelle et son incidence devrait continuer d’augmenter au cours des prochaines années, contrairement à d’autres types de cancer, dont l’incidence est en baisse3. Des facteurs tels que la détection tardive du cancer, la tendance à la progression rapide et le manque de thérapies spécifiques conduisent à un mauvais pronostic de PCa4. De grands progrès dans la recherche sur le cancer ont été obtenus, grâce au développement de modèles murins précliniques plus précis. Les modèles ont fourni des informations appropriées pour la compréhension du mécanisme moléculaire sous-jacent au cancer et pour le développement de nouveaux traitements5. Ces avancées s’appliquent mal au PCa qui, malgré de gros efforts récents, reste résistant aux traitements chimiothérapeutiques actuels1. Pour ces raisons, le développement de nouvelles approches pour améliorer les perspectives des patients est obligatoire.
Au fil des années, de nombreux modèles de souris PCa ont été développés, y compris les xénogreffes, qui sont les modèles les plus utilisés de nosjours5. Les modèles de xénogreffe sont classés comme hétérotopiques sous-cutanés et orthotopiques, en fonction de l’emplacement des cellules tumorales implantées. Les xénogreffes hétérotopiques sous-cutanées sont plus faciles et moins coûteuses à réaliser, mais manquent certaines caractéristiques de la PCa (c’est-à-dire le microenvironnement tumoral particulier, caractérisé par l’accumulation de tissu fibreux, l’hypoxie, l’acidité et l’angiogenèse)6,7. Cela explique pourquoi les xénogreffes sous-cutanées ne fournissent souvent pas de données solides pour les traitements thérapeutiques, ce qui conduit à des échecs lorsqu’elles sont traduites en milieu clinique8. D’autre part, les xénogreffes orthotopiques ressemblent davantage au microenvironnement tumoral, ce qui permet de mieux imiter le développement naturel de la maladie. En outre, les xénogreffes orthotopiques sont plus appropriées pour étudier le processus métastatique et les caractéristiques invasives de PCa, qui ne se produisent presque pas dans les modèles sous-cutanés9. Dans l’ensemble, les modèles murins de xénogreffe orthotopique sont aujourd’hui préférés pour effectuer des tests précliniquesde médicaments 9,10. Les xénogreffes orthotopiques reposent généralement sur des procédures chirurgicales pour implanter des cellules ou de très petits morceaux de tissu tumoral dans le pancréas. En effet, plusieurs articles basés sur des modèles chirurgicaux de PCa ont été publiés au cours des dernières décennies11. Cependant, la qualité et le résultat de l’intervention chirurgicale pour l’établissement d’un modèle de tumeur orthotopique dépendent fortement de la compétence technique de l’opérateur. Un autre point clé pour une xénogreffe PCa orthotopique réussie pour une approche clinique translationnelle est la possibilité d’établir une maladie localisée avec une cinétique de croissance prévisible.
Pour répondre à ces problèmes, nous décrivons ici une procédure innovante pour produire une xénogreffe orthotopique PCa, exploitant l’injection guidée par ultrasons (US) de cellules PCa humaines dans la queue du pancréas chez des souris immunodéficientes. Cette procédure génère un modèle de souris PCa fiable. La croissance tumorale est suivie in vivo par l’imagerie américaine.
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Protocol
Le présent protocole a reçu l’approbation du ministère italien de la Santé avec le numéro d’autorisation 843/2020-PR. Afin d’assurer des conditions d’asepsie, les animaux ont été maintenus à l’intérieur de la salle barrière du vivarium des animaux de recherche (Ce.S.A.L.) de l’Université de Florence. Toutes les procédures ont été effectuées dans le même espace où les souris étaient logées dans les installations LIGeMA de l’Université de Florence (Italie).
1. Préparation cellulaire
- Culture de cellules PCa de la lignée cellulaire PCa dans une boîte de Petri de 100 mm contenant le milieu Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco complété par 2% de L-glutamine et 10% de sérum bovin fœtal (FBS).
- Incuber les cellules dans la normoxie à 37 °C avec 5% de CO2.
- Détacher les cellules avec de la trypsine. Comptez et remettez en suspension 1 x 106 cellules dans 20 μL de PBS, 1 h avant l’inoculation.
2. Préparation de souris pour l’injection guidée par ultrasons (US-GI)
REMARQUE: Les étapes suivantes ont été effectuées dans des conditions stériles. L’ensemble de la procédure d’injection guidée par les États-Unis, du début de l’anesthésie jusqu’à ce que la souris soit retirée de la plate-forme animale, prend environ 10-12 minutes plus 5 minutes pour une récupération complète de la souris.
- Juste avant l’intervention, administrer du carprofène (AINS) par voie sous-cutanée (s.c.) à une dose finale de 5 mg/kg ou du tramadol à une dose finale de 5 mg/kg à l’aide d’une seringue à tuberculine avec une aiguille de 27 G.
NOTE: Pour le présent protocole, 20 souris femelles Athymic Nude-Foxn1nu ont été utilisées. Les souris étaient âgées de 8 semaines et pesaient 20-22 g. - Allumez l’imageur et sélectionnez Souris (petite) abdominale dans le menu de l’application du panneau du transducteur. Assurez-vous que la fenêtre d’imagerie Mode B (Mode luminosité) s’affiche et que le système est prêt à acquérir des données en mode B.
REMARQUE: B-Mode est le mode d’imagerie par défaut du système. Le système affiche les échos dans une vue bidimensionnelle (2D) en attribuant un niveau de luminosité basé sur l’amplitude du signal d’écho. Le mode B est le mode le plus efficace pour localiser les structures anatomiques.- Accédez à la Banque d’études.
- Sélectionnez Nouvelle étude et tapez le nom et les informations de l’étude, c.-à-d. la date de l’étude, etc.
- Remplissez toutes les informations nécessaires dans le nom de la série, c’est-à-dire la souche animale, la pièce d’identité, la date de naissance, etc.
- Appuyez sur Terminé; le programme est prêt pour l’imagerie en mode B.
- Anesthésier la souris dans la chambre d’induction de l’anesthésie en utilisant 4% d’isoflurane avec un débit gazeux de 2 L/min deO2.
REMARQUE: Environ 4 minutes suffisent pour une anesthésie correcte (respiration autour de 50-60 respirations par minute). - Une fois la souris anesthésiée, modifiez la connexion de l’appareil anesthésique pour diriger l’isoflurane vers la table de manipulation de la souris.
- Placer la souris anesthésiée sur son flanc droit sur la table de manipulation (chauffée à 37 °C) avec son museau dans un cône nasal pour s’assurer que la souris est anesthésiée à l’aide d’isoflurane à 2 % avec un débit gazeux de 0,8 L/min d’O2 (Figure 1A).
- Appliquez une goutte de larmes artificielles sur les yeux de la souris pour prévenir la sécheresse sous anesthésie.
- Collez fermement la main droite, le pied droit et la queue sur les électrodes de la plate-forme animale avec de la gaze adhésive.
REMARQUE: La fréquence respiratoire et l’électrocardiogramme (ECG) de la souris sont enregistrés à travers les électrodes.
3. Injection de cellules PANC1 dans le pancréas par la méthode US-GI
- Désinfectez la peau de souris avec de l’éthanol à 70% et maintenez la peau du flanc gauche étirée à l’aide de gaze adhésive.
REMARQUE: Garder la peau étirée est important pour réduire la résistance à l’insertion de l’aiguille et pour prévenir les déformations de l’aiguille. - Appliquer le gel à ultrasons sur l’abdomen et le flanc gauche de la souris à l’aide d’une seringue de 20 ml (sans l’aiguille).
- À l’aide du bouton de contrôle de la hauteur du transducteur US, abaissez le transducteur pour toucher le flanc gauche de la souris et placez-le transversalement sur le corps de l’animal.
- Déplacez le transducteur pour visualiser le pancréas sur l’écran du transducteur à l’aide de l’imagerie en mode B (Figure 1B).
- Préparer une seringue Hamilton de 50 μL, contenant 1 x 106 cellules PANC1 en suspension dans 20 μL de PBS, avec une aiguille de 30 mm 28 G et placer la seringue sur le support approprié (figure 1C).
REMARQUE: Avant utilisation, désinfectez l’aiguille de la seringue avec de l’éthanol à 70% pendant une période de 5 à 10 minutes. - À l’aide du micromanipulateur porteur, abaisser la seringue sur la peau de la souris, avec le biseau de l’aiguille vers le haut et dans le même plan que le transducteur à ultrasons, formant un angle de 45° avec le transducteur (Figure 1D).
REMARQUE: À partir de cette étape, procédez en surveillant l’image américaine à l’écran. - À l’aide du micromanipulateur, perforez la peau et insérez l’aiguille de la seringue dans le pancréas et observez l’image US sur l’écran, pour suivre sa trajectoire (Figure 1E).
REMARQUE: Avant l’injection, prenez la queue du pancréas comme référence qui est située derrière la rate et près du rein gauche. - Une fois l’aiguille insérée dans le pancréas, injecter un bolus de 20 μL contenant les cellules directement dans le pancréas en appliquant une pression constante sur le piston de la seringue (Figure 1F).
REMARQUE: La procédure d’injection correcte est vérifiée par la présence d’une petite bulle dans le pancréas et l’écoulement du liquide hypoéchogénique, qui est à peine visible de la pointe de l’aiguille. - Laissez l’aiguille en place pendant 5 à 10 secondes après l’injection de tout le bolus, puis rétractez-la lentement.
- Retirez le transducteur US, nettoyez le gel du flanc et placez la souris seule dans une nouvelle cage. Observez l’animal jusqu’à ce qu’il ait repris suffisamment conscience pour maintenir une position couchée sternale.
4.3D Imagerie américaine pour la surveillance des tumeurs pancréatiques chez la souris
REMARQUE: L’évaluation du développement tumoral a été réalisée à partir de 8 jours après l’injection cellulaire, en utilisant le même instrument utilisé pour l’injection guidée par les États-Unis (répertorié dans le tableau des matériaux). Par conséquent, certaines procédures, telles que l’allumage du système (étape 2.2.), l’anesthésie (étapes 2.3. - 2.6.) et le placement de la souris sur la plate-forme animale (étape 2.7.), correspondent parfaitement à ce qui a été décrit ci-dessus dans le protocole.
- Avant de commencer l’imagerie américaine, configurez le poste de travail comme illustré à la figure 2A.
- Fixez le transducteur sur le système de moteur 3D (Figure 2A).
- Activez l’imageur et sélectionnez Nouvelle étude dans le navigateur d’études.
- Placez la souris dans la chambre d’induction de l’anesthésie (isoflurane à 4%).
- Placer la souris anesthésiée sur son flanc droit sur la table de manipulation chauffée à 37 °C avec son museau dans le tube anesthésique et réduire l’isoflurane à 2 % (figure 2B).
REMARQUE: Il est important que la souris soit placée dans la même position que l’injection guidée par les États-Unis, afin de conserver les mêmes références anatomiques. - Appliquez une goutte de pommade vétérinaire sur les yeux de la souris.
- Appliquez une couche de gel à ultrasons sur l’abdomen et le flanc gauche de la souris.
- Placez le transducteur de 55 MHz dans l’orientation transversale pour toucher la peau du flanc gauche de telle sorte que le pancréas soit approximativement centré (figure 2C).
- Utilisez le moteur 3D pour acquérir des images de l’ensemble du pancréas dans l’orientation transversale, en rassemblant idéalement 90 à 100 images par acquisition (le nombre d’images peut varier en fonction du choix personnel).
- Sélectionnez la position du moteur 3D sur le pavé tactile de l’imageur.
- Indiquez la distance de balayage en déplaçant le curseur pour acquérir des images de l’ensemble du pancréas des deux extrémités.
- Sélectionnez Scan Frames et commencez l’acquisition 3D.
- Une fois l’imagerie 3D terminée, retirez le transducteur, nettoyez le gel de la peau et placez la souris seule dans une nouvelle cage pour la récupération. Observez l’animal jusqu’à ce qu’il ait repris suffisamment conscience pour maintenir une position couchée sternale.
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Representative Results
Conformément au protocole décrit ci-dessus, les souris ont d’abord été anesthésiées dans une chambre d’isoflurane et placées sur la plateforme animale (Figure 1A). Le pancréas a été visualisé par échographie (figure 1B). Une seringue Hamilton de 50 μL a été chargée de 1 x 106 cellules PANC1 suspendues dans 20 μL de PBS et placée sur le porte-aiguille (figure 1C). L’angle optimal entre la seringue et le transducteur US était de 45° (Figure 1D). À l’aide du micromanipulateur, l’aiguille de la seringue a été insérée dans le pancréas et sa trajectoire a été observée sur l’écran de l’imageur américain (Figure 1E). Un bolus de 20 μL de cellules tumorales a ensuite été injecté dans le pancréas (Figure 1F) et après 10 s, l’aiguille a été rétractée. Des actions pertinentes pour empêcher le recul des cellules et leur fuite ultérieure dans la cavité péritonéale ont été poursuivies, telles que l’application d’une pression constante pendant l’inoculation, la pause après l’injection cellulaire et l’utilisation d’une aiguille fine avec un angle biseau de 30°. Après l’injection guidée par les États-Unis, le poids des souris a été surveillé tous les jours pour évaluer tout signe de stress dû à la procédure. Aucun changement significatif dans le poids des souris injectées n’a été observé.
L’imagerie 3D US a ensuite été appliquée pour surveiller la greffe de cellules tumorales et le développement tumoral. La première acquisition d’image a été réalisée le jour 8 après l’injection cellulaire, suivie d’acquisitions hebdomadaires (pour un total de 6 acquisitions). Au cours de l’imagerie, les animaux ont été placés sur le flanc droit sur la plate-forme chauffée (37 °C) et anesthésiés par inhalation de gaz isoflurane (dose d’induction à 4 % et dose d’entretien à 2 %) (figure 2). L’acquisition 3D a été réalisée en mode B à l’aide du moteur 3D qui permet au transducteur de scanner l’abdomen en différentes sections, perpendiculaires à son axe. Une série d’images 2D a été obtenue, qui a ensuite été assemblée par le logiciel d’analyse, reconstruisant l’image anatomique 3D de l’organe (re-rendu 3D). Pour réaliser l’imagerie 3D, il était nécessaire de synchroniser les phases de respiration de la souris avec l’acquisition du scan 3D. La reproductibilité du protocole a été confirmée par la présence de la masse tumorale, une structure hypo-échogène (représentée par des couleurs sombres) dans la queue du pancréas, à partir du jour 8, chez 16 animaux sur 20 (80%) (Figure 3A). Chez quatre souris (20% des animaux), le développement de la masse tumorale a été observé 2 semaines après l’injection. Cette latence pourrait être attribuée à une procédure sous-optimale d’insertion d’aiguilles dans le pancréas, qui a provoqué une fuite de cellules dans le péritoine.
La figure 3B montre le volume tumoral moyen (n = 16) évalué par imagerie américaine du modèle de souris injectable guidée par les États-Unis. Le lendemain de la dernière acquisition américaine, des souris ont été euthanasiées d’abord par inhalation de CO2, puis par luxation cervicale. La cavité abdominale a été examinée et les masses tumorales ont été explantées pour analyse histologique (Figure 3C-E).
Figure 1 : Méthode guidée par les États-Unis pour l’établissement d’un modèle murin PCa orthotopique. (A) La souris est placée sur le flanc droit sur un support spécial chauffé à 37 °C. (B) Le transducteur US est situé transversalement au corps de l’animal au niveau de la rate et le pancréas est visualisé en mode B. La vue latérale de l’abdomen de la souris montre le pancréas (1) entre la rate (2) et le rein gauche (3). Barre d’échelle: 2 mm. (C) La seringue Hamilton est placée sur le support approprié. (D) Dans cette situation, le transducteur (2) et la seringue (1) sont positionnés formant un angle de 45°. (E) L’aiguille de la seringue (1) est insérée dans la queue du pancréas, juste en dessous de la rate. Barre d’échelle: 2 mm. (F) Un bolus contenant 1 x 106 cellules PANC1 dans 20 μL de PBS est injecté dans la queue du pancréas, à l’aide d’une seringue Hamilton avec une aiguille de 28 G. Barre d’échelle: 2 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Station d’imagerie utilisée pour surveiller les tumeurs pancréatiques chez la souris. (A) Lieu de travail pour l’imagerie américaine. 1° transducteur de 55 MHz; (2) Table de manipulation de la souris; (3) moteur 3D; (4) Bouton de contrôle de hauteur du transducteur US. (B) La souris est placée sur son flanc droit sur la table de manipulation avec son museau dans le tube anesthésique (1), la peau est étirée et le gel US est appliqué sur le flanc droit. (C) Le transducteur est abaissé pour toucher la peau de souris et positionné transversalement au corps de l’animal. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Développement d’une xénogreffe orthotopique PCa dans le pancréas de souris. (A) Acquisition d’images US 2D de la masse tumorale développée après injection cellulaire échoguidée. Le développement de la tumeur est surveillé par imagerie américaine après 8 jours d’injection cellulaire, suivie d’une acquisition une fois par semaine jusqu’au jour 44, pour un total de 6 acquisitions. La tumeur est représentée par une structure hypo-échogène dans le parenchyme pancréatique. La structure hypo-échogène est représentée échographiquement par une zone avec des échos d’intensité réduite, par rapport au parenchyme environnant ou à une structure voisine. Barre d’échelle: 2 mm. (B) Évolution temporelle du volume tumoral de PDAC orthotopique dérivé de cellules PANC1. (C) Acquisition par imagerie américaine d’une masse tumorale au jour 43 après l’injection cellulaire. Barre d’échelle: 2 mm.3D le rendu de la masse tumorale est indiqué dans l’encart. (D) Après l’imagerie, les animaux sont euthanasiés et un examen par nécropsie est effectué. (1) Masse tumorale; (2) Une petite portion d’un pancréas sain; (3) rate; (4) Estomac; (5) Foie. Barre d’échelle: 5 mm. (E) Coloration à l’hématoxyline et à l’éosine de la masse tumorale à un grossissement de 4x. Barre d’échelle : 200 μm. Sur le côté supérieur droit du panneau, encart de la masse tumorale dans laquelle les cellules acineuses pancréatiques sont encore visibles; Grossissement 40x. Barre d’échelle: 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Bien que l’utilisation de l’imagerie américaine soit répandue en clinique, le développement tumoral dans de nombreux modèles murins précliniques est généralement décrit à l’aide de l’imagerie bioluminescente11. Ce dernier est un moyen indirect d’évaluer la greffe et l’expansion tumorale et il ne fournit pas non plus une cinétique de croissance tumorale fiable. Dans la présente étude, nous avons appliqué l’imagerie américaine pour effectuer une injection cellulaire ainsi que pour surveiller le développement tumoral. Le protocole que nous avons décrit et les résultats que nous avons fournis représentent une percée pertinente dans la recherche sur le PCa.
La méthode guidée par les États-Unis décrite ici pour l’injection de cellules tumorales pancréatiques est peu invasive et permet de surmonter de nombreux inconvénients causés par l’intervention chirurgicale, qui est généralement appliquée pour établir un modèle murin PCa orthotopique. Bien que les indications sur le taux de mortalité ou les effets secondaires dus à l’intervention chirurgicale soient absentes de la littérature, notre expérience suggère que la méthode chirurgicale produit une mortalité postopératoire plus élevée dans un faible pourcentage de cas (environ 10%), avec des souffrances fréquentes chez les animaux, nécessitant un certain temps de récupération12. De plus, les points de suture appliqués après la chirurgie empêchent l’application correcte des procédures d’imagerie. Il en résulte l’acquisition d’images américaines de très mauvaise qualité, ce qui conduit à une extrapolation de données inexacte causée par des artefacts, tels que la réverbération et les régions d’ombres. Compte tenu de tous ces faits, une méthode qui ne nécessite pas d’intervention chirurgicale pour l’établissement d’un modèle murin orthotopique est préférée et fortement recommandée à des fins de recherche préclinique. De plus, étant peu invasif, le temps de récupération de l’inoculation cellulaire est plus rapide et la souffrance animale est minime dans la méthode guidée par les États-Unis. Un grand avantage est que la méthode guidée par les États-Unis est compatible avec l’utilisation de l’anesthésie à l’isoflurane qui permet une induction et une récupération plus rapides, relativement moins d’effet d’épargne sur la fonction cardiovasculaire et l’autorégulation du flux sanguin cérébral, par rapport à d’autres méthodes d’anesthésie (c.-à-d. solution de kétamine / xylazine). Dans l’ensemble, le métabolisme négligeable de l’isoflurane le rend particulièrement utile dans la gestion anesthésique13. En effet, environ 5 min après la fin de l’intervention, les animaux retrouvent suffisamment conscience pour maintenir une position couchée sternale. De plus, les souris sont pré-médicamentées avec un analgésique (carprofène) pour minimiser la douleur, et aucun traitement postopératoire n’est nécessaire en raison de la récupération rapide et complète.
Néanmoins, certaines étapes de dépannage cruciales de la procédure doivent être prises en compte. Le nombre de cellules à inoculer ne doit pas dépasser 1 x 106 cellules et le volume d’inoculum cellulaire ne doit pas être supérieur à 20 μL pour éviter le risque de fuite cellulaire hors du pancréas. L’injection cellulaire doit être effectuée immédiatement après leur détachement, afin d’éviter une diminution de la vitalité cellulaire. Après l’injection cellulaire, il est nécessaire d’attendre au moins 10 s avant de retirer l’aiguille pour éviter la fuite de cellules hors du pancréas.
L’un des aspects les plus critiques du présent protocole concerne le positionnement de la souris sur la plate-forme animale. La souris doit être couchée sur le côté droit sur la table de manipulation des animaux et la peau doit être étirée. Si la peau n’est pas correctement étirée pendant l’injection, l’aiguille aura du mal à percer et à pénétrer dans le pancréas, avec le risque que les cellules se répandent hors du pancréas. L’injection guidée par ultrasons pour produire un modèle murin PCa a été décrite pour la première fois par Huynh et al. en 201114. Ici, nous nous sommes concentrés sur la méthodologie appropriée pour produire un tel modèle, en décrivant en détail toutes les étapes pour le rendre reproductible. De plus, par rapport à Huynh et al.14, nous avons introduit certaines innovations principalement liées aux progrès technologiques américains qui ont eu lieu au cours des 5 dernières années. Dans le protocole actuel, l’utilisation d’une seringue Hamilton avec une aiguille rigide et un angle de biseau de 30° est fortement recommandée pour obtenir une meilleure précision lors de l’injection de cellules et pour minimiser les fuites de cellules. Enfin, lors de l’injection guidée par les États-Unis, les souris ont été fixées sur le côté droit sur la plate-forme animale, tandis que chez Huynh et al.14, 14 souris ont été placées en position couchée dorsale. La position latérale de la souris permet de visualiser la queue du pancréas, juste en dessous de la rate, qui fait office de référence visuelle (Figure 1B) lors de l’injection cellulaire, assurant la reproductibilité de la technique.
Comme pour d’autres techniques, la procédure guidée par les États-Unis présente également certaines limites. La plus grande limitation est que l’injection ne peut être effectuée que dans la queue du pancréas car le corps et la tête sont couverts par d’autres organes et sont difficiles à atteindre avec l’aiguille. De plus, une autre limitation associée à l’utilisation de l’imagerie américaine pour surveiller la croissance tumorale est l’incapacité de visualiser l’ensemble de la masse tumorale lorsqu’elle devient trop grande, après 6 semaines d’inoculation (Figure 3C-E). Bien que, de tels volumes n’imitent pas l’évolution clinique de la maladie.
Un autre avantage du modèle PCa obtenu avec le protocole décrit ici est la lenteur de la greffe cellulaire et de la croissance des masses tumorales (Figure 3B). Ceci est idéal pour identifier avec précision le point de départ de l’intervention pharmacologique et mieux surveiller les effets des interventions thérapeutiques dans le temps.
Enfin, la technique décrite est un exemple de mise en œuvre des principes des 3R impliquant le perfectionnement de la technique et le développement de procédures qui minimisent la douleur, la souffrance, la détresse ou les dommages durables, améliorant directement le bien-être des animaux en recherche.
Les applications futures du modèle PCa obtenu par l’injection guidée par les États-Unis comprennent des études visant à développer des traitements thérapeutiques appropriés ou des combinaisons de traitements. En fait, l’utilisation de ces techniques in vivo innovantes pourrait être associée à l’utilisation de petites molécules, par exemple des anticorps, des fragments d’anticorps et des conjugués anticorps-médicament (ADC), avec une approche thérapeutique. Ce dernier pourrait être utilisé seul, à des fins thérapeutiques, comme notre groupe l’a démontré dans nos travaux récents15 ou après une conjugaison appropriée du fluorophore, dans le but de surveiller la croissance tumorale.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par l’Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC, subvention n° 15627, IG 21510 et IG 19766) à AA, PRIN Ministère italien de l’Université et de la Recherche (MIUR). Tirer parti des connaissances de base du réseau de canaux ioniques dans le cancer pour des stratégies thérapeutiques innovantes (LIONESS) 20174TB8KW to AA, pHioniC: European Union’s Horizon 2020 grant No 813834 to AA. CD a été soutenu par une bourse de l’AIRC pour l’Italie ID 24020.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm Petri dish | Sarstedt, Germany | P5856 | |
| 3D-Mode package | Visualsonics Fujifilm, Italy | Includes the 3D Motor; necessary for volumetric imaging | |
| Aquasonic 100, Sonypack 5 lt Ultrasound Transmission Gel | PARKER LABORATORIES, INC. | 150 | Gel for ultrasound |
| Athymic Mice (Nude-Foxn1nu) | ENVIGO, Italy | 69 | 20 females, 8 weeks old, Athymic Nude-Foxn1nu, 20-22 g body weight |
| CO2 Incubator Function Line | Heraeus Instruments, Germany | BB16-ICN2 | |
| Display of ECG, Respiration Waveform and body temperature | Visualsonics Fujifilm, Italy | 11426 | |
| DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) | Euroclone Spa, Italy | ECM0101L | |
| DPBS (Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline) | Euroclone Spa, Italy | ECB4004L | |
| Eppendorf (1.5mL) | Sarstedt, Germany | 72.690.001 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Euroclone Spa, Italy | ECS0170L | |
| Hamilton Needle Pointstyle 4, lenght 30 mm, 28 Gauge | Permax S.r.l., Italy | 7803-02 | |
| Hamilton Syringe 705RM 50 µL | Permax S.r.l., Italy | 7637-01 | |
| Isoflo (250 mL) | Ecuphar | 7081219 | |
| L-glutamine 100X | Euroclone Spa, Italy | ECB3000D | |
| Mouse Handling table II | Visualsonics Fujifilm, Italy | 50249 | |
| MX550D: 55 MHz MX Series Transducer | Visualsonics Fujifilm, Italy | 51069 | Ultrasound Transducers |
| Oxygen/isofluorane mixer | Angelo Franceschini S.r.l. | LFY-I-5A | |
| PANC1 cell line | American Type Culture Collection (ATCC), USA | CRL-1469 | |
| Rimadyl (carprofen) | Pfizer | 11319 | 20 mL, injection solution |
| Trypsin-EDTA 1X in PBS | Euroclone Spa, Italy | ECB3052D | |
| Vet ointment for eyes, Systane nighttime | Alcon | 509/28555-1 | |
| Vevo Compact Dual Anesthesia System (Tabletop Version) | Visualsonics Fujifilm, Italy | VS-12055 | complete with gas chamber |
| Vevo Imaging Station 2 | Visualsonics Fujifilm, Italy | VS-11983 | Imaging WorkStation 1 plus Imaging Station Extension with injection mount |
| Vevo Lab | Visualsonics Fujifilm, Italy | VS-20034 | Data Analysis Software |
| Vevo LAZR-X Photoacoustic Imaging System | Visualsonics Fujifilm, Italy | VS-20054 | Includes analytic software package for B-mode |
| Vevo Photoacoustic Enclosure | Visualsonics Fujifilm, Italy | 53157 |
References
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