Summary
Этот протокол описывает динамику вирусных инфекций с использованием люциферазы и флуоресцентно-экспрессирующих рекомбинантных (r)SARS-CoV-2 и систем визуализации in vivo (IVIS) у трансгенных мышей K18 hACE2 для преодоления необходимости вторичных подходов, необходимых для изучения инфекций SARS-CoV-2 in vivo.
Abstract
Пандемия коронавирусной болезни 2019 года (COVID-19) была вызвана тяжелым острым респираторным синдромом коронавируса 2 (SARS-CoV-2). На сегодняшний день SARS-CoV-2 является причиной более 242 миллионов инфекций и более 4,9 миллиона смертей во всем мире. Подобно другим вирусам, изучение SARS-CoV-2 требует использования экспериментальных методов для обнаружения присутствия вируса в инфицированных клетках и/или на животных моделях. Чтобы преодолеть это ограничение, мы создали репликационно-компетентный рекомбинантный (r)SARS-CoV-2, который экспрессирует биолюминесцентные (нанолюцифераза, Nluc) или флуоресцентные (Венера) белки. Эти репортер-экспрессирующие rSARS-CoV-2 позволяют отслеживать вирусные инфекции in vitro и in vivo на основе экспрессии генов-репортеров Nluc и Venus. Здесь исследование описывает использование rSARS-CoV-2/Nluc и rSARS-CoV-2/Venus для обнаружения и отслеживания инфекции SARS-CoV-2 в ранее описанной K18 человеческой ангиотензинпревращающей ферменте 2 (hACE2) трансгенной мышиной модели инфекции с использованием систем визуализации in vivo (IVIS). Эти rSARS-CoV-2/Nluc и rSARS-CoV-2/Venus демонстрируют rSARS-CoV-2/WT-подобную патогенность и репликацию вируса in vivo. Важно отметить, что экспрессия Nluc и Venus позволяет нам напрямую отслеживать вирусные инфекции in vivo и ex vivo у инфицированных мышей. Эти rSARS-CoV-2/Nluc и rSARS-CoV-2/Venus представляют собой отличный вариант для изучения биологии SARS-CoV-2 in vivo, понимания вирусной инфекции и связанного с ней заболевания COVID-19 и определения эффективных профилактических и/или терапевтических методов лечения для борьбы с инфекцией SARS-CoV-2.
Introduction
Коронавирус тяжелого острого респираторного синдрома 2 (SARS-CoV-2) представляет собой оболочку, с положительным чувством, одноцепочечный РНК-вирус, который принадлежит к линии бетакоронавирусов в семействе Coronaviridae 1. Это вирусное семейство делится на альфа-, бета-, гамма- и дельта-коронавирус1. Альфа- и бетакоронавирусы в основном заражают млекопитающих, тогда как гамма- и дельтакоронавирусы заражают почти исключительно птиц2. На сегодняшний день семь коронавирусов (CoV) пересекли видовые барьеры и стали коронавирусами человека (HCoV): два альфа-CoV (HCoV-229E и HCoV-NL63) и пять бета-CoV (HCoV-OC43, HCoV-HKU1, SARS-CoV, коронавирус ближневосточного респираторного синдрома [MERS-CoV] и SARS-CoV-2)3,4,5,6. SARS-CoV, MERS-CoV и SARS-CoV-2 являются высокопатогенными, вызывая тяжелую инфекцию нижних дыхательных путей7. До появления SARS-CoV-2 было две эпидемические вспышки, вызванные CoVs: SARS-CoV в Провинции Гуандун, Китай, с 2002 по 2003 год, с коэффициентом летальности (CFR) около 9,7%; и БВРС-КоВ на Ближнем Востоке с 2012 г. по настоящее время, при этом CFR составляет около 34%7,8. SARS-CoV-2 имеет общий CFR между 3,4% -49%, при этом базовые условия способствуют более высокому CFR 8,9. С момента своего открытия в декабре 2019 года в Ухане, Китай, SARS-CoV-2 был ответственен за более чем 242 миллиона случаев инфицирования людей и более 4,9 миллиона человеческих смертей во всем мире 7,10,11,12. Примечательно, что с конца 2020 года новые вызывающие озабоченность варианты SARS-CoV-2 (VoC) и интересующие их варианты (VoI) повлияли на характеристики вируса, включая передачу и антигенность 9,13, а также на общее направление пандемии COVID-19. Для лечения инфекций SARS-CoV-2 в настоящее время существует только один Соединенные Штаты (США). Терапевтический противовирусный препарат Управления по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA) (ремдесивир) и один препарат с разрешением на экстренное использование (EUA) (барицитиниб, вводимый в комбинации с ремдесивиром)14. Существует также 6 одобренных моноклональных антител EUA: REGEN-COV (казиривимаб и имдевимаб, вводимые вместе), сотровимаб, тоцилизумаб, бамланивимаб и этесевимаб, вводимые вместе 15,16,17,18,19. В настоящее время существует только одна одобренная FDA профилактическая вакцина, Pfizer-BioNTech, и две другие профилактические вакцины (Moderna и Janssen) были одобрены EUA 20,21,22,23,24. Однако при неконтролируемом уровне инфицирования и появлении VoC и VoI SARS-CoV-2 по-прежнему представляет угрозу для здоровья человека. Поэтому срочно необходимы новые подходы для выявления эффективных профилактических и терапевтических средств для борьбы с инфекцией SARS-CoV-2 и все еще продолжающейся пандемией COVID-19.
Изучение SARS-CoV-2 требует трудоемких методов и вторичных подходов для выявления присутствия вируса в инфицированных клетках и / или проверенных животных моделях инфекции. Использование обратной генетики позволило генерации рекомбинантных вирусов ответить на важные вопросы биологии вирусных инфекций. Например, методы обратной генетики предоставили средства для выявления и понимания механизмов вирусной инфекции, патогенеза и болезни. Аналогичным образом, подходы обратной генетики проложили путь к разработке рекомбинантных вирусов, лишенных вирусных белков, чтобы понять их вклад в вирусный патогенез. Кроме того, методы обратной генетики были использованы для генерации рекомбинантных вирусов, экспрессирующих репортерные гены для применения in vitro и in vivo, включая выявление профилактических и/или терапевтических подходов к лечению вирусных инфекций. Флуоресцентные и биолюминесцентные белки являются наиболее часто используемыми репортерными генами из-за их чувствительности, стабильности и легкости обнаружения на основе совершенствования новых технологий25,26. Было показано, что флуоресцентные белки in vitro служат лучшим вариантом локализации вирусов в инфицированных клетках, в то время как люциферазы более удобны для количественных исследований 27,28,29. In vivo люциферазы предпочтительнее флуоресцентных белков для визуализации целых животных, в то время как флуоресцентные белки предпочтительны для идентификации инфицированных клеток или визуализации ex vivo 30,31,32. Использование репортер-экспрессирующих рекомбинантных вирусов послужило мощным инструментом для изучения вирусов во многих семействах, включая, среди прочего, флавивирусы, энтеровирусы, альфавирусы, лентивирусы, аренавирусы и вирусы гриппа 28,33,34,35,36.
Чтобы преодолеть потребность во вторичных подходах к изучению SARS-CoV-2 и охарактеризовать инфекцию SARS-CoV-2 in vivo в реальном времени, мы создали репликационно-компетентный рекомбинантный (r)SARS-CoV-2, который экспрессирует биолюминесцентные (нанолюциферазы, Nluc) или флуоресцентные (Венера) белки, используя нашу ранее описанную обратную генетику на основе бактериальных искусственных хромосом (BAC), которые поддерживаются как единая копия в E. colili с целью минимизации токсичности последовательностей вируса при его размножении в бактериях37,38. Примечательно, что rSARS-CoV-2/Nluc и rSARS-CoV-2/Venus показали rSARS-CoV-2/WT-подобную патогенность in vivo. Высокий уровень экспрессии Венеры от rSARS-CoV-2/Venus позволил обнаружить вирусную инфекцию в легких инфицированных трансгенных мышей K18 hACE2 с помощью системы визуализации in vivo (IVIS)39. Уровни экспрессии Венеры хорошо коррелировали с вирусными титрами, обнаруженными в легких, демонстрируя возможность использования экспрессии Венеры в качестве действительного суррогата инфекции SARS-CoV-2. Используя rSARS-CoV-2/Nluc, мы смогли отслеживать динамику вирусной инфекции в режиме реального времени и продольно оценивать инфекцию SARS-CoV-2 in vivo, используя тот же подход IVIS у трансгенных мышей K18 hACE2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Протоколы с участием трансгенных мышей K18 hACE2 были одобрены Институциональным комитетом по биобезопасности (IBC) Техасского биомедицинского научно-исследовательского института (TBRI) и Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC). Все эксперименты проводятся в соответствии с рекомендациями Руководства по уходу за лабораторными животными и их использованию Национальным исследовательским советом40. При работе с мышами требуется соответствующее средство индивидуальной защиты (СИЗ).
1. Использование трансгенных мышей K18 hACE2
- Покупка и содержание 4-6-недельных самок мышей B6.Cg-Tg(K18-ACE2)2Prlmn/J (трансгенные мыши K18 hACE2) в учреждении по уходу за животными уровня биобезопасности (BSL)-2 в определенных условиях, свободных от патогенов.
- После прибытия на объекты BSL2 позвольте животным акклиматизироваться в течение 7 дней и перенесите их в учреждение для животных BSL-3 для инфекций и других экспериментальных процедур.
- Следуя протоколам IACUC, поместите по 4 мышей в клетку. Чтобы убедиться, что животное умерло, после заражения мышей rSARS-CoV-2 и визуализации in vivo усыпляют животных смертельной дозой Fatal-Plus (>100 мг/кг).
2. Биобезопасность
ПРИМЕЧАНИЕ: В этой рукописи rSARS-CoV-2 генерируется с использованием обратных генетических систем на основе BAC для штамма SARS-CoV-2 США-WA1/2020, как описано ранее37. Все процедуры in vivo , связанные с инфекциями rSARS-CoV-2/Nluc или rSARS-CoV-2/Venus, должны выполняться в кабинете биологической безопасности в условиях BSL-3.
- Очистите шкаф биобезопасности 2% вексицидом и 70% этанолом дезинфицирующим средством последовательно до и после выполнения всех экспериментальных процедур, описанных в этой статье.
- Стерилизуйте весь материал для рассечения (ножницы, рассекающие щипцы и т.д.) и гомогенизатор до и после каждого использования.
- Очистите изоляционную камеру и продезинфицируйте таблетки MB10 до и после каждого использования в соответствии с инструкцией производителя.
- Выбросьте весь биологический материал, полученный во время процедур в соответствии с руководящими принципами IBC и IACUC.
3. Характеристика in vivo rSARS-CoV-2
- Мышиные инфекции
- Поместите самок 4-6-недельных трансгенных мышей K18 hACE2 в меченые клетки, идентифицируйте мышей в каждой клетке с помощью кода удара по уху и поместите 4 мышей на клетку. Используйте группу мышей для массы тела и выживания и другую группу животных для титрования и визуализации вируса.
- Перед заражением брейте грудь мышей на вентральной стороне от грудного соска до паховой области соска, чтобы облегчить сигнал биолюминесценции.
- Приготовьте инокулятор rSARS-CoV-2 с 105 бляшеобразующими единицами (PFU)/мышью в стерильных условиях в общем объеме 50 мкл с использованием стерильного 1x фосфатного буферного физиологического раствора (PBS).
ПРИМЕЧАНИЕ: Рассчитайте количество rSARS-CoV-2, которое будет использоваться в вирусном разведении с формулой: вирус необходим = (105 PFU на мышь / 50 мкл) x конечный объем) / запас вирусного титра. - Держите вирусный инокулят охлажденным на льду.
- Используйте в качестве средств внутреннего контроля фиктивно зараженных (1x PBS) и rSARS-CoV-2/WT-инфицированных мышей. Поместите мышей, инфицированных макетом, в отдельную клетку, чем мышей, инфицированных rSARS-CoV-2.
- Обезболивают мышей, используя 5% газообразную седацию изофлурана в анестезиологической камере и поддерживают 3% изофлурана.
- Как только постуральная реакция и корректирующий рефлекс будут подтверждены, поместите мышь в положение спинного лежа.
- Зажмите шею мыши между указательным и большим пальцами и прижмите хвост к ладони мизинцем, чтобы удержать животное в спинном положении.
- Поместите наконечник пипетки, содержащий 50 мкл инокулята вируса, в ноздрю и медленно выталкивайте раствор. Убедитесь, что инокулятив вируса вдыхается и нет рефлюкса, наблюдая, как исчезает капля инокулята.
- Мониторинг биолюминесценции K18 hACE2 трансгенных мышей, инфицированных rSARS-CoV-2/Nluc (Рисунок 1 и Рисунок 2)
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот эксперимент следует схематическому представлению и использует вирусы, показанные на рисунке 1. Прикрепление изофлурановой анестезии требуется для системы визуализации in vivo (IVIS). Смотрите Таблицу материалов для получения подробной информации о необходимых инструментах и системах.- Запустите программное обеспечение для обработки изображений и настройте параметры, щелкните режим изображения в режиме Биолюминесценция, откройте фильтр и установите время экспозиции на автоматическое.
- После инициализации машины IVIS поместите мышей в изоляционную камеру, все еще находясь внутри шкафа биобезопасности. Индуцировать мышей изофлураном в концентрации 5%. Как только потеря постуральной реакции и корректирующего рефлекса подтверждена, поддерживают с 3% изофлураном.
- Как только мыши будут обезболены, удалите их из изоляционной камеры и ретроорбитально введите субстрат люциферазы, разбавленный 1:10 в 1x PBS (конечный объем 100 мкл / мышь) с помощью иглы 25 G.
- После введения субстрата люциферазы поместите мышей обратно в изоляционную камеру с их грудью вверх и носовой полостью внутри коллекторного конуса, чтобы животное было обезболено во время процедуры визуализации.
- Перенесите изоляционную камеру на машину IVIS и сразу после закрытия дверцы тепловизора IVIS выберите Acquire в программном обеспечении для инициализации (рисунок 2A).
- Для анализа полученных изображений биолюминесценции используйте инструмент ROI (область интереса) в программном обеспечении для обозначения точного сигнала и измерения потока (рисунок 2B).
- Нажмите « Измерить» и позвольте системе начать оценку биолюминесценции в фотонах, чтобы обеспечить абсолютное излучение фотонов, сопоставимое с выходными измерениями, предоставляемыми различными параметрами.
- Изображение мышей через 1, 2, 4 и 6 дней после заражения.
- После визуализации поместите мышей обратно в клетку.
- Флуоресцентный анализ у трансгенных мышей K18 hACE2, инфицированных rSARS-CoV-2/Venus (Рисунок 3 и Рисунок 4)
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот эксперимент следует схематическому представлению и rSARS-CoV-2, показанному на рисунке 3. Смотрите Таблицу материалов для получения подробной информации о необходимых инструментах и системах.- Запустите программное обеспечение для обработки изображений и настройте параметры, установите фильтры возбуждения (500 нм) и излучения (530 нм), щелкните режим изображения на Флуоресценция и установите время экспозиции на автоматическое.
- Внутрибрюшинно усыпляют мышей, используя смертельную дозу Fatal-Plus (>100 мг/кг). После эвтаназии дезинфицируйте место разреза 70% этанолом.
- С помощью пинцета потяните кожу, сделайте разрез от грудины к животу и ножницами срежьте разрез с боков. Отрежьте печеночную вену, чтобы свести к минимуму количество крови в легких и избежать высоких фоновых сигналов во время визуализации.
- Ножницами срежьте грудину и откройте грудную клетку. Далее ножницами срезают конец трахеи и удаляют легкие пинцетом.
- Поместите иссеченные легкие в 6-луночную пластину, содержащую 2 мл 1x PBS, и промойте, чтобы удалить избыток крови. Свести к минимуму возможность загрязнения между образцами путем дезинфекции и очистки хирургических инструментов между образцами с использованием 70% этанола.
- После инициализации аппарата IVIS поместите легкие в черный лоток и отделите ткани друг от друга.
- Поместите лоток внутрь изоляционной камеры внутри шкафа биобезопасности, а затем перенесите изоляционную камеру в IVIS. Закройте дверь и нажмите « Получить », чтобы запустить систему визуализации (рисунок 4A).
- Чтобы проанализировать флуоресценцию, используйте инструмент ROI и нарисуйте ROI вокруг каждого из отдельных легких. Измерьте каждую рентабельность инвестиций вручную, а затем используйте средние значения эффективности излучения и вычтите их из значений мышей, инфицированных макетом (рисунок 4B).
- Как только визуализация будет завершена, поместите ткани на лед для анализа в тот же день или в криотрубу для замораживания сухого льда, чтобы хранить при -80 ° C для последующей обработки.
- Визуализация яркого поля легких и оценка патологии трансгенных мышей K18 hACE2, инфицированных rSARS-CoV-2/Nluc (Рисунок 2A-C) и rSARS-CoV-2/Venus (Рисунок 4A-C)
- После визуализации биолюминесценции мышей, инфицированных rSARS-CoV-2/Nluc, rSARS-CoV-2/WT и зараженных макетом, возвращают мышей в клетки. Продолжайте эвтаназию и визуализацию ex vivo ярким полем легких мышей (рисунок 2A).
- После визуализации флуоресценции ex vivo легких инфицированных мышей, сделайте снимки легких с ярким полем (рисунок 4A).
- Проанализируйте грубые поражения на поверхности легкого с помощью ImageJ (рисунки 2C и 4C).
- Откройте изображение легких для анализа в ImageJ.
- Рассчитайте отношение пикселя к см, используйте инструмент «Прямая » и измерьте фактическую длину изображения.
- После выбора нажмите «Анализировать > меру», чтобы рассчитать длину пикселей для длины.
- Щелкните Анализ > Установить масштаб и введите числа, рассчитанные из предыдущего шага.
- Используйте инструмент «Выделение от руки» и выделите всю поверхность легких. Нажмите « Проанализировать > измерить, чтобы измерить общую площадь легких.
- Нажмите «Редактировать > выделение» > «Сделать обратным», чтобы выбрать остальную часть области легких, затем нажмите «Delete» или «Backspace», чтобы удалить фон.
- Удалите выбранную область, затем нажмите «Изображение > «Настроить порог цвета >».
- Чтобы выбрать область патологического поражения, отрегулируйте яркость до минимума (от 1 до 50) и максимума (от 50 до 200), в зависимости от уровня застойных явлений и кровоизлияний.
- После того, как патологические поражения выбраны, нажмите « Выбрать» в нижней части цветовой панели порога, затем нажмите « Анализировать > меру», чтобы измерить патологические области.
- Рассчитайте процент грубых поражений по формуле: % от патологической площади = (измерение патологической площади/общей поверхности легких) x 100.
- Титрование вирусов (рисунок 2D и рисунок 4D)
- После визуализации завершите эвтаназию мышей и соберите легкие, мозг и слизистую оболочку носа.
- Поместите легкие, мозг и слизистую оболочку носа в отдельные гомогенизаторы стерильной ткани и добавьте 1 мл холодного 1x PBS.
- Гомогенизируйте образцы путем центрифугирования при 21 500 х г в течение 10 мин до обломков гранулированных клеток. Соберите и переложите супернатанты в новую стерильную трубку и выбросьте гранулу.
- Если титрование вируса проводится в тот же день, храните супернатанты при 4 °C. Альтернативно, заморозить супернатант гомогенизированных образцов при -80°C до последующей оценки.
- Используя супернатанты, полученные из тканевых гомогенатов, производят 10-кратное последовательное разведение и заражают сливающиеся монослои клеток Vero E6 1 мл каждого разведения супернатанта (6-луночный пластинчатый формат, 1,2 × 106 клеток/лунка, трипликаты).
- Дайте вирусу адсорбироваться в течение 1 ч при 37 °C в увлажненном 5% CO2 инкубаторе.
- После вирусной адсорбции промыть клетки 1 мл 1x PBS и инкубировать в 2 мл постинфекционных сред, содержащих 1% агара, в увлажненном 5% CO2 инкубаторе при 37 °C в течение 72 ч.
- После инкубации инактивируйте пластины в 10% нейтральном буферизованном формалине в течение 24 ч при 4 °C, убедитесь, что вся пластина погружена.
- Выньте пластины из BSL3 и промыть клетки три раза 1 мл 1x PBS и пропитайте 1 мл 0,5% Triton X-100 в течение 10 мин при комнатной температуре (RT).
- Блокируют клетки 1 мл 2,5% бычьего сывороточного альбумина (BSA) в 1x PBS в течение 1 ч при 37 °C с последующей инкубацией в 1 мл 1 мкг/мл белка SARS-CoV с перекрестно-реактивным моноклональным антителом (1C7C7), разведенным в 2,5% BSA в течение 1 ч при 37 °C.
- Промыть клетки три раза 1 мл 1x PBS и разработать бляшки с использованием набора ABC и набора СУБСТРАТА DAB Peroxidase в соответствии с инструкциями производителей.
- Рассчитайте вирусные титры как PFU/mL.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рассчитать по формуле PFU/mL = коэффициент разбавления x количество бляшек x (объем 1 мл/инокулят).
- Активность Nluc в тканях трансгенных мышей K18 hACE2, инфицированных rSARS-CoV-2/Nluc (Рисунок 2E)
- Количественно оценить присутствие Nluc в гомогенатах органов у имитационных, rSARS-CoV-2/WT и rSARS-CoV-2/Nluc инфицированных K18 hACE2 трансгенных мышей с использованием анализа люциферазы в соответствии с инструкциями производителей.
- Оценка заболеваемости и смертности (рисунок 2F, G и рисунок 4E, F)
- Интраназально инфицировать 4-6-недельную самку трансгенных мышей K18 hACE2 105 PFU rSARS-CoV-2/WT, rSARS-CoV-2/Venus, rSARS-CoV-2/Nluc или имитированно инфицированных, как описано в разделе 3.1.
- Контролируйте и взвешивайте мышей в течение 12 дней одновременно, чтобы свести к минимуму изменение веса из-за приема пищи. Усыплите мышей, которые теряют 25% своей первоначальной массы тела с тех пор, как они достигли гуманной конечной точки, и отметьте этих мышей как поддающихся вирусной инфекции.
- Через 12 дней усыпляют мышей, переживших вирусную инфекцию, и рассчитывают % изменения массы тела и выживаемости.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Инфекция rSARS-CoV-2/Nluc у трансгенных мышей K18 hACE2 (рисунки 1 и 2)
На рисунке 1А показано схематическое изображение rSARS-CoV-2/WT (вверху) и rSARS-CoV-2/Nluc (снизу), используемых для оценки инфекций in vivo. На рисунке 1B показана схематическая блок-схема, применяемая для оценки динамики инфекции rSARS-CoV-2/Nluc у трансгенных мышей K18 hACE2. Четырех-шестинедельные самки трансгенных мышей K18 hACE2 (N = 4) были либо имитированно инфицированы 1x PBS, либо инфицированы 105 PFU rSARS-COV-2/WT или rSARS-CoV-2/Nluc интраназально. Через 1, 2, 4 и 6 дней после заражения мышей успокаивали с помощью изоляционной камеры, а затем вводили субстрат Nluc ретроорбитально. Изоляционная камера была немедленно помещена в IVIS, и сигнал Nluc был оценен in vivo с использованием программного обеспечения для визуализации. Экспрессия Nluc была легко обнаружена у мышей, инфицированных rSARS-CoV-2/Nluc, но не у мышей, инфицированных rSARS-CoV-2/WT или зараженных имитацией (рисунок 2A). Количественные анализы показали интенсивность Nluc в разные дни после заражения (рисунок 2B). Грубые поражения на поверхности легких мышей, инфицированных rSARS-CoV-2/Nluc, были сопоставимы с поражениями в группе, инфицированной rSARS-CoV-2/WT (рисунки 2C). Наконец, органы мышей (легкие, носовая носовая носовая раковина и мозг) были гомогенизированы, а вирусные титры определялись с помощью анализа бляшек (PFU / mL), а активность Nluc определялась с использованием анализа люциферазы в соответствии с инструкциями производителя. Бляшки оценивали путем иммуноокрашивания с использованием перекрестно-реактивного моноклонального антитела SARS-CoV N 1C7C7. Вирусные титры, обнаруженные у инфицированных rSARS-CoV-2/Nluc мышей, были сопоставимы с теми, кто был инфицирован rSARS-CoV-2/WT во всех органах в разные дни после заражения (рисунок 2D). Активность Nluc была обнаружена только в органах у мышей, инфицированных rSARS-CoV-2/Nluc (рисунок 2E). Отдельная группа инфицированных и инфицированных вирусом мышей наблюдалась в течение 12 дней на предмет изменений массы тела (рисунок 2F) и выживаемости (рисунок 2G). Мыши, инфицированные rSARS-CoV-2/Nluc и rSARS-CoV-2/WT, потеряли до 25% массы тела и все умерли от вирусной инфекции через 7-8 дней после заражения (рисунок 2F-G).
Инфекция rSARS-CoV-2/Venus у трансгенных мышей K18 hACE2 (рисунки 3 и 4)
На рисунке 3А показано схематическое изображение rSARS-CoV-2/WT (вверху) и rSARS-CoV-2/Nluc (снизу), используемых для оценки инфекций ex vivo. На рисунке 3B показана схематическая блок-схема, применяемая для оценки динамики rSARS-CoV-2/Venus у трансгенных мышей K18 hACE2. Четырех-шестинедельные самки трансгенных мышей K18 hACE2 (N = 4 / группа) были либо имитированно инфицированы 1x PBS, либо инфицированы 105 PFU rSARS-COV-2 / WT или rSARS-CoV-2 / Venus интраназально. Через 1, 2, 4 и 6 дней после заражения мышей усыпляли, а их легкие иссекали и визуализировали ex vivo с помощью IVIS. Экспрессия Венеры была легко обнаружена во всех легких у мышей, инфицированных rSARS-CoV-2/Venus, но не у мышей, инфицированных rSARS-CoV-2/WT или зараженных (рисунок 4A). Количественные анализы показали, что интенсивность Венеры достигает пика через 2 дня после заражения и уменьшается в течение инфекции в легких инфицированных мышей (рисунок 4B). Изображения поверхности легких выявили грубые поражения мышей, инфицированных rSARS-CoV-2/Venus, были сопоставимы с поражениями мышей, инфицированных rSARS-CoV-2/WT (рисунок 4C). Наконец, органы мышей (легкие, носовая носовая раковина и мозг) были гомогенизированы, а вирусные титры определялись с помощью анализа бляшек и оценивались иммуноокрашиванием с использованием кросс-реактивного моноклонального антитела 1C7C7 белка SARS-CoV N. Инфекция rSARS-CoV-2/Venus привела к получению вирусных титров, сопоставимых с теми, которые наблюдались у мышей, инфицированных rSARS-CoV-2/WT во всех органах (рисунок 4D). Отдельная группа инфицированных и инфицированных вирусом мышей наблюдалась в течение 12 дней на предмет изменений массы тела (рисунок 4E) и выживаемости (рисунок 4F). Мыши, инфицированные rSARS-CoV-2/Venus и rSARS-CoV-2/WT, потеряли до 25% массы тела и все умерли от вирусной инфекции к 9-му дню после заражения без выживания (рисунки 4E-4F).
Рисунок 1: Оценка инфекции rSARS-CoV-2/Nluc in vivo с использованием трансгенных мышей K18 hACE2. (A) Схематическое изображение rSARS-CoV-2/WT (вверху) и rSARS-CoV-2/Nluc (внизу). B) Схематическая блок-схема для оценки rSARS-CoV-2/Nluc in vivo. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: экспрессия rSARS-CoV-2Nluc у инфицированных трансгенных мышей K18 hACE2. (А-Б) Четырех-шестинедельные самки трансгенных мышей K18 hACE2 были инфицированы (N = 4) или инфицированы rSARS-CoV-2 / WT (N = 4) или rSARS-CoV-2 / Nluc (N = 4) с использованием 105 PFU на животное. Мышей анестезировали через 1, 2, 4 и 6 дней после заражения после ретроорбитального введения субстрата Nluc. (A) Экспрессию Nluc определяли с помощью системы визуализации in vivo, а легкие у инфицированных и инфицированных мышей иссекали и фотографировали через 1, 2, 4 и 6 дней после заражения. (B) Интенсивность Nluc была количественно проанализирована программным обеспечением для анализа изображений, а (C) грубые поражения на поверхности легких были количественно проанализированы ImageJ (C) ** P < 0,01. (D) Вирусные титры в носовой носовой раковине (слева), легких (в середине) и мозге (справа) у мышей, инфицированных rSARS-CoV-2/WT и rSARS-CoV-2/Nluc, были определены с помощью анализа бляшек. (E) Активность Nluc в носовых носовых раковинах (слева), легких (в центре) и мозге (справа) измерялась с помощью многопластинного считывателя люциферазы. ns, не значительный. В течение 12 дней наблюдали за мок- и вирус-инфицированными мышами на предмет изменений массы тела (F) и (G) выживаемости. Все данные представлены в виде среднего ± SD для каждой группы и анализируются SPSS13.0 (IBM). Значение P менее 0,05 (P < 0,05) считалось статистически значимым. Эта цифра была изменена по сравнению с Ye C. et al.41. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Оценка инфекции rSARS-CoV-2/Venus in vivo с использованием трансгенных мышей K18 hACE2. (A) Схематическое изображение rSARS-CoV-2/WT (вверху) и rSARS-CoV-2/Venus (внизу). (B) Схематическая блок-схема для оценки rSARS-CoV-2/Венеры in vivo. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: экспрессия rSARS-CoV-2/Venus у инфицированных трансгенных мышей K18 hACE2. (А-Б) Четырех-шестинедельные самки трансгенных мышей K18 hACE2 были инфицированы (N = 4) или инфицированы (105 PFU / мышь) rSARS-CoV-2 / WT (N = 4) или rSARS-CoV-2 / Венера (N = 4). Легкие иссекались через 1, 2, 4 и 6 дней после заражения, изображения легких были сфотографированы через 1, 2, 4 и 6 дней после заражения. (A) Экспрессия Венеры оценивалась с помощью IVIS, (B) интенсивность флуоресценции была количественно проанализирована программным обеспечением для анализа изображений и (C) грубые поражения на поверхностях легких были количественно проанализированы ImageJ. **P < 0,01. (D) Вирусные титры в носовой носовой раковине (слева), легких (в середине) и головном мозге (справа) у мышей, инфицированных rSARS-CoV-2/WT и rSARS-CoV-2/Venus, определялись с помощью анализа бляшек. ns, не значительный. Мышей, инфицированных Mock- и SARS-CoV-2, наблюдали в течение 12 дней на предмет (E) потери массы тела и (F) выживаемости. Все данные представлены в виде среднего ± SD для каждой группы и анализируются SPSS13.0 (IBM). Значение P менее 0,05 (P < 0,05) считалось статистически значимым. Эта цифра была изменена по сравнению с Ye C. et al.41. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол демонстрирует возможность использования этих rSARS-CoV-2 экспрессирующих репортерных генов для мониторинга вирусных инфекций in vivo. Оба репортер-экспрессирующих рекомбинантных вируса являются отличным инструментом для изучения инфекций SARS-CoV-2 in vivo. Описанные системы визуализации ex vivo (rSARS-CoV-2/Venus) и in vivo (rSARS-CoV-2/Nluc) представляют собой отличный вариант для понимания динамики инфекции SARS-CoV-2, вирусного патогенеза и выявления инфицированных клеток/органов в разное время после вирусной инфекции. Для проведения исследований ex vivo (rSARS-CoV-2/Venus) и in vivo (rSARS-CoV-2/Nluc) важно иметь точные и воспроизводимые инфекции, а также адекватные прививки rSARS-CoV-2/Nluc.
При изучении инфекций in vivo с использованием rSARS-CoV-2/Nluc мышей следует брить, чтобы облегчить визуализацию Nluc под IVIS. Существует также необходимость инокуляции субстрата Nluc для визуализации Nluc. Это может потребовать некоторых экспериментальных испытаний для определения концентраций и объема субстрата Nluc для обеспечения высокого сигнала Nluc. При изучении инфекций ex vivo с использованием rSARS-CoV-2/Venus, а также из-за ограничений обнаружения Венеры непосредственно у всех мышей с использованием IVIS, только визуализация ex vivo легких позволяет обнаружить экспрессию Венеры. Это требует, чтобы группа мышей была усыплена в разные моменты времени. Это противоречит ситуации мышей, инфицированных rSARS-CoV-2/ Nluc, поскольку одна и та же группа мышей может быть изображена в разные дни после заражения, не требуя эвтаназии в каждое из периодов после заражения, необходимых для rSARS-CoV-2 / Venus. Преимущество rSARS-CoV-2/Venus перед rSARS-CoV-2/Nluc заключается в том, что его можно использовать с проточной цитометрией для определения того, какой тип клеток инфицирован SARS-CoV-2 путем простой сортировки инфицированных клеток из неинфицированных клеток в сочетании с использованием специфических клеточных маркеров, как мы ранее описывали с гриппом (REF). Одним из важных аспектов наших rSARS-CoV-2 /Venus и rSARS-CoV-2/Nluc является то, что оба они проявляли WT-подобные свойства роста in vitro и in vivo без признаков ослабления, что позволяет нам контролировать вирусную инфекцию ex vivo в легких инфицированных мышей (rSARS-CoV-2 / Venus) и динамику репликации вируса у всей мыши (rSARS-CoV-2 / Nluc) с использованием неинвазивной продольной визуализации in vivo .
Важно отметить, что эти репортер-экспрессирующие rSARS-CoV-2/Venus и rSARS-CoV-2/Nluc представляют собой отличный вариант для идентификации свинцовых профилактических и/или терапевтических средств для лечения инфекции SARS-CoV-241. Использование репортер-экспрессирующего rSARS-CoV-2, экспрессирующего различные флуоресцентные белки (например, Venus и mCherry), позволяет нам комбинировать их в бифлуоресцентных анализах, чтобы определить, могут ли терапевтические средства эффективно ингибировать инфекцию двух вирусов одновременно, in vitro и /или in vivo, и отслеживать вирусную инфекцию и патогенез39.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии какого-либо коммерческого, финансового и нефинансового или личного конфликта интересов в отношении описываемой работы.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить членов нашего института (Техасского института биомедицинских исследований) за их усилия по поддержанию наших объектов в полной рабочем состоянии и безопасности во время пандемии COVID-19. Мы также хотели бы поблагодарить наш Институциональный комитет по биобезопасности (IBC) и Spell (IACUC) за обзор наших протоколов эффективным по времени образом. Мы благодарим доктора Томаса Морана из Медицинской школы Айкана на горе Синай за предоставление моноклонального антитела к протоклональному белку нуклеокапсида (N) sarS-CoV с перекрестным реактивным 1C7C7 (N). Исследования SARS-CoV-2 в лаборатории Мартинеса-Собридо в настоящее время поддерживаются грантами NIAID/NIH RO1AI161363-01, RO1AI161175-01A1 и R43AI165089-01; Министерство обороны (DoD) предоставляет гранты W81XWH2110095 и W81XWH2110103; Партнерство Сан-Антонио по прецизионной терапии; Форум Техасского института биомедицинских исследований; Научный центр здравоохранения Техасского университета в Сан-Антонио; Медицинский фонд Сан-Антонио; и Центром исследований патогенеза и передачи гриппа (CRIPT), финансируемым NIAID Центром передового опыта в области исследований и реагирования на грипп (CEIRR, контракт No 75N93021C00014).
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.5% Triton X-100 | J.T.Baker | X198-07 | Store at room temperature (RT) |
1% DEAE-Dextran | MP Biomedicals | 195133 | |
10% Formalin solution, neutral buffered | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
Agar | Oxoid | LP0028 | |
24-well Cell Culture Plate | Greiner Bio-one | 662160 | |
5% Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S-5761 | |
6-well Cell Culture Plate | Greiner Bio-one | 657160 | |
96-well Cell Culture Plate | Greiner Bio-one | 655-180 | |
African green monkey kidney epithelial cells (Vero E6) | ATCC | CRL-1586 | |
Ami HT | Spectral Instruments Imaging | ||
Aura Imaging Software 3.2.0 | Spectral Instruments Imaging | Image analysis software | |
Bovine Serum Albumin (BSA), 35% | Sigma-Aldrich | A9647 | Store at 4 °C |
Cell culture grade water | Corning | 25-055-CV | |
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Corning Cellgro | 15-013-CV | Store at 4 °C |
Anesthesia gas machine | Veterinary Anesthesia Systems, Inc. | VAS 2001R | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Seradigm | 1500-050 | Store at -20 °C |
Four- to six-week-old female K18-hACE2 transgenic mice | The Jackson Laboratory | 34860 | |
Graphpad Prism Version 9.1.0 | GraphPad | ||
Isoflurane | Baxter | 1001936040 | Store at RT |
MARS Data Analysis Software | BMG LABTECH | ||
MB10 tablets | QUIP Laboratories | MBTAB1.5 | Store at RT |
Nano-Glo Luciferase Assay Reagent | Promega | N1110 | This reagent is used to measure Nluc activity. Store at -20 °C |
Nunc MicroWell 96-Well Microplates | ThermoFisher Scientific | 269620 | |
Nunc MicroWell 96-Well Microplates | ThermoFisher Scientific | 269620 | |
Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine (PSG) 100x | Corning | 30-009-CI | Store at -20 °C |
PHERAstar FSX | BMG LABTECH | PHERAstar FSX | |
Precelleys Evolution homogenizer | Bertin Instruments | P000062-PEVO0-A | |
Soft tissue homogenizing CK14 – 7 mL | Bertin Instruments | P000940-LYSK0-A | |
T75 EasYFlask | ThermoFisher Scientific | 156499 | |
VECTASTAIN ABC-HRP Kit, Peroxidase | Vector Laboratories | PK-4002 | ABC kit and DAB Peroxidase Substrate kit |
References
- V'Kovski, P., Kratzel, A., Steiner, S., Stalder, H., Thiel, V. Coronavirus biology and replication: implications for SARS-CoV-2. Nature Reviews Microbiology. 19 (3), 155-170 (2021).
- Pal, M., Berhanu, G., Desalegn, C., Kandi, V. Severe acute respiratory syndrome coronavirus-2 (SARS-CoV-2): An update. Cureus. 12 (3), 7423 (2020).
- Su, S., et al. Epidemiology, genetic recombination, and pathogenesis of coronaviruses. Trends in Microbiology. 24 (6), 490-502 (2016).
- Cui, J., Li, F., Shi, Z. L.
Origin and evolution of pathogenic coronaviruses. Nature Reviews Microbiology. 17 (3), 181-192 (2019). - Lu, R., et al. Genomic characterisation and epidemiology of 2019 novel coronavirus: implications for virus origins and receptor binding. Lancet. 395 (10224), 565-574 (2020).
- Evans, J. P., Liu, S. L. Role of host factors in SARS-CoV-2 entry. Journal of Biological Chemistry. 297 (1), 100847 (2021).
- Petersen, E., et al. Comparing SARS-CoV-2 with SARS-CoV and influenza pandemics. Lancet Infectious Diseases. 20 (9), 238-244 (2020).
- Alfaraj, S. H., et al. Clinical predictors of mortality of Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus (MERS-CoV) infection: A cohort study. Travel Medicine and Infectious Disease. 29, 48-50 (2019).
- Harvey, W. T., et al. SARS-CoV-2 variants, spike mutations and immune escape. Nature Reviews Microbiology. 19 (7), 409-424 (2021).
- Dong, E., Du, H., Gardner, L. An interactive web-based dashboard to track COVID-19 in real time. Lancet Infectious Diseases. 20 (5), 533-534 (2020).
- Bar-On, Y. M., Flamholz, A., Phillips, R., Milo, R.
ARS-CoV-2 (COVID-19) by the numbers. Elife. 9, 57309 (2020). - Roussel, Y., et al.
SARS-CoV-2: fear versus data. International Journal of Antimicrobial Agents. 55 (5), 105947 (2020). - Scialo, F., et al. SARS-CoV-2: One year in the pandemic. What have we learned, the new vaccine era and the threat of SARS-CoV-2 variants. Biomedicines. 9 (6), 611 (2021).
- Coronavirus (COVID-19) update: FDA authorizes additional monoclonal antibody for treatment of COVID-19. , Available from: https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/coronavirus-covid-19-update-fda-authorizes-additional-monoclonal-antibody-treatment-covid-19 (2021).
- Dougan, M., et al. Bamlanivimab plus Etesevimab in Mild or Moderate Covid-19. New England Journal of Medicine. 385 (15), 1382-1392 (2021).
- Ledford, H. COVID antibody treatments show promise for preventing severe disease. Nature. 591 (7851), 513-514 (2021).
- Tuccori, M., et al. An overview of the preclinical discovery and development of bamlanivimab for the treatment of novel coronavirus infection (COVID-19): reasons for limited clinical use and lessons for the future. Expert Opinion on Drug Discovery. , 1-12 (2021).
- Phan, A. T., Gukasyan, J., Arabian, S., Wang, S., Neeki, M. M. Emergent inpatient administration of casirivimab and imdevimab antibody cocktail for the treatment of COVID-19 pneumonia. Cureus. 13 (5), 15280 (2021).
- O'Brien, M. P., et al. Subcutaneous REGEN-COV antibody combination in early SARS-CoV-2 infection. medRxiv. , (2021).
- Beigel, J. H., et al. Remdesivir for the treatment of Covid-19 - Final report. New England Journal of Medicine. 383 (19), 1813-1826 (2020).
- Li, L., et al. Effect of convalescent plasma therapy on time to clinical improvement in patients with severe and life-threatening COVID-19: A randomized clinical trial. Journal of the American Medical Association. 324 (5), 460-470 (2020).
- Polack, F. P., et al. Safety and efficacy of the BNT162b2 mRNA Covid-19 vaccine. New England Journal of Medicine. 383 (27), 2603-2615 (2020).
- Oliver, S. E., et al. The advisory committee on immunization practices' interim recommendation for use of Pfizer-BioNTech COVID-19 vaccine - United States, December 2020. Morbidity and Mortality Weekly Report. 69 (50), 1922-1924 (2020).
- Oliver, S. E., et al. The advisory committee on immunization practices' interim recommendation for use of Janssen COVID-19 vaccine - United States, February 2021. Morbidity and Mortality Weekly Report. 70 (9), 329-332 (2021).
- Zhao, H., et al. Emission spectra of bioluminescent reporters and interaction with mammalian tissue determine the sensitivity of detection in vivo. Journal of Biomedical Optics. 10 (4), 41210 (2005).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nature Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
- Nogales, A., et al. A novel fluorescent and bioluminescent bireporter Influenza A Virus to evaluate viral infections. Journal of Virology. 93 (10), 00032 (2019).
- Nogales, A., et al. Replication-competent fluorescent-expressing influenza B virus. Virus Research. 213, 69-81 (2016).
- Welsh, D. K., Noguchi, T.
Cellular bioluminescence imaging. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (8), (2012). - Tran, V., Moser, L. A., Poole, D. S., Mehle, A. Highly sensitive real-time in vivo imaging of an influenza reporter virus reveals dynamics of replication and spread. Journal of Virology. 87 (24), 13321-13329 (2013).
- Schoggins, J. W., et al. Dengue reporter viruses reveal viral dynamics in interferon receptor-deficient mice and sensitivity to interferon effectors in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (36), 14610-14615 (2012).
- Luker, G. D., et al. Noninvasive bioluminescence imaging of herpes simplex virus type 1 infection and therapy in living mice. Journal of Virology. 76 (23), 12149-12161 (2002).
- Li, X., et al. Development of a rapid antiviral screening assay based on eGFP reporter virus of Mayaro virus. Antiviral Research. 168, 82-90 (2019).
- Kirui, J., Freed, E. O. Generation and validation of a highly sensitive bioluminescent HIV-1 reporter vector that simplifies measurement of virus release. Retrovirology. 17 (1), 12 (2020).
- Shang, B., et al. Development and characterization of a stable eGFP enterovirus 71 for antiviral screening. Antiviral Research. 97 (2), 198-205 (2013).
- Zou, G., Xu, H. Y., Qing, M., Wang, Q. Y., Shi, P. Y. Development and characterization of a stable luciferase dengue virus for high-throughput screening. Antiviral Research. 91 (1), 11-19 (2011).
- Ye, C., et al. Rescue of SARS-CoV-2 from a single bacterial artificial chromosome. mBio. 11 (5), 02168 (2020).
- Avila-Perez, G., Park, J. G., Nogales, A., Almazan, F., Martinez-Sobrido, L. Rescue of recombinant Zika virus from a bacterial artificial chromosome cDNA clone. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59537 (2019).
- Chiem, K., et al. A bifluorescent-based assay for the identification of neutralizing antibodies against SARS-CoV-2 variants of concern in vitro and in vivo. Journal of Virology. , (2021).
- Committee for the update of the guide for the care and use of laboratory animals., Institute for laboratory animal research (U.S) & National Academies Press (U.S.). Guide for the care and use of laboratory animals. 8th edn. National Research Council (US). , National Academies Press. (2011).
- Ye, C., et al. Analysis of SARS-CoV-2 infection dynamic in vivo using reporter-expressing viruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (41), (2021).