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Immunology and Infection

Live-Bildgebung und Quantifizierung von Virusinfektionen in transgenen K18-hACE2-Mäusen mit Reporter-exprimierendem rekombinantem SARS-CoV-2

Published: November 5, 2021 doi: 10.3791/63127
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Texas Biomedical Research Institute

Summary

Dieses Protokoll beschreibt die Dynamik von Virusinfektionen unter Verwendung von Luciferase- und Fluoreszenz-exprimierenden rekombinanten (r)SARS-CoV-2 und einem in vivo Bildgebungssystem (IVIS) in transgenen K18 hACE2-Mäusen, um den Bedarf an sekundären Ansätzen zu überwinden, die zur Untersuchung von SARS-CoV-2-Infektionen in vivo erforderlich sind.

Abstract

Die Coronavirus-Krankheit 2019 (COVID-19) Pandemie wurde durch das schwere akute Atemwegssyndrom Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) verursacht. Bis heute war SARS-CoV-2 weltweit für über 242 Millionen Infektionen und mehr als 4,9 Millionen Todesfälle verantwortlich. Ähnlich wie bei anderen Viren erfordert die Untersuchung von SARS-CoV-2 die Verwendung experimenteller Methoden, um das Vorhandensein von Viren in infizierten Zellen und / oder in Tiermodellen nachzuweisen. Um diese Einschränkung zu überwinden, haben wir replikationskompetente rekombinante (r)SARS-CoV-2 erzeugt, die biolumineszierende (Nanoluciferase, Nluc) oder fluoreszierende (Venus) Proteine exprimiert. Diese Reporter-exprimierenden rSARS-CoV-2 ermöglichen die Verfolgung von Virusinfektionen in vitro und in vivo basierend auf der Expression von Nluc- und Venus-Reportergenen. Hier beschreibt die Studie die Verwendung von rSARS-CoV-2/Nluc und rSARS-CoV-2/Venus zum Nachweis und zur Verfolgung einer SARS-CoV-2-Infektion im zuvor beschriebenen transgenen K18-Modell der Infektion mit humanem Angiotensin-Converting-Enzym 2 (hACE2) unter Verwendung von In-vivo-Bildgebungssystemen (IVIS). Diese rSARS-CoV-2/Nluc und rSARS-CoV-2/Venus zeigen rSARS-CoV-2/WT-ähnliche Pathogenität und virale Replikation in vivo. Wichtig ist, dass die Nluc- und Venusexpression es uns ermöglicht, Virusinfektionen in vivo und ex vivo bei infizierten Mäusen direkt zu verfolgen. Diese rSARS-CoV-2/Nluc und rSARS-CoV-2/Venus stellen eine ausgezeichnete Option dar, um die Biologie von SARS-CoV-2 in vivo zu untersuchen, Virusinfektionen und assoziierte COVID-19-Erkrankungen zu verstehen und wirksame prophylaktische und/oder therapeutische Behandlungen zur Bekämpfung der SARS-CoV-2-Infektion zu identifizieren.

Introduction

Das Severe Acute RespiratorySyndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) ist ein umhülltes, positiv-sense, einzelsträngiges RNA-Virus, das zur Betacoronavirus-Linie in der Familie der Coronaviridae 1 gehört. Diese virale Familie ist in Alpha-, Beta-, Gamma- und Delta-Coronavirus1 unterteilt. Alpha- und Betacoronaviren infizieren hauptsächlich Säugetiere, während Gamma- und Deltacoronaviren fast ausschließlich Vögel infizieren2. Bisher haben sieben Coronaviren (CoV) Artenbarrieren überschritten und sind als humane Coronaviren (HCoV) entstanden: zwei Alpha-CoVs (HCoV-229E und HCoV-NL63) und fünf Beta-CoVs (HCoV-OC43, HCoV-HKU1, SARS-CoV, Middle East respiratory syndrome coronavirus [MERS-CoV] und SARS-CoV-2)3,4,5,6. SARS-CoV, MERS-CoV und SARS-CoV-2 sind hochpathogen und verursachen eine schwere Infektion der unteren Atemwege7. Vor der Entstehung von SARS-CoV-2 gab es zwei durch CoVs verursachte epidemische Ausbrüche: SARS-CoV in Guangdong Providence, China, von 2002-2003, mit einer Todesfallrate (CFR) von etwa 9,7%; und MERS-CoV im Nahen Osten von 2012 bis heute, mit einem CFR von etwa 34%7,8. SARS-CoV-2 hat einen Gesamt-CFR zwischen 3,4% und 49%, wobei die zugrunde liegenden Bedingungen zu einem höheren CFRvon 8,9 beitragen. Seit seiner Entdeckung im Dezember 2019 in Wuhan, China, ist SARS-CoV-2 für über 242 Millionen Infektionen beim Menschen und mehr als 4,9 Millionen Todesfälle bei Menschen weltweitverantwortlich 7,10,11,12. Insbesondere seit Ende 2020 haben neue SARS-CoV-2-Varianten der Besorgnis (VoC) und Varianten von Interesse (VoI) die Virusmerkmale, einschließlich Übertragung und Antigenität 9,13, und die allgemeine Richtung der COVID-19-Pandemie beeinflusst. Für die Behandlung von SARS-CoV-2-Infektionen gibt es derzeit nur eine US-amerikanische Food and Drug Administration (FDA) therapeutisches antivirales (Remdesivir) und ein Emergency Use Authorization (EUA) Medikament (Baricitinib, in Kombination mit Remdesivir zu verabreichen)14. Es gibt auch 6 zugelassene monoklonale EUA-Antikörper: REGEN-COV (Casirivimab und Imdevimab, zusammen verabreicht), Sotrovimab, Tocilizumab und Bamlanivimab und Etesevimab, die zusammenverabreicht werden 15,16,17,18,19. Derzeit gibt es nur einen von der FDA zugelassenen prophylaktischen Impfstoff, Pfizer-BioNTech, und zwei weitere prophylaktische Impfstoffe (Moderna und Janssen) wurdenvon der EUA zugelassen 20,21,22,23,24. Mit der unkontrollierten Infektionsrate und dem Aufkommen von VoC und VoI stellt SARS-CoV-2 jedoch immer noch eine Bedrohung für die menschliche Gesundheit dar. Daher sind dringend neue Ansätze erforderlich, um effiziente Prophylaxe- und Therapeutika zur Kontrolle der SARS-CoV-2-Infektion und der noch anhaltenden COVID-19-Pandemie zu identifizieren.

Die Untersuchung von SARS-CoV-2 erfordert aufwändige Techniken und sekundäre Ansätze, um das Vorhandensein des Virus in infizierten Zellen und/oder validierten Tiermodellen der Infektion zu identifizieren. Die Verwendung der umgekehrten Genetik hat es ermöglicht, rekombinante Viren zu erzeugen, um wichtige Fragen in der Biologie von Virusinfektionen zu beantworten. Zum Beispiel haben Techniken der umgekehrten Genetik Mittel zur Verfügung gestellt, um die Mechanismen von Virusinfektionen, Pathogenese und Krankheiten aufzudecken und zu verstehen. Ebenso haben Ansätze der Reverse Genetik den Weg geebnet, rekombinante Viren ohne virale Proteine zu entwickeln, um ihren Beitrag zur viralen Pathogenese zu verstehen. Darüber hinaus wurden Techniken der Umkehrgenetik eingesetzt, um rekombinante Viren zu erzeugen, die Reportergene für In-vitro- und In-vivo-Anwendungen exprimieren, einschließlich der Identifizierung prophylaktischer und/oder therapeutischer Ansätze zur Behandlung von Virusinfektionen. Fluoreszierende und biolumineszierende Proteine sind aufgrund ihrer Empfindlichkeit, Stabilität und einfachen Detektion aufgrund der Verbesserung neuer Technologien die am häufigsten verwendeten Reportergene25,26. In vitro hat sich gezeigt, dass fluoreszierende Proteine als bessere Option für die Lokalisierung von Viren in infizierten Zellen dienen, während Luciferasen für Quantifizierungsstudien bequemer sind27,28,29. In vivo werden Luciferasen gegenüber fluoreszierenden Proteinen für die Bildgebung ganzer Tiere bevorzugt, während fluoreszierende Proteine für die Identifizierung infizierter Zellen oder Ex-vivo-Bildgebung 30,31,32 bevorzugt werden. Die Verwendung von Reporter-exprimierenden rekombinanten Viren hat in vielen Familien als leistungsfähiges Werkzeug für die Untersuchung von Viren gedient, darunter Flaviviren, Enteroviren, Alphaviren, Lentiviren, Arenaviren und Influenzaviren 28,33,34,35,36.

Um den Bedarf an sekundären Ansätzen zur Untersuchung von SARS-CoV-2 und zur Charakterisierung der Echtzeit-SARS-CoV-2-Infektion in vivo zu überwinden, haben wir replikationskompetente rekombinante (r)SARS-CoV-2-Proteine erzeugt, die biolumineszierende (Nanoluciferase, Nluc) oder fluoreszierende (Venus) Proteine unter Verwendung unserer zuvor beschriebenen bakteriellen künstlichen Chromosomen (BAC) -basierten umgekehrten Genetik exprimieren, die als eine einzige Kopie in E. coli beibehalten werden. um die Toxizität von Virussequenzen während ihrer Ausbreitung in Bakterienzu minimieren 37,38. Insbesondere rSARS-CoV-2/Nluc und rSARS-CoV-2/Venus zeigten in vivo eine rSARS-CoV-2/WT-ähnliche Pathogenität. Die hohe Venusexpression von rSARS-CoV-2/Venus ermöglichte den Nachweis einer Virusinfektion in der Lunge infizierter transgener K18 hACE2-Mäuse mit einem In-vivo-Bildgebungssystem (IVIS)39. Die Spiegel der Venusexpression korrelierten gut mit viralen Titern, die in der Lunge nachgewiesen wurden, was die Machbarkeit der Verwendung der Venusexpression als gültiger Ersatz der SARS-CoV-2-Infektion zeigt. Mit rSARS-CoV-2/Nluc konnten wir die Dynamik der Virusinfektion in Echtzeit verfolgen und die SARS-CoV-2-Infektion in vivo mit dem gleichen IVIS-Ansatz bei transgenen K18-hACE2-Mäusen longitudinal bewerten.

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Protocol

Protokolle mit transgenen K18-hACE2-Mäusen wurden vom Institutional Biosafety Committee (IBC) des Texas Biomedical Research Institute (TBRI) und dem Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigt. Alle Experimente folgen den Empfehlungen im Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren des Nationalen Forschungsrats40. Bei der Arbeit mit Mäusen ist die entsprechende persönliche Schutzausrüstung (PSA) erforderlich.

1. Verwendung von transgenen K18 hACE2-Mäusen

  1. Kaufen und pflegen Sie 4-6 Wochen alte weibliche B6.Cg-Tg(K18-ACE2)2Prlmn/J-Mäuse (K18 hACE2 transgene Mäuse) in einer Tierpflegeeinrichtung der Biosicherheitsstufe (BSL)-2 unter spezifischen pathogenfreien Bedingungen.
    1. Nach der Ankunft in den BSL2-Einrichtungen können sich die Tiere 7 Tage lang akklimatisieren und sie für Infektionen und andere experimentelle Verfahren in die BSL-3-Tiereinrichtung bringen.
    2. Platzieren Sie nach den IACUC-Protokollen 4 Mäuse pro Käfig. Um sicherzustellen, dass das Tier nach einer Infektion der Mäuse mit rSARS-CoV-2 und der In-vivo-Bildgebung verstorben ist, sollten die Tiere mit einer tödlichen Dosis Fatal-Plus (>100 mg/kg) eingeschläfert werden.

2. Biologische Sicherheit

HINWEIS: In diesem Manuskript wird rSARS-CoV-2 unter Verwendung der BAC-basierten reverse-genetischen Systeme für den SARS-CoV-2 USA-WA1/2020-Stamm erzeugt, wie zuvor beschrieben37. Alle In-vivo-Verfahren mit rSARS-CoV-2/Nluc- oder rSARS-CoV-2/Venus-Infektionen müssen in einer biologischen Sicherheitswerkbank unter BSL-3-Bedingungen durchgeführt werden.

  1. Reinigen Sie die Biosicherheitskabine nacheinander mit 2% Wexizid und 70% Ethanol-Desinfektionsmittel, bevor und nachdem Sie alle in diesem Artikel beschriebenen experimentellen Verfahren durchgeführt haben.
  2. Sterilisieren Sie das gesamte Seziermaterial (Schere, Sezierzange usw.) und den Homogenisator vor und nach jedem Gebrauch.
  3. Reinigen Sie die Isolierkammer und desinfizieren Sie sie vor und nach jedem Gebrauch mit MB10-Tabletten gemäß den Anweisungen des Herstellers.
  4. Entsorgen Sie das gesamte biologische Material, das während der Verfahren gemäß den IBC- und IACUC-Richtlinien entstanden ist.

3. In-vivo-Charakterisierung von rSARS-CoV-2

  1. Maus-Infektionen
    1. Legen Sie weibliche 4-6 Wochen alte transgene K18 hACE2-Mäuse in markierte Käfige, identifizieren Sie die Mäuse in jedem Käfig mit einem Ohrlochcode und platzieren Sie 4 Mäuse pro Käfig. Verwenden Sie eine Gruppe von Mäusen für Körpergewicht und Überleben und eine andere Gruppe von Tieren für die virale Titration und Bildgebung.
    2. Rasieren Sie vor der Infektion die Brust der Mäuse auf der Bauchseite von der Brustwarze bis zum Leistenbrustwarzenbereich, um das Biolumineszenzsignal zu erleichtern.
    3. Bereiten Sie das rSARS-CoV-2-Inokulum mit 105 plaquebildenden Einheiten (PFU)/Maus unter sterilen Bedingungen in einem Gesamtvolumen von 50 μL mit steriler 1x Phosphatpuffersalzlösung (PBS) vor.
      HINWEIS: Berechnen Sie die Menge an rSARS-CoV-2, die in der viralen Verdünnung verwendet werden soll, mit der Formel: Virus benötigt = (105 PFU pro Maus / 50 μL) x Endvolumen) / Virustiter.
    4. Halten Sie das Virus-Inokulum auf Eis gekühlt.
    5. Verwenden Sie die Schein-infizierten (1x PBS) und rSARS-CoV-2/WT-infizierten Mäuse als interne Kontrollen. Legen Sie die Schein-infizierten Mäuse in einen separaten Käfig als rSARS-CoV-2-infizierte Mäuse.
    6. Betäuben Sie die Mäuse mit 5% Isofluran-Gassedierung in einer Anästhesiekammer und halten Sie sie mit 3% Isofluran aufrecht.
    7. Sobald die Haltungsreaktion und der Aufrichtungsreflex bestätigt sind, platzieren Sie die Maus in der dorsalen Liegeposition.
    8. Scrut den Hals der Maus zwischen Zeigefinger und Daumen und halten Sie den Schwanz mit dem kleinen Finger gegen die Handfläche, um das Tier in einer dorsalen Position zu halten.
    9. Legen Sie die Pipettenspitze mit 50 μL des Virusimpfstoffs in das Nasenloch und stoßen Sie die Lösung langsam aus. Stellen Sie sicher, dass das Virus-Inokulum eingeatmet wird und es keinen Reflux gibt, indem Sie beobachten, wie der Inokulum-Tropfen verschwindet.
  2. Biolumineszenzüberwachung von transgenen Mäusen mit rSARS-CoV-2/Nluc infizierte K18 hACE2-Mäuse (Abbildung 1 und Abbildung 2)
    HINWEIS: Dieses Experiment folgt der schematischen Darstellung und verwendet die in Abbildung 1 dargestellten Viren. Für das in vivo Bildgebungssystem (IVIS) ist ein Isofluran-Anästhesieaufsatz erforderlich. Einzelheiten zu den erforderlichen Instrumenten und Systemen finden Sie in der Materialtabelle .
    1. Starten Sie die Bildgebungssoftware und richten Sie die Parameter ein, klicken Sie auf Bildmodus auf Biolumineszenz, öffnen Sie den Filter und stellen Sie die Belichtungszeit auf automatisch ein.
    2. Legen Sie die Mäuse nach der Initialisierung der IVIS-Maschine in die Isolierkammer, während sie sich noch in der Biosicherheitskabine befinden. Induzieren Sie Mäuse mit Isofluran bei einer Konzentration von 5%. Sobald der Verlust der Haltungsreaktion und des Aufrichtenden Reflexes bestätigt ist, halten Sie mit 3% Isofluran aufrecht.
    3. Sobald die Mäuse betäubt sind, entfernen Sie sie aus der Isolationskammer und verabreichen Sie retro-orbital das 1:10 in 1x PBS (Endvolumen 100 μL / Maus) verdünnte Luciferase-Substrat mit einer 25-G-Nadel.
    4. Nach der Verabreichung des Luciferase-Substrats legen Sie die Mäuse mit nach oben gerichteter Brust und Nasenhöhle in den Verteilerkegel zurück, um das Tier während des bildgebenden Verfahrens betäubt zu halten.
    5. Übertragen Sie die Isolierkammer auf die IVIS-Maschine, und wählen Sie nach dem Schließen der IVIS-Imager-Tür sofort im zu initialisierenden Softwareprogramm die Option Erfassen (Abbildung 2A).
    6. Um die aufgenommenen Biolumineszenzbilder zu analysieren, verwenden Sie das ROI-Tool (Region of Interest) in der Software, um das genaue Signal zu bestimmen und den Fluss zu messen (Abbildung 2B).
    7. Klicken Sie auf Messen und lassen Sie das System mit der Bewertung der Biolumineszenz in Photonen beginnen, um die absolute Photonenemission zu liefern, die mit den Ausgangsmessungen der verschiedenen Parameter vergleichbar ist.
    8. Zeigen Sie Mäuse 1-, 2-, 4- und 6-Tage nach der Infektion.
    9. Nach der Bildgebung die Mäuse zurück in den Käfig legen.
  3. Fluoreszenzanalyse bei transgenen K18-hACE2-Mäusen, die mit rSARS-CoV-2/Venus infiziert sind (Abbildung 3 und Abbildung 4)
    HINWEIS: Dieses Experiment folgt der schematischen Darstellung und rSARS-CoV-2 in Abbildung 3. Einzelheiten zu den erforderlichen Instrumenten und Systemen finden Sie in der Materialtabelle .
    1. Starten Sie die Bildgebungssoftware und richten Sie die Parameter ein, stellen Sie die Anregungs- (500 nm) und Emissionsfilter (530 nm) ein, klicken Sie auf den Bildmodus auf Fluoreszenz und stellen Sie die Belichtungszeit auf Auto ein.
    2. Intraperitoneales Einschläfern der Mäuse mit einer tödlichen Dosis Fatal-Plus (>100 mg/kg). Nach der Euthanasie die Einschneidestelle mit 70% Ethanol desinfizieren.
    3. Ziehen Sie mit einer Pinzette die Haut, machen Sie einen Schnitt vom Brustbein zum Bauch und schneiden Sie den Schnitt von den Seiten mit einer Schere. Schneiden Sie die Lebervene ab, um die Blutmenge in der Lunge zu minimieren und hohe Hintergrundsignale während der Bildgebung zu vermeiden.
    4. Schneiden Sie mit einer Schere das Brustbein ab und öffnen Sie den Brustkorb. Als nächstes schneiden Sie das Ende der Luftröhre mit einer Schere ab und entfernen Sie die Lunge mit einer Pinzette.
    5. Legen Sie die ausgeschnittenen Lungen in eine 6-Well-Platte, die 2 ml 1x PBS enthält, und spülen Sie sie ab, um überschüssiges Blut zu entfernen. Minimieren Sie die Möglichkeit einer Kontamination zwischen den Proben, indem Sie chirurgische Werkzeuge zwischen den Proben mit 70% Ethanol desinfizieren und reinigen.
    6. Nachdem Sie das IVIS-Gerät initialisiert haben, legen Sie die Lungen in ein schwarzes Tablett und trennen Sie die Gewebe voneinander.
    7. Legen Sie das Tablett in die Isolierkammer innerhalb der Biosicherheitskabine und übertragen Sie dann die Isolierkammer in das IVIS. Schließen Sie die Tür und klicken Sie auf Erfassen , um das Bildgebungssystem zu starten (Abbildung 4A).
    8. Um die Fluoreszenz zu analysieren, verwenden Sie das ROI-Tool und zeichnen Sie ROIs um jede der einzelnen Lungen. Messen Sie jeden ROI manuell und verwenden Sie dann die angegebenen durchschnittlichen Strahlungseffizienzwerte und subtrahieren Sie von denen der Schein-infizierten Mäuse (Abbildung 4B).
    9. Sobald die Bildgebung abgeschlossen ist, legen Sie das Gewebe auf Eis für die Analyse am selben Tag oder in eine Kryotube zum Einfrieren von Trockeneis, um es bei -80 ° C für die spätere Verarbeitung zu lagern.
  4. Lungenhellfeldbildgebung und Pathologie-Scoring von transgenen K18-hACE2-Mäusen, die mit rSARS-CoV-2/Nluc infiziert sind (Abbildung 2A-C) und rSARS-CoV-2/Venus (Abbildung 4A-C)
    1. Nach der Bildgebung der Biolumineszenz von Mäusen, die mit rSARS-CoV-2 / Nluc, rSARS-CoV-2 / WT infiziert und simuliert infiziert sind, bringen die Mäuse in ihre Käfige zurück. Fahren Sie mit der Euthanasie und der ex vivo Hellfeldbildgebung von Mäuselungen fort (Abbildung 2A).
    2. Nach der Ex-vivo-Fluoreszenz der Lunge infizierter Mäuse werden Hellfeldbilder der Lunge aufgenommen (Abbildung 4A).
    3. Analysieren Sie die groben Läsionen auf der Oberfläche der Lunge mit ImageJ (Abbildungen 2C und 4C).
    4. Öffnen Sie das Lungenbild, das analysiert werden soll, in ImageJ.
    5. Berechnen Sie das Verhältnis von Pixel zu cm, verwenden Sie das Geraden-Werkzeug und messen Sie die tatsächliche Länge des Bildes.
    6. Klicken Sie nach der Auswahl auf Analyze > Measure , um die Länge der Pixel für die Länge zu berechnen.
    7. Klicken Sie auf Analyse > Skalierung festlegen und geben Sie die aus dem vorherigen Schritt berechneten Zahlen ein.
    8. Verwenden Sie das Freehand-Auswahlwerkzeug und wählen Sie die gesamte Lungenoberfläche aus. Klicken Sie auf Analysieren > Messen , um die gesamte Lungenfläche zu messen.
    9. Klicken Sie auf > Auswahl bearbeiten > Machen Sie Invers , um den Rest des Lungenbereichs auszuwählen, und drücken Sie dann die Entf- oder Rücktaste, um den Hintergrund zu entfernen.
    10. Entfernen Sie den ausgewählten Bereich und klicken Sie dann auf Bild > > Farbschwelle anpassen.
    11. Um den pathologischen Läsionsbereich auszuwählen, passen Sie die Helligkeit auf ein Minimum (zwischen 1 und 50) und ein Maximum (zwischen 50 und 200) an, abhängig von den vorhandenen Stau- und Blutungsgraden.
    12. Sobald pathologische Läsionen ausgewählt sind, klicken Sie unten im Schwellenwertfarbfeld auf Auswählen und dann auf Analysieren > Messen , um pathologische Bereiche zu messen.
    13. Berechnen Sie den Prozentsatz der groben Läsionen mit der Formel: % der pathologischen Fläche = (Messung der pathologischen Fläche/Gesamtlungenoberfläche) x 100.
  5. Virale Titrationen (Abbildung 2D und Abbildung 4D)
    1. Schließen Sie bei der Bildgebung die Euthanasie der Mäuse ab und sammeln Sie Lunge, Gehirn und Nasenschleimhaut.
    2. Legen Sie die Lunge, das Gehirn und die Nasenschleimhaut in separate sterile Gewebehomogenisatoren und fügen Sie 1 ml kaltes 1x PBS hinzu.
    3. Homogenisieren Sie die Proben durch Zentrifugieren bei 21.500 x g für 10 Minuten, um Zellablagerungen zu pelletieren. Sammeln und übertragen Sie die Überstände in ein neues steriles Röhrchen und entsorgen Sie das Pellet.
    4. Wenn am selben Tag virale Titrationen durchgeführt werden, lagern Sie die Überstände bei 4 ° C. Alternativ wird der Überstand der homogenisierten Proben bei -80 °C eingefroren, bis er später ausgewertet wird.
    5. Unter Verwendung der aus den Gewebehomogenaten erhaltenen Überstände werden 10-fache serielle Verdünnungen durchgeführt und konfluente Monoschichten von Vero E6-Zellen mit 1 ml jeder Verdünnung des Überstands infiziert (6-Well-Plattenformat, 1,2 × 106 Zellen / Well, Verdreifachungen).
    6. Das Virus 1 h bei 37 °C in einem befeuchteten 5%CO2-Inkubator adsorbieren lassen.
    7. Nach der viralen Adsorption die Zellen mit 1 ml 1x PBS waschen und in 2 ml Postinfektionsmedien mit 1% Agar im befeuchteten 5% CO2 -Inkubator bei 37 °C für 72 h inkubieren.
    8. Nach der Inkubation die Platten in 10% neutralem gepuffertem Formalin für 24 h bei 4 °C inaktivieren, stellen Sie sicher, dass die gesamte Platte untergetaucht ist.
    9. Nehmen Sie Platten aus BSL3 und waschen Sie die Zellen dreimal mit 1 ml 1x PBS und permeabilisieren Sie mit 1 ml 0,5% Triton X-100 für 10 min bei Raumtemperatur (RT).
    10. Blockieren Sie die Zellen mit 1 ml 2,5% Rinderserumalbumin (BSA) in 1x PBS für 1 h bei 37 °C, gefolgt von einer Inkubation in 1 ml von 1 μg/ml des SARS-CoV-Nukleokapsids (N)-Protein-kreuzreaktiven monoklonalen Antikörpers (1C7C7), verdünnt in 2,5% BSA für 1 h bei 37 °C.
    11. Waschen Sie die Zellen dreimal mit 1 ml 1x PBS und entwickeln Sie die Plaques mit dem ABC-Kit und dem DAB-Peroxidase-Substrat-Kit gemäß den Anweisungen der Hersteller.
    12. Berechnen Sie die viralen Titer als PFU/ml.
      HINWEIS: Berechnen Sie mit der Formel PFU/mL = Verdünnungsfaktor x Anzahl der Plaques x (1 ml/Inokulumvolumen).
  6. Nluc-Aktivität in Geweben von transgenen K18-hACE2-Mäusen, die mit rSARS-CoV-2/Nluc infiziert sind (Abbildung 2E)
    1. Quantifizierung des Vorhandenseins von Nluc in den Organhomogenaten aus Schein-, rSARS-CoV-2/WT- und rSARS-CoV-2/Nluc-infizierten transgenen K18 hACE2-Mäusen unter Verwendung eines Luciferase-Assays gemäß den Anweisungen des Herstellers.
  7. Bewertung von Morbidität und Mortalität (Abbildung 2F, G und Abbildung 4E, F)
    1. Intranasal infizieren 4-6 Wochen alte weibliche transgene K18 hACE2-Mäuse mit 105 PFU von rSARS-CoV-2/WT, rSARS-CoV-2/Venus, rSARS-CoV-2/Nluc oder Scheininfektionen, wie in Abschnitt 3.1 beschrieben.
    2. Überwachen und wiegen Sie die Mäuse über 12 Tage gleichzeitig, um die Gewichtsschwankungen aufgrund der Nahrungsaufnahme zu minimieren. Euthanasieren Sie die Mäuse, die 25% ihres anfänglichen Körpergewichts verlieren, seit sie einen humanen Endpunkt erreicht haben, und beachten Sie, dass diese Mäuse einer Virusinfektion erliegen.
    3. Euthanasieren Sie nach 12 Tagen die Mäuse, die eine Virusinfektion überleben, und berechnen Sie den Prozentsatz der Körpergewichtsänderung und des Überlebens.

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Representative Results

rSARS-CoV-2/Nluc-Infektion in transgenen K18-hACE2-Mäusen (Abbildungen 1 und 2)
Abbildung 1A zeigt eine schematische Darstellung des rSARS-CoV-2/WT (oben) und rSARS-CoV-2/Nluc (unten), das zur Beurteilung von Infektionen in vivo verwendet wird. Abbildung 1B zeigt das schematische Flussdiagramm, das zur Bewertung der rSARS-CoV-2/Nluc-Infektionsdynamik in transgenen K18-hACE2-Mäusen angewendet wird. Vier bis sechs Wochen alte weibliche transgene K18 hACE2-Mäuse (N = 4) wurden entweder mit 1x PBS oder intranasal mit 105 PFU rSARS-COV-2/WT oder rSARS-CoV-2/Nluc infiziert. 1, 2, 4 und 6 Tage nach der Infektion wurden die Mäuse mit der Isolationskammer sediert und dann retroorbital mit dem Nluc-Substrat injiziert. Die Isolierkammer wurde sofort in das IVIS gelegt und das Nluc-Signal wurde in vivo mit der Bildgebungssoftware bewertet. Die Nluc-Expression wurde bei Mäusen, die mit rSARS-CoV-2/Nluc infiziert waren, leicht nachgewiesen, nicht jedoch bei Mäusen, die mit rSARS-CoV-2/WT infiziert oder pseudoinfiziert waren (Abbildung 2A). Quantitative Analysen zeigten die Nluc-Intensität an verschiedenen Tagen nach der Infektion (Abbildung 2B). Die groben Läsionen auf der Lungenoberfläche von Mäusen, die mit rSARS-CoV-2/Nluc infiziert waren, waren vergleichbar mit denen in der rSARS-CoV-2/WT-infizierten Gruppe (Abbildungen 2C). Schließlich wurden die Organe der Mäuse (Lunge, Nasenmuscheln und Gehirn) homogenisiert, und virale Titer wurden durch Plaque-Assay (PFU / ml) bestimmt, und die Nluc-Aktivität wurde unter Verwendung des Luciferase-Assays gemäß den Anweisungen des Herstellers bestimmt. Die Plaques wurden durch Immunfärbung mit dem kreuzreaktiven monoklonalen SARS-CoV-N-Antikörper 1C7C7 untersucht. Virale Titer, die in den mit rSARS-CoV-2/Nluc infizierten Mäusen nachgewiesen wurden, waren vergleichbar mit denen, die an verschiedenen Tagen nach der Infektion in allen Organen mit rSARS-CoV-2/WT infiziert waren (Abbildung 2D). Nluc-Aktivität wurde nur in den Organen von rSARS-CoV-2/Nluc-infizierten Mäusen nachgewiesen (Abbildung 2E). Eine separate Gruppe von Schein- und Virus-infizierten Mäusen wurde 12 Tage lang auf Veränderungen des Körpergewichts (Abbildung 2F) und des Überlebens (Abbildung 2G) überwacht. Mäuse, die mit rSARS-CoV-2/Nluc und rSARS-CoV-2/WT infiziert waren, verloren bis zu 25% ihres Körpergewichts und erlagen alle zwischen 7-8 Tagen nach der Infektion einer Virusinfektion (Abbildung 2F-G).

rSARS-CoV-2/Venus-Infektion bei transgenen K18-hACE2-Mäusen (Abbildungen 3 und 4)
Abbildung 3A zeigt eine schematische Darstellung des rSARS-CoV-2/WT (oben) und rSARS-CoV-2/Nluc (unten), die zur Beurteilung von Infektionen ex vivo verwendet werden. Abbildung 3B zeigt das schematische Flussdiagramm, das zur Beurteilung der rSARS-CoV-2/Venus-Dynamik in transgenen K18-hACE2-Mäusen angewendet wird. Vier bis sechs Wochen alte weibliche transgene K18 hACE2-Mäuse (N = 4 / Gruppe) wurden entweder mit 1x PBS oder intranasal mit 105 PFU von rSARS-COV-2 / WT oder rSARS-CoV-2 / Venus infiziert. 1, 2, 4 und 6 Tage nach der Infektion wurden Mäuse eingeschläfert, und ihre Lungen wurden ex-vivo mit einem IVIS herausgeschnitten und abgebildet. Die Venusexpression wurde in allen Lungen von Mäusen, die mit rSARS-CoV-2 / Venus infiziert waren, leicht nachgewiesen, jedoch nicht von solchen, die mit rSARS-CoV-2 / WT infiziert oder simuliert wurden (Abbildung 4A). Quantitative Analysen zeigten, dass die Intensität der Venus 2 Tage nach der Infektion ihren Höhepunkt erreicht und im Verlauf der Infektion in den Lungen infizierter Mäuse abnimmt (Abbildung 4B). Bilder der Lungenoberfläche zeigten, dass grobe Läsionen von Mäusen, die mit rSARS-CoV-2/Venus infiziert waren, mit denen von rSARS-CoV-2/WT-infizierten Mäusen vergleichbar waren (Abbildung 4C). Schließlich wurden die Organe der Mäuse (Lunge, Nasenmuscheln und Gehirn) homogenisiert, und virale Titer wurden durch Plaque-Assay bestimmt und durch Immunfärbenbildung unter Verwendung des kreuzreaktiven monoklonalen SARS-CoV-N-Protein-Antikörpers 1C7C7 bewertet. Die Infektion mit rSARS-CoV-2/Venus führte zu vergleichbaren viralen Titern wie bei Mäusen, die in allen Organen mit rSARS-CoV-2/WT infiziert waren (Abbildung 4D). Eine separate Gruppe von Schein- und Virus-infizierten Mäusen wurde 12 Tage lang auf Veränderungen des Körpergewichts (Abbildung 4E) und des Überlebens (Abbildung 4F) überwacht. Mäuse, die mit rSARS-CoV-2/Venus und rSARS-CoV-2/WT infiziert waren, verloren bis zu 25% ihres Körpergewichts und alle erlagen bis zum 9. Tag nach der Infektion ohne Überleben einer Virusinfektion (Abbildungen 4E-4F).

Figure 1
Abbildung 1: Beurteilung der rSARS-CoV-2/Nluc-Infektion in vivo mit transgenen K18-hACE2-Mäusen. (A) Schematische Darstellung von rSARS-CoV-2/WT (oben) und rSARS-CoV-2/Nluc (unten). (B) Schematisches Flussdiagramm für die Bewertung von rSARS-CoV-2/Nluc in vivo. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: rSARS-CoV-2Nluc-Expression in infizierten transgenen K18-hACE2-Mäusen. (A-B) Vier bis sechs Wochen alte weibliche transgene K18 hACE2-Mäuse wurden mit 10 5 PFU pro Tier simuliert (N = 4) oder mit rSARS-CoV-2/WT (N = 4) oder rSARS-CoV-2/Nluc (N = 4) infiziert. Die Mäuse wurden 1-, 2-, 4- und 6-Tage nach der Infektion betäubt, nachdem sie retroorbital mit dem Nluc-Substrat injiziert worden waren. (A) Die Nluc-Expression wurde mit einem In-vivo-Bildgebungssystem bestimmt, und die Lungen von Scheininfizierten und infizierten Mäusen wurden 1-, 2-, 4- und 6-Tage nach der Infektion herausgeschnitten und fotografiert. (B) Die Nluc-Intensität wurde quantitativ von der Bildanalysesoftware analysiert und (C) grobe Läsionen auf der Lungenoberfläche wurden quantitativ mit ImageJ (C) **P < 0,01 analysiert. (D) Virale Titer im Nasenmuscheln (links), in der Lunge (Mitte) und im Gehirn (rechts) von Mäusen, die mit rSARS-CoV-2/WT und rSARS-CoV-2/Nluc infiziert waren, wurden durch Plaque-Assay bestimmt. (E) Die Nluc-Aktivität im Nasenmuscheln (links), in der Lunge (Mitte) und im Gehirn (rechts) wurde mit einem Luciferase-Multiplattenleser gemessen. ns, nicht signifikant. Schein- und virusinfizierte Mäuse wurden 12 Tage lang auf Veränderungen des (F) Körpergewichts und (G) des Überlebens überwacht. Alle Daten werden als Mittelwert ± SD für jede Gruppe dargestellt und von SPSS13.0 (IBM) analysiert. Ein P-Wert von weniger als 0,05 (P < 0,05) wurde als statistisch signifikant angesehen. Diese Zahl wurde von Ye C. et al.41 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 3
Abbildung 3: Beurteilung der rSARS-CoV-2/Venus-Infektion in vivo mit transgenen K18-hACE2-Mäusen. (A) Schematische Darstellung von rSARS-CoV-2/WT (oben) und rSARS-CoV-2/Venus (unten). (B) Schematisches Flussdiagramm für die Beurteilung von rSARS-CoV-2/Venus in vivo. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 4
Abbildung 4: rSARS-CoV-2/Venus-Expression in infizierten transgenen K18-hACE2-Mäusen. (A-B) Vier bis sechs Wochen alte weibliche transgene K18 hACE2-Mäuse wurden mit rSARS-CoV-2/WT (N = 4) oder rSARS-CoV-2/Venus (N = 4) oder rSARS-CoV-2/Venus (N = 4) simuliert oder infiziert (105 PFU/Maus). Die Lungen wurden 1-, 2-, 4- und 6-Tage nach der Infektion herausgeschnitten, Bilder der Lunge wurden 1-, 2-, 4- und 6-Tage nach der Infektion fotografiert. (A) Die Venusexpression wurde unter einem IVIS beurteilt, (B) die Fluoreszenzintensität wurde quantitativ von der Bildanalysesoftware analysiert und (C) die groben Läsionen auf den Lungenoberflächen wurden quantitativ von ImageJ analysiert. **P < 0,01. (D) Virale Titer im Nasenmuscheln (links), in der Lunge (Mitte) und im Gehirn (rechts) von Mäusen, die mit rSARS-CoV-2/WT und rSARS-CoV-2/Venus infiziert waren, wurden durch Plaque-Assay bestimmt. ns, nicht signifikant. Schein- und SARS-CoV-2-infizierte Mäuse wurden 12 Tage lang auf (E) Körpergewichtsverlust und (F) Überleben überwacht. Alle Daten werden als Mittelwert ± SD für jede Gruppe dargestellt und von SPSS13.0 (IBM) analysiert. Ein P-Wert von weniger als 0,05 (P < 0,05) wurde als statistisch signifikant angesehen. Diese Zahl wurde von Ye C. et al.41 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

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Discussion

Dieses Protokoll demonstriert die Machbarkeit der Verwendung dieser rSARS-CoV-2-exprimierenden Reportergene zur Überwachung von Virusinfektionen in vivo. Beide Reporter-exprimierenden rekombinanten Viren bieten ein hervorragendes Werkzeug für die Untersuchung von SARS-CoV-2-Infektionen in vivo. Die beschriebenen ex vivo (rSARS-CoV-2/Venus) und in vivo (rSARS-CoV-2/Nluc) Bildgebungssysteme stellen eine ausgezeichnete Option dar, um die Dynamik der SARS-CoV-2-Infektion, der viralen Pathogenese zu verstehen und infizierte Zellen/Organe zu verschiedenen Zeitpunkten nach einer Virusinfektion zu identifizieren. Um Ex-vivo- (rSARS-CoV-2/Venus) und In-vivo- (rSARS-CoV-2/Nluc)-Studien durchführen zu können, ist es wichtig, genaue und reproduzierbare Infektionen sowie ausreichende Impfungen von rSARS-CoV-2/Nluc durchzuführen.

Bei der Untersuchung von In-vivo-Infektionen mit rSARS-CoV-2 / Nluc sollten Mäuse rasiert werden, um die Nluc-Visualisierung unter dem IVIS zu erleichtern. Es besteht auch die Notwendigkeit, das Nluc-Substrat zur Visualisierung von Nluc zu impfen. Dies kann einige experimentelle Tests erfordern, um die Konzentrationen und das Volumen des Nluc-Substrats zu bestimmen, um ein hohes Nluc-Signal zu gewährleisten. Bei der Untersuchung von Ex-vivo-Infektionen mit rSARS-CoV-2/Venus und aufgrund der Einschränkungen beim Nachweis der Venus direkt von den gesamten Mäusen mittels IVIS ermöglicht nur die Ex-vivo-Bildgebung der Lunge den Nachweis der Venusexpression. Dies erfordert, dass eine Gruppe von Mäusen zu verschiedenen Zeitpunkten eingeschläfert wird. Dies steht im Gegensatz zur Situation von Mäusen, die mit rSARS-CoV-2 / Nluc infiziert sind, da die gleiche Gruppe von Mäusen an verschiedenen Tagen nach der Infektion abgebildet werden kann, ohne dass zu jedem Zeitpunkt nach der Infektion, die für rSARS-CoV-2 / Venus erforderlich ist, eine Euthanasie erforderlich ist. Ein Vorteil von rSARS-CoV-2/Venus gegenüber rSARS-CoV-2/Nluc besteht darin, dass es mit Durchflusszytometrie verwendet werden kann, um zu identifizieren, welche Art von Zellen mit SARS-CoV-2 infiziert sind, indem einfach infizierte Zellen aus nicht infizierten Zellen sortiert werden, gepaart mit der Verwendung spezifischer zellulärer Marker, wie wir es zuvor bei Influenza (REF) beschrieben haben. Ein wichtiger Aspekt unseres rSARS-CoV-2/Venus und rSARS-CoV-2/Nluc ist, dass beide WT−ähnliche Wachstumseigenschaften in vitro und in vivo zeigten, ohne Anzeichen einer Abschwächung zu zeigen, was es uns ermöglichte, die Virusinfektion ex vivo in den Lungen infizierter Mäuse (rSARS-CoV-2/Venus) und die Dynamik der Virusreplikation in der gesamten Maus (rSARS-CoV-2/Nluc) mittels nichtinvasiver longitudinaler In-vivo-Bildgebung zu überwachen.

Wichtig ist, dass diese Reporter-exprimierenden rSARS-CoV-2/Venus und rSARS-CoV-2/Nluc eine ausgezeichnete Option für die Identifizierung von bleiprophylaktischen und/oder therapeutischen Mitteln zur Behandlung der SARS-CoV-2-Infektiondarstellen 41. Die Verwendung von Reporter-exprimierendem rSARS-CoV-2, das verschiedene fluoreszierende Proteine exprimiert (z. B. Venus und mCherry), ermöglicht es uns, sie in bifluoreszierenden Assays zu kombinieren, um festzustellen, ob Therapeutika die Infektion von zwei Viren gleichzeitig in vitro und / oder in vivo effizient hemmen können, und um Virusinfektionen und Pathogenesezu verfolgen 39.

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Disclosures

Die Autoren erklären, dass die Forschung in Abwesenheit von kommerziellen, finanziellen und nicht-finanziellen oder persönlichen Interessenkonflikten in Bezug auf die beschriebene Arbeit durchgeführt wurde.

Acknowledgments

Wir möchten den Mitgliedern unseres Instituts (Texas Biomedical Research Institute) für ihre Bemühungen danken, unsere Einrichtungen während der COVID-19-Pandemie voll funktionsfähig und sicher zu halten. Wir möchten uns auch bei unserem Institutional Biosafety Committee (IBC) und Spell (IACUC) für die zeiteffiziente Überprüfung unserer Protokolle bedanken. Wir danken Dr. Thomas Moran von der Icahn School of Medicine am Mount Sinai für die Bereitstellung des monoklonalen SARS-CoV-Kreuzreaktiv-1C7C7-Nukleokapsids (N)-Protein-Antikörpers. Die SARS-CoV-2-Forschung im Martinez-Sobrido-Labor wird derzeit durch die NIAID/NIH-Zuschüsse RO1AI161363-01, RO1AI161175-01A1 und R43AI165089-01 unterstützt; das Verteidigungsministerium (DoD) gewährt W81XWH2110095 und W81XWH2110103; die San Antonio Partnership for Precision Therapeutic; das Texas Biomedical Research Institute Forum; das Health Science Center der University of Texas in San Antonio; die San Antonio Medical Foundation; und vom Center for Research on Influenza Pathogenesis and Transmission (CRIPT), einem NIAID-finanzierten Exzellenzzentrum für Influenza-Forschung und -Reaktion (CEIRR, Vertrag # 75N93021C00014).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5% Triton X-100 J.T.Baker X198-07 Store at room temperature (RT)
1% DEAE-Dextran MP Biomedicals 195133
10% Formalin solution, neutral buffered Sigma-Aldrich HT501128
Agar Oxoid LP0028
24-well Cell Culture Plate Greiner Bio-one 662160
5% Sodium bicarbonate Sigma Aldrich S-5761
6-well Cell Culture Plate Greiner Bio-one 657160
96-well Cell Culture Plate Greiner Bio-one 655-180
African green monkey kidney epithelial cells (Vero E6) ATCC CRL-1586
Ami HT Spectral Instruments Imaging
Aura Imaging Software 3.2.0 Spectral Instruments Imaging Image analysis software
Bovine Serum Albumin (BSA), 35% Sigma-Aldrich A9647 Store at 4 °C
Cell culture grade water Corning 25-055-CV
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Corning Cellgro 15-013-CV Store at 4 °C
Anesthesia gas machine Veterinary Anesthesia Systems, Inc. VAS 2001R
Fetal Bovine Serum (FBS) Seradigm 1500-050 Store at -20 °C
Four- to six-week-old female K18-hACE2 transgenic mice The Jackson Laboratory 34860
Graphpad Prism Version 9.1.0 GraphPad
Isoflurane Baxter 1001936040 Store at RT
MARS Data Analysis Software BMG LABTECH
MB10 tablets QUIP Laboratories MBTAB1.5 Store at RT
Nano-Glo Luciferase Assay Reagent Promega N1110 This reagent is used to measure Nluc activity. Store at -20 °C
Nunc MicroWell 96-Well Microplates ThermoFisher Scientific 269620
Nunc MicroWell 96-Well Microplates ThermoFisher Scientific 269620
Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine (PSG) 100x Corning 30-009-CI Store at -20 °C
PHERAstar FSX BMG LABTECH PHERAstar FSX
Precelleys Evolution homogenizer Bertin Instruments P000062-PEVO0-A
Soft tissue homogenizing CK14 – 7 mL Bertin Instruments P000940-LYSK0-A
T75 EasYFlask ThermoFisher Scientific 156499
VECTASTAIN ABC-HRP Kit, Peroxidase Vector Laboratories PK-4002 ABC kit and DAB Peroxidase Substrate kit

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References

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Morales Vasquez, D., Chiem, K., Silvas, J., Park, J. G., Ye, C., Martínez-Sobrido, L. Live Imaging and Quantification of Viral Infection in K18 hACE2 Transgenic Mice Using Reporter-Expressing Recombinant SARS-CoV-2. J. Vis. Exp. (177), e63127, doi:10.3791/63127 (2021).

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