Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Imagem ao vivo e quantificação da infecção viral em K18 hACE2 Camundongos transgênicos usando o recombinante SARS-CoV-2

Published: November 5, 2021 doi: 10.3791/63127
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Texas Biomedical Research Institute

Summary

Este protocolo descreve a dinâmica das infecções virais usando recombinação expressante (r)SARS-CoV-2 e um sistema de imagem in vivo (IVIS) em camundongos transgênicos K18 hACE2 para superar a necessidade de abordagens secundárias necessárias para estudar infecções sars-cov-2 in vivo.

Abstract

A pandemia da doença coronavírus 2019 (COVID-19) foi causada por síndrome respiratória aguda grave coronavirus 2 (SARS-CoV-2). Até o momento, o SARS-CoV-2 foi responsável por mais de 242 milhões de infecções e mais de 4,9 milhões de mortes em todo o mundo. Semelhante a outros vírus, estudar o SARS-CoV-2 requer o uso de métodos experimentais para detectar a presença de vírus em células infectadas e/ou em modelos animais. Para superar essa limitação, geramos proteínas recombinantes competentes para replicação (r)SARS-CoV-2 que expressa proteínas bioluminescentes (nanoluciferase, Nluc) ou fluorescentes (Vênus). Estes rSARS-CoV-2 que expressam repórteres permitem rastrear infecções virais in vitro e in vivo com base na expressão dos genes de repórteres de Nluc e Vênus. Aqui, o estudo descreve o uso de rSARS-CoV-2/Nluc e rSARS-CoV-2/Venus para detectar e rastrear a infecção pelo SARS-CoV-2 no modelo de infecção transgênica K18(IVIS) da enzima de conversão de angiotensina humana anteriormente descrita. Este rSARS-CoV-2/Nluc e rSARS-CoV-2/Venus mostram rSARS-CoV-2/WT-like patogenicidade e replicação viral in vivo. É importante ressaltar que a expressão de Niuc e Vênus nos permite rastrear diretamente infecções virais in vivo e ex vivo, em camundongos infectados. Estes rSARS-CoV-2/Nluc e rSARS-CoV-2/Venus representam uma excelente opção para estudar a biologia do SARS-CoV-2 in vivo, para entender a infecção viral e a doença COVID-19 associada, e identificar tratamentos profiláticos e/ou terapêuticos eficazes para combater a infecção pelo SARS-CoV-2.

Introduction

Síndrome respiratória aguda grave coronavírus 2 (SARS-CoV-2) é um vírus RNA envolto, de sentido positivo e de uma única cadeia que pertence à linhagem Betacoronavírus na família Coronaviridae 1. Esta família viral é dividida em Alpha-, Beta-, Gamma-, e Delta-coronavirus1. Alfa e Betacoronavírus infectam principalmente mamíferos, enquanto Gamma e Deltacoronavirus infectam quase exclusivamente aves2. Até o momento, sete coronavírus (CoV) cruzaram barreiras de espécies e emergiram como coronavírus humanos (HCoV): dois alfa-CoVs (HCoV-229E e HCoV-NL63) e cinco beta-CoVs (HCoV-OC43, HCoV-HKU1, SARS-CoV, Síndrome Respiratória do Oriente Médio coronavírus [MERS-CoV], e SARS-CoV-2)3,4,5,6. SARS-CoV, MERS-CoV e SARS-CoV-2 são altamente patogênicos, causando infecção grave do trato respiratório inferior7. Antes do surgimento do SARS-CoV-2, houve dois surtos epidêmicos causados por CoVs: SARS-CoV em Guangdong Providence, China, de 2002 a 2003, com uma taxa de letalidade por casos (CFR) de cerca de 9,7%; e MERS-CoV no Oriente Médio de 2012 até hoje, com uma CFR de cerca de 34%7,8. O SARS-CoV-2 possui uma CFR global entre 3,4%-49%, com condições subjacentes contribuindo para uma CFR mais altade 8,9. Desde sua descoberta em dezembro de 2019, em Wuhan, China, o SARS-CoV-2 foi responsável por mais de 242 milhões de infecções humanas e mais de 4,9 milhões de mortes humanas em todo o mundo, 7,10,11,12. Notavelmente, desde o final de 2020, novas variantes sars-CoV-2 de preocupação (VoC) e variantes de interesse (VoI) têm impactado características do vírus, incluindo transmissão e antigenicidade 9,13, e a direção geral da pandemia COVID-19. Para o tratamento de infecções por SARS-CoV-2, atualmente existe apenas um Estados Unidos (EUA) Food and Drug Administration (FDA) antiviral (remdesivir) e um medicamento de Autorização de Uso de Emergência (EUA) (baricitinib, a ser administrado em combinação com remdesivir)14. Há também 6 anticorpos monoclonais EUA aprovados: REGEN-COV (casirivimab e imdevimab, administrados juntos), sotrovimab, tocilizumabe, e bamlanivimab e etesevimab administrados juntos 15,16,17,18,19. Atualmente, apenas uma vacina profilática aprovada pela FDA, a Pfizer-BioNTech, e duas outras vacinas profiláticas (Moderna e Janssen) foram aprovadas pela EUA 20,21,22,23,24. No entanto, com a taxa de infecção descontrolada e o surgimento de VoC e VoI, o SARS-CoV-2 ainda representa uma ameaça à saúde humana. Portanto, novas abordagens são urgentemente necessárias para identificar profiláticas eficientes e terapêuticas para controlar a infecção pelo SARS-CoV-2 e a pandemia COVID-19 ainda em curso.

Estudar o SARS-CoV-2 requer técnicas laboriosas e abordagens secundárias para identificar a presença do vírus em células infectadas e/ou modelos animais validados de infecção. O uso da genética reversa permitiu que a geração de vírus recombinantes respondesse a questões importantes na biologia das infecções virais. Por exemplo, técnicas de genética reversa forneceram meios para descobrir e entender os mecanismos de infecção viral, patogênese e doenças. Da mesma forma, abordagens genéticas reversas abriram caminho para projetar vírus recombinantes sem proteínas virais para entender sua contribuição na patogênese viral. Além disso, técnicas de genética reversa têm sido utilizadas para gerar vírus recombinantes expressando genes repórteres para aplicações in vitro e in vivo, incluindo a identificação de abordagens profiláticas e/ou terapêuticas para o tratamento de infecções virais. Proteínas fluorescentes e bioluminescentes são os genes repórteres mais comumente usados devido à sua sensibilidade, estabilidade e fácil detecção com base na melhoria das novas tecnologias25,26. In vitro, as proteínas fluorescentes têm sido mostradas como uma melhor opção para a localização de vírus em células infectadas, enquanto as luciferases são mais convenientes para estudos de quantificação 27,28,29. In vivo, as luciferases são preferidas em vez de proteínas fluorescentes para imagens animais inteiras, enquanto as proteínas fluorescentes são preferidas para a identificação de células infectadas ou ex vivo imaging 30,31,32. O uso de vírus recombinantes que expressam repórteres tem servido como uma poderosa ferramenta para o estudo de vírus em muitas famílias, incluindo, entre outros, flavivírus, enterovírus, alfavírus, lentivírus, arenavírus e vírus da gripe 28,33,34,35,36.

Para superar a necessidade de abordagens secundárias para estudar SARS-CoV-2 e caracterizar a infecção em tempo real sars-CoV-2 in vivo, geramos recombinação competente para replicação (r)SARS-CoV-2 que expressa proteínas bioluminescentes (nanoluciferase, Nluc) ou fluorescentes (Vênus) usando nossas genéticas reversas baseadas em cromossomos artificiais bacterianos (BAC), que são mantidas como uma única cópia em E. a fim de minimizar a toxicidade das sequências de vírus durante sua propagação em bactérias37,38. Notavelmente, rSARS-CoV-2/Nluc e rSARS-CoV-2/Venus mostraram patogenicidade em forma de rSARS-CoV-2/WT in vivo. O alto nível de expressão de Vênus a partir de rSARS-CoV-2/Vênus permitiu detectar infecção viral nos pulmões de camundongos transgênicos K18 hACE2 infectados usando um sistema de imagem in vivo (IVIS)39. Os níveis de expressão de Vênus correlacionavam-se bem com os títulos virais detectados nos pulmões, demonstrando a viabilidade de usar a expressão de Vênus como um substituto válido da infecção por SARS-CoV-2. Utilizando a infecção rSARS-CoV-2/Nluc, pudemos rastrear a dinâmica da infecção viral em tempo real e avaliar longitudinalmente a infecção pelo SARS-CoV-2 in vivo usando a mesma abordagem IVIS em camundongos transgênicos K18 hACE2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Protocolos envolvendo camundongos transgênicos K18 hACE2 foram aprovados pelo Comitê de Biossegurança Institucional (IBC) do Texas Biomedical Research Institute (TBRI) e pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC). Todos os experimentos seguem as recomendações do Guia de Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do Conselho Nacional de Pesquisa40. Os EPI (Personal Protection Equipment, equipamento de proteção individual) apropriados para trabalhar com camundongos.

1. Uso de camundongos transgênicos K18 hACE2

  1. Compre e mantenha camundongos B6.Cg-Tg femininos de 4-6 semanas de idade (K18-ACE2)2Prlmn/J (camundongos transgênicos K18 hACE2) em um nível de biossegurança (BSL)-2 unidade de cuidados com animais em condições específicas sem patógenos.
    1. Após a chegada às instalações do BSL2, permitem que os animais se aclimatrem por 7 dias e transfiram para a instalação de animais BSL-3 para infecções e outros procedimentos experimentais.
    2. Seguindo os protocolos da IACUC, coloque 4 ratos por gaiola. Para garantir que o animal esteja morto, após infecção por camundongos com ressonância magnética rSARS-CoV-2 e in vivo , eutanize os animais com uma dose letal de Fatal-Plus (>100 mg/kg).

2. Biossegurança

NOTA: Neste manuscrito, o rSARS-CoV-2 é gerado utilizando os sistemas genéticos reversos baseados em BAC para a cepa SARS-CoV-2 USA-WA1/2020, como descrito anteriormente37. Todos os procedimentos in vivo envolvendo as infecções por rSARS-CoV-2/Nluc ou rSARS-CoV-2/Venus devem ser realizados em um gabinete de segurança biológica sob condições BSL-3.

  1. Limpe o armário de biossegurança com 2% de Wexicide e 70% desinfetante de etanol sequencialmente antes e depois de realizar todos os procedimentos experimentais descritos neste artigo.
  2. Esterilizar todo o material de dissecção (tesoura, dissecando fórceps, etc.) e o homogeneizador antes e depois de cada uso.
  3. Limpe a câmara de isolamento e desinfete usando comprimidos MB10 antes e depois de cada uso de acordo com as instruções do fabricante.
  4. Descarte todo o material biológico produzido durante os procedimentos seguindo as diretrizes do IBC e do IACUC.

3. Caracterização in vivo do rSARS-CoV-2

  1. Infecções de camundongos
    1. Coloque camundongos transgênicos K18 hACE2 fêmeas de 4-6 semanas em gaiolas rotuladas, identifique os ratos em cada gaiola usando um código de perfuração de ouvido e coloque 4 ratos por gaiola. Use um grupo de camundongos para peso corporal e sobrevivência e outro grupo de animais para titulação viral e imagem.
    2. Antes da infecção, raspe o peito de camundongos no lado ventral do mamilo peitoral até a área do mamilo inguinal para facilitar o sinal de bioluminescência.
    3. Prepare o inóculo rSARS-CoV-2 com 105 unidades formadoras de placas (PFU)/mouse em condições estéreis em um volume total de 50 μL usando soro fisco tampão de fosfato estéril de 1x (PBS).
      NOTA: Calcule a quantidade de rSARS-CoV-2 a ser usada na diluição viral com a fórmula: vírus necessário = (105 PFU por mouse / 50 μL) x volume final) / título viral de estoque.
    4. Mantenha o vírus inóculo refrigerado no gelo.
    5. Use os camundongos infectados por simulação (1x PBS) e os camundongos infectados por RSARS-CoV-2/WT como controles internos. Coloque os camundongos infectados por simulação em uma gaiola separada do que os camundongos infectados por RSARS-CoV-2.
    6. Anestesiar os camundongos usando sedação gasosa isoflurane de 5% em uma câmara de anestesia e manter com 3% de isoflurane.
    7. Uma vez confirmada a reação postural e o reflexo de redocimento, coloque o rato na posição de recumbência dorsal.
    8. Esmague o pescoço do rato entre o dedo indicador e o polegar e segure a cauda contra a palma da mão com o dedo mindinho para segurar o animal em uma posição dorsal.
    9. Coloque a ponta da pipeta contendo 50 μL do vírus inóculo na narina e ejete lentamente a solução. Certifique-se de que o vírus inóculo é inalado e não há refluxo observando a queda do inóculo desaparecendo.
  2. Bioluminescência monitorando camundongos transgênicos K18 hACE2 infectados com rSARS-CoV-2/Nluc (Figura 1 e Figura 2)
    NOTA: Este experimento segue a representação esquemática e usa os vírus exibidos na Figura 1. Um acessório de anestesia isoflurano é necessário para o sistema de imagem in vivo (IVIS). Consulte Tabela de Materiais para obter detalhes dos instrumentos e sistemas necessários.
    1. Inicie o software de imagem e configure os parâmetros, clique no modo de imagem para Bioluminescência, abra o filtro e defina o tempo de exposição para auto.
    2. Ao inicializar a máquina IVIS, coloque os ratos na câmara de isolamento enquanto ainda estiver dentro do armário de biossegurança. Induzir camundongos com isoflurane a uma concentração de 5%. Uma vez confirmada a perda da reação postural e o reflexo de redocimento, mantenha-se com 3% de isoflurane.
    3. Uma vez que os ratos sejam anestesiados, remova-os da câmara de isolamento e administre retro-orbitalmente o substrato luciferase diluído 1:10 em 1x PBS (volume final 100 μL/mouse) com uma agulha de 25 G.
    4. Após a administração do substrato da luciferase, coloque os ratos de volta na câmara de isolamento com os peitos voltados para cima e cavidade nasal dentro do cone coletor para manter o animal anestesiado durante o procedimento de imagem.
    5. Transfira a câmara de isolamento para a máquina IVIS e, instantaneamente, após o fechamento da porta do imager IVIS, selecione Adquirir no programa de software para inicializar (Figura 2A).
    6. Para analisar as imagens de bioluminescência adquiridas, utilize a ferramenta ROI (região de interesse) no software para designar o sinal preciso e medir o fluxo (Figura 2B).
    7. Clique em Medir e deixe que o sistema comece a avaliar a bioluminescência em fótons para fornecer a emissão absoluta de fótons comparável às medições de saída fornecidas pelos vários parâmetros.
    8. Ratos de imagem em 1-, 2-, 4 e 6 dias após a infecção.
    9. Depois de imagens coloque os ratos de volta na gaiola.
  3. Análise de fluorescência em camundongos transgênicos K18 hACE2 infectados com rSARS-CoV-2/Vênus (Figura 3 e Figura 4)
    NOTA: Este experimento segue a representação esquemática e o rSARS-CoV-2 mostrado na Figura 3. Consulte Tabela de Materiais para obter detalhes dos instrumentos e sistemas necessários.
    1. Inicie o software de imagem e configure os parâmetros, defina excitação (500 nm) e filtros de emissão (530 nm), clique no modo de imagem para Fluorescência e defina o tempo de exposição para auto.
    2. Eutanizar intraperitoneally os camundongos usando uma dose letal de Fatal-Plus (>100 mg/kg). Após a eutanásia, desinfete o local da incisão com 70% de etanol.
    3. Usando pinças, puxe a pele, faça uma incisão do esterno para o abdômen e corte a incisão dos lados com uma tesoura. Corte a veia hepática para minimizar a quantidade de sangue nos pulmões e evite sinais de fundo elevados durante a imagem.
    4. Usando uma tesoura, corte o esterno e abra a caixa torácica. Em seguida, corte a extremidade da traqueia com uma tesoura e remova os pulmões com pinças.
    5. Coloque os pulmões excisados em uma placa de 6 poços contendo 2 mL de PBS 1x e enxágue para remover o excesso de sangue. Minimizar a possibilidade de contaminação entre amostras por desinfecção e limpeza de ferramentas cirúrgicas entre amostras utilizando 70% de etanol.
    6. Depois de inicializar a máquina IVIS, coloque os pulmões em uma bandeja preta e separe os tecidos uns dos outros.
    7. Coloque a bandeja dentro da câmara de isolamento dentro do armário de biossegurança e, em seguida, transfira a câmara de isolamento para o IVIS. Feche a porta e clique em Adquirir para iniciar o sistema de imagem (Figura 4A).
    8. Para analisar a fluorescência, utilize a ferramenta ROI e desenhe ROIs em torno de cada um dos pulmões individuais. Meça cada ROI manualmente e, em seguida, use os valores médios de eficiência radiante dados e subtrai-se dos ratos infectados por simulação (Figura 4B).
    9. Uma vez que a imagem esteja completa, coloque os tecidos no gelo para análise no mesmo dia ou em um criobotube para congelamento de gelo seco para armazenar a -80 °C para processamento posterior.
  4. Imagem de campo brilhante pulmonar e pontuação patológica de camundongos transgênicos K18 hACE2 infectados com rSARS-CoV-2/Nluc (Figura 2A-C) e rSARS-CoV-2/Venus (Figura 4A-C)
    1. Após a bioluminescência de imagem de camundongos infectados com rSARS-CoV-2/Nluc, rSARS-CoV-2/WT e simulados infectados, devolva os ratos para suas gaiolas. Prossiga com eutanásia e a imagem de campo ex vivo brilhante de pulmões de camundongos (Figura 2A).
    2. Após a imagem ex vivo fluorescência de pulmões de camundongos infectados, pegue imagens de campo brilhante dos pulmões (Figura 4A).
    3. Analisar as lesões brutas na superfície do pulmão usando ImageJ (Figuras 2C e 4C).
    4. Abra a imagem pulmonar a ser analisada no ImageJ.
    5. Calcule a razão entre pixel e cm, use a ferramenta Reta e meça o comprimento real da imagem.
    6. Após a seleção, clique em Analisar > Medida para calcular o comprimento dos pixels para o comprimento.
    7. Clique em Análise > Escala de Conjunto e insira os números calculados a partir da etapa anterior.
    8. Use a ferramenta Seleções à Mão Livre e selecione toda a superfície pulmonar. Clique em Analisar > Medida para medir a área pulmonar total.
    9. Clique em Editar > Seleção > Fazer Inverso para selecionar o resto da área pulmonar e pressione excluir ou voltar ao espaço para remover o fundo.
    10. Remova a área selecionada e clique em Imagem > Ajuste > limite de cores.
    11. Para selecionar a área da lesão patológica, ajuste o brilho para um mínimo (entre 1 a 50) e um máximo (entre 50 a 200), dependendo dos níveis de congestionamento e hemorragias presentes.
    12. Uma vez selecionadas lesões patológicas, clique em Selecionar na parte inferior do painel de cores limiar e clique em Analisar > Medida para medir áreas patológicas.
    13. Calcular o percentual de lesões brutas com a fórmula: % de área patológica = (medição da área patológica/superfície pulmonar total) x 100.
  5. Titulações virais (Figura 2D e Figura 4D)
    1. Ao fotografar, complete a eutanásia dos camundongos e colete pulmões, cérebro e mucosa nasal.
    2. Coloque os pulmões, cérebro e mucosa nasal em homogeneizadores de tecido estéril separados e adicione 1 mL de PBS frio 1x.
    3. Homogeneize as amostras por centrifugação a 21.500 x g por 10 minutos para detritos celulares de pelotas. Colete e transfira os supernantes em um novo tubo estéril e descarte a pelota.
    4. Se as titulações virais forem realizadas no mesmo dia, armazene os supernantes a 4 °C. Alternativamente, congele o sobrenante das amostras homogeneizadas a -80 °C até ser avaliado posteriormente.
    5. Utilizando os supernacantes obtidos a partir dos homogeneizadores teciduais fazem diluições seriais de 10 vezes e infectam monocamadas confluentes de células Vero E6 com 1 mL de cada diluição do supernacido (formato de placa de 6 poços, 1,2 × 106 células/bem, triplicados).
    6. Deixe o adsorb do vírus por 1 h a 37 °C em uma incubadora umidificada de 5% de CO2 .
    7. Após adsorção viral, lave as células com 1 mL de 1x PBS e incuba em 2 mL de mídia pós-infecção contendo 1% de Ágar na incubadora de CO2 umidificada a 37 °C por 72 h.
    8. Após a incubação, inative as placas em formalina tamponada 10% neutra por 24 h a 4 °C, certifique-se de que toda a placa esteja submersa.
    9. Tire as placas de BSL3 e lave as células três vezes com 1 mL de 1x PBS e permeabilize com 1 mL de 0,5% Triton X-100 por 10 min à temperatura ambiente (RT).
    10. Bloqueie as células com 1 mL de 2,5% de albumina de soro bovino (BSA) em 1x PBS por 1 h a 37 °C, seguido pela incubação em 1 mL de 1 μg/mL do anticorpo monoclonal transativo de proteína SARS-CoV (N) (1C7C7), diluído em 2,5% BSA por 1 h a 37 °C.
    11. Lave as células três vezes com 1 mL de PBS 1x e desenvolva as placas usando o kit ABC e o kit substrato DAB Peroxidase de acordo com as instruções dos fabricantes.
    12. Calcule os títulos virais como PFU/mL.
      NOTA: Calcular com a fórmula PFU/mL = fator de diluição x número de placas x (volume de 1 mL/inóculo).
  6. Atividade de NICus em tecidos de camundongos transgênicos K18 hACE2 infectados com rSARS-CoV-2/Nluc (Figura 2E)
    1. Quantifique a presença de Niuc nos camundongos transgênicos simulados, rSARS-CoV-2/WT e rSARS-CoV-2/Nluc infectados K18 hACE2 camundongos transgênicos usando um ensaio de luciferase seguindo as instruções dos fabricantes.
  7. Avaliação da morbidade e mortalidade (Figura 2F, G e Figura 4E, F)
    1. Infectar camundongos transgênicos K18 hACE2 fêmeas de 4-6 semanas com 105 PFU de rSARS-CoV-2/WT, rSARS-CoV-2/Venus, rSARS-CoV-2/Nluc, ou simulado infectado como descrito na seção 3.1.
    2. Monitore e pese os camundongos ao longo de 12 dias ao mesmo tempo para minimizar a variação de peso devido à ingestão alimentar. Eutanize os camundongos que perdem 25% de seu peso corporal inicial desde que atingiram um ponto final humano e notam esses camundongos como sucumbindo à infecção viral.
    3. Após 12 dias, eutanize os camundongos que sobrevivem à infecção viral e calculam a % de mudança de peso corporal e sobrevivência.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

rSARS-CoV-2/Infecção por Niuc em camundongos transgênicos K18 hACE2 (Figuras 1 e 2)
A Figura 1A mostra uma representação esquemática do rSARS-CoV-2/WT (superior) e rSARS-CoV-2/Nluc (inferior) utilizado para avaliar infecções in vivo. A Figura 1B mostra o fluxograma esquemático aplicado para avaliar a dinâmica da infecção rSARS-CoV-2/Nluc em camundongos transgênicos K18 hACE2. Camundongos transgênicos K18 hACE2 fêmeas de quatro a seis semanas (N = 4) foram infectados por 1x PBS ou infectados com 105 PFU de rSARS-COV-2/WT ou rSARS-CoV-2/Nluc intranasally. Em 1-, 2-, 4 e 6 dias após a infecção, os ratos foram sedados usando a câmara de isolamento e, em seguida, injetados com substrato niuc retro-orbital. A câmara de isolamento foi imediatamente colocada no IVIS e o sinal de NLUC foi avaliado in vivo usando o software de imagem. A expressão de NLUC foi prontamente detectada em camundongos infectados com rSARS-CoV-2/Nluc, mas não aqueles infectados com rSARS-CoV-2/WT, ou simulados infectados (Figura 2A). As análises quantitativas mostraram intensidade de NL em diferentes dias pós-infecção (Figura 2B). Lesões brutas na superfície pulmonar de camundongos infectados com rSARS-CoV-2/Nluc foram comparáveis às do grupo infectado rSARS-CoV-2/WT (Figuras 2C). Por fim, os órgãos de camundongos (pulmões, turbinados nasais e cérebro) foram homogeneizados, e os títulos virais foram determinados por ensaio de placa (PFU/mL) e a atividade de NLuc foi determinada utilizando o ensaio de luciferase seguindo as instruções do fabricante. As placas foram avaliadas por imunostaining utilizando o anticorpo monoclonal SARS-CoV N interativo 1C7C7. Os títulos virais detectados nos camundongos infectados rSARS-CoV-2/Nluc foram comparáveis aos infectados com rSARS-CoV-2/WT em todos os órgãos em dias diferentes pós-infecção (Figura 2D). A atividade de NLuc só foi detectada nos órgãos de camundongos infectados por rSARS-CoV-2/Niuc (Figura 2E). Um grupo separado de camundongos infectados por simulação e infectados por vírus foram monitorados por 12 dias para alterações no peso corporal (Figura 2F) e sobrevivência (Figura 2G). Camundongos infectados com rSARS-CoV-2/Nluc e rSARS-CoV-2/WT perderam até 25% de seu peso corporal e todos sucumbiram à infecção viral entre 7-8 dias após a infecção (Figura 2F-G).

rSARS-CoV-2/Venus infecção em camundongos transgênicos K18 hACE2 (Figuras 3 e 4)
A Figura 3A mostra uma representação esquemática do rSARS-CoV-2/WT (superior) e rSARS-CoV-2/Nluc (inferior) usado para avaliar infecções ex vivo. A Figura 3B mostra o fluxograma esquemático aplicado para avaliar a dinâmica rSARS-CoV-2/Venus em camundongos transgênicos K18 hACE2. Camundongos transgênicos K18 hACE2 fêmeas de quatro a seis semanas (N= 4/grupo) foram infectados por 1x PBS ou infectados com 105 PFU de rSARS-COV-2/WT ou rSARS-CoV-2/Venus intranasally. Em 1-, 2-, 4 e 6 dias após a infecção, os camundongos foram eutanizados, e seus pulmões foram excisados e ex vivo imagem usando um IVIS. A expressão de Vênus foi prontamente detectada em todos os pulmões de camundongos infectados com rSARS-CoV-2/Vênus, mas não aqueles infectados com rSARS-CoV-2/WT, ou simulados infectados (Figura 4A). Análises quantitativas mostraram que a intensidade de Vênus atinge picos de intensidade de 2 dias após a infecção e diminui ao longo da infecção nos pulmões de camundongos infectados (Figura 4B). Imagens da superfície pulmonar revelaram lesões brutas de camundongos infectados com rSARS-CoV-2/Vênus era comparável à dos camundongos infectados rSARS-CoV-2/WT (Figura 4C). Finalmente, os órgãos de camundongos (pulmões, turbinados nasais e cérebro) foram homogeneizados, e os títulos virais foram determinados por ensaio de placa e avaliados por imunostaining utilizando o anticorpo monoclonal transativo de proteína SARS-CoV N 1C7C7. A infecção por rSARS-CoV-2/Vênus resultou em títulos virais comparáveis aos observados em camundongos infectados com rSARS-CoV-2/WT em todos os órgãos (Figura 4D). Um grupo separado de camundongos infectados por simulação e infectados por vírus foram monitorados por 12 dias para alterações no peso corporal (Figura 4E) e sobrevivência (Figura 4F). Camundongos infectados com rSARS-CoV-2/Venus e rSARS-CoV-2/WT perderam até 25% de seu peso corporal e todos sucumbiram à infecção viral até o dia 9 pós-infecção sem sobrevida (Figuras 4E-4F).

Figure 1
Figura 1: Avaliação da infecção por rSARS-CoV-2/Nluc in vivo utilizando camundongos transgênicos K18 hACE2. (A) Representação esquemática de rSARS-CoV-2/WT (superior) e rSARS-CoV-2/Nluc (inferior). (B) Gráfico de fluxo esquemático para avaliação do rSARS-CoV-2/Nluc in vivo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: expressão rSARS-CoV-2Nluc em camundongos transgênicos K18 hACE2 infectados. (A-B) Camundongos transgênicos K18 hACE2 fêmeas de quatro a seis semanas foram infectados por simulação (N = 4) ou infectados com rSARS-CoV-2/WT (N = 4) ou rSARS-CoV-2/Nluc (N = 4) usando 105 PFU por animal. Os camundongos foram anestesiados em 1-, 2,4 e 6 dias após a infecção, depois de serem retroorbitais injetados com o substrato de Nluc. (A) A expressão de NIUC foi determinada sob um sistema de imagem in vivo, e os pulmões de camundongos infectados por simulação e infectados foram extirpados e fotografados em 1-, 2, 4 e 6 dias após a infecção . (B) A intensidade de niuc foi analisada quantitivamente pelo software de análise de imagens e (C) lesões brutas na superfície pulmonar foram analisadas quantitivamente por ImageJ (C) **P < 0,01. (D) Os títulos virais no turbinado nasal (esquerda), pulmões (médio) e cérebro (direita) de camundongos infectados com rSARS-CoV-2/WT e rSARS-CoV-2/Nluc foram determinados por ensaio de placa. (E) A atividade de niuc no turbinado nasal (esquerda), pulmões (médio) e cérebro (direita) foram medidos sob um leitor de várias placas luciferase. ns, não significativo. Camundongos infectados por simulação e vírus foram monitorados por 12 dias para alterações no peso corporal (F) e (G) sobrevivência. Todos os dados são apresentados como média ± SD para cada grupo e analisados pelo SPSS13.0 (IBM). Um valor P inferior a 0,05 (P < 0,05) foi considerado estatisticamente significativo. Este número foi modificado de Ye C. et al.41. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Avaliação da infecção por rSARS-CoV-2/Vênus in vivo usando camundongos transgênicos K18 hACE2. (A) Representação esquemática de rSARS-CoV-2/WT (superior) e rSARS-CoV-2/Venus (inferior). (B) Gráfico de fluxo esquemático para avaliação do rSARS-CoV-2/Venus in vivo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: expressão rSARS-CoV-2/Vênus em camundongos transgênicos K18 hACE2 infectados. (A-B) Camundongos transgênicos K18 hACE2 fêmeas de quatro a seis semanas foram infectados por simulação (N = 4) ou infectados (105 PFU/mouse) com rSARS-CoV-2/WT (N = 4) ou rSARS-CoV-2/Venus (N = 4). Os pulmões foram extirpados em 1-, 2,4 e 6 dias após a infecção, imagens de pulmões foram fotografadas em 1-, 2, 4 e 6 dias após a infecção. (A) A expressão de Vênus foi avaliada sob uma intensidade de fluorescência IVIS, (B) foi analisada quantitivamente pelo software de análise de imagens e (C) as lesões brutas nas superfícies pulmonares foram analisadas quantitivamente pelo ImageJ. **P < 0,01. (D) Os títulos virais no turbinado nasal (esquerda), pulmões (médio) e cérebro (direita) de camundongos infectados com rSARS-CoV-2/WT e rSARS-CoV-2/Venus foram determinados por ensaio de placa. ns, não significativo. Camundongos infectados por simulação e SARS-CoV-2 foram monitorados por 12 dias para perda de peso corporal (E) e sobrevivência (F). Todos os dados são apresentados como média ± SD para cada grupo e analisados pelo SPSS13.0 (IBM). Um valor P inferior a 0,05 (P < 0,05) foi considerado estatisticamente significativo. Este número foi modificado de Ye C. et al.41. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Este protocolo demonstra a viabilidade do uso desses rSARS-CoV-2 expressando genes repórteres para monitorar infecções virais in vivo. Ambos os vírus recombinantes que expressam repórteres fornecem uma excelente ferramenta para estudar infecções pelo SARS-CoV-2 in vivo. Os sistemas de imagem ex vivo (rSARS-CoV-2/Venus) e in vivo (rSARS-CoV-2/Nluc) representam uma excelente opção para entender a dinâmica da infecção pelo SARS-CoV-2, a patogênese viral e identificar células/órgãos infectados em diferentes momentos após a infecção viral. Para realizar estudos ex vivo (rSARS-CoV-2/Venus) e in vivo (rSARS-CoV-2/Nluc), é eminente ter infecções precisas e reprodutíveis, bem como inoculações adequadas de rSARS-CoV-2/Nluc.

Ao estudar infecções in vivo usando rSARS-CoV-2/Nluc, os camundongos devem ser raspados para facilitar a visualização de NLuc sob o IVIS. Há também a necessidade de inocular o substrato niuc para visualização de Nluc. Isso pode exigir alguns testes experimentais para determinar as concentrações e o volume do substrato de Nluc para garantir um sinal niuc alto. Ao estudar infecções ex vivo usando rSARS-CoV-2/Vênus, e por causa de limitações de detectar Vênus diretamente de todo o camundongo usando IVIS, apenas imagens ex vivo dos pulmões permitem a detecção da expressão de Vênus. Isso requer que um grupo de camundongos seja eutanizado em diferentes momentos. Isso é contrário à situação dos camundongos infectados com rSARS-CoV-2/Nluc, uma vez que o mesmo grupo de camundongos pode ser imagedo em dias diferentes após a infecção, sem exigir eutanásia em cada um dos momentos pós-infecção necessários para rSARS-CoV-2/Vênus. Uma vantagem do rSARS-CoV-2/Vênus sobre o rSARS-CoV-2/Nluc é que ele pode ser usado com citometria de fluxo para identificar que tipo de células são infectadas pelo SARS-CoV-2, simplesmente classificando células infectantes de células não infectadas, juntamente com o uso de marcadores celulares específicos como descrevemos anteriormente com a influenza (REF). Um aspecto importante do nosso rSARS-CoV-2/Venus e rSARS-CoV-2/Nluc é que ambos exibiram propriedades de crescimento semelhantes a WT-like in vitro e in vivo sem exibir sinais de atenuação, permitindo-nos monitorar a infecção por vírus ex vivo nos pulmões de camundongos infectados (rSARS-CoV-2/Vênus) e a dinâmica da replicação viral em todo o camundongo (rSARS-CoV-2/Nluc) usando imagens longitudinal in vivo não invasivas.

É importante ressaltar que esses repórteres que expressam rSARS-CoV-2/Venus e rSARS-CoV-2/Nluc representam uma excelente opção para a identificação de profiláticos e/ou terapêuticos de chumbo para o tratamento da infecção sars-cov-241. O uso do rSARS-CoV-2 que expressa as diferentes proteínas fluorescentes utilizadas (por exemplo, Vênus e mCherry) nos permite combiná-los em ensaios bifluorescentes para identificar se a terapêutica pode inibir eficientemente a infecção de dois vírus ao mesmo tempo, in vitro e ou in vivo, e para rastrear infecção viral, e patogênese39.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Os autores declaram que a pesquisa foi realizada na ausência de qualquer conflito comercial, financeiro e não financeiro ou pessoal de interesse em relação ao trabalho descrito.

Acknowledgments

Gostaríamos de agradecer aos membros do nosso instituto (Texas Biomedical Research Institute) por seus esforços em manter nossas instalações totalmente operacionais e seguras durante a pandemia COVID-19. Gostaríamos também de agradecer ao nosso Comitê de Biossegurança Institucional (IBC) e ao Feitiço (IACUC) por revisar nossos protocolos de forma eficiente. Agradecemos ao Dr. Thomas Moran da Escola de Medicina Icahn do Monte Sinai por fornecer o anticorpo monoclonal de proteína sars-CoV 1C7C7 (N) proteína. A pesquisa SARS-CoV-2 no laboratório de Martinez-Sobrido é atualmente apoiada pelas bolsas NIAID/NIH RO1AI161363-01, RO1AI161175-01A1 e R43AI165089-01; o Departamento de Defesa (DoD) concede W81XWH2110095 e W81XWH2110103; a Parceria de San Antonio para a Precision Therapeutic; o Fórum do Instituto de Pesquisa Biomédica do Texas; o Centro de Ciência da Saúde da Universidade do Texas em San Antonio; a Fundação Médica de San Antonio; e pelo Centro de Pesquisa em Patogênese e Transmissão da Influenza (CRIPT), um Centro de Excelência para Pesquisa e Resposta à Influenza (CEIRR, contrato nº 75N93021C00014).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5% Triton X-100 J.T.Baker X198-07 Store at room temperature (RT)
1% DEAE-Dextran MP Biomedicals 195133
10% Formalin solution, neutral buffered Sigma-Aldrich HT501128
Agar Oxoid LP0028
24-well Cell Culture Plate Greiner Bio-one 662160
5% Sodium bicarbonate Sigma Aldrich S-5761
6-well Cell Culture Plate Greiner Bio-one 657160
96-well Cell Culture Plate Greiner Bio-one 655-180
African green monkey kidney epithelial cells (Vero E6) ATCC CRL-1586
Ami HT Spectral Instruments Imaging
Aura Imaging Software 3.2.0 Spectral Instruments Imaging Image analysis software
Bovine Serum Albumin (BSA), 35% Sigma-Aldrich A9647 Store at 4 °C
Cell culture grade water Corning 25-055-CV
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Corning Cellgro 15-013-CV Store at 4 °C
Anesthesia gas machine Veterinary Anesthesia Systems, Inc. VAS 2001R
Fetal Bovine Serum (FBS) Seradigm 1500-050 Store at -20 °C
Four- to six-week-old female K18-hACE2 transgenic mice The Jackson Laboratory 34860
Graphpad Prism Version 9.1.0 GraphPad
Isoflurane Baxter 1001936040 Store at RT
MARS Data Analysis Software BMG LABTECH
MB10 tablets QUIP Laboratories MBTAB1.5 Store at RT
Nano-Glo Luciferase Assay Reagent Promega N1110 This reagent is used to measure Nluc activity. Store at -20 °C
Nunc MicroWell 96-Well Microplates ThermoFisher Scientific 269620
Nunc MicroWell 96-Well Microplates ThermoFisher Scientific 269620
Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine (PSG) 100x Corning 30-009-CI Store at -20 °C
PHERAstar FSX BMG LABTECH PHERAstar FSX
Precelleys Evolution homogenizer Bertin Instruments P000062-PEVO0-A
Soft tissue homogenizing CK14 – 7 mL Bertin Instruments P000940-LYSK0-A
T75 EasYFlask ThermoFisher Scientific 156499
VECTASTAIN ABC-HRP Kit, Peroxidase Vector Laboratories PK-4002 ABC kit and DAB Peroxidase Substrate kit

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. V'Kovski, P., Kratzel, A., Steiner, S., Stalder, H., Thiel, V. Coronavirus biology and replication: implications for SARS-CoV-2. Nature Reviews Microbiology. 19 (3), 155-170 (2021).
  2. Pal, M., Berhanu, G., Desalegn, C., Kandi, V. Severe acute respiratory syndrome coronavirus-2 (SARS-CoV-2): An update. Cureus. 12 (3), 7423 (2020).
  3. Su, S., et al. Epidemiology, genetic recombination, and pathogenesis of coronaviruses. Trends in Microbiology. 24 (6), 490-502 (2016).
  4. Cui, J., Li, F., Shi, Z. L. Origin and evolution of pathogenic coronaviruses. Nature Reviews Microbiology. 17 (3), 181-192 (2019).
  5. Lu, R., et al. Genomic characterisation and epidemiology of 2019 novel coronavirus: implications for virus origins and receptor binding. Lancet. 395 (10224), 565-574 (2020).
  6. Evans, J. P., Liu, S. L. Role of host factors in SARS-CoV-2 entry. Journal of Biological Chemistry. 297 (1), 100847 (2021).
  7. Petersen, E., et al. Comparing SARS-CoV-2 with SARS-CoV and influenza pandemics. Lancet Infectious Diseases. 20 (9), 238-244 (2020).
  8. Alfaraj, S. H., et al. Clinical predictors of mortality of Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus (MERS-CoV) infection: A cohort study. Travel Medicine and Infectious Disease. 29, 48-50 (2019).
  9. Harvey, W. T., et al. SARS-CoV-2 variants, spike mutations and immune escape. Nature Reviews Microbiology. 19 (7), 409-424 (2021).
  10. Dong, E., Du, H., Gardner, L. An interactive web-based dashboard to track COVID-19 in real time. Lancet Infectious Diseases. 20 (5), 533-534 (2020).
  11. Bar-On, Y. M., Flamholz, A., Phillips, R., Milo, R. ARS-CoV-2 (COVID-19) by the numbers. Elife. 9, 57309 (2020).
  12. Roussel, Y., et al. SARS-CoV-2: fear versus data. International Journal of Antimicrobial Agents. 55 (5), 105947 (2020).
  13. Scialo, F., et al. SARS-CoV-2: One year in the pandemic. What have we learned, the new vaccine era and the threat of SARS-CoV-2 variants. Biomedicines. 9 (6), 611 (2021).
  14. Coronavirus (COVID-19) update: FDA authorizes additional monoclonal antibody for treatment of COVID-19. , Available from: https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/coronavirus-covid-19-update-fda-authorizes-additional-monoclonal-antibody-treatment-covid-19 (2021).
  15. Dougan, M., et al. Bamlanivimab plus Etesevimab in Mild or Moderate Covid-19. New England Journal of Medicine. 385 (15), 1382-1392 (2021).
  16. Ledford, H. COVID antibody treatments show promise for preventing severe disease. Nature. 591 (7851), 513-514 (2021).
  17. Tuccori, M., et al. An overview of the preclinical discovery and development of bamlanivimab for the treatment of novel coronavirus infection (COVID-19): reasons for limited clinical use and lessons for the future. Expert Opinion on Drug Discovery. , 1-12 (2021).
  18. Phan, A. T., Gukasyan, J., Arabian, S., Wang, S., Neeki, M. M. Emergent inpatient administration of casirivimab and imdevimab antibody cocktail for the treatment of COVID-19 pneumonia. Cureus. 13 (5), 15280 (2021).
  19. O'Brien, M. P., et al. Subcutaneous REGEN-COV antibody combination in early SARS-CoV-2 infection. medRxiv. , (2021).
  20. Beigel, J. H., et al. Remdesivir for the treatment of Covid-19 - Final report. New England Journal of Medicine. 383 (19), 1813-1826 (2020).
  21. Li, L., et al. Effect of convalescent plasma therapy on time to clinical improvement in patients with severe and life-threatening COVID-19: A randomized clinical trial. Journal of the American Medical Association. 324 (5), 460-470 (2020).
  22. Polack, F. P., et al. Safety and efficacy of the BNT162b2 mRNA Covid-19 vaccine. New England Journal of Medicine. 383 (27), 2603-2615 (2020).
  23. Oliver, S. E., et al. The advisory committee on immunization practices' interim recommendation for use of Pfizer-BioNTech COVID-19 vaccine - United States, December 2020. Morbidity and Mortality Weekly Report. 69 (50), 1922-1924 (2020).
  24. Oliver, S. E., et al. The advisory committee on immunization practices' interim recommendation for use of Janssen COVID-19 vaccine - United States, February 2021. Morbidity and Mortality Weekly Report. 70 (9), 329-332 (2021).
  25. Zhao, H., et al. Emission spectra of bioluminescent reporters and interaction with mammalian tissue determine the sensitivity of detection in vivo. Journal of Biomedical Optics. 10 (4), 41210 (2005).
  26. Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nature Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
  27. Nogales, A., et al. A novel fluorescent and bioluminescent bireporter Influenza A Virus to evaluate viral infections. Journal of Virology. 93 (10), 00032 (2019).
  28. Nogales, A., et al. Replication-competent fluorescent-expressing influenza B virus. Virus Research. 213, 69-81 (2016).
  29. Welsh, D. K., Noguchi, T. Cellular bioluminescence imaging. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (8), (2012).
  30. Tran, V., Moser, L. A., Poole, D. S., Mehle, A. Highly sensitive real-time in vivo imaging of an influenza reporter virus reveals dynamics of replication and spread. Journal of Virology. 87 (24), 13321-13329 (2013).
  31. Schoggins, J. W., et al. Dengue reporter viruses reveal viral dynamics in interferon receptor-deficient mice and sensitivity to interferon effectors in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (36), 14610-14615 (2012).
  32. Luker, G. D., et al. Noninvasive bioluminescence imaging of herpes simplex virus type 1 infection and therapy in living mice. Journal of Virology. 76 (23), 12149-12161 (2002).
  33. Li, X., et al. Development of a rapid antiviral screening assay based on eGFP reporter virus of Mayaro virus. Antiviral Research. 168, 82-90 (2019).
  34. Kirui, J., Freed, E. O. Generation and validation of a highly sensitive bioluminescent HIV-1 reporter vector that simplifies measurement of virus release. Retrovirology. 17 (1), 12 (2020).
  35. Shang, B., et al. Development and characterization of a stable eGFP enterovirus 71 for antiviral screening. Antiviral Research. 97 (2), 198-205 (2013).
  36. Zou, G., Xu, H. Y., Qing, M., Wang, Q. Y., Shi, P. Y. Development and characterization of a stable luciferase dengue virus for high-throughput screening. Antiviral Research. 91 (1), 11-19 (2011).
  37. Ye, C., et al. Rescue of SARS-CoV-2 from a single bacterial artificial chromosome. mBio. 11 (5), 02168 (2020).
  38. Avila-Perez, G., Park, J. G., Nogales, A., Almazan, F., Martinez-Sobrido, L. Rescue of recombinant Zika virus from a bacterial artificial chromosome cDNA clone. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59537 (2019).
  39. Chiem, K., et al. A bifluorescent-based assay for the identification of neutralizing antibodies against SARS-CoV-2 variants of concern in vitro and in vivo. Journal of Virology. , (2021).
  40. Committee for the update of the guide for the care and use of laboratory animals., Institute for laboratory animal research (U.S) & National Academies Press (U.S.). Guide for the care and use of laboratory animals. 8th edn. National Research Council (US). , National Academies Press. (2011).
  41. Ye, C., et al. Analysis of SARS-CoV-2 infection dynamic in vivo using reporter-expressing viruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (41), (2021).

Tags

Imunologia e Infecção Problema 177 SARS-CoV-2 coronavírus fluorescência bioluminescência vírus competentes em replicação vírus repórter NanoLuc luciferase vênus proteína fluorescente infecção viral in vivo imaging IVIS Ami HT K18 hACE2 ratos transgênicos
Imagem ao vivo e quantificação da infecção viral em K18 hACE2 Camundongos transgênicos usando o recombinante SARS-CoV-2
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Morales Vasquez, D., Chiem, K.,… More

Morales Vasquez, D., Chiem, K., Silvas, J., Park, J. G., Ye, C., Martínez-Sobrido, L. Live Imaging and Quantification of Viral Infection in K18 hACE2 Transgenic Mice Using Reporter-Expressing Recombinant SARS-CoV-2. J. Vis. Exp. (177), e63127, doi:10.3791/63127 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter