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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Herstellung von perlengestützten Lipiddoppelschichten zur Untersuchung der partikulären Ausscheidung von T-Zell-Immunsynapsen

Published: April 1, 2022 doi: 10.3791/63130
Automatic Translation
1, 1
1Kennedy Institute of Rheumatology, Nuffield Department of Orthopaedics, Rheumatology and Musculoskeletal Sciences, The University of Oxford

Summary

Hier stellen wir das Protokoll für die schrittweise Rekonstitution synthetischer Antigen-präsentierender Zellen unter Verwendung von Bead-Supported Lipid Bilayers und deren Verwendung zur Abfrage der synaptischen Ausgabe von aktivierten T-Zellen vor.

Abstract

Antigen-präsentierende Zellen (APCs) präsentieren drei aktivierende Signale an T-Zellen, die in physischem Kontakt stehen: 1) Antigen, 2) Kostimulation / Kernpression und 3) lösliche Zytokine. T-Zellen setzen als Reaktion auf die Aktivierung zwei Arten von Effektorpartikeln frei: transsynaptische Vesikel (tSVs) und supramolekulare Angriffspartikel, die interzelluläre Botenstoffe übertragen bzw. Zytotoxizität vermitteln. Diese Entitäten werden schnell von APCs verinnerlicht, die in physischem Kontakt mit T-Zellen stehen, was ihre Charakterisierung entmutigend macht. Dieser Artikel stellt das Protokoll zur Herstellung und Verwendung von Bead-Supported Lipid Bilayers (BSLBs) als Antigen-präsentierende Zell (APC) Mimetika vor, um diese transsynaptischen Partikel zu erfassen und zu analysieren. Ebenfalls beschrieben sind die Protokolle für die absoluten Messungen von Proteindichten auf Zelloberflächen, die Rekonstitution von BSLBs mit solchen physiologischen Werten und das Durchflusszytometrieverfahren zur Verfolgung der synaptischen Partikelfreisetzung durch T-Zellen. Dieses Protokoll kann angepasst werden, um die Auswirkungen einzelner Proteine, komplexer Ligandengemische, Pathogenvirulenzdeterminanten und Medikamente auf den Effektorausgang von T-Zellen, einschließlich Helfer-T-Zellen, zytotoxischen T-Lymphozyten, regulatorischen T-Zellen und chimären Antigenrezeptor-exprimierenden T-Zellen (CART), zu untersuchen.

Introduction

Die immunologische Synapse (IS) ist eine zentrale molekulare Struktur, die an der Schnittstelle von Zellen gebildet wird, die in physischem Kontakt stehen und den regulierten Austausch von Juxtracrin-Informationen erleichtern. Verschiedene ISs wurden in der Literatur beschrieben, und eine wachsende Zahl von Beweisen deutet darauf hin, dass diese molekularen Zentren ein konserviertes Merkmal zellulärer Netzwerke sind. Verschiedene Immunzellen, darunter B-Zellen, natürliche Killerzellen, dendritische Zellen, Makrophagen und T-Zellen, tauschen Informationen über den Aufbau kurzlebiger Kontakte aus1. Multiomische Studien fördern das Verständnis neuartiger Untergruppen von Leukozyten und Stromazellen, die pathogene zelluläre Netzwerke antreiben und Oberflächenproteine mit unbekannten Funktionen exprimieren. Als synthetische APCs erlauben BSLBs die direkte Untersuchung der funktionellen Rolle einzelner Proteine bei der Integration von aktivierenden Signalen, nämlich Antigenen und Kostimulation/Corepression, durch T-Zellen und die daraus resultierende Freisetzung von Effektorpartikeln, die als Signal vier bezeichnet werden.

In diesem Dokument werden die Protokolle und kritischen technischen Punkte beschrieben, die bei der Verwendung von BSLBs zur Nachahmung der Oberflächenzusammensetzung von Modell-APCs zu berücksichtigen sind. Die Protokolle für die quantitative Messung von Immunrezeptoren und anderen Oberflächenproteinen auf APCs werden zusammen mit dem Protokoll für die Rekonstitution synthetischer APCs, die diese gemessenen Größen enthalten, vorgestellt. Anschließend werden die schritte, die für die Kokulturation von T-Zellen und BSLB erforderlich sind, zusammen mit dem Protokoll für die quantitative Messung des transsynaptischen Partikeltransfers mittels Durchflusszytometrie vorgestellt. Am bemerkenswertesten ist, dass BSLBs die Untersuchung einer aus der Plasmamembran abgeleiteten Population von tSVs erleichtern, die als synaptische Ektosomen (SEs) bezeichnet werden. T-Zell-Antigenrezeptor-angereicherte (TCR+) SEs werden als Reaktion auf TCR-Triggerung2 abgestoßen und effizient von BSLBs3 abgefangen, was eine hervorragende Ablesung darstellt, um die agonistischen Eigenschaften von Antigenen und die modellierte Membranzusammensetzung zu bewerten. CD63+-Exosomen und supramolekulare Angriffspartikel (SMAPs) werden ebenfalls von stimulierten T-Zellen freigesetzt und von BSLBs eingefangen. Sie können als zusätzliche Auslesungen der Aktivierung und der daraus resultierenden exozytären und lytischen Granulensekretion durch T-Zellen verwendet werden. Die Mobilisierung exozytärer Vesikel zum interagierenden Pol der T-Zelle erleichtert auch die direktionale Freisetzung von Zytokinen wie IL-2, IFN-γ und IL-10 als Reaktion auf die Aktivierung4,5,6,7,8. Obwohl T-Zell-freigesetzte Zytokine auch auf BSLBs nachgewiesen werden können, befindet sich derzeit eine speziellere Studie in der Entwicklung, um die quantitative Analyse der Zytokinfreisetzung an der immunologischen Synapse zu validieren.

Um zu untersuchen, wie spezifische Membranzusammensetzungen die synaptische Leistung von T-Zellen beeinflussen, muss die physiologische Dichte der Zielmembrankomponente definiert werden. Durchflusszytometrie-basierte Quantifizierungen von Zelloberflächenproteinen sind ein wesentlicher Schritt in diesem Protokoll und erfordern: 1) die Verwendung von Antikörpern mit bekannter Anzahl von Fluorochromen pro Antikörper (F / P) und 2) Benchmark-Kügelchen, die eine Standardreferenz für die Interpolation von Fluorochrommolekülen aus gemessenen mittleren Fluoreszenzintensitäten (MFIs) darstellen.

Diese Benchmark-Standards bestehen aus fünf Perlenpopulationen, die jeweils eine zunehmende Anzahl äquivalenter löslicher Fluorochrome (MESFs) enthalten, die den Dynamikbereich der willkürlichen Fluoreszenzdetektion abdecken. Diese Standardpopulationen liefern diskrete Fluoreszenzpeaks, die die Umwandlung beliebiger Fluoreszenzeinheiten in MESFs durch einfache lineare Regression erleichtern. Die resultierenden MESFs werden dann zusammen mit Antikörper-F/P-Werten verwendet, um die durchschnittliche Anzahl der gebundenen Moleküle pro Zelle (oder BSLB in späteren Schritten) zu berechnen. Die Anwendung der geschätzten Zelloberflächen auf die durchschnittliche Anzahl der nachgewiesenen Moleküle ermöglicht dann die Berechnung physiologischer Dichten als Moleküle/μm2. Dieses Quantifizierungsprotokoll kann auch an die Messung von Proteindichten auf T-Zellen und die biochemische Rekonstitution von Membranzusammensetzungen angepasst werden, die die Bildung homotypischer T-Zell-Synapsen (d.h. T-T-Synapsen9) vermitteln. Bei Bedarf kann die Wertigkeit der Antikörperbindung weiter geschätzt werden, indem rekombinante Targets verwendet werden, die mit einer bekannten Anzahl von Fluorochromen pro Molekül markiert sind. Dann kann die Antikörper-bindende Valenz für die gleiche BSLB-Population berechnet werden, indem gleichzeitig die Anzahl der gebundenen fluoreszierenden Proteine und Quantifizierungsantikörper verglichen wird (unter Verwendung von zwei verschiedenen Quantifizierungsfluorochromen und MESF-Standards).

Die Rekonstitution von APC-Membranen erfordert die Montage von gestützten Lipiddoppelschichten (SLBs) auf Silica-Perlen1. Liposomenbestände, die verschiedene Phospholipidspezies enthalten, können zu einer vielseitigen Lipid-Doppelschicht-Matrix genutzt werden, die die Verankerung rekombinanter Proteine mit unterschiedlicher Bindungschemie ermöglicht (die Herstellung von Liposomen ist in 10 beschrieben). Sobald die physiologische Dichte (oder Dichte) des relevanten Liganden "auf Zellen" definiert ist, wird das gleiche Durchflusszytometrieprotokoll angepasst, um die Konzentration des rekombinanten Proteins abzuschätzen, das benötigt wird, um BSLBs mit der physiologischen Zieldichte zu beschichten. Zwei verschiedene Verankerungssysteme können entweder in Kombination oder separat verwendet werden.

Erstens reicht SLB, das die letzten 12,5 Mol-% Ni2+-haltiger Phospholipide enthält, aus, um etwa 10.000 His-Tag-Bindungsstellen pro Quadratmikron10 bereitzustellen, und eignet sich gut, um BSLBs mit den meisten kommerziell erhältlichen Proteinen zu dekorieren, deren physiologische Dichten diese maximale Beladungskapazität nicht überschreiten. Das zweite Ladesystem nutzt biotinhaltige Phospholipide (als mol%), um biotinylierte Anti-CD3e Fab (oder HLA /MHC-Monomere) über Streptavidinbrücken zu laden. Die Kombination dieser beiden BSLB-Dekorationsmethoden ermöglicht dann die flexible Anpassung von BSLBs als synthetische APCs. Bei hochkomplexen APC-Oberflächenzusammensetzungen kann der Mol-Anteil an Phospholipiden und Proteinen erhöht werden, um so viele Proteine zu laden, wie die vorliegende Frage erfordert. Sobald die Arbeitskonzentrationen von Proteinen und Mol-% biotinylierter Phospholipide definiert sind, können BSLBs zusammengestellt werden, um die synaptische Leistung von T-Zellen mit multiparametrischer Durchflusszytometrie zu abfragen.

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Protocol

1. Messung der Zelloberflächenproteindichten mit quantitativer Durchflusszytometrie

  1. Herstellen eines 0,22 μm-gefilterten menschlichen Durchflusszytometriepuffers (hFCB) durch Zugabe von EDTA (auf eine endgültige Konzentration von 2 mM) und humanem AB-Serum (auf letzte 10 %) zu steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), pH 7,4 (siehe Tabelle 1). Die Lösung wird mit einer 0,22 μm Porenfiltereinheit filtriert, um Serumverunreinigungen zu entfernen, und bei 4 °C gelagert.
  2. Gewinnen Sie die Zellen zurück und sedimentieren Sie sie durch Zentrifugation bei 300 × g für 5 min bei Raumtemperatur (RT).
  3. Waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS. In jedem Waschschritt die Zellen in PBS auf das ursprüngliche Volumen (vor der Zentrifugation) resuspendieren und bei 300 × g für 5 min bei RT herunterdrehen.
  4. Zählen Sie Trypan blau gefärbte Zellsuspensionen in einem Hämozytometer11. Alternativ können Sie Zellen mit elektrischem Stromausschluss zählen. Befolgen Sie für Letzteres die CASY-TT-Herstelleranleitung (siehe Materialtabelle).
    HINWEIS: Der CASY-TT-Zellzähler ermöglicht die Bestimmung von prozentual lebensfähigen Zellen, Zellgröße und Zellvolumen.
  5. Berechnen Sie das Volumen von PBS mit einer Verdünnung von 1:1.000 fixierbarem Lebensfähigkeitsfarbstoff eFluor 780 oder ähnlich (siehe Materialtabelle), das erforderlich ist, um die Zellen auf eine Färbekonzentration von 107 Zellen / ml zu resuspendieren.
  6. Resuspendieren Sie die Zellen mit der Lebensfähigkeitsfarbstoff-PBS-Lösung und inkubieren Sie 30 min auf Eis.
  7. Entfernen Sie den Lebensfähigkeitsfarbstoff, indem Sie ein Volumen eiskaltes hFCB hinzufügen. Bei 300 × g für 5 min bei 4 °C nach unten drehen.
    HINWEIS: Halten Sie die Kühlkette von nun an ununterbrochen.
  8. Waschen Sie die Zellen mit hFCB, das eine Verdünnung von 1:50 der Fc-Rezeptor-Blockierungslösung enthält (siehe Tabelle der Materialien). Bringen Sie das Volumen auf eine Endkonzentration von 107 Zellen / ml und inkubieren Sie für weitere 15 Minuten, um eine effiziente FcgR-Blockierung zu erreichen.
  9. Verteilen Sie 100 μL der Zellsuspension (d. h. 106 Zellen) pro Vertiefung einer U-Boden- oder V-Boden-96-Well-Platte. Halten Sie die Zellen auf Eis und vor Licht geschützt (Abdeckung mit Aluminiumfolie).
  10. Bereiten Sie eine Antikörper-Mastermischung in hFCB vor, indem Sie die optimalen Antikörperkonzentrationen für jeden Fluorochrom-konjugierten Antikörper und vor allem für die Antikörper definieren, die zur Bestimmung der Oberflächenproteindichten verwendet werden. Bereiten Sie beispielsweise zur Quantifizierung der ICAM-1-Expression auf Tonsillarzellpopulationen, wie in Abbildung 1 gezeigt, eine Mischung mit 1:200 Verdünnungen von Anti-CD4, Anti-CD19 und Anti-CXCR5 zusammen mit sättigenden Konzentrationen eines Anti-ICAM-1-Antikörpers mit bekannten AF647-Fluorochromen pro Antikörper (d. h. 10 μg / ml, die durch unabhängige Antikörpertitrationsexperimente definiert wurde) vor.
  11. Bereiten Sie als zusätzliche Kontrollen eine Antikörper-Master-Mischung vor, die die relevanten Antikörper-Isotyp-Kontrollen enthält (bei den gleichen effektiven Konzentrationen wie ihre Gegenstücke, die mit den gleichen Fluorochromen für die Hintergrundsubtraktion konjugiert sind ), d. h. verwenden Sie 10 μg / ml einer relevanten AF647-Isotypkontrolle.
    HINWEIS: Im obigen Beispiel wird eine solche Isotypkontrolle verwendet, um die Hintergrundfluoreszenz vom wahren ICAM-1-Signal auf Zellen zu subtrahieren.
  12. Bei der Quantifizierung von Proteindichten auf Zelluntergruppen, die bei niedrigen Frequenzen im Gewebe vorhanden sind, stellen Sie Fluoreszenz minus eins (FMO) -Kontrollen vor, die alle färbenden Antikörper mit Ausnahme der interessierenden Marker enthalten (siehe weitere Details in 12).
  13. Drehen Sie die 96-Well-Platte, die die Zellen enthält, bei 300 × g für 5 min bei 4 °C herunter, verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 50 μL entweder des Quantifizierungs-Antikörper-Master-Mix oder des Isotyp-Antikörper-Master-Mixes.
  14. Inkubieren Sie die Zellen für mindestens 30 min bei 4 °C und 400 U / min mit einem Plattenschüttler. Schützen Sie die Platten vor Licht (Abdeckung mit Alufolie).
  15. Die Zellen dreimal mit hFCB waschen und bei 300 × g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren.
  16. Resuspendieren Sie das Zellpellet mit 200 μL PBS (d.h. auf eine Endkonzentration von 5 × 106 Zellen/ml).
  17. Für die Akquisition:
    1. Wenn Sie einen Standard-BD FACS Loader verwenden, übertragen Sie die Proben auf 5 ml Polystyrol-Rundbodenröhrchen (siehe Materialtabelle).
    2. Wenn Sie Hochdurchsatz-Probenehmer (HTS, auch als Plattenleser bezeichnet) verwenden, fahren Sie sofort mit Schritt 1.19 fort.
  18. Bevor Sie mit der Datenerfassung für die MESF-Standards fortfahren, überprüfen Sie die maximalen und minimalen Grenzwerte für die Fluoreszenzintensitätslinearität für die Quantifizierungskanäle.
  19. Erfassen Sie vor der Kompensation Daten für die MESF-Standards, um sicherzustellen, dass sowohl die dunkelsten als auch die klügsten Populationen in den linearen Messbereich fallen.
  20. Erwerben Sie die Vergütungsproben. Lassen Sie die PMT-Spannungswerte (Photomultiplier Tube) für die Quantifizierungskanäle unverändert, um den dynamischen Erfassungsbereich beizubehalten. Führen Sie leichte Anpassungen der PMT-Spannung anderer Kanäle durch, bevor Sie die Kompensationsmatrizen berechnen.
  21. Berechnen und berechnen Sie die Entschädigung.
  22. Erwerben und speichern Sie mindestens 2 × insgesamt 104 MESF-Kügelchen für jeden der Quantifizierungskanäle.
  23. Selektieren Sie die Population einzelner Zellen basierend auf ihren seitlichen und vorwärtslichtstreuenden Bereichen (SSC-A bzw. FSC-A, wie in Abbildung 1A (i) gezeigt), gefolgt von der Auswahl der Ereignisse innerhalb des Zeitkontinuums (Abbildung 1A (ii)) und niedrig für die Flugzeit (W) sowohl in FSC als auch in SSC im Vergleich zu ihren Höhen (d. h. FSC-W/FSC-H, gefolgt von SSC-W/SSC-H-Gating, wie in Abbildung 1A (iii) bzw. (iv) dargestellt). Definieren Sie ein letztes Einzelereignis-Gate, das Ereignisse mit proportionaler FSC-A- im Vergleich zu FSC-H-Verteilung enthält (Abbildung 1A (v)).
  24. Erfassen Sie Kontrollproben (Isotype-markierte und FMO-Kontrollen).
  25. Sammeln Sie Proben und zeichnen Sie auf, bis mindestens 10.000 Zielzellen erfasst wurden.
    HINWEIS: Die robuste Bestimmung durchschnittlicher molekularer Dichten erfordert die Analyse mehrerer Spender über unabhängige Experimente hinweg. Dies ist entscheidend für die Analyse von Zelluntergruppen, die in reduzierten Frequenzen gefunden wurden oder aus knappem biologischem Material (z. B. aus menschlichen Gewebebiopsien) stammen.
  26. Waschen Sie das Zytometer 5 Minuten lang mit einer FACS-Reinigungslösung, gefolgt von 5 Minuten Reinstwasser, bevor Sie das Gerät abschalten. Wenn Sie das HTS verwenden, folgen Sie den Optionen unter der Registerkarte HTS und Clean Plate Programm.
    HINWEIS: Um den Übertrag von Probe zu Probe zu reduzieren, aktivieren Sie die Optionen "Sit (Sampler) Flush" oder "High-Throughput Sampler Wash ", die das Zytometer automatisch zwischen Röhrchen oder Vertiefungen waschen. Bevor Sie mit der Erfassung beginnen, lassen Sie Reinstwasser 10 Minuten lang mit einer hohen Durchflussrate laufen, um ungewaschene biologische Verunreinigungen aus der Zytometer-Probenleitung zu entfernen.
  27. Exportieren Sie die FCS-Dateien (Flow Cytometry Standard).

2. MESF-Regressionsanalysen mit mittlerer (oder mittlerer) Fluoreszenzintensität (MFI)

  1. Öffnen Sie die Software zur Durchflusszytometrieanalyse und laden Sie die FCS-Dateien des Experiments. Wählen Sie die Population der Perlen basierend auf ihren seitlichen und vorwärts gerichteten Lichtstreubereichen (SSC-A versus FSC-A) aus, wie in Abbildung 1A (i) dargestellt.
  2. Kontrollieren Sie die Datenqualität, indem Sie die Verteilung einzelner Ereignisse über die Zeit überprüfen, wie in Schritt 1.24 angegeben.
    HINWEIS: Blasen erzeugen Lücken in der Verteilung von Ereignissen im Zeitverlauf. Dies erscheint typischerweise zu Beginn der Erfassung mit dem HTS. Vermeiden Sie die Auswahl von Ereignissen, die Lücken in der Erfassungszeit flankieren, da diese aufgrund optischer Aberrationen zu Messfehlern führen.
  3. Konzentrieren Sie sich auf die einzelnen Ereignisse.
    1. Zellen
      1. Identifizierung einzelner Zellen zuerst basierend auf ihrer SSC-A- und FSC-A-Verteilung (Abbildung 1A (i)), gefolgt von Ereignissen, die für W in den sequentiellen Gattern FSC-W/FSC-H (Singuletts-1, Abbildung 1A-Panel (iii)) und SSC-W/SSC-H (Singlets-2; Abbildung 1A Bedienfeld (iv)). Definieren Sie ein zusätzliches Singlets-3-Gatter, indem Sie Ereignisse mit proportionalem FSC-A und FSC-H auswählen (Abbildung 1A, Panel (v)). Identifizieren Sie schließlich lebende Zellen als diejenigen, die negativ für den fixierbaren Lebensfähigkeitsfarbstoff sind.
    2. MESF-Perlen
      1. Befolgen Sie die gleiche Unterscheidung zwischen Singuletts-1 und Singuletts-3 wie in Schritt 2.3.1.1 (Abbildung 1B, Panels (i) bis (v)). Identifizieren Sie jede der MESF-Populationen (leer, 1, 2, 3 und 4) basierend auf ihren Fluoreszenzintensitätsniveaus (siehe Abbildung 1B, Panel (vi)).
  4. Extrahieren Sie den MFI von MESF-Fraktionen leer und 1 bis 4.
  5. Generieren Sie korrigierte MFI-Werte (cMFI) für die MESF-Fraktionen 1 bis 4, indem Sie die MFIs der Leerperlenpopulation von jeder Fraktion subtrahieren.
  6. Berechnen Sie die Linie der besten Anpassung für die Beziehung zwischen cMFIs und den vom Hersteller bereitgestellten MESF-Werten (unabhängige Variable, wobei ein Bruchteil gleich Null ist).
  7. Extrahieren Sie die Steigung (b in der folgenden Gleichung) der linearen Regression von MESF über cMFI (Abbildung 1B Panel (viii) zeigt eine Regression, bei der y = a + bx; mit a = 0).
  8. Extrahieren Sie die mittleren (für bimodale Fluoreszenzverteilungen) oder mittleren (für normale oder logarithmische Fluoreszenzverteilungen) Fluoreszenzintensitäten aus den interessierenden Populationen (TFH- und B-Zellen in Abbildung 1A-Panel (vii)).
  9. Extrahieren Sie wie in den Schritten 2.5-2.7 die MFI-Werte aus isotypbeschrifteten Kontrollzellen.
  10. Wenn das F / P der Isotypkontrollen mit den Quantifizierungsantikörpern übereinstimmt, korrigieren Sie die MFIs der gefärbten Zellen, indem Sie die MFIs von isotypmarkierten Zellen subtrahieren.
  11. Wenn der F/P der Isotypen von denen der Quantifizierungsantikörper abweicht, extrahieren Sie den MESF aus den Isotypen, indem Sie die MFIs von isotypmarkierten Zellen mit der in Schritt 2.7 berechneten Steigung teilen. Subtrahieren Sie Isotype MESF von Quantifizierungs-MESF, bevor Sie gebundene Quantifizierungsantikörper schätzen.
  12. Teilen Sie den MESF durch den F/P der Quantifizierungsantikörper, um die Anzahl der gebundenen Moleküle pro Zelle abzuschätzen (Molec. Zelle , wie im Flussdiagramm von Abbildung 1C gezeigt).
  13. Teilen Sie die Anzahl der gebundenen Moleküle mit der geschätzten Zelloberfläche (CSA (μm2)), um die Dichte der Proteine als Molec./μm2 zu extrahieren (Abbildung 1C). Weitere Informationen finden Sie im Abschnitt zu den repräsentativen Ergebnissen.

3. Funktionelle Phospholipidspezies zur Verwendung bei der Kalibrierung von Proteinen, die BSLBs beschichten

  1. Verwenden Sie 0,4 mM DOPC (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin) als Hauptbestandteil der Lipidmatrix, die die unterstützte Lipiddoppelschicht bildet. Verdünnen Sie alle anderen Lipidspezies in dieser DOPC-Lösung.
  2. Verwendung zwischen 0,2 und 1 Mol-% 0,4 mM DOPE (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin), konjugiert an Farbstoffe, einschließlich ATTO 390, 488 oder 565 (siehe Materialtabelle), um BSLBs mit intrinsischer Fluoreszenz zu erzeugen.
    HINWEIS: Die intrinsische Fluoreszenz von BSLBs erleichtert die Identifizierung einzelner BSLBs und einzelner Zellen in synaptischen Transferexperimenten.
  3. Verwenden Sie 12,5 Mol%0,4 mM DGS-NTA(Ni) (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-Amino-1-carboxypentyl) iminodiakiestinsäure) succinyl]), um His-markierte Proteine zu verankern. Halten Sie den Mol-% von DGS-NTA(Ni) konstant und führen Sie 2-fache Titrationen der His-markierten Proteine durch, beginnend mit 100 nM als höchster Konzentration. Lassen Sie eine Bedingung ohne Protein als Negativkontrolle für absolute Quantifizierungen.
    HINWEIS: Zubehörsignale und Adhäsionsmoleküle wie ICAM-1 sind mit einem 12-His-Tag ausgestattet, um die Affinität des Proteins für DGS-NTA(Ni) zu erhöhen.
  4. Verwenden Sie Biotinyl Cap PE (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(cap biotinyl)) zur Verankerung biotinylierter Proteine über Biotin-Streptavidin-Biotin-Brücken. Verwenden Sie eine 5-fache serielle Titration von 0,4 mM Biotinyl Cap PE, die zwischen 10 mol% und 0 mol% abdeckt (als Negativkontrolle). Halten Sie die Konzentration von Streptavidin und biotinylierten Proteinen konstant (200 nM) sowohl in Kalibrierexperimenten als auch in der Rekonstitution synthetischer APCs für synaptische Transferexperimente.
    HINWEIS: Die Regressionsanalysen der empirischen Dichten biotinylierter Proteine über den letzten Mol-% von Biotinyl Cap PE in der Lipidmatrix (die auch DGS-NTA(Ni) zur Verankerung von His-markierten Proteinen enthält) definieren den Mol-%, der zur Rekonstitution von Zieldichten des Antigens verwendet werden soll.

4. Herstellung von ergänzter HEPES-gepufferter Kochsalzlösung mit 1% Serumalbumin

HINWEIS: Ergänzte HEPES-gepufferte Kochsalzlösung, die 1% humanes Serumalbumin (HBS/HSA) oder 1% Rinderserumalbumin (HBS/BSA) enthält, ist in den Wasch- und Proteinbeladungsschritten von BSLBs erforderlich (Tabelle 1). Bereiten Sie eine 10x HBS-Stammlösung und den Arbeitspuffer so frisch wie möglich vor; gekühlt aufbewahren und innerhalb eines Monats verwenden. Während BSA eine billigere Alternative zu HSA ist, bietet es eine effiziente Blockierung von Ni-chelatbildenden Lipiden13 und wird für Hochdurchsatzexperimente empfohlen.

  1. Bereiten Sie eine 10-fache Stammpufferlösung aus ergänztem HBS vor, die 200 mM HEPES, 7 mM Na2HPO4, 1400 mM NaCl, 50 mM KCl, 60 mM Glucose, 10 mM CaCl2 und 20 mM MgCl2 enthält.
    HINWEIS: Das Auflösen von MgCl2 ist stark exotherm und eine Verbrennungsgefahr. Fügen Sie dieses Salz langsam und auf eine große Menge Lösungsmittel hinzu. Vermeiden Sie die Herstellung konzentrierter Lösungen (d. h. 1 M) dieser Salze, da sie dazu neigen, im Laufe der Zeit auszufallen, was ihre präzise Zugabe zum Arbeitspuffer erschwert.
  2. Die 10-fache Lösung mit einer 0,22 μm Filtereinheit filtrieren und bei 4 °C steril halten.
  3. Nehmen Sie für 500 ml HBS / has 50 ml der ergänzten 10x HBS-Lösung, stellen Sie den pH-Wert bei Bedarf auf 7,4 ein und machen Sie das Volumen mit Reinstwasser auf 483,4 ml auf.
  4. 16,6 ml 30%ige HSA-Lösung zu den 483,4 ml HBS, pH 7,4, geben.
  5. Für 500 ml HBS/BSA 5 g BSA in HBS lösen und bei 37 °C für 30 min inkubieren. Mischen Sie dann vorsichtig bei RT, indem Sie die Flasche regelmäßig umkehren, bis keine sichtbaren Proteinkristalle oder Klumpen mehr vorhanden sind.
  6. Die resultierende Lösung aus Schritt 4.5 wird mit einer 0,22 μm Filtereinheit (siehe Materialtabelle) filtriert und bei 4 °C gelagert.

5. Kalibrierungen der Proteindichte auf BSLBs

  1. Bevor Sie die nicht funktionalisierten Silicaperlen mit einem Durchmesser von 5,00 ± 0,05 μm entnehmen, mischen Sie die Stammlösung gut und resuspen sie alle großen Perlenklumpen, die auf dem Boden der Kolben sedimentiert sind.
    HINWEIS: Silica-Perlen neigen dazu, schnell zu sedimentieren, was zu Zählfehlern führen kann. Mischen Sie kräftig, indem Sie die Hälfte des maximalen Volumens einer P1000-Mikropipette auf und ab pipettieren.
  2. Verdünnen Sie 1 μL Perlenlösung in 1.000 μL PBS, zählen Sie die Kügelchen mit einer Hämozytometerkammer und berechnen Sie ihre Konzentration pro ml.
    HINWEIS: Für die Visualisierung von Silica-Perlen ist keine Trypan-Blaufärbung erforderlich.
  3. Berechnen Sie das Volumen der Silica-Perlen, die für 5 × 105 endgültige BSLBs pro Punkt der Titration benötigt werden.
  4. Übertragen Sie das erforderliche Volumen an Kieselsäureperlen in ein steriles 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
  5. Waschen Sie die Silica-Perlen dreimal mit 1 ml sterilem PBS, zentrifugieren Sie die Perlen für 15 s auf einer Tischmikrozentrifuge bei RT (bei fester Drehzahl).
    HINWEIS: Vermeiden Sie beim Entfernen der Waschlösung eine Störung des Perlenpellets. Eine kleine Puffersäule hat keinen Einfluss auf die Ausbreitung der Liposomen, aus denen sich die Liposomen-Mastermischung zusammensetzt, da diese auch in PBS enthalten sind.
  6. Bereiten Sie drei Volumen der Liposomen-Mastermischung vor, um die BSLB auf den gewaschenen Silica-Perlen zusammenzusetzen (z. B. wenn das anfängliche Gesamtvolumen der Silica-Perlen 20 μL beträgt, bereiten Sie mindestens 60 μL der Liposomen-Mastermischung vor).
  7. Für Biotinyl Cap PE Mol%-Titrationen
    1. Bereiten Sie die Lipid-Master-Mischungen mit 5-fachen Verdünnungen von Biotinyl Cap PE vor.
      1. Verdünnen Sie die 0,4 mM Biotinyl Cap PE mol% in einer 100% DOPC Matrix.
      2. Mischen Sie jeden Biotinyl Cap PE Mol%-Titrationspunkt im Verhältnis 1:1 (vol:vol) mit einer Lösung von 0,4 mM 25% DGS-NTA(Ni), so dass in allen Titrationen abschließend 12,5 Mol-% Ni-haltige Lipide vorhanden sind.
        ANMERKUNG: Die 12,5 Mol-% (vol:vol%) Ni-haltigen Lipide stellen die gemischte Lipidzusammensetzung von BSLBs dar, an denen His-markierte Proteine auch in parallelen Kalibrierungen getestet werden können. Da beispielsweise alle Liposomensubstanzen in der gleichen molaren Konzentration hergestellt werden, mischen Sie einfach 100 μL 25 mol-haltiges DGS-NTA mit 100 μL 100 mol% Ni-haltigem DGS-NTA mit 100 μL 100 mol% DOPC.
    2. Übertragen Sie 5 × 105 gewaschenen Kieselsäureperlen auf 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, so dass pro Röhrchen ein Biotinyl Cap PE Mol%-Titrationspunkt zusammengesetzt wird.
    3. Fügen Sie die Biotinyl Cap PE mol% Titration Master Mischungen zu den gewaschenen Silica-Perlen hinzu und mischen Sie vorsichtig durch Pipettieren die Hälfte des Gesamtvolumens. Vermeiden Sie die Bildung von Blasen, die im Übermaß die Lipiddoppelschicht zerstören.
    4. Fügen Sie Argon -Gas (oder Stickstoff) auf das Röhrchen hinzu, das die sich jetzt bildenden BSLBs enthält, um die Luft zu verdrängen und die Lipide während des Mischens vor Oxidation zu schützen.
    5. Argon vor der Lagerung zu den 0,4 mM Lipidvorräten geben und mit einer sterilen Technik manipulieren.
      HINWEIS: Schließen Sie einen kleinen Schlauch an die Argon/Stickstoff-Gasflasche an. Stellen Sie vor dem Hinzufügen von Gas zu den Rohren den Gasflaschenregler so ein, dass der Druck nicht höher als 2 psi eingestellt ist. Schließen Sie eine sterile Pipettenspitze an den Auslassschlauch an, um den Gasstrom für 5 s in den Liposomenschaft zu leiten und den Deckel schnell zu schließen. Bei Lipidvorräten den Deckel des Röhrchens vor der Lagerung bei 4 °C mit Paraffinfolie verschließen.
    6. Bewegen Sie die BSLBs zu einem vertikalen Labormischer mit variablem Winkel (siehe Materialtabelle) und mischen Sie 30 Minuten bei RT mit einer Orbitalmischung von 10 U / min.
      HINWEIS: Dieser Schritt verhindert die Sedimentation von Kügelchen während der Bildung der gestützten Lipiddoppelschicht.
    7. Drehen Sie die Perlen durch Zentrifugieren für 15 s bei RT auf einer Tisch-Minizentrifuge und waschen Sie dann dreimal mit 1 ml HBS / HSA (BSA), um überschüssige Liposomen zu entfernen.
    8. Blockieren Sie die gebildeten BSLBs, indem Sie 1 ml 5% Casein oder 5% BSA mit 100 μM NiSO4 zur Sättigung von NTA-Stellen und 200 nM Streptavidin hinzufügen, um alle Biotin-Verankerungsstellen auf den BSLBs gleichmäßig zu beschichten. Mischen Sie vorsichtig, indem Sie die Hälfte des Gesamtvolumens nach oben und unten pipettieren und inkubieren Sie im vertikalen Mischer für nicht länger als 20 min bei RT und 10 U / min.
    9. Drehen Sie die BSLBs durch Zentrifugieren für 15 s bei RT auf einer Tisch-Minizentrifuge und waschen Sie dann dreimal mit 1 ml HBS / HSA (BSA) -Puffer.
      HINWEIS: Bewahren Sie gewaschene Perlen vertikal mit einem kleinen Volumen waschpuffer auf, der die BSLBs bedeckt. Vermeiden Sie die Austrocknung der BSLBs, da Luft die Lipiddoppelschicht zerstört.
  8. Zur Titration von His-markierten Proteinen auf 12,5 mol% DGS-(Ni) NTA-haltigen BSLBs
    1. Bereiten Sie drei Bände Liposomen-Master-Mix vor, die die letzten 12,5 Mol-% DGS-NTA(Ni) enthalten.
    2. Verwenden Sie die Liposomen-Mastermischung, um die gewaschenen Silica-Perlen wieder zu versenken und vorsichtig zu mischen, indem Sie die Hälfte des Gesamtvolumens nach oben und unten pipettieren. Vermeiden Sie die Bildung von Blasen, die im Übermaß die Lipiddoppelschicht schädigen.
    3. Fügen Sie Argon -Gas (oder Stickstoff) auf das Röhrchen hinzu, das die sich jetzt bildenden BSLBs enthält, um die Luft zu verdrängen und die Lipide während des Mischens vor Oxidation zu schützen.
    4. Argon vor der Lagerung zu den 0,4 mM Lipidvorräten geben und mit einer sterilen Technik manipulieren.
    5. Bewegen Sie die BSLBs zum vertikalen Mischer und mischen Sie für 30 min bei RT mit Orbitalmischung bei 10 U / min.
    6. Drehen Sie die Perlen durch Zentrifugieren für 15 s bei RT auf einer Tisch-Minizentrifuge und waschen Sie dann dreimal mit 1 ml HBS / HSA (BSA), um überschüssige Liposomen zu entfernen.
    7. Blockieren Sie die gebildeten BSLBs durch Zugabe von 1 ml 5% Casein (oder 5% BSA) mit 100 μM NiSO4 , um NTA-Stellen auf den BSLBs zu sättigen. Mischen Sie vorsichtig und inkubieren Sie im vertikalen Mischer für nicht länger als 20 min bei RT und 10 U / min.
    8. Dreimal mit HBS/HSA (BSA) waschen, um die überschüssige Blockierungslösung zu entfernen.
    9. In einer neuen U-Boden-96-Well-Platte 2-fache serielle Verdünnungen der Proteine herstellen.
      1. Bereiten Sie eine Ausgangskonzentration von 100 nM für das interessierende Protein in einem Gesamtvolumen von 200 μL HBS/HSA (BSA)-Puffer vor, verteilen Sie 100 μL dieser Lösung in der ersten Säule und die restlichen 100 μL auf Spalte Nr. 2, die 100 μL HBS/HSA (BSA)-Puffer enthalten.
      2. Fahren Sie fort, indem Sie 100 μL seriell von Spalte 2 in Spalte Nr. 3 übertragen und bei Bedarf wiederholen, um alle Titrationspunkte abzudecken. Belassen Sie die letzte Spalte der Reihe ohne Protein, da dies als leere Referenz für die Quantifizierung verwendet wird.
    10. Resuspendieren Sie die hergestellten BSLBs in einem Volumen, so dass 5 × 105 BSLB in 100 μL HBS/HSA (BSA) Puffer enthalten sind.
    11. Übertragen Sie 100 μL der BSLB-Suspension in Vertiefungen einer zweiten U-Bodenplatte mit 96 Wellen, so dass jede Vertiefung 5 × 105 BSLBs erhält.
    12. Drehen Sie die zweite Platte, die BSLBs enthält, für 2 min bei 300 × g und RT herunter und verwerfen Sie den Überstand.
    13. Übertragen Sie die 100 μL-Volumina von der Proteintitrationsplatte auf die Platte, die die sedimentierten BSLBs enthält. Mischen Sie vorsichtig, vermeiden Sie übermäßige Blasenbildung während des Pipettierens und inkubieren Sie 30 min bei RT und 1.000 U / min mit einem Plattenschüttler. Schützen Sie vor Licht mit Aluminiumfolie.
    14. Waschen Sie die Platte dreimal mit HBS/HSA (BSA) Puffer in Sedimentationsschritten von 300 × g für 2 min bei RT.
    15. Wenn das bei der Kalibrierung verwendete rekombinante Protein direkt mit Fluorochromen konjugiert ist und bekannte F/P-Werte aufweist, fahren Sie mit Schritt 5.8.20 fort.
    16. Wenn das bei der Kalibrierung verwendete rekombinante Protein nicht markiert oder mit Fluorochromen konjugiert ist oder kein MESF-Perlenstandard verfügbar ist, verwenden Sie Alexa Fluor 488 oder 647-konjugierte Antikörper mit bekannten F / P-Werten, um den proteinbeschichteten BSLB zu färben.
    17. Färbung mit sättigenden Konzentrationen von Quantifizierungsantikörpern.
      HINWEIS: Je nach Zielausdrucksniveau liegen diese zwischen 5 und 10 μg/ml.
    18. Färben Sie 30 min bei RT und 1.000 U / min mit einem Plattenschüttler. Schützen Sie vor Licht mit Aluminiumfolie.
    19. Zweimal mit HBS/HSA (BSA) Puffer und einmal mit PBS mit Sedimentationsschritten von 300 × g für 2 min bei RT waschen.
      HINWEIS: Verwenden Sie PBS, pH 7,4, um die gewaschenen BSLBs vor dem Erwerb wieder aufzunehmen. Verwenden Sie keine proteinhaltigen Puffer, da dies bei der automatischen Mischung von Proben mit Hochdurchsatz-Probenehmern zur Bildung von Blasen führt.
    20. Erfassen Sie die MESF-Standards, um sicherzustellen, dass die hellsten Peaks im linearen Erfassungsbereich für den Quantifizierungsdetektor (Kanal) verbleiben, wie in Abbildung 1B (vii) dargestellt.
    21. Erfassen Sie die Proben manuell oder mit HTS. Wenn Sie letzteres verwenden, resuspendieren Sie BSLBs in 100 μL PBS und erwerben 80 μL mit einer Durchflussrate zwischen 2,5 und 3,0 μL/s, einem Mischvolumen von 100 μL (oder 50% des Gesamtvolumens, wenn das Resuspensionsvolumen geringer ist), einer Mischgeschwindigkeit von 150 μL/s und fünf Mischungen, um sicherzustellen, dass BSLBs monodispersiert sind.
    22. Exportieren Sie die FCS-Dateien.
    23. Konzentrieren Sie sich auf einzelne Ereignisse für die Analysen (Abbildung 2A), da Dubletten oder Tripletts Fehler in der Bestimmung verursachen. Verwenden Sie die verschachtelte Identifizierung einzelner Ereignisse, wie in Protokollschritt 1.2.3 angegeben.
    24. Messen Sie den MFI jeder MESF-Fraktion (1-4) und subtrahieren Sie den MFI von Blindkügelchen, um korrigierte MFIs (cMFI) zu extrahieren.
    25. Führen Sie eine lineare Regressionsanalyse durch, um die Steigung (b) des MESF über dem für MESF-Standards berechneten cMFI zu extrahieren, der in Schritt 5.33 verwendet wird.
    26. Extrahieren Sie den MFI jedes Titrationspunkts und subtrahieren Sie den MFI von Kügelchen ohne Protein, um cMFIs zu erhalten.
    27. Teilen Sie die cMFIs mit der in Schritt 5.31 berechneten Steigung, um die an BSLBs gebundene MESF für jeden Titrationspunkt zu extrahieren.
    28. Teilen Sie meSF, das an BSLBs gebunden ist, durch den F / P-Wert des Quantifizierungsantikörpers, um die durchschnittliche Anzahl der pro BSLB gebundenen Moleküle zu extrahieren.
    29. Extrahieren Sie anhand des Durchmessers der BSLBs (5,00 ± 0,05 μm) die Perlenoberfläche (SA = 4pr2), um die Enddichten des Proteins (Molec./μm2) pro Titrationspunkt (Proteinkonzentration) zu berechnen.
    30. Führen Sie eine neue Regressionsanalyse der Proteinkonzentration über die Proteindichte durch , um die Steigung (b) der Linie der besten Anpassung zu berechnen.
      ANMERKUNG: Die Konzentration von 12,5 mol% DGS-NTA(Ni) verleiht eine maximale Verankerungskapazität von ca. 10.000 Molc./μm210, ohne die unspezifische Aktivierung von T-Zellen zu induzieren oder die laterale Beweglichkeit der SLBs zu beeinträchtigen.

6. Durchführung synaptischer Transferexperimente zwischen T-Zellen und BSLBs

  1. Vor dem Ausführen des synaptischen Transferexperiments
    1. Erwerben Sie nicht-fluoreszierende BSLBs, BSLBs mit fluoreszierenden Lipiden, ungefärbte Zellen (oder Kompensationsperlen; siehe Materialtabelle) und einfarbig gefärbte Zellen (oder Kompensationsperlen), um die Fluoreszenzspektrum-Wechselwirkungen des Instruments zu identifizieren. Konzentrieren Sie sich auf die Detektoren mit hoher Spillover-Ausbreitung, um das polychromatische Panel neu zu gestalten, die Empfindlichkeit zu erhöhen und den Messfehler bei kritischen Detektoren zu reduzieren (siehe 14).
    2. Titrieren Sie die Nachweisantikörper, um die optimale Konzentration zu finden, die den Nachweis positiver Ereignisse ermöglicht, ohne den Nachweis von Negativen zu beeinträchtigen.
      HINWEIS: Wiederholen Sie diesen Schritt, wenn sich die Antikörperchargen ändern, da die F / P-Werte und die Helligkeit von Charge zu Charge variieren.
    3. Optional: Optimieren Sie die PMT-Spannungen, indem Sie die Probe in verschiedenen Spannungsbereichen erfassen (d. h. eine Spannung geht), um die PMTs zu finden, die zu einem optimalen Signal über Rauschen führen (d. h. Trennung von Negativen und Positiven, während sichergestellt wird, dass das Signal der hellsten Population im linearen Bereich bleibt).
  2. Messung der T-Zell-Ausgangsübertragung auf BSLBs
    1. Zubereitung eines ergänzten RPMI 1640 (hierin R10-Medium), enthaltend 10 % hitzeinaktiviertes fötales Rinderserum (FBS), 100 μM nicht-essentielle Aminosäuren, 10 mM HEPES, 2 mM L-Glutamin, 1 mM Natriumpyruvat, 100 U/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin. Verwenden Sie R10-Medium, um T-Zellen zu kultivieren und zu erweitern.
    2. Isolieren Sie an Tag 1 T-Zellen aus peripheren Blut- oder Leukoreduktionssystemkammern (LRS). Verwenden Sie Immundichte-Zellisolations- und Separationskits (siehe Materialtabelle) zur Anreicherung von menschlichen CD4+ und CD8+ T-Zellen.
    3. Säen Sie die Zellen in einer Endkonzentration zwischen 1,5 und 2,0 × 106 Zellen / ml, wobei 6-Well-Platten mit nicht mehr als 5 ml Gesamtmenge pro Bohrung verwendet werden.
    4. Aktivieren Sie T-Zellen mit einem 1: 1-Verhältnis von menschlichen T-Zell-Aktivierung (Anti-CD3 / Anti-CD28) magnetischen Perlen (siehe Tabelle der Materialien) und fügen Sie 100 IE rekombinantes menschliches IL-2 hinzu, um die Zellproliferation und das Überleben zu unterstützen.
    5. Entfernen Sie am Tag 3 die aktivierenden Magnetperlen mit magnetischen Säulen (siehe Materialtabelle). Stellen Sie sicher, dass magnetische Perlen an den Seiten des Röhrchens befestigt bleiben, bevor Sie die Zellen für zusätzliche Waschschritte wiederherstellen.
    6. Waschen Sie die Magnetperlen noch einmal mit 5 ml frischem R10-Medium, mischen Sie sie gut und legen Sie sie wieder in den Magneten. Stellen Sie dieses Volumen wieder her und mischen Sie es mit den in Schritt 6.2.5 wiederhergestellten Zellen.
    7. Resuspendieren Sie die Zellen auf 1,5-2 × 106 Zellen / ml in frischem R10, das 100 U / ml IL-2 enthält. Füllen Sie das Medium nach 48 h auf und stellen Sie sicher, dass die letzte Zugabe von IL-2 48 h vor dem Tag des Experimentierens (Tage 7 bis 14 der Kultur) erfolgt.
    8. Bereiten Sie am Tag des synaptischen Transferexperiments das Synaptic Transfer Assay-Medium (siehe Tabelle 1) vor, indem Sie Phenol Red-freies RPMI 1640-Medium mit 10% FBS, 100 μM nicht-essentiellen Aminosäuren, 2 mM L-Glutamin, 1 mM Natriumpyruvat, 100 U/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin ergänzen. Rekombinantes humanes IL-2 darf nicht eingeschlossen werden.
    9. Zählen Sie Zellen entweder mit Trypanblaufärbung oder elektrischem Stromausschluss und resuspendieren Sie sie auf eine Endkonzentration von 2,5 × 106 Zellen / ml in Medium. Wenn ein übermäßiger Zelltod beobachtet wird (>10%), entfernen Sie tote/sterbende Zellen mit einer Mischung aus Polysaccharid und Natriumdiatrizoat (siehe Materialtabelle) wie folgt:
      1. Schicht 15 ml Zellkultur auf 13 ml der Polysaccharid-Natriumdiatrizoat-Lösung.
      2. Zentrifuge für 1.250 × g für 20 min bei RT mit minimaler Beschleunigung und Entbeschleunigung. Sammeln Sie die Zellschicht (Wolke) in der Grenzfläche zwischen dem Medium und der Polysaccharid-Natriumdiatrizoat-Lösung.
      3. Waschen Sie die Zellen mindestens zweimal mit einem vorgewärmten Synaptic Transfer Assay Medium (hergestellt in Schritt 6.2.7).
      4. Zählen und resuspenieren Sie die Zellen auf eine Endkonzentration von 2,5 × 106/ml unter Verwendung des Synaptic Transfer Assay-Mediums. Kokultur 100 μL dieser Zellsuspension mit BSLBs (siehe Schritt 6.2.15).
    10. Berechnen Sie die Anzahl der BSLBs, die für das Experiment benötigt werden. betrachten sie alle verschiedenen Protein-Master-Mischungen und Antigen-Titrationen, die getestet werden sollen (entweder biotinylierte HLA/MHC-Peptid-Monomere oder monobiotinylierte Anti-CD3ε Fab).
    11. Setzen Sie die BSLBs zusammen, indem Sie die gleichen Schritte wie in Protokollabschnitt 5 ausführen, aber kombinieren Sie diesmal alle Titrationen von Proteinen und Lipiden, die zur Rekonstitution einer komplexen APC-Membran erforderlich sind (Abbildung 3A). Halten Sie die gleichen vol:vol-Beziehungen zwischen dem anfänglichen Volumen der Silica-Perlen und dem Volumen der Proteinmischung, die während der Kalibrierungen verwendet wird, sowie Zeiten und Temperaturen, die bei der Beladung von BSLBs verwendet werden. Wenn beispielsweise 0,5 μL Kieselsäureperlen/Well und 100 μL/Well Proteinmischung für die anfängliche Kalibrierung verwendet wurden, halten Sie 5:1.000 vol:vol-Verhältnisse aufrecht, um die BSLBs für die Kokulturierung mit T-Zellen vorzubereiten.
    12. Sobald BSLBs mit der interessierenden Proteinmischung beladen wurden, waschen Sie die BSLBs zweimal mit HBS / HSA (BSA), um überschüssige ungebundene Proteine zu entfernen. Sedimentationsgeschwindigkeiten von 300 × g für 2 min bei RT in jedem Waschschritt verwenden und die Überstände entsorgen.
    13. Resuspendieren Sie die 5 × 105 BSLBs pro Vertiefung in 200 μL.
    14. Übertragen Sie 100 μL pro Bohrloch auf eine neue U-Bodenplatte mit 96 Well, um ein Duplikat herzustellen, so dass die endgültige Menge an BSLB pro Bohrloch 2,5 × 105 beträgt.
    15. Drehen Sie die BSLBs bei 300 × g für 2 min und RT herunter und verwerfen Sie den Überstand.
    16. Resuspendieren sie die BSLBs mit 100 μL T-Zell-Suspension; vorsichtig mischen, um die Bildung von Blasen zu verhindern.
    17. Inkubieren Sie die Kokulturen für 90 min bei 37 °C.
      HINWEIS: Alternativ können Zellen und Kügelchen in HBS/HSA (BSA)-Puffer anstelle von Phenol-Red-freiem RPMI für die Kokultur resuspendiert werden. In diesem Fall muss die Inkubation in einem Nicht-CO2-Inkubator durchgeführt werden, da dieses Gas den Puffer in Abwesenheit von Bicarbonat schnell ansäuert.
    18. Kühlen Sie die BSLB-T-Zellkokulturen ab, indem Sie die Zellen zuerst bei RT für mindestens 15 min inkubieren. Schützen Sie sie vor Licht.
    19. Zentrifugieren Sie die Zellen für 5 min bei 500 × g und RT; verwerfen Sie den Überstand.
    20. Resuspendieren Sie die Zellen in RT 2% BSA-PBS (Ca2+ und Mg2+-frei) zur Blockierung. Legen Sie die Zellen für 45 min auf Eis. Vor Licht schützen.
    21. Bereiten Sie während der Inkubation der Zellen den Antikörper-Master-Mix mit eiskaltem 0,22 μm-gefiltertem 2% BSA in PBS als Färbepuffer vor, der für eine zusätzliche Blockierung sorgt.
      HINWEIS: Einige Chargen von Antikörpern, die mit Brilliant Violet-Farbstoffen konjugiert sind, neigen dazu, unspezifisch an BSLBs zu binden. Das Blockieren mit 5% BSA-PBS hilft, dieses Rauschen zu reduzieren. Achten Sie von nun an darauf, die Kühlkette ununterbrochen zu halten.
    22. Die Kokulturen bei 500 × g für 5 min und 4 °C abdrehen. Bevor Sie die Überstände entsorgen, stellen Sie kurz sicher, dass das Pellet vorhanden ist, indem Sie den Boden der 96-Well-Platte mit einer Hintergrundbeleuchtung untersuchen.
    23. Resuspendieren Sie mit einer Mehrkanalpipette die Zellen in der Färbemastermischung mit optimierten Antikörperkonzentrationen.
      HINWEIS: Verwenden Sie Pipettenspitzen ohne Filter, um die Bildung von Blasen und Fehler bei der Verteilung der Färbevolumina zu vermeiden.
    24. Dazu gehören isotypmarkierte Zellen und BSLBs, fluoreszierende und nicht fluoreszierende BSLBs sowie zellen und BSLBs, die allein gefärbt wurden. Respektieren Sie die Gesamtzahl der Ereignisse pro Bohrloch für alle Kontrollen (d. h. nur BSLBs mit 5 × 105 BSLB/Well und nur Zellkontrollen mit 5 × 105 Zellen/Well, um einen relativen Anstieg der Antikörper pro gefärbtem Ereignis zu vermeiden).
    25. Mischen Sie vorsichtig, indem Sie die Hälfte des Volumens auf und ab pipettieren und 30 minuten auf Eis inkubieren. Vor Licht schützen.
    26. Waschen Sie die Zellen und BSLBs zweimal mit eiskaltem 2% BSA-PBS, pH 7,4 und Sedimentationsschritten von 500 × g für 5 min bei 4 °C. Resuspendieren Sie die gewaschenen Kokulturen in 100 μL PBS und erwerben Sie sofort.
    27. Wenn eine Fixierung erforderlich ist, fixieren Sie 10 Minuten lang mit 0,5% PFA in PBS, waschen Sie sie einmal und bewahren Sie sie bis zum Erwerb in PBS auf. Vor Licht schützen.
    28. Erwerben Sie vor der Kompensation MESF-Standards, um sicherzustellen, dass sowohl die dunkelsten als auch die klügsten Populationen in den linearen Messbereich fallen.
    29. Erwerben Sie Kompensationsproben, berechnen Sie die Vergütung und wenden Sie die Kompensationsmatrix (Link) auf das Experiment an.
    30. Erwerben und speichern Sie mindestens 2 × 104 MESF-Standards für jeden der Quantifizierungskanäle.
    31. Stellen Sie für die Erfassung mit Hochdurchsatz-Probenehmern die Geräteerfassung auf den Standard ein, stellen Sie die Probenerfassung auf 80 μL (oder 80 % des Gesamtvolumens), die Probendurchflussrate zwischen 2,0 und 3,0 μL/s, das Probenmischvolumen von 50 μL (oder 50 % des Gesamtvolumens, um Blasenbildung während des Mischens zu vermeiden), das Mischen der Proben von 150 μL/s und das Mischen pro Vertiefung zwischen 3 und 5.
    32. Erwerben Sie mindestens 1 × 104 einzelne BSLBs pro Probe (siehe Abbildung 3B Paneele (i)-(vi) für die Referenz-Gating-Strategie).
    33. Waschen Sie das Zytometer 5 Minuten lang mit einer Reinigungslösung, gefolgt von 5 Minuten Reinstwasser, bevor Sie das Gerät abschalten. Wenn Sie das HTS verwenden, folgen Sie den Optionen unter der Registerkarte HTS und der Option Reinigen .
    34. Exportieren Sie FCS-Dateien.

7. Messung des synaptischen Transfers von Partikeln auf BSLB

  1. Öffnen Sie die FCS-Testdateien. Wählen Sie die Population der Zellen und BSLBs basierend auf ihren seitlichen und vorwärts gerichteten Lichtstreubereichen (SSC-A versus FSC-A) aus, wie in Abbildung 3B (i) dargestellt.
  2. Wählen Sie die Ereignisse innerhalb des kontinuierlichen Erfassungsfensters aus (Abbildung 3B (ii)).
  3. Konzentrieren Sie sich auf die einzelnen Ereignisse beider Zellen und BSLB; Identifizierung einzelner Zellen zuerst basierend auf niedrigem W in den sequentiellen Gattern FSC-W/FSC-H (Singulette-1, Abbildung 3B Panel (iii)) und SSC-W/SSC-H (Singulette-2; Abbildung 3B Panel (iv)). Definieren Sie ein zusätzliches Singlets-3-Gatter, indem Sie Ereignisse mit proportionalem FSC-A und FSC-H auswählen (Abbildung 3B, Panel (v)).
  4. Extrahieren Sie den MFI der MESF-Fraktionen leer und 1 bis 4 und aus einzelnen Zellen und MESF für jede Experimentprobe.
  5. Generieren Sie korrigierte MFI-Werte (cMFI) für die MESF-Fraktionen 1 bis 4, indem Sie den MFI der Leerenperlenpopulation von jeder Fraktion subtrahieren.
  6. Generieren Sie cMFIs für einzelne BSLBs und Zellen (siehe Abbildung 3C panel (i)).
  7. Verwenden Sie das Signal von BSLB, das mit Isotyp-Kontrollantikörpern gefärbt wurde, um den MFI von BSLB zu korrigieren, der mit Antikörpern gegen die relevanten T-Zell-Marker gefärbt wurde. Verwenden Sie cMFI, um den normalisierten synaptischen Transferprozentsatz (NST%) zu berechnen, indem Sie die Gleichung in Abbildung 3C panel (ii) verwenden.
  8. Wenn Sie stattdessen an den Partikeln interessiert sind, die speziell als Reaktion auf die TCR-Triggerung übertragen werden, subtrahieren Sie das Signal von Null-BSLBs vom MFI agonistischer BSLBs. Verwenden Sie diese cMFI, um den TCR-gesteuerten NST% unter Verwendung der in Abbildung 3C ( ii) gezeigten Gleichung zu berechnen.
  9. Wenn Sie daran interessiert sind, die Gesamtzahl der Moleküle zu bestimmen , die als Partikelfracht über die T-Zell-BSLB-Schnittstelle übertragen werden, erwerben Sie MESF-Benchmark-Perlen mit den gleichen Instrumenteneinstellungen und derselben Erfassungssitzung für T-Zell-BSLB-Kokulturen.
  10. Analysieren Sie MESF-Perlenpopulationen und extrahieren Sie ihre cMFIs wie in den Protokollschritten 5.8.15 bis 5.8.17 angegeben. Berechnen Sie die Steigung der Linie der besten Eignung für die Regressionsanalyse von MESF über cMFI.
  11. Verwenden Sie die berechnete Steigung, um die Anzahl der auf BSLBs abgelagerten MESF zu extrahieren. Verwenden Sie cMFIs, die entweder mit Isotypkontrollen oder Null-BSLB als Leerproben berechnet wurden, um die Anzahl der MESF zu extrahieren, die speziell auf stimulierende BSLBs übertragen wurden.
  12. Berechnen Sie die Anzahl der Moleküle von Markern, die auf BSLBs übertragen werden, indem Sie die berechneten (durchschnittlichen) MESFs pro BSLB durch den F / P-Wert des Quantifizierungsantikörpers dividieren.

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Representative Results

FCM zur absoluten Proteinquantifizierung auf der Zelloberfläche
Die Rekonstitution von BSLBs, die physiologische Dichten von Liganden aufweisen, erfordert die Abschätzung der Gesamtproteindichten auf der modellierten Zelluntergruppe. Um BSLBs zu rekonstruieren, schließen Sie alle relevanten Liganden ein, von denen erwartet wird, dass sie eine Rolle in der Signalachse von Interesse spielen, neben Proteinen, die die Adhäsion und funktionelle Interaktion zwischen BSLB und Zellen unterstützen, wie ICAM-1 und kostimulatorische Moleküle, z. B. CD40-, CD58- und B7-Rezeptoren (CD80 und CD86). Je nach Fragestellung können zusätzliche Proteine hinzugefügt werden, darunter kostimulatorische Moleküle wie ICOSL3, PD-L1 und PD-L215. Rekonstituieren Sie für alle anderen Moleküle BSLBs unter Verwendung molekularer Dichten, die durch direkte Analyse von Zellen mit quantitativer Durchflusszytometrie bestimmt werden. Für direkt konjugierte Antikörper liefert BioLegend F/P-Werte für jede Antikörper-Chargennummer. Antikörper können auch intern markiert und die F / P-Verhältnisse durch Spektrophotometrie bestimmt werden, was eine Alternative darstellt, wenn keine kommerziellen Antikörper an das gewünschte Fluorochrom konjugiert sind. Da wir die gleiche Antikörper verwenden, um die Anzahl der rekombinanten Proteine auf der Oberfläche von Zellen und BSLBs zu kalibrieren, besteht keine Notwendigkeit, die Antikörperbindungsvalenz zu korrigieren, da diese konstant bleibt. Wenn die Antikörper-bindende Valenz erforderlich ist, verwenden Sie sowohl rekombinante Proteine als auch Antikörper mit bekanntem F / P, um BSLBs zu dekorieren, und vergleichen Sie Moleküle von beladenen rekombinanten Proteinen mit der Anzahl der gebundenen Antikörper nach der Färbung unter Sättigungsbedingungen.

Die gebundenen Antikörpermoleküle pro Zelle können mit einer speziellen monochromatischen durchflusszytometrischen Messung oder einem polychromatischen Antikörperpanel geschätzt werden, um absolute Proteindichten auf einer relativ seltenen Untergruppe von Zellen innerhalb eines Gewebes von Interesse, wie z. B. Gaumenmandeln, zu schätzen. Abbildung 1 zeigt repräsentative Messungen der Dichten von ICAM-1 in CXCR5+ B-Zellen und follikulären T-Zellen (TFH) als Beispiel. Das gleiche Färbeprotokoll und die gleichen Durchflusszytometrie-Analyseprinzipien, die in Abbildung 1A gezeigt sind, können verwendet werden, um Proteindichten auf Epithelzellen, Stromazellen, Monozyten, aus Monozyten gewonnenen dendritischen Zellen (moDCs) oder auf B- und T-Lymphozyten in anderen menschlichen und Mausgeweben zu messen. Bei Geweben, die sich von Blut und Mandeln unterscheiden, ist bei der Isolierung von Zellen mit Proteasecocktails Vorsicht geboten, da die längere Exposition der Zellen gegenüber verdauenden Enzymen die Zelloberflächenexpression reduziert.

Konzentrieren Sie die Erfassung und Die Analysen auf einzelne, lebende Zellen innerhalb des kontinuierlichen Erfassungsfensters (Abbildung 1A ii), da Ereignisse außerhalb des Zeitkontinuums das Licht aberrant streuen und die Quantifizierung beeinträchtigen. Um die Genauigkeit der Bestimmungen zu erhöhen, reduzieren Sie die unspezifische Färbung von APCs durch effiziente Blockierung von FcγRs. Das in hFCB enthaltene humane Serum und EDTA ermöglichen eine effiziente FcγR-Blockierung bei gleichzeitiger Chelatbildung von freiem Ca2+ , um die spontane Aggregation von Zellen während ihrer Manipulation und Färbung zu reduzieren (schwarze Pfeile in Abbildung 1A (iii) und (iv) zeigen verbleibende Dubletten in Suspensionen von Tonsillarzellen).

Die Überwachung der Geräteleistung durch die Verwendung der Setup- und Tracking-Perlen und der Software (oder ähnliches; siehe Materialtabelle) ist entscheidend für die Reproduzierbarkeit von Quantifizierungen im Laufe der Zeit, insbesondere in späteren Schritten, wenn der synaptische Transfer von Partikeln zu BSLB nur mit MFIs gemessen wird (d. H. Für Fluorochrome, für die es keine MESF-Standards gibt). Überprüfen Sie in ähnlicher Weise den linearen Bereich (d. h. Linearitätsminimum und Linearitätsmaximum) beliebiger Fluoreszenzeinheiten für den Quantifizierungsdetektor, der neben den MESF-Standards verwendet werden soll, so dass jeder Kalibrierpunkt die lineare Beziehung zwischen Fluoreszenz und der Anzahl der Fluorochrome beibehält.

Die Vorbereitung von Proben, die für die Fluoreszenz "leer" sind, oder Proben, die eine Vorstellung vom Hintergrundfärbungsrauschen vermitteln, sind unerlässlich, um das unspezifische Fluoreszenzsignal zu subtrahieren. Isotypkontrollen und/oder biologisch Nullproben (z. B. Knockouts) sind unerlässlich, um das Hintergrundsignal von Zellen zu korrigieren und das wahre Signal aus den Quantifizierungsantikörpern zu extrahieren (Abbildung 1A Panel (viii)). In ähnlicher Weise verwenden Standard-MESF-Perlen eine dedizierte Blindpopulation, um das Hintergrundsignal von jeder wirklich positiven Perlenpopulation zu subtrahieren (Abbildung 1B-Panels (vii) und (viii)). Sobald die Regressionsanalysen durchgeführt und die Steigung, die die Beziehung zwischen MESF und korrigierten MFIs definiert, extrahiert wurde, folgt die Umrechnung in absolute Moleküldichten einfachen mathematischen Operationen (Abbildung 1C).

Um CSA in Abbildung 1C zu schätzen, wurde der elektrische Stromausschluss (CASY-TT) verwendet, um Messungen des Zellvolumens und -durchmessers aus Tausenden von Zellen zu extrahieren. Die resultierende CSA, die aus der Berechnung der Oberfläche für Kugeln (4pr2) geschätzt wird, variiert mit dem Aktivierungszustand der Zellen, mit beobachteten Werten von 170,37 ± 4,91 μm2 für nicht aktivierte B-Zellen und 234,52 ± 1,53 μm2 bzw. 318 ± 24,45 μm2 für nicht aktivierte und aktivierte T-Zellen. Diese CSAs sind vergleichbar mit denen, die durch bildgebende Verfahren wie die dreidimensionale Refraktivindextomographie von nicht aktivierten Lymphozyten geschätzt werden16.

Sobald der Bereich der physiologischen Dichten definiert wurde (z. B. durch den Vergleich von Oberflächendichten auf Zellen, die verschiedene Aktivierungsprogramme durchlaufen), können BSLBs verwendet werden, um diese Oberflächen zu modellieren. Eine Titration von biotinylierten antigenen HLA-Peptid-Monomeren, die von der NIH-Tetrameranlage bereitgestellt werden (oder monobiotinyliertes monomeres Anti-CD3ε-Fab), kann zusammen mit ICAM-1 12-His verwendet werden, um eine kanonische APC-Membran zu rekonstituieren. Kommerzielle Proteine, die mit 6, 9, 12 und 14 His markiert sind, können verwendet werden, um die Oberfläche von BSLB zu dekorieren (siehe Abbildung 2A für Beispiele mit ICAM-1 12-His). Proteintitrationen zusammen mit quantitativen FCM-Analysen bieten eine robuste Methodik, um physiologische APC-Oberflächen zu rekonstituieren und ihre Wirkung auf den synaptischen Output verschiedener T-Zell-Untergruppen zu testen.

Um die Ausgabe von T-Zell-Synapsen zu untersuchen, verwenden Sie ein BSLB-zu-T-Zell-Verhältnis von 1: 1, um sicherzustellen, dass im Durchschnitt eine Zelle im untersuchten Zeitraum mit einem BSLB interagiert. Wir haben beobachtet, dass der Materialtransfer proportional zur Inkubationszeit ist und eine vielseitige Plattform für den Nachweis von Molekülen bietet, die in geringen Mengen über die Cell:BSLB-Schnittstelle übertragen werden. Ein geeignetes Panel-Design ist daher entscheidend für die Erhöhung der Empfindlichkeit und Zuverlässigkeit des Nachweises von transsynaptischem Material, da im Falle von tSVs die Leistung zwischen 25 und 36 Vesikeln/Zelle/20 min2,3 variiert. Testen Sie zuerst das spektrale Spillover jedes Fluorochrom-markierten Antikörpers und Lipids. Wenn ein hohes Spillover beobachtet wird, empfehlen wir die Titration von färbenden Antikörpern und den Prozentsatz der fluoreszierenden Lipide, aus denen sich der BSLB zusammensetzt, sowie PMT-Spannungswanderungen, um den Ausbreitungsfehler bei kompensierten Proben zu reduzieren und das Signal-Rausch-Verhältnis zu verbessern (siehe 12,14,17 für eine spezielle Einführung in das Thema).

Die Verwendung von Quantifizierungskontrollen, einschließlich Null-BSLBs (fehlendes Antigen oder Anti-CD3-Fab) und entweder Knockout-Zellen oder isotypmarkierte Proben18, ist unerlässlich, um den Transfer von Effektor-tSV, wie SEs, sowie supramolekulare Angriffspartikel, die innerhalb des synaptischen Spalts freigesetzt werden, genau zu messen. Verwenden Sie sehr häufig vorkommende Zelloberflächenproteine wie CD4, CD2 oder CD45 neben synthetischen fluoreszierenden Lipiden (DOPE Atto-Konjugate), um die Population einzelner Zellen und BSLB bei kalter Dissoziation von Konjugaten zu identifizieren. Konzentrieren Sie die Analysen auf das geometrische Mittel oder den Median der Fluoreszenzintensitäten in einzelnen BSLB und Zellen (CD4 wird in Abbildung 3B verwendet). SEs sind eine spezialisierte Art von tSV, die von der Plasmamembran (PM) abgeleitet ist, und ihre Übertragung auf BSLB wird durch die Verstärkung des Markersignals auf BSLBs mit dem konsistenten Signalverlust auf der Oberfläche der interagierenden Zellen nachgewiesen (siehe TCR auf BSLBs, wie in Abbildung 2B gezeigt, violette Pfeile). Null-BSLBs, denen entweder Antigen oder Anti-CD3 fehlt, sind eine ausgezeichnete Referenz, um die spezifische Verstärkung von TCR (und anderen T-Zell-Markern) auf BSLB zu verfolgen, die sich aus der Stimulation interagierender Zellen über ihren TCR-Komplex ergibt.

Figure 1
Abbildung 1: Absolute Quantifizierung von Proteinen auf der Oberfläche von APCs. (A) Beispiel für quantitative durchflusszytometrische Messungen von ICAM-1 auf der Oberfläche von Tonsillar-B-Zellen (Foll. Bc) und Helfer-T-Zellen (TFH). (i-vii) Gating-Strategie zur Analyse einzelner CXCR5+ Bc und TFH, isoliert aus menschlichen Gaumenmandeln. Gezeigt wird die sequenzielle Gating-Strategie zur Identifizierung einzelner Live-Ereignisse, die innerhalb des kontinuierlichen Erfassungsfensters enthalten sind. (iii-iv) schwarze Pfeile zeigen Dubletten an. (viii) überlagerte Histogramme, die die Zelloberflächenexpression von ICAM-1 (türkisfarbene Histogramme) im Vergleich zu FMO-Kontrollen (graue Histogramme) und FMO-Kontrollen zeigen, die mit relevanten Isotypen (schwarze Histogramme, die sich mit den grauen Histogrammen überschneiden) der unter Ziffer vii gezeigten Populationen kennzeichnen. Pfeile zeigen die Richtung für die verschachtelte Gating-Strategie an, die zur Identifizierung von CXCR5+ B-Zellen (Bc; CD19+) und TFH (CD4+). (B) Die Extraktion absoluter Moleküle auf der Oberfläche von Tonsillarzellen aus MFI erfordert Regressionsanalysen von MESF-Benchmark-Kügelchen, die mit der gleichen Instrumenteneinstellung wie die in A gezeigten Zellen erworben wurden. (i-v) Gezeigt wird die sequenzielle Gating-Strategie zur Identifizierung einzelner Live-Ereignisse, die innerhalb des kontinuierlichen Erfassungsfensters enthalten sind. (vi) Gating und Messung von MFIs aus verschiedenen Standard-MESF-Populationen. (vii) gezeigt sind überlagerte Histogramme der unter Ziffer vi identifizierten MESF-Populationen. Die oben rechts angezeigten Werte stellen die MFIs für jede der 5 MESF-Populationen dar (leer, 1, 2, 3 und 4). (viii) Lineare Regression von MESF über cMFI für die unter (vii) dargestellten MESF-Populationen. Dargestellt ist die Steigung (b) für die Extraktion von MESF, die an Zellen gebunden sind, aus Daten in A. (C) Befolgen Sie bei der Extraktion der Anzahl der Moleküle einfache mathematische Operationen, beginnend mit der Anwendung der in (viii) berechneten Steigung aus gemessenen MESF cMFI (cMFIM) und Referenz-MESF-Werten (MESFR). Um die an Zellen gebundenen MESF (MESFcells) zu extrahieren, teilen Sie den korrigierten MFI der Zellen (cMFIcells) durch die berechnete Steigung. Um dann die Anzahl der an Zellen gebundenen Moleküle zu berechnen (Molec. B. Zellen), teilen MESFcells durch den F/P des Nachweis-(Quantifizierungs-)Antikörpers. Schließlich, um die molekulare Dichte auf der Oberfläche von Zellen (Dcells) zu berechnen, teilen Sie Molec. Zellen nach der geschätzten Zelloberfläche (CSAE). Abkürzungen: X = unabhängige Variable; Y = abhängige Variable (gemessene Fluoreszenz), cMFIM = gemessene korrigierte MFI; MESFR = Referenz-MESF-Werte; MESFcells = geschätzter MESF pro Zelle; cMFIcells = korrigierte MFI-Zellen; Molec. Zellen = geschätzte Moleküle pro Zelle. Dcells = geschätzte Dichte auf Zellen; CSAE = geschätzte Zelloberfläche. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Rekonstitution von BSLB mit rekombinantem ICAM-1 und Messung des partikelförmigen Transfers auf BSLBs. (A, i-vi) Durchflusszytometrische Analyse von BSLBs rekonstituiert mit erhöhten Dichten rekombinanter monomerer ICAM-1 12-His (rICAM-1). (i-v) Wie in Abbildung 1, konzentrieren Sie die Gating-Strategie auf einzelne BSLBs innerhalb des kontinuierlichen Erfassungsfensters. Beachten Sie den Spalt unmittelbar vor dem Zeitkontinuumstor, der ausgeschlossen wurde, um Messfehler zu vermeiden. (vi) Eine gute Proteinqualität führt häufig zu einer homogenen Beschichtung von BSLB in hohen Konzentrationen, wobei enge Fluoreszenzverteilungen beobachtet werden (niedriger Variationskoeffizient, siehe Histogramme in vi). (B) Regressionsanalysen der ICAM-1-Referenzkonzentration (CR) über der gemessenen Dichte (DM). Verwenden Sie die Steigung, um die Zielkonzentrationen von Protein (CT) zu berechnen, um die Dichte von Zellen (Dcells) zu erreichen, die in den Experimenten in Abbildung 1 gemessen wurde. Abkürzungen: 12-His = 12-Histidin-Tag; DM = gemessene molekulare Dichten; CR = Referenzkonzentrationen des rICAM-1; CT = Zielkonzentration (zu interpolieren); Dcells = dichte gemessene Dichten in Zellen (siehe auch Abb. 1C). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Messung von synaptischen T-Zell-Partikeln, die auf BSLBs übertragen werden. (A; i-v) Flussdiagramm, das die kritischen Schritte für die Kokulturierung von T-Zellen mit BSLBs zur Rekonstitution von Modellmembranen und die anschließende Messung des Partikeltransfers mit Durchflusszytometrie zeigt. (iv) Blaue und dunkelgelbe Diagramme zeigen die relative Verteilung und Position von Zellen und BSLBs in biparametrischen Durchflusszytometrie-Diagrammen. (v) Fluoreszenzverteilungshistogramme, die den relativen Fluoreszenzgewinn agonistischer BSLBs (dunkelgelb) im Vergleich zu Null-BSLBs (grau) anzeigen. (B) Beispielhaftes synaptisches Transferexperiment. i-vi) Gezeigt wird die Gating-Strategie zur Identifizierung einzelner BSLBs und Zellen innerhalb des kontinuierlichen Erfassungsfensters. Violette Pfeile zeigen die Richtung der Analyse an, die sich in C fortsetzt. (C) (i) Konzentrieren Sie die Analysen auf den MFI einzelner Zellen (blau) und einzelner BSLBs (gelb). (ii) Gleichungen zur Berechnung des normalisierten synaptischen Transfers (NST%, oben) und Tmax% (unten) aus dem cMFI, berechnet für BSLB und Zellen. iii-vi) Überlagerte Histogramme, die die Änderung der Fluoreszenzintensitätsverteilungen für Zellen (Blautöne) und BSLBs (Gelbtöne) über verschiedene Dichten der T-Zell-aktivierenden Anti-CD3ε-Fab zeigen, einschließlich nicht aktivierender (grau) und aktivierender Mit entweder 250 (weicher Farbwert) oder 1.000 (hoher Farbwert) Molec./μm2. Zahlen in verschiedenen Farbwerten stellen den NST% dar, der für die gelb dargestellten BSLB-Histogramme gemessen wurde. Die überlagerten Histogramme zeigen die übergeordnete Hierarchie im synaptischen Transfer von T-Zell-Vesikeln, die für verschiedene Marker positiv sind. Für diese Zusammensetzung von BSLBs (200 Molec./μm2 ICAM-1 und zunehmende Dichten von Anti-CD3ε-Fab) werden tSVs mit TCR+(iii) > CD81+(iv) > CD4+(v) > CD28+(vi) auf BSLB übertragen. Wie in früheren Artikeln gezeigt, sind TCR und CD81 Bestandteile von SE und werden mit vergleichsweise höheren Wirkungsgraden auf CD4 übertragen, obwohl letzteres auf vergleichsweise höheren Oberflächenebenen ausgedrückt wird. SE-Abwurf führt zum Verlust der Zelloberfläche CD81 und TCR und zum Gewinn dieser Signale auf BSLBs (offene violette Pfeile für 250 Molec./μm2 und geschlossene violette Pfeile für 1.000 Molec./μm2 in gelben Histogrammen). (D) Eine unsachgemäße Abkühlung von Konjugaten führt dazu, dass Zellen den SLB aus Kieselsäurekügelchen abreißen, wie aus dem Vergleich von Eingangsperlen (linkes biparametrisches Diagramm) und Konjugaten hervorgeht, die einer schnellen Abkühlung von 37 °C auf 4 °C ausgesetzt sind (rechtes biparametrisches Diagramm). Vergleichen Sie auch mit Abbildung 3B Panel (vi). Abkürzungen: PRF1 = Perforin 1; NST% = normalisierter synaptischer Transfer; Tmax% = Prozentsatz der maximal beobachteten Übertragung (im Kontroll- oder Referenzzustand); tSVs: transsynaptische Vesikel; SEs: synaptische Ektosomen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Tabelle 1: In diesem Protokoll verwendete Puffer. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

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Discussion

BSLBs sind vielseitige Werkzeuge zur Untersuchung der Partikelabgabe von T-Zellen, die mit Modell-APC-Membranen stimuliert werden. Die Flexibilität der Methode ermöglicht die Rekonstitution komplexer und reduktionistischer Membranzusammensetzungen, um die Auswirkungen von Liganden und deren Signalen auf die Sekretion von tSVs und supramolekularen Angriffspartikeln und deren Komponenten zu untersuchen. Wir haben diese Technologie an verschiedenen T-Zellen getestet, darunter voraktivierte TH, CTL, Tregs und CART15. Dieses Protokoll funktioniert auch für die Messung der synaptischen Partikelfreisetzung von frisch isolierten und ruhenden T-Zellen. Eine Einschränkung der Verwendung von frisch isolierten T-Zellen besteht darin, dass diese ruhenden Populationen ein anderes Profil transsynaptischer Partikel erzeugen, das mit ihrer Zelloberflächenzusammensetzung korreliert (siehe 15 für weitere Details).

Als einfaches Durchflusszytometrie-Panel empfehlen wir die Verwendung von Anti-TCR-Klon IP26, Anti-CD81-Klon 5A6, Anti-Perforin (PRF1) Klon B-D48 oder Anti-CD40L Klon 24-31 und ATTO 390 oder ATTO 565-haltigen Lipiden (um BSLBs eine intrinsische Fluoreszenz zu verleihen). Um einzelne Zellen von einzelnen BSLBs und Konjugaten zu unterscheiden, empfehlen wir die Verwendung von Anti-CD4-Klon OKT4 und/oder Anti-CD45-Klon HI30, die in begrenzten Mengen auf BSLBs übertragen werden, obwohl sie in sehr hohen Konzentrationen an der Zelloberfläche exprimiert werden (siehe Materialtabelle für weitere Details zu Fluorochromen und anderen validierten Antikörpern). Panels mit einer höheren Anzahl von Fluorochromen können entworfen werden, erfordern jedoch eine systematische Bewertung des Fluoreszenzspektrums jedes analysierten Fluorochroms. Um die Empfindlichkeit zu erhöhen, versuchen Sie verschiedene Titrationen von Quantifizierungsantikörpern im Bereich von 0,5 μg bis 20 μg / ml end, und wiederholen Sie sie, wenn neue Antikörpervorräte verwendet werden. Um die Reproduzierbarkeit der absoluten und relativen Messungen des Partikeltransfers zu gewährleisten, titrieren und berechnen Sie die Bindungskapazität jeder neuen Charge biotinylierter und Ni-haltiger Phospholipide, da sie sich von Charge zu Charge erheblich unterscheiden können. Die allmähliche Abkühlung von T-Zell-BSLB-Konjugaten ist entscheidend für die Erhöhung der Empfindlichkeit der Detektion von Partikeln mit geringer Häufigkeit. Die schnelle Abkühlung von Kokulturen führt zur Zerstörung von BSLBs, wie der signifikante Verlust der Lipidfluoreszenz belegt (Abbildung 3D).

Unterschiedliche Metriken können verwendet werden, um den Partikelausstoß von T-Zell-Immunsynapsen abhängig von der vorliegenden experimentellen Fragestellung zu messen. Wenn beispielsweise geringfügige Unterschiede in den Baseline-Expressionsniveaus von Oberflächenproteinen erwartet werden, die in angehende SE sortiert sind, kann eine normalisierte synaptische Transfermetrik (NST%) verwendet werden (Abbildung 3C-Panel (ii) obere Gleichung). Letzteres quantifiziert das prozentuale MFI-Signal auf BSLBs als Funktion des gesamten, kombinierten MFI von Zellen und Kügelchen. Ein Vorbehalt aus diesem Ansatz ist die Analyse von übertragenen Markern, die nicht auf dem PM exprimiert werden, wie z.B. Komponenten supramolekularer Angriffspartikel19. Da diese Elemente BSLBs über vom PM-Transit unabhängige Wege erreichen, wie z. B. die exozytose des intrazellulären Speichers, wird die Berechnung von NST% nicht empfohlen, da das Ergebnis aufgebläht wird, da der Zähler durch einen vergleichsweise kleinen Nenner (Zelloberflächenexpressionsniveau) geteilt wird. Verwenden Sie stattdessen korrigierte MFIs, um die Ablagerung von Perforin und Granzymen zwischen Null-BSLBs und BSLBs zu vergleichen, die eine zunehmende Dichte von Antigen oder Anti-CD3-Fab aufweisen. Alternativ, um intrazelluläre Elemente zu verfolgen, die auf BSLBs übertragen werden, verwenden Sie zum Vergleich entweder die geschätzten übertragenen absoluten Moleküle oder den Prozentsatz des Signals in Bezug auf das maximale Signal, das an BSLBs übertragen wird (Tmax%) (Abbildung 3C-Panel (ii) untere Gleichung). Verwenden Sie für Tmax% entweder cMFI oder Moleküle, die an der BSLB-Probe (oder -Bedingung) gemessen wurden und die höchste Antigendichte als Referenz-Tmax aufweisen. Verwenden Sie bei der Analyse verschiedener Spender die spenderspezifische Tmax für Vergleiche. Bei der Untersuchung des Materials, das als Reaktion auf die spezifische Triggerung des TCR übertragen wurde, können MFIs auch auf das Niveau des Hintergrundtransfers korrigiert werden, der bei Antigen-negativen (Null-) BSLBs beobachtet wurde.

Die Schätzung der absoluten Anzahl von Molekülen, die auf BSLBs übertragen werden, ist eine robustere Methode, da dies eine MESF-Kalibrierung mit der Messung von Molekülen als Endpunkt und einen besseren Vergleich unabhängiger Experimente beinhaltet. Tmax% bietet eine ähnliche Normalisierung über unabhängige Experimente hinweg und ist besonders nützlich bei der Verwendung von polychromatischem FCM für intrazelluläre Marker wie Perforin und Granzyme oder für Marker, für die kein MESF-Standard verfügbar ist. Tmax% ist einfach der Prozentsatz des Signals in einem bestimmten Zustand zu dem Zustand mit der höchsten Übertragung in der Kontrollbedingung (z. B. Vehikel-/unbehandelte Kontrollen für Arzneimittelstudien, Kontrollleitfaden-RNAs für CRISPR/Cas9-Bibliotheken). Darüber hinaus kann Tmax% sowohl für cMFIs als auch für eine absolute Anzahl von Molekülen verwendet werden und war besonders nützlich für den direkten Vergleich der Auswirkungen von Gendeletionen auf die synaptische Ausgabe von T-Zellen. Letzteres zeigt sich, wenn gen-editing zu einer hohen Variabilität im dynamischen Bereich der Immunrezeptorexpression bei unabhängigen Spendern und Experimenten führt, was sich auf absolute und NST%-Messungen auswirken könnte.

BSLBs haben die Erfassung und Charakterisierung des synaptischen Outputs verschiedener T-Zelltypen erleichtert, die aufgrund ihrer schnellen Internalisierung durch APCs sonst schwer zu isolieren sind2. Die physikalische Stabilität von BSLBs bietet auch eine Plattform für die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung von BSLBs, die von T-Zellen untersucht wurden, und ermöglicht so die biochemische Charakterisierung hochreiner Partikelpräparationen durch Massenspektrometrie und Nukleinsäuresequenzierungstechnologien. Letzteres ermöglicht die detaillierte Charakterisierung interzellulärer Botenstoffe, die von T-Zellen unter einer Vielzahl von experimentellen Bedingungen abgegeben werden. Verschiedene Fragen können angesprochen werden, einschließlich der Frage, wie sich diese partikulären Botenstoffe zwischen verschiedenen T-Zelltypen und Aktivierungszuständen verändern, wie kanonische und nichtkanonische Antigenrezeptoren (d.h. chimäre Antigenrezeptoren) und wie agonistische und antagonistische Membransignale die Partikelzusammensetzung beeinflussen. Derzeit entwickeln wir diese Technologie für die quantitative Charakterisierung von Zytokinen, die an der Immunsynapse stimulierter T-Zellen sezerniert werden, weiter. Letzteres erfordert die sorgfältige Untersuchung von Kombinationen rekombinanter Zytokinrezeptoren und Antikörper, die eine effiziente Erfassung von Interleukinen, Interferonen und Chemokinen ermöglichen, die nach der T-Zell-Aktivierung auf BSLBs abgelagert wurden. BSLBs können angepasst werden, um die Oberflächenzusammensetzung anderer APCs zu modellieren, bei denen der Verdacht besteht, dass sie die tSV-Freisetzung durch T-Zellen auslösen, wie z. B. stromale und angeborene Immunzellen. BSLBs können auch angepasst werden, um neue pharmakologische Verbindungen zu screenen, die die positive und negative Modulation der exozytären und tSV-Sekretionsmaschinerie zur Behandlung von Krebs und anderen Pathologien anstreben. Schließlich können BSLBs auch verwendet werden, um Virulenzdeterminanten zu entdecken, die die T-Zell-Funktion bei Infektionskrankheiten modulieren20.

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Disclosures

Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt zu erklären.

Acknowledgments

Wir danken unseren Labormitgliedern und der Gemeinschaft des Kennedy Institute of Rheumatology für konstruktive wissenschaftliche Diskussionen, insbesondere unserem Durchflusszytometrie-Facility-Manager Jonathan Webber. Diese Arbeit wurde durch das Wellcome Trust Principal Research Fellowship 100262Z/12/Z, den ERC Advanced Grant (SYNECT AdG 670930) und den Kennedy Trust for Rheumatology Research (KTRR) (alle drei an MLD) finanziert. PFCD wurde durch embo Long-Term Fellowship (ALTF 1420-2015, in Zusammenarbeit mit der Europäischen Kommission (LTFCOFUND2013, GA-2013-609409) und Marie Sklodowska-Curie Actions) und ein Oxford-Bristol Myers Squibb Fellowship unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl] (nickel salt) Avanti Polar Lipids 790404C-25mg 18:1 DGS-NTA(Ni) in chloroform

PIPETMAN L Multichannel P8x200L, 20-200 µL		 Gilson FA10011
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Avanti Polar Lipids 850375C-25mg  18:1 (Δ9-Cis) PC (DOPC) in chloroform
1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) ATTO 390 ATTO-TEC AD 390-165 DOPE ATTO 390
1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) ATTO 488 ATTO-TEC AD 488-165 DOPE ATTO 488
1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) ATTO 565 ATTO-TEC AD 565-165 DOPE ATTO 565
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(cap biotinyl) (sodium salt) Avanti Polar Lipids 870273C-25mg 18:1 Biotinyl Cap PE in chloroform
200 µL yellow tips 10 x 96 Tips, Stack Starlab S1111-0206
5 mL polystyrene round-bottom tubes Falcon® 352052
5.00 ± 0.05 µm non-functionalized silica beads Bangs Laboratories Inc. SS05003
96 Well Cell Cultture Plate U-bottom with Lid, Tissue culture treated, non-pyrogenic. Costar® 3799 For FCM staining and co-culture of BSLB and cells.
96 Well Cell Cultture Plate V-bottom with Lid, Tissue culture treated, non-pyrogenic. Costar® 3894 For FCM staining of cells or beads in suspension.
Alexa Fluor 488 NHS Ester (Succinimidyl Ester) Thermo Fisher Scientific, Invitrogen™ A20000
Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) Thermo Fisher Scientific, Invitrogen™ A37573 and A20006
Allegra X-12R Centrifuge Beckman Coulter For normal in tube staining of biological samples for FCM
Aluminum Foil Any brand For protecting cells and BSLBs from light
anti-human CD154 (CD40L), clone 24-31 BioLegend 310815 and 310818 Alexa Fluor 488 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively.
anti-human CD185 (CXCR5) Brilliant Violet 711, clone J252D4 BioLegend 356934 For quantitative FCM analysis of tonsillar cells as shown in Fig. 1E
anti-human CD19 Brilliant Violet 421, clone HIB19 BioLegend 302234 For quantitative FCM analysis of tonsillar cells as shown in Fig. 1E
anti-human CD2, clone RPA-2.10 BioLegend 300202 Labeled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD2, clone TS1/8 BioLegend 309218 Brilliant Violet 421 conjugate.
anti-human CD252 (OX40L), clone 11C3.1 BioLegend Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human CD28, clone CD28.2 eBioscience 16-0289-85 Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD317 (BST2, PDCA-1), clone 26F8 ThermoFisher Scientific, invitrogen 53-3179-42 Alexa Fluor 488 conjugate, we found this clone to be cleaner than clone RS38E.
anti-human CD38, clone HB-7 BioLegend 356624 Alexa Fluor 700 conjugate
anti-human CD38, clone HIT2 BioLegend 303514 Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human CD39, clone A1 BioLegend Labeled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD4 Brilliant Violet 650, clone OKT4 BioLegend 317436 For quantitative FCM analysis of tonsillar cells as shown in Fig. 1E
anti-human CD4, clone A161A1 BioLegend 357414 and 357421 PerCP/Cyanine5.5 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively
anti-human CD4, clone OKT4 BioLegend 317414 and 317422 PE/Cy7 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively
anti-human CD40, clone 5C3 BioLegend 334304 Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD40, clone G28.5 BioLegend Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD45, clone HI30 BioLegend 304056 and 368516 Alexa Fluor 647 and APC/Cy7 conjugates
anti-human CD47, clone CC2C6 BioLegend 323118 Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human CD54 (ICAM-1), clone HCD54 BioLegend 322702 Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD63 (LAMP-3), clone H5C6 BioLegend 353020 and 353015 PerCP/Cyanine5.5 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively
anti-human CD73, clone AD2 BioLegend 344002 Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD80, clone 2D10 BioLegend 305216 Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human CD81, clone 5A6 BioLegend 349512 and 349502 PE/Cy7 conjugate and labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester), respectively.
anti-human CD82, clone ASL-24 BioLegend 342108 Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human CD86, clone IT2.2 BioLegend 305416 Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human CD8a, clone HIT8a BioLegend 300920 Alexa Fluor 700 conjugate
anti-human CD8a, clone SK1 BioLegend 344724 Alexa Fluor 700 conjugate
anti-human HLA-A/B/C/E, clone w6/32 BioLegend 311414 and 311402 Alexa Fluor 647 conjugate and Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human HLA-DR, clone L243 BioLegend 307656 and 307622 Alexa Fluor 488 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively.
anti-human ICAM-1, clone HCD54 BioLegend 322702 Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human ICOS, clone C398.4A BioLegend 313516 Armenian Hamster IgG
anti-human ICOSL, clone MIH12 BioLegend 329611 Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human ICOSL, clone MIH12 eBioscience 16-5889-82 Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human LFA-1, clone TS1/22 BioLegend Produced in house Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human OX40, clone Ber-ACT35 (ACT35) BioLegend 350018 Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human PD-1 , clone EH12.2H7 BioLegend 135230 and 329902 Alexa Fluor 647 conjugate and Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human PD-L1, clone 29E.2A3 BioLegend 329702 Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human PD-L2, clone 24F.10C12 BioLegend 329611 Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human PD-L2, clone MIH18 BioLegend 345502 Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human TCRab, clone IP26 BioLegend 306712 and 306714 Alexa Fluor 488 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively.
antti-human CD156c (ADAM10), clone SHM14 BioLegend 352702
antti-human CD317 (BST2, Tetherin), clone RS38E BioLegend 348404 Alexa Fluor 647 conjugate
Armenian Hamster IgG Alexa Fluor 647 Isotype control, clone HTK888 BioLegend 400902 Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
BD Cytometer Setup and Tracking beads Becton Dickinson & Company (BD) 641319 Performance track of instruments before quantitative FCM
BD FACSDiva Becton Dickinson & Company (BD) 23-14523-00 Acquisition software
Bovine Seum Albumin Merck, Sigma-Aldrich A3294
CaCl2, Calcium chloride Merck, Sigma-Aldrich C5670 anhydrous, BioReagent, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥96.0%
Casein from bovine milk, suitable for substrate for protein kinase (after dephosphorylation), purified powder Merck, Sigma-Aldrich C5890
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 ThermoFisher Scientific, Gibco 11132D
DynaMag-2 ThermoFisher Scientific, Invitrogen™ 12321D For the removal of Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 in volumes less than 2 mL
DynaMag™-15 ThermoFisher Scientific, Invitrogen™ 12301D For the removal of Dynabeads™ Human T-Activator CD3/CD28 in volumes less than 15 mL
Fetal Bovine Serum Qualified, One Shot ThermoFisher Scientific, Gibco A3160801 Needs heat inactivation for 30 min at 56 oC
Ficoll-Paque PLUS Cytiva, GE Healthcare GE17-1440-02 Sterile solution of polysaccharide and sodium diatrizoate for lymphocyte isolation
Fixable Viability Dye eFluor 780 eBiosciences 65-0865-14 For the exclusion of dead cells during analyses
FlowJo Becton Dickinson & Company (BD) Version 10.7.1 Analysis software
Grant Bio MPS-1 Multi Plate Shaker Keison Products MPS-1 For the mixing of either cells during stainings or BSLBs during staning or protein loading (as an alternative to orbital agitation)
HEPES Buffer Solution (1 M) ThermoFisher Scientific, Gibco 15630-056
HEPES, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid), 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid. Merck, Sigma-Aldrich H4034 For preparation of HBS/HAS or HBS/BSA buffer. BioPerformance Certified, ≥99.5% (titration), suitable for cell culture
HERACell 150i CO2 incubator, 150 L, Electropolished Stainless Steel ThermoFisher Scientific 51026282 For culturing and expanding purified CD4+ and CD8+ T cells.
Hula Mixer® Sample Mixer ThermoFisher Scientific, Life Technologies 15920D Vertical, variable-angle laboratory mixer used for the mixing of BSLBs and lipid master mix, blocking solutions, protein master mix and small scale antibody stainings.
Human Serum Albumin, 30% aqueous solution Merck, Sigma-Aldrich 12667-M
Human TruStain FcX Fc Receptor Blocking Solution BioLegend 422302 Fc Receptor Blocking Solution for blocking of Fc Receptors from biologically relevant samples
Innovatis CASY cell counter and analyzer TT Biovendis Products GmbH For the counting of cells and the determination of cell size and volume based on the exclusion of electric current.
KCl, Potassium chloride Merck, Sigma-Aldrich P5405 Powder, BioReagent, suitable for cell culture
L-Glutamine 200 mM (100x) ThermoFisher Scientific, Gibco 25030-024
MgCl2, Magessium chloride Merck, Sigma-Aldrich M2393 BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture
Microtube Insert for 24 x 1.5/2.0 mL tubes Keison Products P-2-24 Microtube insert for Grant Bio MPS-1 Multi Plate Shaker
Mini Incubator Labnet International  I5110A-230V For the incubation (co-culturing) of BSLB and cells in the absence of CO2
Minimum Essential Medium Non-Essential Amino Acids ThermoFisher Scientific, Gibco 11140-035
Mouse IgG polyclonal antibody control Merck, Sigma-Aldrich PP54 Used as positive control for the measurement of antibodies bound to mouse IgG capture bead standards
Mouse IgG1, k Isotype, clone MOPC-21 BioLegend 400129, 400112, 400130, 400144, 400128 and 400170 Alexa Fluor 488, PE, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 700, APC/Cyanine7 and Brilliant Violet 785  conjugates, respectively.
Mouse IgG1, k Isotype, clone X40 Becton Dickinson & Company (BD), Horizon 562438 Brilliant Violet 421 conjugate.
Mouse IgG1, κ Isotype control, clone P3.6.2.8.1 eBioscience 14-4714-82 Labeled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
Mouse IgG2a, k Isotype, clone MOPC-173 BioLegend 400240 Alexa Fluor 647 conjugate
Mouse IgG2b, k Isotype, clone MPC-11 BioLegend 400330 and 400355 Alexa Fluor 647 and Brilliant Violet 785 conjugates, respectively
Multiwell 6 well Tissue culture treated with vacuum gas plasma Falcon 353046 For culturing and expanding purified CD4+ and CD8+ T cells.
Na2HPO4, Disodium Phosphate Merck, Sigma-Aldrich S7907
NaCl, Sodium chloride Merck, Sigma-Aldrich S5886 BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥99%
NiSO4, Nickel(II) sulfate Merck, Sigma-Aldrich 656895 For saturating NTA sites; added during the blocking process
Penicillin Streptomycin [+]10,000 units Penicillin; [+] 10,000 µg/mL Streptomycin ThermoFisher Scientific, Gibco 15140-122
Phosphate Buffered Saline pH 7.4, sterile ThermoFisher Scientific, Gibco 10010 No Ca2+ or Mg2+ added
Polyethersulfone (PES) Filter unit Thermo Scientific Nalgene  UY-06730-43 Hydrophilic PES membrane with low protein binding facilitates the filtering of solutions with high protein content
PURESHIELD argon ISO 14175-I1-Ar BOC Ltd. 11-Y For the protection of lipid stocks stored at +4 ºC.
Purified Streptavidin BioLegend 280302
Quantum Alexa Fluor 488 MESF beads Bangs Laboratories Inc. 488 Benchmark beads for the interpolation of Alexa Fluor 488 molecules bound to cells and/or BSLB
Quantum Alexa Fluor 647 MESF beads Bangs Laboratories Inc. 647 Benchmark beads for the interpolation of Alexa Fluor 647 molecules bound to cells and/or BSLB
Rat anti-mouse IgG Kappa Light Chain, clone OX-20 ThermoFisher Scientific, invitrogen SA1-25258 Labeled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
Recombinant human IL-2 Peprotech 200-02-1MG
RMPI Medium 1640 (1x); [-] L-Glutamine ThermoFisher Scientific, Gibco 31870-025
Rosette Human B Cell Enrichment Cocktail STEMCELL Technologies 15064 Isolation of B cells for measuring densities of proteins in purified cell populations
Rosette Human CD4+ T Cell Enrichment Cocktail STEMCELL Technologies 15022C.1
Rosette Human CD4+CD127low T Cell Enrichment Cocktail STEMCELL Technologies 15361 Pre-enrichment of CD4+ CD127Low T cells for the downstream isolation of Tregs by FACS.
Rosette Human CD8+ T Cell Enrichment Cocktail STEMCELL Technologies 15063
RPMI Medium 1640 (1x); [-] Phenol Red ThermoFisher Scientific, Gibco 11835-063 For the incubation (co-culturing) of BSLB and cells in the absence of CO2. Phenol red-free media reduces the autofluorescence of cells in flow cytometry and microscopy based measurements.
Sodium Pyruvate (100 mM) ThermoFisher Scientific, Gibco 11360-070
Sprout mini centrifuge FisherScientific, Heathrow Scientific LLC 120301 Benchtop microcentrifuge used to wash silica beads and BSLB in 1.5 mL Eppendorf tubes.
Sterile cappeed 5 mL polystyrene round-bottom tubes Falcon 352058
UltraComp eBeads Compensation Beads ThermoFisher Scientific, invitrogen 01-2222-42
Zeba Spin Desalting Columns 7K MWCO Thermo Fisher Scientific, Invitrogen™ 89882

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References

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Immunologie und Infektion Heft 182
Herstellung von perlengestützten Lipiddoppelschichten zur Untersuchung der partikulären Ausscheidung von T-Zell-Immunsynapsen
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Céspedes, P. F., Dustin, M. L.… More

Céspedes, P. F., Dustin, M. L. Preparation of Bead-supported Lipid Bilayers to Study the Particulate Output of T Cell Immune Synapses. J. Vis. Exp. (182), e63130, doi:10.3791/63130 (2022).

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