Preparazione di doppi strati lipidici supportati da perline per studiare la produzione di particolato delle sinapsi immunitarie delle cellule T

Summary

Qui presentiamo il protocollo per la ricostituzione graduale di cellule sintetiche che presentano antigene utilizzando Bead-Supported Lipid Bilayers e il loro uso per interrogare l'output sinaptico dalle cellule T attivate.

Abstract

Le cellule che presentano l'antigene (APC) presentano tre segnali attivanti alle cellule T impegnate nel contatto fisico: 1) antigene, 2) costimolazione/corepressione e 3) citochine solubili. Le cellule T rilasciano due tipi di particelle effettrici in risposta all'attivazione: vescicole trans-sinaptiche (tSV) e particelle di attacco supramolecolare, che trasferiscono rispettivamente messaggeri intercellulari e mediano la citotossicità. Queste entità vengono rapidamente interiorizzate da APC impegnate in contatto fisico con le cellule T, rendendo la loro caratterizzazione scoraggiante. Questo documento presenta il protocollo per fabbricare e utilizzare i BSLB lipidici supportati da perline come mimetici delle cellule che presentano l'antigene (APC) per catturare e analizzare queste particelle trans-sinaptiche. Vengono inoltre descritti i protocolli per le misurazioni assolute delle densità proteiche sulle superfici cellulari, la ricostituzione dei BSLB con tali livelli fisiologici e la procedura di citometria a flusso per il monitoraggio del rilascio di particelle sinaptiche da parte delle cellule T. Questo protocollo può essere adattato per studiare gli effetti di singole proteine, miscele di ligandi complessi, determinanti di virulenza patogena e farmaci sulla produzione effettrice delle cellule T, comprese le cellule T helper, i linfociti T citotossici, le cellule T regolatorie e le cellule T che esprimono il recettore dell'antigene chimerico (CART).

Introduction

La sinapsi immunologica (IS) è una struttura molecolare cardine formata all'interfaccia di cellule impegnate nel contatto fisico che facilita lo scambio regolato di informazioni juxtracrine. Diversi IS sono stati descritti in letteratura e un numero crescente di prove suggerisce che questi hub molecolari sono una caratteristica conservata delle reti cellulari. Varie cellule immunitarie, tra cui cellule B, cellule natural killer, cellule dendritiche, macrofagi e cellule T, si scambiano informazioni attraverso l'assemblaggio di contatti di breve ^durata1. Studi multiomici stanno facendo progredire la comprensione di nuovi sottoinsiemi di leucociti e cellule stromali che guidano reti cellulari patogene ed esprimono proteine di superficie con funzioni sconosciute. Come APC sintetici, i BSLB consentono lo studio diretto del ruolo funzionale delle singole proteine nell'integrazione dei segnali attivanti, vale a dire antigeni e costimolazione/corepressione, da parte delle cellule T e il conseguente rilascio di particelle effettrici denominate segnale quattro.

Questo documento descrive i protocolli e i punti tecnici critici da considerare durante l'utilizzo dei BSLB per imitare la composizione superficiale degli APC modello. I protocolli per la misurazione quantitativa dei recettori immunitari e di altre proteine di superficie sulle APC sono presentati insieme al protocollo per la ricostituzione di APC sintetici contenenti queste quantità misurate. Quindi, i passaggi necessari per la coculturazione delle cellule T e BSLB vengono presentati insieme al protocollo per la misurazione quantitativa del trasferimento di particelle trans-sinaptiche utilizzando la citometria a flusso. Più sorprendentemente, i BSLB facilitano lo studio di una popolazione di TSV derivati dalla membrana plasmatica chiamati ectosomi sinaptici (SE). Le SE arricchite con recettore dell'antigene delle cellule T (TCR⁺) vengono eliminate in risposta all'attivazione del ^TCR2 e catturate in modo efficiente dai BSLB3, rappresentando un'eccellente lettura per valutare le proprietà agonistiche degli antigeni e la composizione della membrana modellata. Gli esosomi CD63⁺ e le particelle di attacco supramolecolare (SMAP) vengono anche rilasciati dalle cellule T stimolate e catturati dai BSLB. Possono essere utilizzati come letture aggiuntive dell'attivazione e della conseguente secrezione di granuli esocitici e litici da parte delle cellule T. La mobilizzazione delle vescicole esocitiche al polo interagente della cellula T facilita anche il rilascio direzionale di citochine, come IL-2, IFN-γ e IL-10 in risposta all'attivazione4,5,6,7,8. Sebbene le citochine rilasciate dalle cellule T possano essere rilevate anche sui BSLB, uno studio più dedicato è attualmente in fase di sviluppo per convalidare l'analisi quantitativa del rilascio di citochine nella sinapsi immunologica.

Per interrogarsi su come specifiche composizioni di membrana influenzano l'output sinaptico delle cellule T è necessario definire la densità fisiologica della componente della membrana bersaglio. Le quantificazioni basate sulla citometria a flusso delle proteine di superficie cellulare sono un passo essenziale in questo protocollo e richiedono: 1) l'uso di anticorpi con un numero noto di fluorocromi per anticorpo (F / P) e 2) perline di riferimento che forniscono un riferimento standard per l'interpolazione di molecole di fluorocromo da intensità medie di fluorescenza misurate (MFI).

Questi standard di riferimento sono costituiti da cinque popolazioni di perline, ciascuna contenente un numero crescente di fluorocromi solubili equivalenti (MESF), che coprono la gamma dinamica di rilevamento arbitrario della fluorescenza. Queste popolazioni standard producono picchi di fluorescenza discreti, facilitando la conversione di unità di fluorescenza arbitrarie in MESF mediante semplice regressione lineare. I MESF risultanti vengono quindi utilizzati insieme ai valori degli anticorpi F / P per calcolare il numero medio di molecole legate per cellula (o BSLB nelle fasi successive). L'applicazione di aree di superficie cellulare stimate al numero medio di molecole rilevate consente quindi il calcolo delle densità fisiologiche come molecole/^μm2. Questo protocollo di quantificazione può anche essere adattato alla misurazione delle densità proteiche sulle cellule T e alla ricostituzione biochimica delle composizioni di membrana che mediano la formazione di sinapsi omotipiche delle cellule T (cioè le sinapsi ^T-T9). Se necessario, la valenza del legame anticorpale può essere ulteriormente stimata utilizzando bersagli ricombinanti etichettati con un numero noto di fluorocromi per molecola. Quindi, la valenza legante gli anticorpi può essere calcolata per la stessa popolazione BSLB confrontando contemporaneamente il numero di proteine fluorescenti legate e gli anticorpi di quantificazione (utilizzando due diversi fluorocromi di quantificazione e standard MESF).

La ricostituzione delle membrane APC richiede l'assemblaggio di doppi strati lipidici supportati (SLB) su perle di ^silice1. Gli stock di liposomi contenenti diverse specie di fosfolipidi possono essere sfruttati per formare una matrice lipidico-bistrato versatile, consentendo l'ancoraggio di proteine ricombinanti con una diversa chimica di legame (la preparazione dei liposomi è dettagliata in ¹⁰). Una volta definita la densità fisiologica (o densità) del ligando pertinente "sulle cellule", lo stesso protocollo di citometria a flusso viene adattato per stimare la concentrazione di proteina ricombinante necessaria per rivestire i BSLB con la densità fisiologica target. Due diversi sistemi di ancoraggio possono essere utilizzati in combinazione o separatamente.

In primo luogo, SLB contenente un ultimo 12,5 mol% di fosfolipidi contenenti ^Ni2+ è sufficiente a fornire circa 10.000 siti di legame His-tag per micron ^quadrato10 e funziona bene per decorare BSLB con la maggior parte delle proteine disponibili in commercio le cui densità fisiologiche non superano questa capacità di carico massima. Il secondo sistema di carico sfrutta i fosfolipidi contenenti biotina (come mol%) per caricare i biotinilati anti-CD3e Fab (o monomeri HLA / MHC) tramite ponti di streptavidina. La combinazione di questi due metodi di decorazione BSLB consente quindi la personalizzazione flessibile dei BSLB come APC sintetici. Per composizioni superficiali APC altamente complesse, il mol% di fosfolipidi e proteine può essere aumentato per caricare tutte le proteine richieste dalla domanda in questione. Una volta definite le concentrazioni di lavoro delle proteine e il mol% dei fosfolipidi biotinilati, i BSLB possono essere assemblati per interrogare l'output sinaptico delle cellule T con citometria a flusso multiparametrica.

Protocol

1. Misurazione delle densità proteiche di superficie cellulare con citometria quantitativa a flusso

1. Preparare il tampone citometrico a flusso umano filtrato (hFCB) filtrato da 0,22 μm aggiungendo EDTA (a una concentrazione finale di 2 mM) e siero AB umano (a un 10%) finale a soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS), pH 7,4 (vedere Tabella 1). Filtrare la soluzione utilizzando un'unità filtrante dei pori da 0,22 μm per rimuovere le impurità sieriche e conservare a 4 °C.
2. Recuperare le cellule e sedimentarle per centrifugazione a 300 × g per 5 minuti a temperatura ambiente (RT).
3. Lavare le cellule due volte con PBS. In ogni fase di lavaggio, risospesere le celle in PBS al volume originale (prima della centrifugazione) e ruotare a 300 × g per 5 minuti a RT.
4. Conta le sospensioni cellulari macchiate di tripano blu in un ^{emocitometro11}. In alternativa, contare le celle utilizzando l'esclusione di corrente elettrica. Per quest'ultimo, seguire le istruzioni del produttore CASY-TT (vedere la Tabella dei materiali).
   NOTA: il contatore di celle CASY-TT consente di determinare la percentuale di cellule vitali, la dimensione della cella e il volume della cella.
5. Calcolare il volume di PBS contenente 1:1.000 diluizione del colorante di vitalità fissabile eFluor 780 o simile (vedere la tabella dei materiali) necessario per risospese le celle a una concentrazione di colorazione di 107 cellule / mL.
6. Risospese le cellule utilizzando la soluzione di colorante di vitalità-PBS e incubare sul ghiaccio per 30 minuti.
7. Rimuovere il colorante di vitalità aggiungendo un volume di hFCB ghiacciato. Girare a 300 × g per 5 minuti a 4 °C.
   NOTA: D'ora in poi, mantenere la catena del freddo ininterrotta.
8. Lavare le cellule con hFCB contenente 1:50 diluizione della soluzione di blocco del recettore Fc (vedere la tabella dei materiali). Portare il volume a una concentrazione finale di ¹⁰⁷ cellule / mL e incubare per altri 15 minuti per ottenere un efficiente blocco FcgR.
9. Distribuire 100 μL della sospensione cellulare (cioè ¹⁰⁶ celle) per pozzetto di una piastra a 96 pozzetti con fondo a U o a V. Tenere le celle sul ghiaccio e al riparo dalla luce (coprire con foglio di alluminio).
10. Preparare un mix principale di anticorpi in hFCB definendo le concentrazioni ottimali di anticorpi per ciascun anticorpo coniugato con fluorocromo e, soprattutto, per quegli anticorpi utilizzati per determinare le densità proteiche di superficie. Ad esempio, per la quantificazione dell'espressione di ICAM-1 sulle popolazioni di cellule tonsillari, come mostrato nella Figura 1, preparare una miscela contenente 1:200 diluizioni di anti-CD4, anti-CD19 e anti-CXCR5 insieme a concentrazioni saturanti di un anticorpo anti-ICAM-1 con fluorocromi AF647 noti per anticorpo (cioè 10 μg / mL, che è stato definito da esperimenti di titolazione degli anticorpi indipendenti).
11. Come controlli aggiuntivi, preparare una miscela principale di anticorpi contenente i controlli dell'isotipo anticorpale pertinente (alle stesse concentrazioni efficaci delle loro controparti coniugate con gli stessi fluorocromi per la sottrazione di fondo), cioè utilizzare 10 μg / mL di un pertinente controllo isotipico AF647.
    NOTA: nell'esempio precedente, tale controllo isotipico viene utilizzato per sottrarre la fluorescenza di fondo dal vero segnale ICAM-1 sulle cellule.
12. Quando si quantificano le densità proteiche su sottoinsiemi cellulari presenti a basse frequenze all'interno dei tessuti, preparare controlli di fluorescenza meno uno (FMO) contenenti tutti gli anticorpi di colorazione ad eccezione dei marcatori di interesse (vedere ulteriori dettagli in ¹²).
13. Abbassare la piastra a 96 pozzetti contenente le cellule a 300 × g per 5 minuti a 4 °C, scartare il surnatante e risospese le cellule in 50 μL del mix principale di anticorpi di quantificazione o del mix master di anticorpi isotipo.
14. Incubare le celle per almeno 30 minuti a 4 °C e 400 giri/min utilizzando uno shaker a piastre. Proteggere le piastre dalla luce (coprire con un foglio di alluminio).
15. Lavare le celle tre volte utilizzando hFCB e centrifugare a 300 × g per 5 minuti a 4 °C.
16. Risospesso il pellet cellulare utilizzando 200 μL di PBS (cioè, ad una concentrazione finale di 5 × ¹⁰⁶ celle / mL).
17. Per l'acquisizione:
    1. Se si utilizza un caricatore BD FACS standard, trasferire i campioni in tubi a fondo tondo da 5 ml di polistirene (vedere la tabella dei materiali).
    2. Se si utilizzano campionatori ad alta produttività (HTS, noti anche come lettori di piastre), procedere immediatamente al passaggio 1.19.
18. Prima di procedere con l'acquisizione dei dati per gli standard MESF, verificare i limiti massimi di linearità dell'intensità di fluorescenza e minimi per i canali di quantificazione.
19. Prima della compensazione, acquisire i dati per gli standard MESF, assicurando che sia le popolazioni più deboli che quelle più luminose rientrino nell'intervallo lineare di misurazione.
20. Acquisire i campioni di compensazione. Mantenere invariati i valori di tensione del tubo fotomoltiplicatore (PMT) per i canali di quantificazione per preservare la gamma dinamica di rilevamento. Eseguire lievi regolazioni della tensione PMT di altri canali prima di calcolare le matrici di compensazione.
21. Calcola e applica un risarcimento.
22. Acquisire e salvare un minimo di 2 × ¹⁰⁴ perline MESF totali per ciascuno dei canali di quantificazione.
23. Selezionare la popolazione di singole celle in base alle loro aree di diffusione della luce laterale e in avanti (SSC-A e FSC-A, rispettivamente, come mostrato nella Figura 1A (i)), seguita dalla selezione degli eventi all'interno del continuum temporale (Figura 1A (ii)) e basso per il tempo di volo (W) sia in FSC che in SSC rispetto alle loro altezze (ad esempio, FSC-W/FSC-H, seguito da SSC-W/SSC-H gating come mostrato nella Figura 1A (iii) e (iv), rispettivamente). Definire un gate finale a singolo evento contenente eventi con distribuzione proporzionale FSC-A rispetto a FSC-H (Figura 1A (v)).
24. Acquisire campioni di controllo (controlli con etichetta isotipo e FMO).
25. Acquisire campioni e registrare fino a quando non sono state acquisite almeno 10.000 cellule bersaglio.
    NOTA: la robusta determinazione delle densità molecolari medie richiede l'analisi di diversi donatori attraverso esperimenti indipendenti. Ciò è fondamentale quando si analizzano sottoinsiemi cellulari trovati a frequenze ridotte o derivati da materiale biologico scarso (ad esempio, da biopsie di tessuti umani).
26. Lavare il citometro per 5 minuti con una soluzione detergente FACS seguita da 5 minuti di acqua ultrapura prima di spegnere lo strumento. Se si utilizza HTS, seguire le opzioni nella scheda HTS e Clean Plate program.
    NOTA: per ridurre il riporto da campione a campione, attivare le opzioni di lavaggio a filo sit (campionatore) o ad alta produttività , che laveranno automaticamente il citometro tra provette o pozzetti. Prima di iniziare l'acquisizione, eseguire acqua ultrapura per 10 minuti ad una portata elevata per rimuovere eventuali contaminanti biologici non lavati dalla linea di campionamento del citometro.
27. Esportare i file FCS (Flow Cytometry Standard).

2. Analisi di regressione dell'intensità di fluorescenza media (o mediana) (IFM) sovracorrettata (IFM) meSF

1. Aprire il software di analisi della citometria a flusso e caricare i file FCS dell'esperimento. Selezionare la popolazione di perline in base alle loro aree di diffusione della luce laterale e in avanti (SSC-A rispetto a FSC-A), come mostrato nella Figura 1A (i).
2. Controllare la qualità dei dati controllando la distribuzione dei singoli eventi nel tempo, come indicato al punto 1.24.
   NOTA: le bolle creano lacune nella distribuzione degli eventi nel tempo; questo appare in genere all'inizio dell'acquisizione utilizzando l'HTS. Evitare di selezionare eventi che fiancheggiano lacune nel tempo di acquisizione in quanto questi aggiungono errori di misurazione dovuti ad aberrazioni ottiche.
3. Concentrati sui singoli eventi.
   1. Cellule
      1. Identificare prima le singole celle in base alla loro distribuzione SSC-A e FSC-A (Figura 1A (i)), seguita da eventi bassi per W nelle porte sequenziali FSC-W/FSC-H (singlets-1, Pannello Figura 1A (iii)) e SSC-W/SSC-H (singlets-2; Figura 1Un pannello (iv)). Definire un gate singlets-3 aggiuntivo selezionando eventi con FSC-A e FSC-H proporzionali (Figura 1A, pannello (v)). Infine, identificare le cellule vive come quelle negative per il colorante di vitalità fissabile.
   2. Perline MESF
      1. Seguire la stessa discriminazione da singoletti-1 a singoletti-3 come nel passaggio 2.3.1.1 (Figura 1B, pannelli da (i) a (v)). Identificare ciascuna delle popolazioni MESF (in bianco, 1, 2, 3 e 4) in base ai loro livelli di intensità di fluorescenza (vedere Figura 1B, pannello (vi)).
4. Estrarre l'IFM delle frazioni MESF in bianco e da 1 a 4.
5. Generare valori MFI corretti (cMFI) per le frazioni MESF da 1 a 4 sottraendo le IFM della popolazione di perline vuote da ciascuna frazione.
6. Calcola la linea di migliore adattamento per la relazione tra cMFI e i valori MESF forniti dal fornitore (variabile indipendente, essendo frazione vuota uguale a zero).
7. Estrarre la pendenza (b nell'equazione sottostante) della regressione lineare di MESF su cMFI (il pannello Figura 1B (viii) mostra una regressione in cui y = a + bx; con a = 0).
8. Estrarre le intensità di fluorescenza mediana (per le distribuzioni di fluorescenza bimodale) o media (per le distribuzioni di fluorescenza normali o log-normali) dalle popolazioni di interesse (cellule TFH e B nel pannello Figura 1A (vii)).
9. Come nei passaggi 2.5-2.7, estrarre i valori MFI dalle celle di controllo marcate con isotipo.
10. Se l'F/P dei controlli isotipici è lo stesso degli anticorpi di quantificazione, correggere le IFM delle cellule colorate sottraendo le IFM dalle cellule marcate con isotipo.
11. Se l'F/P degli isotipi differisce da quelli degli anticorpi di quantificazione, estrarre il MESF dagli isotipi dividendo le IFM delle cellule marcate con isotipo con la pendenza calcolata nel punto 2.7. Sottrarre l'isotipo MESF dalla quantificazione MESF prima di stimare gli anticorpi di quantificazione legati.
12. Dividere il MESF per l'F/P degli anticorpi di quantificazione per stimare il numero di molecole legate per cellula (Molec. _come mostrato nel diagramma di flusso della Figura 1C).
13. Dividere il numero di molecole legate con la superficie cellulare stimata (CSA (^μm2)) per estrarre la densità delle proteine come molec./^μm2 (Figura 1C). Fare riferimento alla sezione dei risultati rappresentativi per maggiori dettagli.

3. Specie di fosfolipidi funzionali da utilizzare nella calibrazione delle proteine che rivestono BSLB

1. Utilizzare 0,4 mM DOPC (1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina) come componente principale della matrice lipidica che forma il doppio strato lipidico supportato. Diluire tutte le altre specie lipidiche in questa soluzione DOPC.
2. Utilizzare tra lo 0,2 e l'1 mol% di 0,4 mM di DOPE (1,2-Dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina) coniugato a coloranti, inclusi ATTO 390, 488 o 565 (vedere la Tabella dei materiali), per generare BSLB con fluorescenza intrinseca.
   NOTA: La fluorescenza intrinseca dei BSLB facilita l'identificazione di singoli BSLB e singole cellule negli esperimenti di trasferimento sinaptico.
3. Utilizzare il 12,5 mol% di 0,4 mM DGS-NTA(Ni) (1,2-dioleoil-sn-glicero-3-[(N-(5-ammino-1-carbossipentil) acido iminodiacetico) succinil]) per ancorare le proteine his-tagged. Mantenere costante la mol% di DGS-NTA(Ni) ed eseguire titolazioni 2 volte delle proteine His-tagged a partire da 100 nM come la concentrazione più alta. Lasciare una condizione senza proteine come controllo negativo per le quantificazioni assolute.
   NOTA: i segnali accessori e le molecole di adesione, come ICAM-1, sono progettati con un tag 12-His per aumentare l'affinità della proteina per DGS-NTA(Ni).
4. Utilizzare Biotinyl Cap PE (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(cap biotinyl)) per ancorare proteine biotinilate tramite ponti biotina-streptavidina-biotina. Utilizzare una titolazione seriale 5 volte di 0,4 mM Biotinyl Cap PE che copre tra il 10 mol% e lo 0 mol% (come controllo negativo). Mantenere costante la concentrazione di streptavidina e proteine biotinilate (200 nM) sia negli esperimenti di calibrazione che nella ricostituzione di APC sintetici per esperimenti di trasferimento sinaptico.
   NOTA: Le analisi di regressione delle densità empiriche di proteine biotinilate rispetto al mol% finale di Biotinyl Cap PE nella matrice lipidica (contenente anche DGS-NTA(Ni) per ancorare le proteine His-tagged) definiranno il mol% da utilizzare per ricostituire le densità bersaglio dell'antigene.

4. Preparazione di soluzione salina tamponata HEPES integrata contenente l'1% di albumina sierica

NOTA: nelle fasi di lavaggio e carico proteico dei BSLB (Tabella 1) è necessaria una soluzione salina tamponata con HEPES integrata contenente l'1% di albumina sierica umana (HBS/HSA) o l'1% di albumina sierica bovina (HBS/BSA). Preparare una soluzione stock HBS 10x e il buffer di lavoro il più fresco possibile; conservare in frigorifero e utilizzare entro un mese. Mentre BSA è un'alternativa più economica all'HSA, fornisce un blocco efficiente dei lipidi ni-chelanti13 ed è raccomandato per esperimenti ad alto rendimento.

1. Preparare una soluzione tampone 10x di HBS integrato contenente 200 mM HEPES, 7 mM _Na2HPO4, 1400 mM NaCl, 50 mM KCl, 60 mM glucosio, 10 mM _CaCl2 e 20 mM _MgCl2.
   NOTA: La dissoluzione di _MgCl2 è altamente esotermica e un rischio di ustioni. Aggiungere questo sale lentamente e su un grande volume di solvente. Evitare di preparare soluzioni concentrate (cioè 1 M) di questi sali in quanto tendono a precipitare nel tempo, rendendo difficile la loro precisa aggiunta al tampone di lavoro.
2. Filtrare la soluzione 10x utilizzando un'unità filtrante da 0,22 μm e mantenerla sterile a 4 °C.
3. Per 500 mL di HBS/ha, prendere 50 mL della soluzione HBS 10x integrata, regolare il pH a 7,4 se necessario e portare il volume a 483,4 mL con acqua ultrapura.
4. Aggiungere 16,6 mL di soluzione HSA al 30% ai 483,4 mL di HBS, pH 7,4.
5. Per 500 mL di HBS/BSA, sciogliere 5 g di BSA in HBS e incubare a 37 °C per 30 min. Quindi, mescolare delicatamente a RT invertendo periodicamente il flacone fino a quando non ci sono cristalli proteici o grumi visibili.
6. Filtrare la soluzione risultante dal punto 4.5 utilizzando un'unità filtrante da 0,22 μm (vedere la Tabella dei materiali) e conservarla a 4 °C.

5. Calibrazioni della densità proteica sui BSLB

1. Prima di prendere le perle di silice non funzionalizzate da 5,00 ± 0,05 μm di diametro, mescolare bene la soluzione madre e risospese eventuali grandi ciuffi di perline sedimentate sul fondo dei palloni.
   NOTA: le perle di silice tendono a sedimentarsi rapidamente, il che potrebbe portare a errori di conteggio. Mescolare vigorosamente pipettando su e giù metà del volume massimo di una micropipetta P1000.
2. Diluire 1 μL di soluzione di perline in 1.000 μL di PBS, contare le perline usando una camera emocitometrica e calcolare la loro concentrazione per mL.
   NOTA: la colorazione blu Trypan non è necessaria per visualizzare le perle di silice.
3. Calcolare il volume di perle di silice necessarie per 5 × ¹⁰⁵ BSLB finali per punto della titolazione.
4. Trasferire il volume richiesto di perline di silice in un tubo microcentrifuga sterile da 1,5 ml.
5. Lavare le perle di silice tre volte con 1 mL di PBS sterile, centrifugare le perline per 15 s su una microcentrifuga da banco a RT (a regime fisso).
   NOTA: Quando si rimuove la soluzione di lavaggio, evitare di disturbare il pellet di perline. Una piccola colonna tampone non influenzerà la diffusione dei liposomi che compongono il mix master di liposomi in quanto questi sono anche in PBS.
6. Preparare tre volumi del mix master di liposomi per assemblare il BSLB sulle perle di silice lavate (ad esempio, se il volume totale iniziale di perle di silice è di 20 μL, preparare un minimo di 60 μL del mix master di liposomi).
7. Per le titolazioni di Biotinyl Cap PE mol%
   1. Preparare le miscele lipidiche contenenti diluizioni 5 volte di Biotinyl Cap PE.
      1. Diluire il Biotinyl Cap PE mol% da 0,4 mM in una matrice DOPC al 100%.
      2. Mescolare ogni punto di titolazione di Biotinyl Cap PE mol% con un rapporto 1:1 (vol:vol) con una soluzione di 0,4 mM 25% DGS-NTA(Ni) in modo tale che un ultimo 12,5 mol% di lipidi contenenti Ni sia presente in tutte le titolazioni.
         NOTA: Il 12,5 mol% (vol:vol%) dei lipidi contenenti Ni rappresenta la composizione lipidica mista dei BSLB su cui le proteine His-tagged possono anche essere testate in calibrazioni parallele. Ad esempio, poiché tutti gli stock di liposomi sono preparati alla stessa concentrazione molare, per raggiungere la miscela mol% target in 200 μL di miscela finale di liposomi, è sufficiente mescolare 100 μL del 25 mol% di DGS-NTA contenente Ni con 100 μL di DOPC al 100 mol%.
   2. Trasferire 5 × ¹⁰⁵ perle di silice lavate in tubi microcentrifuga da 1,5 mL, in modo tale che un punto di titolazione di Biotinyl Cap PE mol% sia assemblato per tubo.
   3. Aggiungere le miscele master di titolazione Biotinyl Cap PE mol% alle perle di silice lavate e mescolare delicatamente tubando su e giù metà del volume totale. Evitare di formare bolle, che in eccesso distruggono il doppio strato lipidico.
   4. Aggiungere il gas Argon (o Azoto) sul tubo contenente i BSLB ora in formazione per spostare l'aria e proteggere i lipidi dall'ossidazione durante la miscelazione.
   5. Aggiungere Argon alle scorte lipidiche 0,4 mM prima dello stoccaggio e manipolare utilizzando una tecnica sterile.
      NOTA: Collegare un piccolo tubo alla bombola di gas Argon/Azoto. Prima di aggiungere gas ai tubi, regolare il regolatore della bombola del gas in modo che la pressione non sia impostata su un livello superiore a 2 psi. Collegare una punta di pipetta sterile al tubo di uscita per dirigere il flusso di gas all'interno del liposoma per 5 s e chiudere rapidamente il coperchio. Nel caso di scorte lipidiche, sigillare il coperchio del tubo con un film di paraffina prima di conservarlo a 4 °C.
   6. Spostare i BSLB su un miscelatore da laboratorio verticale ad angolo variabile (vedere la Tabella dei materiali) e mescolare per 30 minuti a RT utilizzando una miscelazione orbitale di 10 giri / min.
      NOTA: Questo passaggio impedirà la sedimentazione delle perline durante la formazione del doppio strato lipidico supportato.
   7. Abbassare le perline centrifugando per 15 s a RT su una minicentrifuga da banco, quindi lavare tre volte con 1 mL di HBS / HSA (BSA) per rimuovere i liposomi in eccesso.
   8. Blocca i BSLB formati aggiungendo 1 mL di caseina al 5% o BSA al 5% contenente 100 μM di NiSO4 per saturare i siti NTA e 200 nM di streptavidina per rivestire uniformemente tutti i siti di ancoraggio della biotina sui BSLB. Mescolare delicatamente pipettando su e giù metà del volume totale e incubare nel miscelatore verticale per non più di 20 minuti a RT e 10 giri / min.
   9. Abbassare i BSLB centrifugando per 15 s a RT su una minicentrifuga da banco e quindi lavare tre volte con 1 mL di tampone HBS/HSA (BSA).
      NOTA: Tenere le perline lavate verticalmente con un piccolo volume di tampone di lavaggio che copre i BSLB. Evitare la disidratazione dei BSLB poiché l'aria distruggerà il doppio strato lipidico.
8. Per la titolazione di proteine marcate con His sul 12,5 mol% di BSLB contenenti NTA DGS(Ni)
   1. Preparare tre volumi di liposome master mix contenenti un ultimo 12,5 mol% di DGS-NTA(Ni).
   2. Utilizzare il mix master di liposomi per risospescere le perle di silice lavate e mescolare delicatamente pipettando su e giù metà del volume totale. Evitare di formare bolle, che in eccesso danneggiano il doppio strato lipidico.
   3. Aggiungere il gas Argon (o Azoto) sul tubo contenente i BSLB ora in formazione per spostare l'aria e proteggere i lipidi dall'ossidazione durante la miscelazione.
   4. Aggiungere Argon alle scorte lipidiche 0,4 mM prima dello stoccaggio e manipolare utilizzando una tecnica sterile.
   5. Spostare i BSLB sul mixer verticale e mescolare per 30 minuti a RT utilizzando la miscelazione orbitale a 10 giri / min.
   6. Abbassare le perline centrifugando per 15 s a RT su una minicentrifuga da banco, quindi lavare tre volte con 1 mL di HBS / HSA (BSA) per rimuovere i liposomi in eccesso.
   7. Bloccare i BSLB formati aggiungendo 1 mL di caseina al 5% (o BSA al 5%) contenente 100 μM di NiSO4 per saturare i siti NTA sui BSLB. Mescolare delicatamente e incubare nel miscelatore verticale per non più di 20 minuti a RT e 10 rpm.
   8. Lavare tre volte utilizzando HBS/HSA (BSA) per rimuovere la soluzione bloccante in eccesso.
   9. In una nuova piastra a 96 pozzetti con fondo a U preparare diluizioni seriali 2 volte delle proteine.
      1. Preparare una concentrazione iniziale di 100 nM per la proteina di interesse in un volume totale di 200 μL di tampone HBS/HSA (BSA), distribuire 100 μL di questa soluzione nella prima colonna e i restanti 100 μL sopra la colonna #2 contenente 100 μL di tampone HBS/HSA (BSA).
      2. Continuare trasferendo in serie 100 μL dalla colonna #2 alla colonna #3 e ripetere se necessario per coprire tutti i punti di titolazione. Lasciare l'ultima colonna della serie senza proteine, in quanto verrà utilizzata come riferimento vuoto per la quantificazione.
   10. Sospendere i BSLB preparati in un volume tale che 5 × ¹⁰⁵ BSLB siano contenuti in 100 μL di buffer HBS/HSA (BSA).
   11. Trasferire 100 μL della sospensione BSLB ai pozzetti di una seconda piastra a 96 pozzetti con fondo a U, in modo tale che ogni pozzo riceva 5 × ¹⁰⁵ BSLB.
   12. Girare verso il basso la seconda piastra contenente BSLB per 2 minuti a 300 × g e RT e scartare il surnatante.
   13. Trasferire i volumi di 100 μL dalla piastra di titolazione delle proteine alla piastra contenente i BSLB sedimentati. Mescolare delicatamente, evitare la generazione di bolle in eccesso durante il pipettaggio e incubare per 30 minuti a RT e 1.000 giri / min utilizzando uno shaker a piastre. Proteggere dalla luce con un foglio di alluminio.
   14. Lavare la piastra tre volte con tampone HBS/HSA (BSA) utilizzando fasi di sedimentazione di 300 × g per 2 minuti a RT.
   15. Se la proteina ricombinante utilizzata nella calibrazione è direttamente coniugata ai fluorocromi e ha valori F/P noti, procedere al passaggio 5.8.20.
   16. Se la proteina ricombinante utilizzata nella calibrazione non è etichettata o coniugata ai fluorocromi o non è disponibile alcuno standard di perline MESF, utilizzare anticorpi coniugati Alexa Fluor 488 o 647 con valori F/P noti per colorare il BSLB rivestito di proteine.
   17. Macchia con concentrazioni saturanti di anticorpi di quantificazione.
       NOTA: a seconda del livello di espressione target, questi variano tra 5 e 10 μg/ml.
   18. Macchia per 30 minuti a RT e 1.000 giri / min usando uno shaker a piastre. Proteggere dalla luce usando un foglio di alluminio.
   19. Lavare due volte con tampone HBS/HSA (BSA) e una volta con PBS utilizzando fasi di sedimentazione di 300 × g per 2 minuti a RT.
       NOTA: utilizzare PBS, pH 7,4 per risospendere i BSLB lavati prima dell'acquisizione. Non utilizzare tamponi contenenti proteine, in quanto ciò porta alla formazione di bolle durante la miscelazione automatica di campioni con campionatori ad alto rendimento.
   20. Acquisire gli standard MESF, assicurandosi che i picchi più luminosi rimangano nel campo di rilevamento lineare per il rivelatore di quantificazione (canale), come mostrato nella Figura 1B (vii).
   21. Acquisire i campioni manualmente o utilizzando HTS. Se si utilizza quest'ultimo, sospendere i BSLB in 100 μL di PBS e acquisire 80 μL utilizzando una portata compresa tra 2,5 e 3,0 μL/s, un volume di miscelazione di 100 μL (o il 50% del volume totale se il volume di risospensione è inferiore), una velocità di miscelazione di 150 μL/s e cinque miscele per garantire che i BSLB siano monodispersi.
   22. Esporta i file FCS.
   23. Concentrati sui singoli eventi per le analisi (Figura 2A), poiché doppietti o terzine introdurranno errori nella determinazione. Utilizzare l'identificazione nidificata di singoli eventi come indicato nel passaggio di protocollo 1.2.3.
   24. Misurare l'IFM di ciascuna frazione MESF (1-4) e sottrarre l'IFM di perline vuote per estrarre le IFM corrette (cMFI).
   25. Eseguire un'analisi di regressione lineare per estrarre la pendenza (b) del MESF rispetto al cMFI calcolato per gli standard MESF, che verrà utilizzato nel passaggio 5.33.
   26. Estrarre l'IFM di ciascun punto di titolazione e sottrarre l'IFM di perline senza proteine per ottenere cMFI.
   27. Dividere i CMFI con la pendenza calcolata al punto 5.31 per estrarre il MESF legato ai BSLB per ciascun punto di titolazione.
   28. Dividere il MESF legato ai BSLB per il valore F/P dell'anticorpo di quantificazione per estrarre il numero medio di molecole legate per BSLB.
   29. Utilizzando il diametro dei BSLB (5,00 ± 0,05 μm), estrarre la superficie del tallone (SA = ^4pr2) per calcolare le densità finali di proteina (molec./^μm2) per punto di titolazione (concentrazione proteica).
   30. Eseguire una nuova analisi di regressione della concentrazione proteica rispetto alla densità proteica per calcolare la pendenza (b) della linea di migliore adattamento.
       NOTA: La concentrazione del 12,5 mol% di DGS-NTA(Ni) conferisce una capacità massima di ancoraggio di circa 10.000 molec./^μm210 senza indurre l'attivazione non specifica delle cellule T o influenzare la mobilità laterale delle SLB.

6. Esecuzione di esperimenti di trasferimento sinaptico tra cellule T e BSLB

1. Prima di eseguire l'esperimento di trasferimento sinaptico
   1. Acquisire BSLB non fluorescenti, BSLB con lipidi fluorescenti, cellule non macchiate (o perle di compensazione; vedere la Tabella dei materiali) e cellule colorate a colore singolo (o perline di compensazione) per identificare le interazioni dello spettro di fluorescenza dello strumento. Concentrati su quei rivelatori con elevata diffusione di spillover per riprogettare il pannello policromatico, aumentare la sensibilità e ridurre l'errore di misurazione sui rilevatori critici (vedi ¹⁴).
   2. Titolare gli anticorpi di rilevamento per trovare la concentrazione ottimale, consentendo il rilevamento di eventi positivi senza compromettere il rilevamento di negativi.
      NOTA: ripetere questo passaggio ogni volta che si verifica una modifica del lotto di anticorpi poiché i valori F/P e la luminosità variano da lotto a lotto.
   3. Opzionale: ottimizza le tensioni PMT acquisendo il campione a diversi intervalli di tensione (ad esempio, una camminata di tensione) per trovare i PMT che portano a un segnale ottimale sul rumore (cioè, separazione di negativi e positivi, garantendo al contempo che il segnale della popolazione più luminosa rimanga nell'intervallo lineare).
2. Misurazione del trasferimento dell'uscita delle cellule T ai BSLB
   1. Preparare RPMI 1640 integrato (di seguito R10 medium) contenente il 10% di siero bovino fetale inattivato dal calore (FBS), 100 μM di aminoacidi non essenziali, 10 mM HEPES, 2 mM di L-glutammina, 1 mM di piruvato di sodio, 100 U/ ml di penicillina e 100 μg / mL di streptomicina. Utilizzare il mezzo R10 per coltivare ed espandere le cellule T.
   2. Il giorno 1, isolare le cellule T dal sangue periferico o dalle camere del sistema di leucoriduzione (LRS). Utilizzare kit di isolamento e separazione cellulare immunodensità (vedere la Tabella dei materiali) per l'arricchimento delle cellule T cd4⁺ e CD8⁺ umane.
   3. Seminare le cellule ad una concentrazione finale compresa tra 1,5 e 2,0 × ¹⁰⁶ cellule/ml, utilizzando piastre a 6 pozzetti con non più di 5 ml totali per pozzetto.
   4. Attivare le cellule T utilizzando un rapporto 1:1 di perle magnetiche di attivazione delle cellule T umane (anti-CD3/anti-CD28) (vedere la Tabella dei materiali) e aggiungere 100 UI di IL-2 umano ricombinante per supportare la proliferazione e la sopravvivenza cellulare.
   5. Il giorno 3, rimuovere le perle magnetiche attivanti utilizzando colonne magnetiche (vedere la Tabella dei materiali). Assicurarsi che le perle magnetiche rimangano attaccate ai lati del tubo prima di recuperare le celle per ulteriori fasi di lavaggio.
   6. Lavare ancora una volta le perline magnetiche con 5 ml di R10 medio fresco, mescolare bene e rimetterle nel magnete. Recuperare questo volume e mescolare con le cellule recuperate nel passaggio 6.2.5.
   7. Sospendere le cellule a 1,5-2 × ¹⁰⁶ cellule/mL in R10 fresco contenente 100 U/mL di IL-2. Ricostituire il mezzo dopo 48 ore, assicurandosi che l'ultima aggiunta di IL-2 sia 48 ore prima del giorno di sperimentazione (giorni da 7 a 14 di coltura).
   8. Il giorno dell'esperimento di trasferimento sinaptico, preparare il mezzo di saggio di trasferimento sinaptico (vedere Tabella 1) integrando il mezzo RPMI 1640 privo di fenolo rosso con 10% FBS, 100 μM di aminoacidi non essenziali, 2 mM di L-glutammina, 1 mM di piruvato di sodio, 100 U / ml di penicillina e 100 μg / mL di streptomicina. Non includere IL-2 umano ricombinante.
   9. Contare le cellule utilizzando la colorazione blu di tripano o l'esclusione di corrente elettrica e risospenderle ad una concentrazione finale di 2,5 × ¹⁰⁶ cellule / mL in mezzo. Se si osserva un'eccessiva morte cellulare (>10%), rimuovere le cellule morte/morenti utilizzando una miscela di polisaccaride e diatrizoato di sodio (vedere la Tabella dei materiali) come segue:
      1. Strato 15 mL di coltura cellulare sopra 13 mL della soluzione di polisaccaride-diatrizoato di sodio.
      2. Centrifuga per 1.250 × g per 20 min a RT con accelerazione e decelerazione minime. Raccogliere lo strato cellulare (nuvola) nell'interfaccia tra il mezzo e la soluzione di polisaccaride-diatrizoato di sodio.
      3. Lavare le cellule almeno due volte con il mezzo Synaptic Transfer Assay preriscalcato (preparato nel passaggio 6.2.7).
      4. Contare e risospesare le cellule a una concentrazione finale di 2,5 × ¹⁰⁶/mL utilizzando il mezzo Synaptic Transfer Assay. Cocoltura 100 μL di questa sospensione cellulare con BSLB (vedere passo 6.2.15).
   10. Calcolare il numero di BSLB necessari per l'esperimento; considerare tutti i diversi mix di master proteici e le titolazioni di antigene da testare (monomeri biotinilati HLA/MHC-peptidi o monobiotinilati anti-CD3ε Fab).
   11. Assemblare i BSLB seguendo gli stessi passaggi della sezione 5 del protocollo, ma questa volta, combinare tutte le titolazioni di proteine e lipidi necessari per ricostituire una membrana APC complessa (Figura 3A). Mantenere le stesse relazioni vol: vol tra il volume iniziale delle perle di silice e il volume della miscela proteica utilizzata durante le calibrazioni, nonché i tempi e le temperature utilizzati nel caricamento dei BSLB. Ad esempio, se per la calibrazione iniziale sono stati utilizzati 0,5 μL di perline di silice/pozzetto e 100 μL/pozzetto di miscela proteica, mantenere rapporti vol:1.000 vol/vol per preparare i BSLB da cocolturare con cellule T.
   12. Una volta che i BSLB sono stati caricati con il mix proteico di interesse, lavare i BSLB due volte con HBS / HSA (BSA) per rimuovere le proteine non legate in eccesso. Utilizzare velocità di sedimentazione di 300 × g per 2 minuti a RT in ogni fase di lavaggio ed eliminare i supernatanti.
   13. Sospendere i 5 × ¹⁰⁵ BSLB per pozzetto in 200 μL.
   14. Trasferire 100 μL per pozzetto a una nuova piastra a 96 pozzetti con fondo a U per creare un duplicato, in modo tale che la quantità finale di BSLB per pozzetto sia di 2,5 × ¹⁰⁵.
   15. Abbassare i BSLB a 300 × g per 2 minuti e RT e scartare il surnatante.
   16. Sospendere i BSLB utilizzando 100 μL di sospensione di cellule T; mescolare delicatamente per evitare la formazione di bolle.
   17. Incubare le cocolture per 90 min a 37 °C.
       NOTA: In alternativa, le cellule e le perline possono essere risospese nel buffer HBS/HSA (BSA) anziché nell'RPMI privo di fenolo rosso per la cocoltura. In questo caso, l'incubazione deve essere eseguita in un incubatore non a _CO2 in quanto questo gas acidificherà rapidamente il tampone in assenza di bicarbonato.
   18. Raffreddare le cocolture cellulari BSLB-T incubando prima le cellule a RT per un minimo di 15 minuti. Proteggili dalla luce.
   19. Centrifugare le celle per 5 min a 500 × g e RT; scartare il surnatante.
   20. Sospendere le cellule in RT 2% BSA-PBS (^Ca2+ e ^Mg2+-free) per il blocco. Mettere le celle sul ghiaccio per 45 min. Proteggere dalla luce.
   21. Durante l'incubazione delle cellule, preparare la miscela principale di anticorpi utilizzando BSA al 2% filtrato 0,22 μm ghiacciato in PBS come tampone di colorazione, che fornirà un blocco extra.
       NOTA: Alcuni lotti di anticorpi coniugati ai coloranti Brilliant Violet tendono a legarsi ai BSLB in modo non specifico. Il blocco con il 5% di BSA-PBS aiuta a ridurre questo rumore. D'ora in poi, assicurati di mantenere la catena del freddo ininterrotta.
   22. Girare le cocolture a 500 × g per 5 minuti e 4 °C. Prima di scartare i supernatanti, assicurarsi brevemente che il pellet sia presente ispezionando il fondo della piastra a 96 pozzetti utilizzando una retroilluminazione.
   23. Utilizzando una pipetta multicanale, risospese le cellule nella miscela principale di colorazione contenente concentrazioni di anticorpi ottimizzate.
       NOTA: utilizzare punte per pipette senza filtro per evitare la generazione di bolle ed errori nella distribuzione dei volumi di colorazione.
   24. Includere cellule marcate con isotipo e BSLB, BSLB fluorescenti e non fluorescenti e cellule e BSLB colorati da soli. Rispettare il numero totale di eventi per pozzetto per tutti i controlli (cioè, solo BSLB contenenti 5 × ¹⁰⁵ BSLB / pozzetto e solo controlli cellulari contenenti 5 × ¹⁰⁵ cellule / pozzetto per evitare un aumento relativo di anticorpi per evento colorato).
   25. Mescolare delicatamente pipettando su e giù metà del volume e incubare per 30 minuti sul ghiaccio. Proteggere dalla luce.
   26. Lavare le cellule e i BSLB due volte utilizzando BSA-PBS al 2% ghiacciato, pH 7,4 e fasi di sedimentazione di 500 × g per 5 minuti a 4 °C. Risospendare le cocolture lavate in 100 μL di PBS e acquisire immediatamente.
   27. Se è necessaria la fissazione, correggere utilizzando lo 0,5% p / v di PFA in PBS per 10 minuti, lavare una volta e conservare in PBS fino all'acquisizione. Proteggere dalla luce.
   28. Prima della compensazione, acquisire gli standard MESF, assicurando che sia le popolazioni più deboli che quelle più luminose rientrino nell'intervallo lineare di misurazione.
   29. Acquisire campioni di compensazione, calcolare la compensazione e applicare la matrice di compensazione (link) all'esperimento.
   30. Acquisire e salvare un minimo di 2 × ¹⁰⁴ standard MESF totali per ciascuno dei canali di quantificazione.
   31. Per l'acquisizione utilizzando campionatori ad alta produttività, impostare l'acquisizione dello strumento su standard, impostare l'acquisizione del campione su 80 μL (o l'80% del volume totale), la portata del campione tra 2,0 e 3,0 μL/s, il volume di miscelazione del campione di 50 μL (o il 50% del volume totale per evitare la formazione di bolle durante la miscelazione), la miscelazione del campione di 150 μL/s e la miscelazione per pozzetto compreso tra 3 e 5.
   32. Acquisire un minimo di 1 × ¹⁰⁴ BSLB singoli per campione (fare riferimento alla Figura 3B pannelli (i)-(vi) per la strategia di gating di riferimento).
   33. Lavare il citometro in funzione per 5 minuti una soluzione detergente seguita da 5 minuti di acqua ultrapura prima di spegnere lo strumento. Se si utilizza HTS, seguire le opzioni nella scheda HTS e nell'opzione Pulisci .
   34. Esporta i file FCS.

7. Misurare il trasferimento sinaptico di particelle a BSLB

1. Aprire i file FCS dell'esperimento. Selezionare la popolazione di celle e BSLB in base alle loro aree di diffusione della luce laterale e in avanti (SSC-A rispetto a FSC-A), come mostrato nella Figura 3B (i).
2. Selezionare gli eventi all'interno della finestra di acquisizione continua (Figura 3B (ii)).
3. Concentrarsi sui singoli eventi di entrambe le cellule e BSLB; identificare prima le singole celle in base al basso W nelle porte sequenziali FSC-W/FSC-H (singlets-1, Figura 3B panel (iii)) e SSC-W/SSC-H (singlets-2; Figura 3B pannello (iv)). Definire un gate singlets-3 aggiuntivo selezionando eventi con FSC-A e FSC-H proporzionali (Figura 3B, pannello (v)).
4. Estrarre l'IFM delle frazioni MESF in bianco e da 1 a 4 e da singole celle e MESF per ciascun campione di esperimento.
5. Generare valori MFI corretti (cMFI) per le frazioni MESF da 1 a 4 sottraendo l'IFM della popolazione di perline vuote da ciascuna frazione.
6. Generare cMFI per singoli BSLB e celle (fare riferimento al pannello Figura 3C (i)).
7. Utilizzare il segnale di BSLB colorato con anticorpi di controllo dell'isotipo per correggere l'MFI di BSLB colorato con anticorpi contro i marcatori delle cellule T pertinenti. Utilizzare cMFI per calcolare la percentuale di trasferimento sinaptico normalizzato (NST%) utilizzando l'equazione mostrata nel pannello Figura 3C (ii).
8. Se invece siete interessati alle particelle specificamente trasferite in risposta all'attivazione del TCR, sottrarre il segnale da BSLB nulli dall'MFI dei BSLB agonistici. Utilizzare questo cMFI per calcolare l'NST% guidato da TCR utilizzando l'equazione mostrata nel pannello Figura 3C (ii).
9. Se interessati a determinare il numero totale di molecole trasferite come carico di particelle attraverso l'interfaccia T cell-BSLB, acquisire perline di riferimento MESF utilizzando le stesse impostazioni dello strumento e la stessa sessione di acquisizione per le cocolture T-BSLB.
10. Analizzare le popolazioni di perline MESF ed estrarre i loro cMFI come indicato nei passaggi del protocollo da 5.8.15 a 5.8.17. Calcolare la pendenza della linea di migliore adattamento per l'analisi di regressione di MESF su cMFI.
11. Utilizzare la pendenza calcolata per estrarre il numero di MESF depositati sui BSLB. Utilizzare cMFI calcolati utilizzando controlli isotipici o BSLB nulli come spazi vuoti per estrarre il numero di MESF trasferiti specificamente ai BSLB stimolanti.
12. Calcolare il numero di molecole di marcatori trasferiti ai BSLB dividendo i MESF calcolati (medi) per BSLB per il valore F/P dell'anticorpo di quantificazione.

Representative Results

FCM per la quantificazione assoluta delle proteine sulla superficie cellulare
La ricostituzione di BSLB che presentano densità fisiologiche di ligandi richiede la stima delle densità proteiche totali sul sottoinsieme cellulare modellato. Per ricostituire i BSLB, includere qualsiasi ligando rilevante che si prevede svolga un ruolo nell'asse di segnalazione di interesse insieme alle proteine che supportano l'adesione e l'interazione funzionale tra BSLB e cellule, come ICAM-1 e molecole costimulatorie, ad esempio i recettori CD40, CD58 e B7 (CD80 e CD86). Ulteriori proteine possono essere aggiunte a seconda della domanda in questione, comprese molecole costimulatorie come ^ICOSL3, PD-L1 e PD-L215. Per qualsiasi altra molecola, ricostituire i BSLB utilizzando densità molecolari determinate analizzando direttamente le cellule con citometria a flusso quantitativa. Per gli anticorpi coniugati direttamente, BioLegend fornisce valori F/P per ogni numero di lotto di anticorpi. Gli anticorpi possono anche essere etichettati internamente e i rapporti F / P determinati dalla spettrofotometria, fornendo un'alternativa quando non ci sono anticorpi commerciali coniugati al fluorocromo desiderato. Poiché utilizziamo gli stessi anticorpi per calibrare il numero di proteine ricombinanti sulla superficie delle cellule e dei BSLB, non è necessario correggere la valenza di legame degli anticorpi in quanto rimane costante. Se è richiesta la valenza di legame anticorpale, utilizzare sia proteine ricombinanti che anticorpi con F/P noti per decorare i BSLB e confrontare le molecole di proteine ricombinanti caricate con il numero di anticorpi legati dopo la colorazione in condizioni di saturazione.

Le molecole anticorpali legate per cellula possono essere stimate utilizzando una misurazione citometrica a flusso monocromatica dedicata o un pannello policromatico di anticorpi destinati a stimare le densità proteiche assolute su un sottoinsieme relativamente raro di cellule all'interno di un tessuto di interesse, come le tonsille palatine. La Figura 1 mostra misure rappresentative delle densità di ICAM-1 nelle cellule B CXCR5+ e nelle cellule T follicolari (TFH) come esempio. Lo stesso protocollo di colorazione e gli stessi principi di analisi della citometria a flusso mostrati nella Figura 1A possono essere utilizzati per misurare le densità proteiche su cellule epiteliali, cellule stromali, monociti, cellule dendritiche derivate da monociti (moDC) o su linfociti B e T in altri tessuti umani e murini. Per i tessuti diversi dal sangue e dalle tonsille, è necessario prestare attenzione quando si isolano le cellule utilizzando cocktail di proteasi, poiché l'esposizione prolungata delle cellule agli enzimi digerenti riduce i livelli di espressione della superficie cellulare.

Focalizzare l'acquisizione e le analisi su singole cellule vive all'interno della finestra di acquisizione continua (Figura 1A ii), poiché gli eventi al di fuori del continuum temporale diffondono aberrantemente la luce, compromettendo la quantificazione. Per aumentare l'accuratezza delle determinazioni, ridurre la colorazione non specifica degli APC bloccando efficacemente i FcγR. Il siero umano e l'EDTA presenti nell'hFCB consentono un efficiente blocco della FcγR durante la chelazione del ^Ca2+ libero per ridurre l'aggregazione spontanea delle cellule durante la loro manipolazione e colorazione (le frecce nere in Figura 1A (iii) e (iv) mostrano i doppietti rimanenti nelle sospensioni di cellule tonsillari).

Tenere traccia delle prestazioni dello strumento utilizzando le perline di setup e tracking e il software (o simili; vedi la Tabella dei Materiali) è fondamentale per la riproducibilità delle quantificazioni nel tempo, specialmente nelle fasi successive quando il trasferimento sinaptico delle particelle a BSLB viene misurato utilizzando solo MFI (cioè per i fluorocromi per i quali non esistono standard MESF). Allo stesso modo, controllare l'intervallo lineare (cioè linearità minima e linearità massima) delle unità di fluorescenza arbitrarie per il rivelatore di quantificazione da utilizzare insieme agli standard MESF in modo tale che ciascun punto di calibrazione mantenga la relazione lineare tra fluorescenza e numero di fluorocromi.

La preparazione di campioni "vuoti" per la fluorescenza, o campioni che forniscono un'idea del rumore di colorazione di fondo, sono essenziali per sottrarre il segnale fluorescente non specifico. I controlli isotipici e/o i campioni biologicamente nulli (ad esempio, knockout) sono essenziali per correggere il segnale di fondo delle cellule ed estrarre il vero segnale derivato dagli anticorpi di quantificazione (Figura 1A pannello (viii)). Allo stesso modo, le perle MESF standard utilizzano una popolazione vuota dedicata per sottrarre il segnale di fondo da ogni popolazione di perline veramente positiva (pannelli Figura 1B (vii) e (viii)). Una volta eseguite le analisi di regressione e estratta la pendenza che definisce la relazione tra MESF e MFI corrette, la conversione in densità molecolari assolute segue semplici operazioni matematiche (Figura 1C).

Per stimare il CSA nella Figura 1C, l'esclusione di corrente elettrica (CASY-TT) è stata utilizzata per estrarre le misurazioni del volume e del diametro delle celle da migliaia di celle. Il CSA risultante stimato dal calcolo della superficie per le sfere (^4pr2) varia con lo stato di attivazione delle cellule, con valori osservati di 170,37 ± 4,91 ^μm2 per le cellule B non attivate e 234,52 ± 1,53 ^μm2 e 318 ± 24,45 ^μm2 per le cellule T non attivate e attivate, rispettivamente. Questi CSA sono paragonabili a quelli stimati con tecniche di imaging come la tomografia tridimensionale con indice di rifrazione dei linfociti non ^attivati16.

Una volta definito l'intervallo di densità fisiologiche (ad esempio, confrontando le densità superficiali su cellule sottoposte a diversi programmi di attivazione), i BSLB possono essere utilizzati per modellare tali superfici. Una titolazione di monomeri antigenici HLA-peptidici biotinilati forniti dalla struttura tetramerica NIH (o monobiotinilato monomerico anti-CD3ε-Fab) può essere utilizzata insieme a ICAM-1 12-His per ricostituire una membrana APC canonica. Le proteine commerciali etichettate con 6, 9, 12 e 14 His possono essere utilizzate per decorare la superficie di BSLB (vedere la Figura 2A per esempi con ICAM-1 12-His). Le titolazioni proteiche insieme alle analisi quantitative FCM forniscono una solida metodologia per ricostituire le superfici FISIOLOGICHE APC e testare il loro effetto sulla produzione sinaptica di diversi sottoinsiemi di cellule T.

Per studiare l'output delle sinapsi delle cellule T, utilizzare un rapporto BSLB-T di 1:1 per garantire che, in media, una cellula interagisca con un BSLB nel periodo studiato. Abbiamo osservato che il trasferimento di materiale è proporzionale al tempo di incubazione, fornendo una piattaforma versatile per rilevare molecole trasferite in basse quantità attraverso l'interfaccia cell:BSLB. Un'adeguata progettazione del pannello è quindi fondamentale per aumentare la sensibilità e l'affidabilità del rilevamento di materiale transsinaptico, poiché nel caso dei TSV, l'uscita varia tra 25 e 36 vescicole / cella / 20 ^min2,3. Testare prima lo spillover spettrale di ciascun anticorpo e lipide marcato con fluorocromo. Quando si osserva un elevato spillover, si consiglia la titolazione degli anticorpi di colorazione e la percentuale di lipidi fluorescenti che compongono il BSLB, nonché le passeggiate di tensione PMT per ridurre l'errore di diffusione su campioni compensati e migliorare il rapporto segnale su rumore, rispettivamente (fare riferimento a 12,14,17 per un'introduzione dedicata all'argomento).

L'uso di controlli di quantificazione, tra cui BSLB nulli (privi di antigene o anti-CD3 Fab) e cellule knockout o campioni marcati con ^isotipo18, è essenziale per misurare con precisione il trasferimento di tSV effettore, come i SE, così come le particelle di attacco supramolecolare rilasciate all'interno della fessura sinaptica. Utilizzare proteine di superficie cellulare ad alta abbondanza come CD4, CD2 o CD45 insieme a lipidi fluorescenti sintetici (coniugati DOPE Atto) per identificare la popolazione di singole cellule e BSLB dopo la dissociazione a freddo dei coniugati. Focalizzare le analisi sulla media geometrica o mediana delle intensità di fluorescenza in singoli BSLB e cellule (CD4 è usato nella Figura 3B). Le SE sono un tipo specializzato di tSV derivato dalla membrana plasmatica (PM), e il loro trasferimento a BSLB è evidenziato dal guadagno del segnale marcatore sui BSLB con la consistente perdita di segnale sulla superficie delle cellule interagenti (fare riferimento a TCR su BSLB come mostrato in Figura 2B, frecce viola). I BSLB nulli privi di antigene o anti-CD3 sono un ottimo riferimento per tenere traccia del guadagno specifico di TCR (e altri marcatori delle cellule T) su BSLB derivante dalla stimolazione delle cellule interagenti attraverso il loro complesso TCR.

Figura 1: Quantificazione assoluta delle proteine sulla superficie delle APC. (A) Esempio di misure quantitative di citometria a flusso di ICAM-1 sulla superficie di cellule B tonsillari (Foll. Bc) e cellule T helper (TFH). (i-vii) Strategia di Gating per l'analisi di singoli CXCR5⁺ Bc e TFH isolati da tonsille palatine umane. Viene mostrata la strategia di gating sequenziale per l'identificazione di singoli eventi live contenuti nella finestra continua di acquisizione. (iii-iv) le frecce nere indicano i doppietti. viii) istogrammi sovrapposti che mostrano l'espressione superficiale cellulare di ICAM-1 (istogrammi verde acqua) rispetto ai controlli FMO (istogrammi grigi) e ai controlli FMO etichettati con isotipi pertinenti (istogrammi neri, che si sovrappongono agli istogrammi grigi) delle popolazioni di cui al punto vii). Le frecce indicano la direzione della strategia di gating nidificata utilizzata per identificare le cellule B CXCR5⁺ (Bc; CD19⁺) e TFH (CD4⁺). (B) L'estrazione di molecole assolute sulla superficie delle cellule tonsillari dall'IFM richiede analisi di regressione delle perle di riferimento MESF acquisite utilizzando la stessa impostazione dello strumento delle cellule mostrate in A. (i-v) Viene mostrata la strategia di gating sequenziale per l'identificazione di singoli eventi live contenuti nella finestra continua di acquisizione. vi) Gating e misurazione di IFM di diverse popolazioni standard di MESF. vii) sono riportati gli istogrammi sovrapposti delle popolazioni MESF di cui al punto vi). I valori visualizzati in alto a destra rappresentano le IFM per ciascuna delle 5 popolazioni MESF (vuote, 1, 2, 3 e 4). (viii) Regressione lineare del MESF su cMFI per le popolazioni MESF di cui al punto vii). Viene mostrata la pendenza (b) per l'estrazione di MESF legato alle celle dai dati in A. (C) Nell'estrazione del numero di molecole, seguire semplici operazioni matematiche a partire dall'applicazione della pendenza calcolata in (viii) da valori misurati MESF cMFI (cMFIM) e MESF di riferimento (_MESFR). Per estrarre il MESF legato alle cellule (_MESFcells), dividere l'IFM corretta delle cellule (_cMFIcells) per la pendenza calcolata. Quindi, per calcolare il numero di molecole legate alle cellule (Molec. _cellule), dividere _{le MESFcelle} per l'F/P dell'anticorpo di rilevazione (quantificazione). Infine, per calcolare la densità molecolare sulla superficie delle cellule (_Dcells), dividere Molec. _cellule in base alla superficie cellulare stimata (CSAE). Abbreviazioni: X = variabile indipendente; Y = variabile dipendente (fluorescenza misurata), cMFIM = MFI corretta misurata; _MESFR = valori MESF di riferimento; _MESFcells = MESF stimato per cella; _cMFIcells = cellule MFI corrette; Molec. _cellule = molecole stimate per cellula. _Dcells = densità stimata sulle cellule; _CSAE = superficie cellulare stimata. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Ricostituzione di BSLB con ICAM-1 ricombinante e misurazione del trasferimento di particolato a BSLB. (A, i-vi) Analisi citometrica a flusso di BSLB ricostituita con densità aumentate di ICAM-1 12-His monomerico ricombinante (rICAM-1). (i-v) Come nella Figura 1, focalizzare la strategia di gating su singoli BSLB all'interno della finestra continua di acquisizione. Si noti lo spazio immediatamente prima del cancello del continuum temporale, che è stato escluso per evitare errori di misurazione. (vi) Una buona qualità proteica spesso si traduce nel rivestimento omogeneo di BSLB ad alte concentrazioni, con l'osservazione di distribuzioni di fluorescenza strette (basso coefficiente di variazione, vedi istogrammi in vi). (B) Analisi di regressione della concentrazione di riferimento ICAM-1 (_CR) sulla densità misurata (_DM). Utilizzare la pendenza per calcolare le concentrazioni target di proteine (_CT) per ottenere la densità delle cellule (_Dcells) misurata negli esperimenti in Figura 1. Abbreviazioni: 12-His = 12-istidine tag; _DM = densità molecolari misurate; _CR = concentrazioni di riferimento del rICAM-1; _CT = concentrazione target (da interpolare); _Dcells = densità misurate in cellule (vedi anche Fig. 1C). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Misurazione delle particelle sinaptiche delle cellule T trasferite ai BSLB. (A; i-v) Diagramma di flusso che mostra le fasi critiche per la co-coltura di cellule T con BSLB che ricostituiscono membrane modello e la successiva misurazione del trasferimento di particelle con citometria a flusso. (iv) I diagrammi blu e giallo scuro mostrano la distribuzione relativa e la posizione delle cellule e dei BSLB nei grafici biparametrici a citometria a flusso. (v) Istogrammi di distribuzione della fluorescenza che mostrano il guadagno relativo di fluorescenza dei BSLB agonistici (giallo scuro) rispetto ai BSLB nulli (grigio). (B) Esperimento esemplare di trasferimento sinaptico. (i-vi) Viene mostrata la strategia di gating per identificare singoli BSLB e celle all'interno della finestra di acquisizione continua. Le frecce viola indicano la direzione dell'analisi, che continua in C. (C) (i) Focalizzare le analisi sull'IFM di singole cellule (blu) e singoli BSLB (giallo). (ii) Equazioni per calcolare il trasferimento sinaptico normalizzato (NST%, in alto) e _Tmax% (in basso) dal cMFI calcolato per BSLB e celle. (iii-vi) Istogrammi sovrapposti che mostrano il cambiamento delle distribuzioni di intensità della fluorescenza per le cellule (sfumature blu) e BSLB (sfumature gialle) attraverso diverse densità della cellula T che attivano l'anti-CD3ε-Fab, incluso il non attivante (grigio) e l'attivazione con 250 (valore di colore morbido) o 1.000 (alto valore di colore) molec./^μm2. I numeri in diversi valori di colore rappresentano la percentuale NST misurata per gli istogrammi BSLB mostrati in giallo. Gli istogrammi sovrapposti mostrano la gerarchia generale nel trasferimento sinaptico delle vescicole delle cellule T positive per diversi marcatori. Per questa composizione di BSLB (200 molec./^μm2 di ICAM-1 e densità crescenti di anti-CD3ε-Fab), i tSV vengono trasferiti a BSLB con TCR⁺(iii) > CD81⁺(iv) > CD4⁺(v) > CD28⁺(vi). Come dimostrato in articoli precedenti, TCR e CD81 sono componenti di SE e vengono trasferiti con efficienze relativamente più elevate a CD4, nonostante quest'ultimo sia espresso a livelli di superficie relativamente più elevati. Lo spargimento di SE provoca la perdita della superficie cellulare CD81 e TCR e il guadagno di questi segnali sui BSLB (frecce viola aperte per 250 molec./^μm2 e frecce viola chiuse per 1.000 molec./^μm2 in istogrammi gialli). (D) Il raffreddamento improprio dei coniugati porta a cellule che strappano l'SLB dalle perle di silice come si vede confrontando le perle di ingresso (grafico biparametrico sinistro) e i coniugati sottoposti a un rapido raffreddamento fino a 4 °C da 37 °C (grafico biparametrico destro). Confronta anche con il pannello Figura 3B (vi). Abbreviazioni: PRF1 = perforin 1; NST% = trasferimento sinaptico normalizzato; _Tmax% = percentuale del trasferimento massimo osservato (in condizioni di controllo o di riferimento); tSV: vescicole trans-sinaptiche; SE: ectosomi sinaptici. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Buffer utilizzati in questo protocollo. Fare clic qui per scaricare questa tabella.

Discussion

I BSLB sono strumenti versatili per studiare la produzione di particolato delle cellule T stimolate con membrane APC modello. La flessibilità del metodo consente la ricostituzione di composizioni di membrana complesse e riduzioniste per studiare gli effetti dei ligandi e dei loro segnali sulla secrezione di tSV e particelle di attacco supramolecolare e dei loro componenti. Abbiamo testato questa tecnologia su varie cellule T, tra cui TH, CTL, Tregs e ^CART15 preattivati. Questo protocollo funziona anche per la misurazione del rilascio di particelle sinaptiche di cellule T appena isolate e quiescenti. Una limitazione dell'uso di cellule T appena isolate è che queste popolazioni quiescenti producono un diverso profilo di particelle trans-sinaptiche, che è correlato alla loro composizione della superficie cellulare (vedi ¹⁵ per maggiori dettagli).

Come semplice pannello di citometria a flusso, raccomandiamo l'uso del clone anti-TCR IP26, del clone anti-CD81 5A6, del clone anti-perforina (PRF1) B-D48 o del clone anti-CD40L 24-31 e dei lipidi contenenti ATTO 390 o ATTO 565 (per conferire ai BSLB una fluorescenza intrinseca). Per aiutare a discriminare le singole cellule da singoli BSLB e coniugati, raccomandiamo l'uso del clone anti-CD4 OKT4 e/o del clone anti-CD45 HI30, che vengono trasferiti ai BSLB a livelli limitati nonostante siano espressi a livelli molto elevati sulla superficie cellulare (vedere Tabella dei materiali per ulteriori dettagli sui fluorocromi e altri anticorpi convalidati). I pannelli con un numero maggiore di fluorocromi possono essere progettati ma richiedono una valutazione sistematica dello spettro di fluorescenza di ciascun fluorocromo analizzato. Per aumentare la sensibilità, provare diverse titolazioni di anticorpi di quantificazione che vanno da 0,5 μg a 20 μg / mL finali e ripetere ogni volta che vengono utilizzate nuove scorte di anticorpi. Per garantire la riproducibilità delle misure assolute e relative del trasferimento di particelle, titolare e calcolare la capacità di legame di ogni nuovo lotto di fosfolipidi biotinilati e contenenti Ni, in quanto potrebbero differire significativamente da lotto a lotto. Il graduale raffreddamento dei coniugati T-BSLB è fondamentale per aumentare la sensibilità di rilevamento di particelle con bassa abbondanza. Il rapido raffreddamento delle cocolture porta alla distruzione dei BSLB, come evidenziato dalla significativa perdita di fluorescenza lipidica (Figura 3D).

Diverse metriche possono essere utilizzate per misurare la produzione di particolato delle sinapsi immunitarie delle cellule T a seconda della domanda sperimentale in questione. Ad esempio, quando sono previste piccole differenze nei livelli di espressione basale delle proteine di superficie ordinate in SE in erba, è possibile utilizzare una metrica di trasferimento sinaptico normalizzato (NST%) (Figura 3C pannello (ii) equazione superiore). Quest'ultimo quantifica la percentuale di segnale MFI sui BSLB in funzione del totale, combinato MFI di cellule e perline. Un avvertimento di questo approccio è l'analisi di marcatori trasferiti non espressi sul PM, come componenti di particelle di attacco supramolecolari19. Poiché questi elementi raggiungono i BSLB per vie indipendenti dal transito del PM, come l'esocitosi intracellulare della memoria, il calcolo dell'NST% non è raccomandato in quanto il risultato sarà gonfiato perché il numeratore sarà diviso per un denominatore relativamente piccolo (livello di espressione della superficie cellulare). Invece, utilizzare MFI corrette per confrontare la deposizione di perforina e granzimi tra BSLB nulli e BSLB che presentano densità crescenti di antigene o anti-CD3 Fab. In alternativa, per tracciare gli elementi intracellulari trasferiti ai BSLB, utilizzare per il confronto le molecole assolute stimate trasferite o la percentuale di segnale per quanto riguarda il segnale massimo trasferito ai BSLB (_Tmax%) (Figura 3C pannello (ii) equazione inferiore). Per il _Tmax%, utilizzare cMFI o molecole misurate sul campione BSLB (o condizione) che presenta la più alta densità di antigene come _Tmax di riferimento. Quando si analizzano diversi donatori, utilizzare _Tmax specifico del donatore per i confronti. Quando si studia il materiale trasferito in risposta all'innesco specifico del TCR, le IFM possono anche essere corrette al livello di trasferimento di fondo osservato sui BSLB antigene-negativi (nulli).

Stimare il numero assoluto di molecole trasferite ai BSLB è un metodo più robusto, in quanto ciò comporta la calibrazione MESF con la misurazione delle molecole come endpoint e un migliore confronto di esperimenti indipendenti. _Tmax% offre una normalizzazione simile attraverso esperimenti indipendenti ed è particolarmente utile quando si utilizza FCM policromatico per marcatori intracellulari, come perforina e granzimi, o per marcatori per i quali non è disponibile lo standard MESF. _Tmax% è semplicemente la percentuale di segnale in una data condizione alla condizione con il più alto trasferimento nella condizione di controllo (ad esempio, controlli veicolo / non trattati per studi farmacologici, RNA guida di controllo per librerie CRISPR / Cas9). Inoltre, il _Tmax% può essere utilizzato sia per i cMFI che per un numero assoluto di molecole ed è stato particolarmente utile per i confronti fianco a fianco degli effetti delle delezioni geniche sull'output sinaptico delle cellule T. Quest'ultimo è evidente quando l'editing genetico porta ad un'elevata variabilità nella gamma dinamica dell'espressione del recettore immunitario tra donatori ed esperimenti indipendenti, che potrebbero avere un impatto sulle misurazioni assolute e NST%.

I BSLB hanno facilitato la cattura e la caratterizzazione dell'output sinaptico di diversi tipi di cellule T, che altrimenti sono difficili da isolare a causa della loro rapida internalizzazione da parte degli ^APC2. La stabilità fisica dei BSLB fornisce anche una piattaforma per lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza dei BSLB che sono stati rilevati dalle cellule T, consentendo così la caratterizzazione biochimica di preparati di particelle altamente pure mediante spettrometria di massa e tecnologie di sequenziamento degli acidi nucleici. Quest'ultimo facilita la caratterizzazione dettagliata dei messaggeri intercellulari rilasciati dalle cellule T in una vasta gamma di condizioni sperimentali. Diverse domande possono essere affrontate, tra cui come questi messaggeri del particolato cambiano tra diversi tipi di cellule T e stati di attivazione, come i recettori dell'antigene canonici e non canonici (cioè i recettori dell'antigene chimerico) e come i segnali agonistici e antagonisti della membrana influenzano la composizione delle particelle. Attualmente stiamo sviluppando ulteriormente questa tecnologia per la caratterizzazione quantitativa delle citochine secrete nella sinapsi immunitaria delle cellule T stimolate. Quest'ultimo richiede l'attento studio di combinazioni di recettori e anticorpi delle citochine ricombinanti, fornendo una cattura efficiente di interleuchine, interferoni e chemochine depositate sui BSLB dopo l'attivazione delle cellule T. I BSLB possono essere adattati per modellare la composizione superficiale di altri APC sospettati di innescare il rilascio di tSV da parte delle cellule T, come le cellule immunitarie stromali e innate. I BSLB possono anche essere adattati per lo screening di nuovi composti farmacologici che cercano la modulazione positiva e negativa del meccanismo di secrezione esocitica e tSV per il trattamento del cancro e di altre patologie. Infine, i BSLB possono anche essere utilizzati per scoprire determinanti di virulenza che modulano la funzione delle cellule T nelle malattie ^infettive20.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl] (nickel salt)	Avanti Polar Lipids	790404C-25mg	18:1 DGS-NTA(Ni) in chloroform
PIPETMAN L Multichannel P8x200L, 20-200 µL	Gilson	FA10011
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine	Avanti Polar Lipids	850375C-25mg	18:1 (Δ9-Cis) PC (DOPC) in chloroform
1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) ATTO 390	ATTO-TEC	AD 390-165	DOPE ATTO 390
1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) ATTO 488	ATTO-TEC	AD 488-165	DOPE ATTO 488
1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) ATTO 565	ATTO-TEC	AD 565-165	DOPE ATTO 565
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(cap biotinyl) (sodium salt)	Avanti Polar Lipids	870273C-25mg	18:1 Biotinyl Cap PE in chloroform
200 µL yellow tips 10 x 96 Tips, Stack	Starlab	S1111-0206
5 mL polystyrene round-bottom tubes	Falcon®	352052
5.00 ± 0.05 µm non-functionalized silica beads	Bangs Laboratories Inc.	SS05003
96 Well Cell Cultture Plate U-bottom with Lid, Tissue culture treated, non-pyrogenic.	Costar®	3799	For FCM staining and co-culture of BSLB and cells.
96 Well Cell Cultture Plate V-bottom with Lid, Tissue culture treated, non-pyrogenic.	Costar®	3894	For FCM staining of cells or beads in suspension.
Alexa Fluor 488 NHS Ester (Succinimidyl Ester)	Thermo Fisher Scientific, Invitrogen™	A20000
Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)	Thermo Fisher Scientific, Invitrogen™	A37573 and A20006
Allegra X-12R Centrifuge	Beckman Coulter		For normal in tube staining of biological samples for FCM
Aluminum Foil	Any brand		For protecting cells and BSLBs from light
anti-human CD154 (CD40L), clone 24-31	BioLegend	310815 and 310818	Alexa Fluor 488 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively.
anti-human CD185 (CXCR5) Brilliant Violet 711, clone J252D4	BioLegend	356934	For quantitative FCM analysis of tonsillar cells as shown in Fig. 1E
anti-human CD19 Brilliant Violet 421, clone HIB19	BioLegend	302234	For quantitative FCM analysis of tonsillar cells as shown in Fig. 1E
anti-human CD2, clone RPA-2.10	BioLegend	300202	Labeled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD2, clone TS1/8	BioLegend	309218	Brilliant Violet 421 conjugate.
anti-human CD252 (OX40L), clone 11C3.1	BioLegend		Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human CD28, clone CD28.2	eBioscience	16-0289-85	Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD317 (BST2, PDCA-1), clone 26F8	ThermoFisher Scientific, invitrogen	53-3179-42	Alexa Fluor 488 conjugate, we found this clone to be cleaner than clone RS38E.
anti-human CD38, clone HB-7	BioLegend	356624	Alexa Fluor 700 conjugate
anti-human CD38, clone HIT2	BioLegend	303514	Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human CD39, clone A1	BioLegend		Labeled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD4 Brilliant Violet 650, clone OKT4	BioLegend	317436	For quantitative FCM analysis of tonsillar cells as shown in Fig. 1E
anti-human CD4, clone A161A1	BioLegend	357414 and 357421	PerCP/Cyanine5.5 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively
anti-human CD4, clone OKT4	BioLegend	317414 and 317422	PE/Cy7 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively
anti-human CD40, clone 5C3	BioLegend	334304	Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD40, clone G28.5	BioLegend		Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD45, clone HI30	BioLegend	304056 and 368516	Alexa Fluor 647 and APC/Cy7 conjugates
anti-human CD47, clone CC2C6	BioLegend	323118	Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human CD54 (ICAM-1), clone HCD54	BioLegend	322702	Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD63 (LAMP-3), clone H5C6	BioLegend	353020 and 353015	PerCP/Cyanine5.5 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively
anti-human CD73, clone AD2	BioLegend	344002	Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD80, clone 2D10	BioLegend	305216	Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human CD81, clone 5A6	BioLegend	349512 and 349502	PE/Cy7 conjugate and labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester), respectively.
anti-human CD82, clone ASL-24	BioLegend	342108	Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human CD86, clone IT2.2	BioLegend	305416	Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human CD8a, clone HIT8a	BioLegend	300920	Alexa Fluor 700 conjugate
anti-human CD8a, clone SK1	BioLegend	344724	Alexa Fluor 700 conjugate
anti-human HLA-A/B/C/E, clone w6/32	BioLegend	311414 and 311402	Alexa Fluor 647 conjugate and Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human HLA-DR, clone L243	BioLegend	307656 and 307622	Alexa Fluor 488 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively.
anti-human ICAM-1, clone HCD54	BioLegend	322702	Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human ICOS, clone C398.4A	BioLegend	313516	Armenian Hamster IgG
anti-human ICOSL, clone MIH12	BioLegend	329611	Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human ICOSL, clone MIH12	eBioscience	16-5889-82	Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human LFA-1, clone TS1/22	BioLegend	Produced in house	Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human OX40, clone Ber-ACT35 (ACT35)	BioLegend	350018	Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human PD-1 , clone EH12.2H7	BioLegend	135230 and 329902	Alexa Fluor 647 conjugate and Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human PD-L1, clone 29E.2A3	BioLegend	329702	Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human PD-L2, clone 24F.10C12	BioLegend	329611	Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human PD-L2, clone MIH18	BioLegend	345502	Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human TCRab, clone IP26	BioLegend	306712 and 306714	Alexa Fluor 488 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively.
antti-human CD156c (ADAM10), clone SHM14	BioLegend	352702
antti-human CD317 (BST2, Tetherin), clone RS38E	BioLegend	348404	Alexa Fluor 647 conjugate
Armenian Hamster IgG Alexa Fluor 647 Isotype control, clone HTK888	BioLegend	400902	Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
BD Cytometer Setup and Tracking beads	Becton Dickinson & Company (BD)	641319	Performance track of instruments before quantitative FCM
BD FACSDiva	Becton Dickinson & Company (BD)	23-14523-00	Acquisition software
Bovine Seum Albumin	Merck, Sigma-Aldrich	A3294
CaCl2, Calcium chloride	Merck, Sigma-Aldrich	C5670	anhydrous, BioReagent, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥96.0%
Casein from bovine milk, suitable for substrate for protein kinase (after dephosphorylation), purified powder	Merck, Sigma-Aldrich	C5890
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28	ThermoFisher Scientific, Gibco	11132D
DynaMag-2	ThermoFisher Scientific, Invitrogen™	12321D	For the removal of Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 in volumes less than 2 mL
DynaMag™-15	ThermoFisher Scientific, Invitrogen™	12301D	For the removal of Dynabeads™ Human T-Activator CD3/CD28 in volumes less than 15 mL
Fetal Bovine Serum Qualified, One Shot	ThermoFisher Scientific, Gibco	A3160801	Needs heat inactivation for 30 min at 56 oC
Ficoll-Paque PLUS	Cytiva, GE Healthcare	GE17-1440-02	Sterile solution of polysaccharide and sodium diatrizoate for lymphocyte isolation
Fixable Viability Dye eFluor 780	eBiosciences	65-0865-14	For the exclusion of dead cells during analyses
FlowJo	Becton Dickinson & Company (BD)	Version 10.7.1	Analysis software
Grant Bio MPS-1 Multi Plate Shaker	Keison Products	MPS-1	For the mixing of either cells during stainings or BSLBs during staning or protein loading (as an alternative to orbital agitation)
HEPES Buffer Solution (1 M)	ThermoFisher Scientific, Gibco	15630-056
HEPES, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid), 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid.	Merck, Sigma-Aldrich	H4034	For preparation of HBS/HAS or HBS/BSA buffer. BioPerformance Certified, ≥99.5% (titration), suitable for cell culture
HERACell 150i CO2 incubator, 150 L, Electropolished Stainless Steel	ThermoFisher Scientific	51026282	For culturing and expanding purified CD4+ and CD8+ T cells.
Hula Mixer® Sample Mixer	ThermoFisher Scientific, Life Technologies	15920D	Vertical, variable-angle laboratory mixer used for the mixing of BSLBs and lipid master mix, blocking solutions, protein master mix and small scale antibody stainings.
Human Serum Albumin, 30% aqueous solution	Merck, Sigma-Aldrich	12667-M
Human TruStain FcX Fc Receptor Blocking Solution	BioLegend	422302	Fc Receptor Blocking Solution for blocking of Fc Receptors from biologically relevant samples
Innovatis CASY cell counter and analyzer TT	Biovendis Products GmbH		For the counting of cells and the determination of cell size and volume based on the exclusion of electric current.
KCl, Potassium chloride	Merck, Sigma-Aldrich	P5405	Powder, BioReagent, suitable for cell culture
L-Glutamine 200 mM (100x)	ThermoFisher Scientific, Gibco	25030-024
MgCl2, Magessium chloride	Merck, Sigma-Aldrich	M2393	BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture
Microtube Insert for 24 x 1.5/2.0 mL tubes	Keison Products	P-2-24	Microtube insert for Grant Bio MPS-1 Multi Plate Shaker
Mini Incubator	Labnet International	I5110A-230V	For the incubation (co-culturing) of BSLB and cells in the absence of CO2
Minimum Essential Medium Non-Essential Amino Acids	ThermoFisher Scientific, Gibco	11140-035
Mouse IgG polyclonal antibody control	Merck, Sigma-Aldrich	PP54	Used as positive control for the measurement of antibodies bound to mouse IgG capture bead standards
Mouse IgG1, k Isotype, clone MOPC-21	BioLegend	400129, 400112, 400130, 400144, 400128 and 400170	Alexa Fluor 488, PE, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 700, APC/Cyanine7 and Brilliant Violet 785  conjugates, respectively.
Mouse IgG1, k Isotype, clone X40	Becton Dickinson & Company (BD), Horizon	562438	Brilliant Violet 421 conjugate.
Mouse IgG1, κ Isotype control, clone P3.6.2.8.1	eBioscience	14-4714-82	Labeled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
Mouse IgG2a, k Isotype, clone MOPC-173	BioLegend	400240	Alexa Fluor 647 conjugate
Mouse IgG2b, k Isotype, clone MPC-11	BioLegend	400330 and 400355	Alexa Fluor 647 and Brilliant Violet 785 conjugates, respectively
Multiwell 6 well Tissue culture treated with vacuum gas plasma	Falcon	353046	For culturing and expanding purified CD4+ and CD8+ T cells.
Na2HPO4, Disodium Phosphate	Merck, Sigma-Aldrich	S7907
NaCl, Sodium chloride	Merck, Sigma-Aldrich	S5886	BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥99%
NiSO4, Nickel(II) sulfate	Merck, Sigma-Aldrich	656895	For saturating NTA sites; added during the blocking process
Penicillin Streptomycin [+]10,000 units Penicillin; [+] 10,000 µg/mL Streptomycin	ThermoFisher Scientific, Gibco	15140-122
Phosphate Buffered Saline pH 7.4, sterile	ThermoFisher Scientific, Gibco	10010	No Ca2+ or Mg2+ added
Polyethersulfone (PES) Filter unit	Thermo Scientific Nalgene	UY-06730-43	Hydrophilic PES membrane with low protein binding facilitates the filtering of solutions with high protein content
PURESHIELD argon ISO 14175-I1-Ar	BOC Ltd.	11-Y	For the protection of lipid stocks stored at +4 ºC.
Purified Streptavidin	BioLegend	280302
Quantum Alexa Fluor 488 MESF beads	Bangs Laboratories Inc.	488	Benchmark beads for the interpolation of Alexa Fluor 488 molecules bound to cells and/or BSLB
Quantum Alexa Fluor 647 MESF beads	Bangs Laboratories Inc.	647	Benchmark beads for the interpolation of Alexa Fluor 647 molecules bound to cells and/or BSLB
Rat anti-mouse IgG Kappa Light Chain, clone OX-20	ThermoFisher Scientific, invitrogen	SA1-25258	Labeled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
Recombinant human IL-2	Peprotech	200-02-1MG
RMPI Medium 1640 (1x); [-] L-Glutamine	ThermoFisher Scientific, Gibco	31870-025
Rosette Human B Cell Enrichment Cocktail	STEMCELL Technologies	15064	Isolation of B cells for measuring densities of proteins in purified cell populations
Rosette Human CD4+ T Cell Enrichment Cocktail	STEMCELL Technologies	15022C.1
Rosette Human CD4+CD127low T Cell Enrichment Cocktail	STEMCELL Technologies	15361	Pre-enrichment of CD4+ CD127Low T cells for the downstream isolation of Tregs by FACS.
Rosette Human CD8+ T Cell Enrichment Cocktail	STEMCELL Technologies	15063
RPMI Medium 1640 (1x); [-] Phenol Red	ThermoFisher Scientific, Gibco	11835-063	For the incubation (co-culturing) of BSLB and cells in the absence of CO2. Phenol red-free media reduces the autofluorescence of cells in flow cytometry and microscopy based measurements.
Sodium Pyruvate (100 mM)	ThermoFisher Scientific, Gibco	11360-070
Sprout mini centrifuge	FisherScientific, Heathrow Scientific LLC	120301	Benchtop microcentrifuge used to wash silica beads and BSLB in 1.5 mL Eppendorf tubes.
Sterile cappeed 5 mL polystyrene round-bottom tubes	Falcon	352058
UltraComp eBeads Compensation Beads	ThermoFisher Scientific, invitrogen	01-2222-42
Zeba Spin Desalting Columns 7K MWCO	Thermo Fisher Scientific, Invitrogen™	89882