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Immunology and Infection

मनका-समर्थित लिपिड बाईलेयर्स की तैयारी टी सेल प्रतिरक्षा Synapses के कण आउटपुट का अध्ययन करने के लिए

Published: April 1, 2022 doi: 10.3791/63130
Automatic Translation
1, 1
1Kennedy Institute of Rheumatology, Nuffield Department of Orthopaedics, Rheumatology and Musculoskeletal Sciences, The University of Oxford

Summary

यहां हम मनका-समर्थित लिपिड बाईलेयर्स का उपयोग करके सिंथेटिक एंटीजन-प्रस्तुत करने वाली कोशिकाओं के चरणबद्ध पुनर्गठन के लिए प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं और सक्रिय टी कोशिकाओं से सिनैप्टिक आउटपुट से पूछताछ करने के लिए उनके उपयोग करते हैं।

Abstract

एंटीजन-प्रस्तुत करने वाली कोशिकाएं (एपीसी) शारीरिक संपर्क में लगी टी कोशिकाओं के लिए तीन सक्रिय संकेत प्रस्तुत करती हैं: 1) एंटीजन, 2) कोस्टिमुलेशन / कोरप्रेसन, और 3) घुलनशील साइटोकिन्स। टी कोशिकाएं सक्रियण के जवाब में दो प्रकार के प्रभावक कणों को जारी करती हैं: ट्रांस-सिनैप्टिक पुटिकाओं (टीएसवी) और सुपरमोलेक्यूलर हमले के कण, जो क्रमशः अंतरकोशिकीय दूतों को स्थानांतरित करते हैं और साइटोटॉक्सिसिटी की मध्यस्थता करते हैं। इन संस्थाओं को टी कोशिकाओं के साथ शारीरिक संपर्क में लगे एपीसी द्वारा जल्दी से आंतरिक किया जाता है, जिससे उनका लक्षण वर्णन चुनौतीपूर्ण हो जाता है। यह पेपर इन ट्रांस-सिनैप्टिक कणों को पकड़ने और विश्लेषण करने के लिए एंटीजन-प्रस्तुत सेल (एपीसी) मिमेटिक्स के रूप में मनका-समर्थित लिपिड बाईलेयर्स (बीएसएलबी) का निर्माण और उपयोग करने के लिए प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है। इसके अलावा वर्णित सेल सतहों पर प्रोटीन घनत्व के पूर्ण माप के लिए प्रोटोकॉल, इस तरह के शारीरिक स्तरों के साथ BSLBs के पुनर्गठन, और टी कोशिकाओं द्वारा सिनैप्टिक कण रिलीज पर नज़र रखने के लिए प्रवाह साइटोमेट्री प्रक्रिया। इस प्रोटोकॉल को व्यक्तिगत प्रोटीन, जटिल लिगैंड मिश्रण, रोगज़नक़ वायरस निर्धारकों और टी कोशिकाओं के प्रभावकारी आउटपुट पर दवाओं के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, जिसमें सहायक टी कोशिकाएं, साइटोटोक्सिक टी लिम्फोसाइट्स, नियामक टी कोशिकाएं और चिमेरिक एंटीजन रिसेप्टर-एक्सप्रेसिंग टी कोशिकाएं (CART) शामिल हैं।

Introduction

इम्यूनोलॉजिकल सिनैप्स (आईएस) एक महत्वपूर्ण आणविक संरचना है जो भौतिक संपर्क में लगी कोशिकाओं के इंटरफ़ेस पर बनाई गई है जो जुक्सट्राइन जानकारी के विनियमित आदान-प्रदान की सुविधा प्रदान करती है। साहित्य में विभिन्न आईएस का वर्णन किया गया है, और सबूतों के बढ़ते शरीर से पता चलता है कि ये आणविक केंद्र सेलुलर नेटवर्क की एक संरक्षित विशेषता हैं। बी कोशिकाओं, प्राकृतिक हत्यारा कोशिकाओं, डेंड्रिटिक कोशिकाओं, मैक्रोफेज और टी कोशिकाओं सहित विभिन्न प्रतिरक्षा कोशिकाएं, अल्पकालिक संपर्कों की असेंबली के माध्यम से जानकारी का आदान-प्रदान करती हैं। Multiomic अध्ययन ल्यूकोसाइट्स और स्ट्रोमल कोशिकाओं के उपन्यास सबसेट की समझ को आगे बढ़ा रहे हैं रोगजनक सेलुलर नेटवर्क ड्राइविंग और अज्ञात कार्यों के साथ सतह प्रोटीन व्यक्त करते हैं। सिंथेटिक एपीसी के रूप में, बीएसएलबी टी कोशिकाओं द्वारा सक्रिय संकेतों के एकीकरण में व्यक्तिगत प्रोटीन की कार्यात्मक भूमिका की प्रत्यक्ष जांच की अनुमति देते हैं, अर्थात् एंटीजन और कोस्टिमुलेशन / कोरप्रेशन, और सिग्नल चार के रूप में संदर्भित प्रभावकारी कणों की परिणामी रिहाई।

यह पेपर मॉडल एपीसी की सतह संरचना की नकल करने के लिए बीएसएलबी का उपयोग करते समय विचार करने के लिए प्रोटोकॉल और महत्वपूर्ण तकनीकी बिंदुओं का वर्णन करता है। एपीसी पर प्रतिरक्षा रिसेप्टर्स और अन्य सतह प्रोटीन के मात्रात्मक माप के लिए प्रोटोकॉल इन मापा मात्राओं वाले सिंथेटिक एपीसी के पुनर्गठन के लिए प्रोटोकॉल के साथ प्रस्तुत किए जाते हैं। फिर, टी कोशिकाओं और बीएसएलबी को सह-संवर्धित करने के लिए आवश्यक चरणों को प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करके ट्रांस-सिनैप्टिक कण हस्तांतरण के मात्रात्मक माप के लिए प्रोटोकॉल के साथ प्रस्तुत किया जाता है। सबसे उल्लेखनीय रूप से, बीएसएलबी टीएसवी की प्लाज्मा झिल्ली-व्युत्पन्न आबादी का अध्ययन करने की सुविधा प्रदान करते हैं, जिसे सिनैप्टिक एक्टोसोम (एसई) कहा जाता है। टी-सेल एंटीजन रिसेप्टर-समृद्ध (टीसीआर +) एसई को टीसीआर ट्रिगरिंग 2 के जवाब में बहाया जाता है और कुशलतापूर्वक बीएसएलबी 3 द्वारा कब्जा कर लिया जाता है, जो एंटीजन के एगोनिस्टिक गुणों और मॉडलकिए गए झिल्ली संरचना का आकलन करने के लिए एक उत्कृष्ट रीडआउट का प्रतिनिधित्व करता है। CD63+ एक्सोसोम और सुपरमोलेक्यूलर अटैक पार्टिकल्स (SMAPs) भी उत्तेजित टी कोशिकाओं द्वारा जारी किए जाते हैं और BSLBs द्वारा कब्जा कर लिया जाता है। उन्हें सक्रियण के अतिरिक्त रीडआउट और टी कोशिकाओं द्वारा परिणामी एक्सोसाइटिक और लाइटिक ग्रेन्युल स्राव के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। टी सेल के इंटरैक्टिंग पोल के लिए एक्सोसाइटिक पुटिकाओं की लामबंदी भी साइटोकिन्स की दिशात्मक रिहाई की सुविधा प्रदान करती है, जैसे आईएल -2, आईएफएन -γ, और आईएल -10 सक्रियण 4,5,6,7,8 के जवाब में। यद्यपि टी-सेल जारी साइटोकिन्स को बीएसएलबी पर भी पता लगाया जा सकता है, वर्तमान में इम्यूनोलॉजिकल सिनेप्स में साइटोकाइन रिलीज के मात्रात्मक विश्लेषण को मान्य करने के लिए एक अधिक समर्पित अध्ययन विकास के अधीन है।

यह पूछने के लिए कि विशिष्ट झिल्ली रचनाएं टी कोशिकाओं के सिनैप्टिक आउटपुट को कैसे प्रभावित करती हैं, इसके लिए लक्ष्य झिल्ली घटक के शारीरिक घनत्व को परिभाषित करने की आवश्यकता होती है। सेल सतह प्रोटीन के फ्लो साइटोमेट्री-आधारित परिमाणीकरण इस प्रोटोकॉल में एक आवश्यक कदम हैं और इसकी आवश्यकता होती है: 1) प्रति एंटीबॉडी (एफ / पी) फ्लोरोक्रोम की ज्ञात संख्या के साथ एंटीबॉडी का उपयोग, और 2) बेंचमार्क मोती मापा माध्य प्रतिदीप्ति तीव्रता (एमएफआई) से फ्लोरोक्रोम अणुओं को इंटरपोल करने के लिए एक मानक संदर्भ प्रदान करते हैं।

इन बेंचमार्क मानकों में पांच मनका आबादी होती है, जिनमें से प्रत्येक में समतुल्य घुलनशील फ्लोरोक्रोम (एमईएसएफ) की बढ़ती संख्या होती है, जो मनमाने ढंग से प्रतिदीप्ति का पता लगाने की गतिशील सीमा को फैलाती है। ये मानक आबादी असतत प्रतिदीप्ति चोटियों की उपज, सरल रैखिक प्रतिगमन द्वारा एमईएसएफ में मनमाने ढंग से प्रतिदीप्ति इकाइयों के रूपांतरण की सुविधा प्रदान करती है। परिणामी एमईएसएफ का उपयोग तब एंटीबॉडी एफ / पी मानों के साथ प्रति सेल बाउंड अणुओं की औसत संख्या की गणना करने के लिए किया जाता है (या बाद के चरणों में बीएसएलबी)। पता लगाए गए अणुओं की औसत संख्या के लिए अनुमानित सेल सतह क्षेत्रों का अनुप्रयोग तब अणुओं / μm2 के रूप में शारीरिक घनत्व की गणना को सक्षम बनाता है। इस परिमाणीकरण प्रोटोकॉल को टी कोशिकाओं पर प्रोटीन घनत्व के माप और झिल्ली रचनाओं के जैव रासायनिक पुनर्गठन के लिए भी अनुकूलित किया जा सकता है जो होमोटाइपिक टी सेल सिनेप्स (यानी, टी-टी synapses9) के गठन की मध्यस्थता करता है। यदि आवश्यक हो, तो प्रति अणु फ्लोरोक्रोम की ज्ञात संख्या के साथ लेबल किए गए पुनः संयोजक लक्ष्यों का उपयोग करके एंटीबॉडी बाइंडिंग की संयोजकता का अनुमान लगाया जा सकता है। फिर, एंटीबॉडी-बाइंडिंग वैलेंसी की गणना एक ही बीएसएलबी आबादी के लिए एक ही समय में बाध्य फ्लोरोसेंट प्रोटीन और परिमाणीकरण एंटीबॉडी (दो अलग-अलग परिमाणीकरण फ्लोरोक्रोम और एमईएसएफ मानकों का उपयोग करके) की संख्या की तुलना करके की जा सकती है।

एपीसी झिल्ली के पुनर्गठन के लिए सिलिका मोतियों 1 पर समर्थित लिपिड बाईलेयर (एसएलबी) की असेंबली की आवश्यकता होती है। विभिन्न फॉस्फोलिपिड प्रजातियों वाले लिपोसोम स्टॉक का उपयोग एक बहुमुखी लिपिड-बाईलेयर मैट्रिक्स बनाने के लिए किया जा सकता है, जो विभिन्न बाध्यकारी रसायन विज्ञान के साथ पुनः संयोजक प्रोटीन की एंकरिंग को सक्षम करता है (लिपोसोम की तैयारी 10 में विस्तृत है)। एक बार जब प्रासंगिक लिगैंड "कोशिकाओं पर" के शारीरिक घनत्व (या घनत्व) को परिभाषित किया जाता है, तो एक ही प्रवाह साइटोमेट्री प्रोटोकॉल को लक्ष्य शारीरिक घनत्व के साथ बीएसएलबी को कोट करने के लिए आवश्यक पुनः संयोजक प्रोटीन की एकाग्रता का अनुमान लगाने के लिए अनुकूलित किया जाता है। दो अलग-अलग एंकरिंग सिस्टम का उपयोग या तो संयोजन में या अलग-अलग किया जा सकता है।

सबसे पहले, एसएलबी जिसमें Ni2 + का अंतिम 12.5 mol% होता है - फॉस्फोलिपिड्स युक्त लगभग 10,000 हिज़-टैग बाइंडिंग साइटों को प्रति वर्ग माइक्रोन 10 प्रदान करने के लिए पर्याप्त है और सबसे व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्रोटीन के साथ BSLBs को सजाने के लिए अच्छी तरह से काम करता है, जिसका शारीरिक घनत्व इस अधिकतम लोडिंग क्षमता से अधिक नहीं है। दूसरी लोडिंग प्रणाली बायोटिन युक्त फॉस्फोलिपिड्स (मोल के रूप में) का उपयोग करती है ताकि स्ट्रेप्टाविडिन पुलों के माध्यम से बायोटिनिलेटेड एंटी-सीडी 3 ई फैब (या एचएलए / एमएचसी मोनोमर्स) को लोड किया जा सके। इन दो बीएसएलबी सजावट विधियों का संयोजन तब सिंथेटिक एपीसी के रूप में बीएसएलबी की लचीली सिलाई को सक्षम बनाता है। अत्यधिक जटिल एपीसी सतह रचनाओं के लिए, फॉस्फोलिपिड्स और प्रोटीन के मोल% को हाथ में प्रश्न के रूप में कई प्रोटीन लोड करने के लिए बढ़ाया जा सकता है। एक बार प्रोटीन की कार्यशील सांद्रता और बायोटिनिलेटेड फॉस्फोलिपिड्स के मोल% को परिभाषित करने के बाद, बीएसएलबी को मल्टीपैरामीट्रिक प्रवाह साइटोमेट्री के साथ टी कोशिकाओं के सिनैप्टिक आउटपुट से पूछताछ करने के लिए इकट्ठा किया जा सकता है।

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Protocol

1. मात्रात्मक प्रवाह cytometry के साथ सेल सतह प्रोटीन घनत्व का मापन

  1. 0.22 μm-फ़िल्टर मानव प्रवाह cytometry बफर (hFCB) EDTA (एक अंतिम 2 mM एकाग्रता के लिए) और मानव एबी सीरम (एक अंतिम 10% के लिए) बाँझ फॉस्फेट-buffered खारा (PBS), पीएच 7.4 ( तालिका 1 देखें) को जोड़कर तैयार करें। सीरम अशुद्धियों को हटाने और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करने के लिए एक 0.22 μm रंध्र फिल्टर इकाई का उपयोग करके समाधान फ़िल्टर करें।
  2. कोशिकाओं को पुनर्प्राप्त करें और कमरे के तापमान (आरटी) पर 5 मिनट के लिए 300 × जी पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा उन्हें तलछट करें।
  3. पीबीएस के साथ कोशिकाओं को दो बार धोएं। प्रत्येक धोने के चरण में, पीबीएस में कोशिकाओं को मूल मात्रा (सेंट्रीफ्यूजेशन से पहले) पर फिर से निलंबित करें और आरटी पर 5 मिनट के लिए 300 × जी पर स्पिन करें।
  4. एक हेमोसाइटोमीटर 11 में ट्राइपैन नीले रंग के दाग वाले सेल निलंबन की गणना करें। वैकल्पिक रूप से, विद्युत प्रवाह बहिष्करण का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें। उत्तरार्द्ध के लिए, CASY-TT निर्माता के निर्देशों का पालन करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    नोट:: CASY-TT कक्ष काउंटर प्रतिशत व्यवहार्य कक्षों, कक्ष आकार, और कक्ष वॉल्यूम के निर्धारण की अनुमति देता है।
  5. 107 कोशिकाओं / एमएल की धुंधला एकाग्रता के लिए कोशिकाओं को फिर से निलंबित करने के लिए आवश्यक फिक्सेबल व्यवहार्यता डाई eFluor 780 या इसी तरह के (सामग्री की तालिका देखें) के 1: 1,000 कमजोर पड़ने वाले पीबीएस की मात्रा की गणना करें।
  6. व्यवहार्यता डाई-पीबीएस समाधान का उपयोग करके कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें और 30 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट करें।
  7. बर्फ-ठंडे hFCB की एक मात्रा जोड़कर व्यवहार्यता डाई निकालें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 × ग्राम पर नीचे स्पिन करें।
    नोट: अब से, कोल्ड चेन को अटूट रखें।
  8. HFCB के साथ कोशिकाओं को धोएं जिसमें Fc रिसेप्टर ब्लॉकिंग समाधान के 1:50 कमजोर पड़ने वाले हैं ( सामग्री की तालिका देखें)। वॉल्यूम को 107 कोशिकाओं / एमएल की अंतिम एकाग्रता में लाएं और कुशल एफसीजीआर ब्लॉकिंग प्राप्त करने के लिए अतिरिक्त 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  9. यू-बॉटम या वी-बॉटम 96-वेल प्लेट के प्रति सेल सस्पेंशन (यानी, 106 कोशिकाओं) के 100 μL वितरित करें। बर्फ पर कोशिकाओं को रखें और प्रकाश से संरक्षित करें (एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर करें)।
  10. प्रत्येक फ्लोरोक्रोम-संयुग्मित एंटीबॉडी के लिए इष्टतम एंटीबॉडी सांद्रता को परिभाषित करके एचएफसीबी में एक एंटीबॉडी मास्टर मिश्रण तैयार करें, और सबसे महत्वपूर्ण बात, सतह प्रोटीन घनत्व को निर्धारित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले एंटीबॉडी के लिए। उदाहरण के लिए, टॉन्सिलर सेल आबादी पर आईसीएएम -1 अभिव्यक्ति के परिमाणीकरण के लिए, जैसा कि चित्रा 1 में दिखाया गया है, एंटी-सीडी 4, एंटी-सीडी 19, और एंटी-सीएक्ससीआर 5 के 1: 200 कमजोर पड़ने वाले मिश्रण को एक साथ ज्ञात एएफ 647 फ्लोरोक्रोम प्रति एंटीबॉडी (यानी, 10 μg / एमएल, जिसे स्वतंत्र एंटीबॉडी अनुमापन प्रयोगों द्वारा परिभाषित किया गया था) के साथ एंटी-आईसीएएम -1 एंटीबॉडी की संतृप्त सांद्रता के साथ तैयार करें।
  11. अतिरिक्त नियंत्रण के रूप में, प्रासंगिक एंटीबॉडी आइसोटाइप नियंत्रण युक्त एक एंटीबॉडी मास्टर मिश्रण तैयार करें (पृष्ठभूमि घटाव के लिए एक ही फ्लोरोक्रोम के साथ संयुग्मित उनके समकक्षों के समान प्रभावी सांद्रता पर ), यानी, एक प्रासंगिक AF647 आइसोटाइप नियंत्रण के 10 μg / mL का उपयोग करें।
    नोट:: ऊपर दिए गए उदाहरण में, इस तरह के एक आइसोटाइप नियंत्रण का उपयोग कोशिकाओं पर सच्चे आईसीएएम -1 सिग्नल से पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति को घटाने के लिए किया जाता है।
  12. ऊतकों के भीतर कम आवृत्तियों पर मौजूद सेल सबसेट पर प्रोटीन घनत्व को परिमाणित करते समय, ब्याज के मार्करों को छोड़कर सभी धुंधला एंटीबॉडी वाले प्रतिदीप्ति माइनस वन (एफएमओ) नियंत्रण तैयार करें ( 12 में अधिक विवरण देखें)।
  13. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 × जी पर कोशिकाओं वाली 96-अच्छी तरह से प्लेट को नीचे स्पिन करें, supernatant को त्याग दें, और 50 μL में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें या तो परिमाणीकरण एंटीबॉडी मास्टर मिश्रण या आइसोटाइप एंटीबॉडी मास्टर मिश्रण।
  14. प्लेट शेकर का उपयोग करके 4 डिग्री सेल्सियस और 400 आरपीएम पर कम से कम 30 मिनट के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें। प्रकाश से प्लेटों की रक्षा (एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर).
  15. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 × ग्राम पर एचएफसीबी और सेंट्रीफ्यूज का उपयोग करके कोशिकाओं को तीन बार धोएं।
  16. पीबीएस के 200 μL का उपयोग करके सेल पैलेट को फिर से निलंबित करें (यानी, 5 × 106 कोशिकाओं / एमएल की अंतिम एकाग्रता के लिए)।
  17. अधिग्रहण के लिए:
    1. यदि एक मानक बीडी FACS लोडर का उपयोग कर रहे हैं, तो नमूनों को 5 mL polystyrene राउंड-बॉटम ट्यूबों में स्थानांतरित करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    2. यदि उच्च-थ्रूपुट सैंपलर्स (एचटीएस, जिसे प्लेट रीडर्स के रूप में भी जाना जाता है) का उपयोग कर रहे हैं, तो चरण 1.19 पर तुरंत आगे बढ़ें।
  18. एमईएसएफ मानकों के लिए डेटा अधिग्रहण के साथ आगे बढ़ने से पहले, परिमाणीकरण चैनलों के लिए प्रतिदीप्ति तीव्रता रैखिकता अधिकतम और न्यूनतम सीमाओं की जांच करें।
  19. मुआवजे से पहले, एमईएसएफ मानकों के लिए डेटा प्राप्त करें, यह सुनिश्चित करते हुए कि सबसे मंद और सबसे उज्ज्वल आबादी दोनों माप की रैखिक सीमा में आते हैं।
  20. मुआवजे के नमूने प्राप्त करें। पता लगाने की गतिशील सीमा को संरक्षित करने के लिए परिमाणीकरण चैनलों के लिए फोटोमल्टीप्लायर ट्यूब (पीएमटी) वोल्टेज मानों को अपरिवर्तित रखें। क्षतिपूर्ति मैट्रिक्स की गणना करने से पहले अन्य चैनलों के पीएमटी वोल्टेज में मामूली समायोजन करें।
  21. गणना करें और मुआवजे को लागू करें।
  22. प्राप्त करें और परिमाणीकरण चैनलों में से प्रत्येक के लिए 2 × 104 कुल MESF मोतियों की एक न्यूनतम बचाने के लिए।
  23. एकल कोशिकाओं की जनसंख्या का चयन उनके पक्ष और आगे प्रकाश प्रकीर्णन क्षेत्रों (SSC-A और FSC-A, क्रमशः, जैसा कि चित्र 1A (i) में दिखाया गया है, के आधार पर, समय निरंतरता (चित्रा 1A (ii)) के अंदर की घटनाओं का चयन और उनकी ऊंचाइयों की तुलना में FSC और SSC दोनों में उड़ान (W) के समय (W) के लिए कम (यानी, FSC-W/FSC-H, इसके बाद SSC-W/SSC-H गेटिंग के बाद, जैसा कि क्रमशः चित्र 1A (iii) और (iv) में दिखाया गया है। आनुपातिक FSC-A बनाम FSC-H वितरण (चित्रा 1A (v)) के साथ घटनाओं वाले अंतिम एकल-ईवेंट गेट को परिभाषित करें।
  24. नियंत्रण नमूने प्राप्त करें (आइसोटाइप-लेबल और FMO नियंत्रण).
  25. नमूने प्राप्त करें और रिकॉर्ड तब तक रिकॉर्ड करें जब तक कि न्यूनतम 10,000 लक्ष्य कोशिकाओं का अधिग्रहण नहीं किया गया है।
    नोट: औसत आणविक घनत्व के मजबूत निर्धारण के लिए स्वतंत्र प्रयोगों में कई दाताओं के विश्लेषण की आवश्यकता होती है। यह महत्वपूर्ण है जब या तो कम आवृत्तियों में पाए जाने वाले सेल सबसेट का विश्लेषण किया जाता है या दुर्लभ जैविक सामग्री (उदाहरण के लिए, मानव ऊतक बायोप्सी से) से व्युत्पन्न होता है।
  26. उपकरण को बंद करने से पहले 5 मिनट के लिए अल्ट्राप्योर पानी के 5 मिनट के बाद एक FACS सफाई समाधान के साथ 5 मिनट के लिए चल रहे साइटोमीटर को धोएं। HTS का उपयोग कर रहे हैं, तो टैब HTS और क्लीन प्लेट प्रोग्राम के अंतर्गत विकल्पों का पालन करें।
    नोट: नमूना-से-नमूना कैरीओवर को कम करने के लिए, सिट (सैंपलर) फ्लश या उच्च-थ्रूपुट सैंपलर वॉश विकल्पों को सक्रिय करें, जो स्वचालित रूप से ट्यूबों या कुओं के बीच साइटोमीटर को धो देगा। अधिग्रहण शुरू करने से पहले, साइटोमीटर नमूना लाइन से किसी भी बिना धुले हुए जैविक संदूषकों को हटाने के लिए उच्च प्रवाह दर पर 10 मिनट के लिए अल्ट्राप्योर पानी चलाएं।
  27. Flow Cytometry Standard (FCS) फ़ाइलें निर्यात करें।

2. MESF overcorrected मतलब (या माध्यिका) प्रतिदीप्ति तीव्रता (MFI) प्रतिगमन विश्लेषण

  1. प्रवाह cytometry विश्लेषण सॉफ्टवेयर खोलें और प्रयोग FCS फ़ाइलें लोड करें। उनके पक्ष और आगे प्रकाश प्रकीर्णन क्षेत्रों (एसएससी-ए बनाम एफएससी-ए) के आधार पर मोतियों की आबादी का चयन करें, जैसा कि चित्र 1 ए (i) में दिखाया गया है।
  2. समय के साथ एकल ईवेंट के वितरण की जाँच करके डेटा गुणवत्ता को नियंत्रित करें, जैसा कि चरण 1.24 में इंगित किया गया है.
    नोट:: बुलबुले समय के साथ घटनाओं के वितरण में अंतराल बनाते हैं; यह आमतौर पर एचटीएस का उपयोग करके अधिग्रहण की शुरुआत में दिखाई देता है। अधिग्रहण समय में अंतराल flanking घटनाओं का चयन करने से बचें के रूप में ये ऑप्टिकल aberrations के कारण माप त्रुटियों को जोड़ने.
  3. एकल घटनाओं पर ध्यान केंद्रित करें।
    1. कोशिकाएँ
      1. पहले एकल कोशिकाओं को उनके एसएससी-ए और एफएससी-ए वितरण (चित्रा 1 ए (i)) के आधार पर पहचानें, इसके बाद अनुक्रमिक गेट एफएससी-डब्ल्यू / एफएससी-एच (सिंगल्स -1, चित्रा 1 ए पैनल (iii)) और एसएससी-डब्ल्यू / एसएससी-एच (सिंगल्स -2) में डब्ल्यू के लिए कम घटनाओं के बाद; चित्रा 1A पैनल (iv)). आनुपातिक FSC-A और FSC-H (चित्रा 1A, पैनल (v)) के साथ घटनाओं का चयन करके एक अतिरिक्त singlets-3 गेट परिभाषित करें। अंत में, स्थिर व्यवहार्यता डाई के लिए उन नकारात्मक के रूप में जीवित कोशिकाओं की पहचान करें।
    2. MESF मोती
      1. चरण 2.3.1.1 (चित्रा 1B, पैनल (i) से (v)) में के रूप में singlets-3 भेदभाव करने के लिए एक ही singlets-1 का पालन करें। एमईएसएफ आबादी (रिक्त, 1, 2, 3, और 4) में से प्रत्येक को उनके प्रतिदीप्ति तीव्रता स्तरों के आधार पर पहचानें ( चित्रा 1 बी, पैनल (vi) देखें)।
  4. एमईएसएफ अंशों के एमएफआई को खाली और 1 से 4 तक निकालें।
  5. प्रत्येक भिन्न से रिक्त मनका जनसंख्या के MFIs घटाकर MESF भिन्नों 1 से 4 के लिए सही MFI (cMFI) मान जनरेट करें।
  6. cMFIs और विक्रेता द्वारा प्रदान किए गए MESF मानों के बीच संबंध के लिए सर्वोत्तम फ़िट की रेखा की गणना करें (स्वतंत्र चर, शून्य के बराबर भिन्न रिक्त होने के नाते).
  7. सीएमएफआई पर एमईएसएफ के रैखिक प्रतिगमन की ढलान (नीचे दिए गए समीकरण में बी ) को निकालें (चित्र 1 बी पैनल (viii) एक प्रतिगमन दिखाता है जिसमें y = a + bx; a = 0 के साथ)।
  8. माध्यिका (bimodal प्रतिदीप्ति वितरण के लिए) या माध्य (सामान्य या लॉग-सामान्य प्रतिदीप्ति वितरण के लिए) ब्याज की आबादी से प्रतिदीप्ति तीव्रता निकालें ( चित्रा 1A पैनल (vii) में TFH और B कोशिकाओं)।
  9. चरण 2.5-2.7 के रूप में, MFI मानों को आइसोटाइप-लेबल नियंत्रण कक्षों से निकालें।
  10. यदि आइसोटाइप नियंत्रणों का एफ / पी परिमाणीकरण एंटीबॉडी के समान है, तो आइसोटाइप-लेबल वाली कोशिकाओं से एमएफआई को घटाकर दाग वाली कोशिकाओं के एमएफआई को सही करें।
  11. यदि आइसोटाइप का एफ / पी परिमाणीकरण एंटीबॉडी से भिन्न होता है, तो चरण 2.7 में गणना की गई ढलान के साथ आइसोटाइप-लेबल वाली कोशिकाओं के एमएफआई को विभाजित करके आइसोटाइप से एमईएसएफ को निकालें। बाध्य परिमाणीकरण एंटीबॉडी का अनुमान लगाने से पहले परिमाणीकरण एमईएसएफ से आइसोटाइप एमईएसएफ घटाएं।
  12. प्रति कोशिका बाध्य अणुओं की संख्या का अनुमान लगाने के लिए परिमाणीकरण एंटीबॉडी के एफ / पी द्वारा एमईएसएफ को विभाजित करें (मोलेक)। सेल जैसा कि चित्र 1C) के प्रवाह आरेख में दिखाया गया है।
  13. प्रोटीन के घनत्व को मोलेक/μm2 (चित्र1C) के रूप में निकालने के लिए अनुमानित सेल सतह क्षेत्र (CSA (μm2)) के साथ बाध्य अणुओं की संख्या को विभाजित करें। अधिक जानकारी के लिए प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग देखें.

3. कार्यात्मक फॉस्फोलिपिड प्रजातियों प्रोटीन कोटिंग BSLBs के अंशांकन में उपयोग करने के लिए

  1. लिपिड मैट्रिक्स समर्थित लिपिड बाईलेयर बनाने के प्रमुख घटक के रूप में 0.4 mM DOPC (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) का उपयोग करें। इस डीओपीसी समाधान में अन्य सभी लिपिड प्रजातियों को पतला करें।
  2. 0.4 mM डोप (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine) के 0.2 और 1 mol% के बीच का उपयोग करें, एटीटो 390, 488, या 565 ( सामग्री की तालिका देखें) सहित रंगों के लिए संयुग्मित, आंतरिक प्रतिदीप्ति के साथ BSLBs उत्पन्न करने के लिए।
    नोट: BSLBs की आंतरिक प्रतिदीप्ति सिनैप्टिक स्थानांतरण प्रयोगों में एकल BSLBs और एकल कोशिकाओं की पहचान की सुविधा प्रदान करती है।
  3. 0.4 mM DGS-NTA (Ni) (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl) iminodiacetic acid) succinyl]) के 12.5 mol% का उपयोग करें ताकि उनके टैग किए गए प्रोटीन लंगर किया जा सके। DGS-NTA (Ni) के mol% को स्थिर रखें और उच्चतम एकाग्रता के रूप में 100 nM से शुरू होने वाले उनके-टैग किए गए प्रोटीन के 2-गुना अनुमापन करें। निरपेक्ष परिमाणीकरण के लिए एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में कोई प्रोटीन के साथ एक शर्त छोड़ दें।
    नोट: गौण संकेत और आसंजन अणु, जैसे आईसीएएम -1, डीजीएस-एनटीए (एनआई) के लिए प्रोटीन की आत्मीयता को बढ़ाने के लिए 12-उसके टैग के साथ डिज़ाइन किए गए हैं।
  4. बायोटिनिल कैप पीई (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(cap biotinyl)) का उपयोग बायोटिन-स्ट्रेप्टाविडिन-बायोटिन पुलों के माध्यम से बायोटिनिलेटेड प्रोटीन को लंगर करने के लिए करें। 0.4 mM Biotinyl कैप पीई के 5 गुना सीरियल अनुमापन का उपयोग करें जो 10 mol% और 0 mol% (नकारात्मक नियंत्रण के रूप में) के बीच कवर करता है। दोनों अंशांकन प्रयोगों और synaptic हस्तांतरण प्रयोगों के लिए सिंथेटिक APCs के पुनर्गठन में स्ट्रेप्टाविडिन और biotinylated प्रोटीन की एकाग्रता स्थिर (200 nM) रखें।
    नोट: लिपिड मैट्रिक्स में बायोटिनिल कैप पीई के अंतिम मोल% पर बायोटिनिलेटेड प्रोटीन के अनुभवजन्य घनत्व के प्रतिगमन विश्लेषण (जिसमें डीजीएस-एनटीए (एनआई) भी शामिल है, जो उनके-टैग किए गए प्रोटीन को लंगर करने के लिए है) एंटीजन के लक्ष्य घनत्व को पुनर्गठित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले मोल% को परिभाषित करेगा।

4. पूरक HEPES बफ़र्ड खारा 1% सीरम एल्ब्यूमिन युक्त की तैयारी

नोट: पूरक HEPES-buffered खारा जिसमें 1% मानव सीरम एल्ब्यूमिन (HBS / HSA) या 1% गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन (HBS / BSA) शामिल है, BSLBs (तालिका 1) के धोने और प्रोटीन लोडिंग चरणों में आवश्यक है। एक 10x HBS स्टॉक समाधान और काम बफर के रूप में संभव के रूप में ताजा के रूप में तैयार करें; प्रशीतित रखें और एक महीने के भीतर उपयोग करें। जबकि बीएसए एचएसए के लिए एक सस्ता विकल्प है, यह नी-चेलेटिंग लिपिड 13 की कुशल रुकावट प्रदान करता है और उच्च-थ्रूपुट प्रयोगों के लिए अनुशंसित है।

  1. 200 mM HEPES, 7 mM Na2HPO4, 1400 mM NaCl, 50 mM KCl, 60 mM ग्लूकोज, 10 mM CaCl2, और 20 mM MgCl2 युक्त पूरक HBS का 10x स्टॉक बफर समाधान तैयार करें।
    नोट: MgCl2 को भंग अत्यधिक exothermic और एक जलने का खतरा है। इस नमक को धीरे-धीरे और विलायक की एक बड़ी मात्रा पर जोड़ें। इन लवणों के केंद्रित समाधान (यानी, 1 एम) तैयार करने से बचें क्योंकि वे समय के साथ अवक्षेपित होते हैं, जिससे काम करने वाले बफर में उनका सटीक अतिरिक्त मुश्किल हो जाता है।
  2. एक 0.22 μm फ़िल्टर इकाई का उपयोग करके 10x समाधान को फ़िल्टर करें और इसे 4 °C पर बाँझ रखें।
  3. HBS के 500 mL के लिए, पूरक 10x HBS समाधान के 50 mL लें, यदि आवश्यक हो तो pH को 7.4 में समायोजित करें, और अल्ट्राप्योर पानी के साथ 483.4 mL तक मात्रा बनाएं।
  4. HBS, pH 7.4 के 483.4 mL में 30% HSA समाधान के 16.6 mL जोड़ें।
  5. एचबीएस / बीएसए के 500 एमएल के लिए, एचबीएस में 5 ग्राम बीएसए को भंग करें और 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। फिर, समय-समय पर बोतल को उलटकर आरटी पर धीरे से मिलाएं जब तक कि कोई दृश्यमान प्रोटीन क्रिस्टल या clumps न हो।
  6. एक 0.22 μm फ़िल्टर इकाई ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके चरण 4.5 से परिणामी समाधान फ़िल्टर करें और इसे 4 °C पर संग्रहीत करें।

5. BSLBs पर प्रोटीन घनत्व अंशांकन

  1. 5.00 ±0.05 μm व्यास गैर कार्यात्मक सिलिका मोतियों लेने से पहले, स्टॉक समाधान अच्छी तरह से मिश्रण और फ्लास्क के तल पर तलछट मोतियों के किसी भी बड़े clumps resuspend.
    नोट: सिलिका मोती जल्दी से तलछट करते हैं, जो त्रुटियों की गिनती का कारण बन सकता है। एक P1000 micropipette की अधिकतम मात्रा के ऊपर और नीचे pipetting द्वारा जोरदार मिश्रण.
  2. पीबीएस के 1,000 μL में मनका समाधान के 1 μL को पतला करें, हेमोसाइटोमीटर कक्ष का उपयोग करके मोतियों की गणना करें, और प्रति एमएल उनकी एकाग्रता की गणना करें।
    नोट: Trypan नीले दाग सिलिका मोतियों visualizing के लिए आवश्यक नहीं है.
  3. अनुमापन के प्रति बिंदु 5 × 105 अंतिम BSLBs के लिए आवश्यक सिलिका मोतियों की मात्रा की गणना करें।
  4. सिलिका मोतियों की आवश्यक मात्रा को एक बाँझ 1.5 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  5. बाँझ पीबीएस के 1 मिलीलीटर के साथ सिलिका मोतियों को तीन बार धोएं, आरटी (निश्चित आरपीएम पर) पर एक बेंचटॉप माइक्रोसेंट्रिफ्यूज पर 15 एस के लिए मोतियों को सेंट्रीफ्यूज करें।
    नोट: धोने के समाधान को हटाते समय, मनका गोली को परेशान करने से बचें। एक छोटा सा बफर कॉलम लिपोसोम मास्टर मिश्रण की रचना करने वाले लिपोसोम के प्रसार को प्रभावित नहीं करेगा क्योंकि ये पीबीएस में भी हैं।
  6. धोए गए सिलिका मोतियों पर बीएसएलबी को इकट्ठा करने के लिए लिपोसोम मास्टर मिश्रण के तीन संस्करणों को तैयार करें (उदाहरण के लिए, यदि सिलिका मोतियों की प्रारंभिक कुल मात्रा 20 μL है, तो लिपोसोम मास्टर मिक्स के न्यूनतम 60 μL तैयार करें)।
  7. Biotinyl कैप पीई मोल% अनुमापन के लिए
    1. लिपिड मास्टर मिश्रण तैयार करें जिसमें बायोटिनिल कैप पीई के 5 गुना कमजोर पड़ने वाले होते हैं।
      1. एक 100% DOPC मैट्रिक्स में 0.4 mM Biotinyl कैप पीई मोल% पतला.
      2. प्रत्येक बायोटिनिल कैप पीई मोल% अनुमापन बिंदु को 0.4 mM 25% DGS-NTA (Ni) के समाधान के साथ 1: 1 (vol: vol) अनुपात पर मिलाएं, जैसे कि नी-युक्त लिपिड का अंतिम 12.5 मोल% सभी अनुमापनों में मौजूद है।
        नोट: Ni-युक्त लिपिड का 12.5 mol% (vol:vol%) BSLBs की मिश्रित लिपिड संरचना का प्रतिनिधित्व करता है जिस पर उनके-टैग किए गए प्रोटीन का समानांतर अंशांकन में भी परीक्षण किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, चूंकि सभी लिपोसोम स्टॉक एक ही दाढ़ एकाग्रता पर तैयार किए जाते हैं, अंतिम लिपोसोम मिश्रण के 200 μL में लक्ष्य mol% मिश्रण तक पहुंचने के लिए, बस 100 mol% DOPC के 100 μL के साथ Ni-युक्त DGS-NTA के 25 mol% के 100 μL मिश्रण को मिलाएं।
    2. स्थानांतरण 5 × 105 धोया सिलिका मोतियों को 1.5 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में स्थानांतरित करें, जैसे कि एक बायोटिनिल कैप पीई मोल% अनुमापन बिंदु प्रति ट्यूब इकट्ठा होता है।
    3. Biotinyl कैप पीई mol% अनुमापन मास्टर धोया सिलिका मोतियों के लिए mixes जोड़ें और धीरे से ऊपर और कुल मात्रा के आधे नीचे pipetting द्वारा मिश्रण. बुलबुले बनाने से बचें, जो अधिक मात्रा में लिपिड बाईलेयर को नष्ट कर देते हैं।
    4. हवा को विस्थापित करने और मिश्रण के दौरान ऑक्सीकरण से लिपिड की रक्षा करने के लिए अब बनाने वाले बीएसएलबी युक्त ट्यूब पर आर्गन (या नाइट्रोजन) गैस जोड़ें।
    5. भंडारण से पहले 0.4 mM लिपिड स्टॉक में आर्गन जोड़ें और एक बाँझ तकनीक का उपयोग करके हेरफेर करें।
      नोट: आर्गन / नाइट्रोजन गैस सिलेंडर के लिए एक छोटे से टयूबिंग कनेक्ट करें। ट्यूबों में गैस जोड़ने से पहले, गैस सिलेंडर नियामक को समायोजित करें ताकि दबाव 2 साई से अधिक न हो। 5 s के लिए liposome स्टॉक के अंदर गैस स्ट्रीम को निर्देशित करने के लिए आउटलेट टयूबिंग के लिए एक बाँझ पिपेट टिप कनेक्ट करें और जल्दी से ढक्कन बंद करें। लिपिड स्टॉक के मामले में, 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत करने से पहले पैराफिन फिल्म के साथ ट्यूब के ढक्कन को सील करें।
    6. BSLBs को एक ऊर्ध्वाधर, चर-कोण प्रयोगशाला मिक्सर में ले जाएं ( सामग्री की तालिका देखें) और 10 आरपीएम के कक्षीय मिश्रण का उपयोग करके आरटी पर 30 मिनट के लिए मिश्रण करें।
      नोट: यह चरण समर्थित लिपिड बाईलेयर के गठन के दौरान मोतियों के अवसादन को रोक देगा।
    7. एक बेंचटॉप मिनीसेंट्रिफ्यूज पर आरटी पर 15 एस के लिए सेंट्रीफ्यूजिंग करके मोतियों को नीचे स्पिन करें, और फिर अतिरिक्त लिपोसोम को हटाने के लिए एचबीएस / एचएसए (बीएसए) के 1 एमएल के साथ तीन बार धोएं।
    8. 5% casein के 1 mL या 5% BSA जिसमें NiSO4 के 100 μM युक्त NTA साइटों को संतृप्त करने के लिए और BSLBs पर सभी बायोटिन-एंकरिंग साइटों को समान रूप से कोट करने के लिए 200 nM स्ट्रेप्टाविडिन शामिल हैं, को जोड़कर गठित BSLBs को ब्लॉक करें। कुल मात्रा के ऊपर और नीचे आधे पिपेटिंग द्वारा धीरे से मिश्रण करें और आरटी और 10 आरपीएम पर 20 मिनट से अधिक समय तक ऊर्ध्वाधर मिक्सर में इनक्यूबेट न करें।
    9. एक बेंचटॉप मिनीसेंट्रिफ्यूज पर आरटी पर 15 एस के लिए सेंट्रीफ्यूजिंग करके बीएसएलबी को नीचे स्पिन करें, और फिर एचबीएस / एचएसए (बीएसए) बफर के 1 एमएल के साथ तीन बार धोएं।
      नोट: BSLBs को कवर करने वाले वॉश बफर की एक छोटी मात्रा के साथ धुले हुए मोतियों को लंबवत रखें। BSLBs के निर्जलीकरण से बचें क्योंकि हवा लिपिड बाईलेयर को नष्ट कर देगी।
  8. DGS-(Ni) NTA-युक्त BSLBs के 12.5 mol% पर उनके-टैग किए गए प्रोटीन के अनुमापन के लिए
    1. डीजीएस-एनटीए (एनआई) के अंतिम 12.5 मोल% वाले लिपोसोम मास्टर मिक्स के तीन संस्करणों को तैयार करें।
    2. लिपोसोम मास्टर मिश्रण का उपयोग करने के लिए धोया सिलिका मोतियों resuspend और धीरे से ऊपर और कुल मात्रा के आधे नीचे pipetting द्वारा मिश्रण. बुलबुले बनाने से बचें, जो अतिरिक्त रूप से लिपिड बाईलेयर को नुकसान पहुंचाते हैं।
    3. हवा को विस्थापित करने और मिश्रण के दौरान ऑक्सीकरण से लिपिड की रक्षा करने के लिए अब बनाने वाले बीएसएलबी युक्त ट्यूब पर आर्गन (या नाइट्रोजन) गैस जोड़ें।
    4. भंडारण से पहले 0.4 mM लिपिड स्टॉक में आर्गन जोड़ें और एक बाँझ तकनीक का उपयोग करके हेरफेर करें।
    5. BSLBs को ऊर्ध्वाधर मिक्सर में ले जाएँ और 10 rpm पर कक्षीय मिश्रण का उपयोग करके RT पर 30 मिनट के लिए मिश्रण करें।
    6. एक बेंचटॉप मिनीसेंट्रिफ्यूज पर आरटी पर 15 एस के लिए सेंट्रीफ्यूजिंग करके मोतियों को नीचे स्पिन करें, और फिर अतिरिक्त लिपोसोम को हटाने के लिए एचबीएस / एचएसए (बीएसए) के 1 एमएल के साथ तीन बार धोएं।
    7. BSLBs पर NTA साइटों को संतृप्त करने के लिए NiSO4 के 100 μM वाले 5% केसीन (या 5% BSA) के 1 mL को जोड़कर गठित BSLBs को ब्लॉक करें। RT और 10 rpm पर 20 मिनट से अधिक समय तक ऊर्ध्वाधर मिक्सर में धीरे से मिलाएं और इनक्यूबेट करें।
    8. अतिरिक्त ब्लॉकिंग समाधान को हटाने के लिए एचबीएस / एचएसए (बीएसए) का उपयोग करके तीन बार धोएं।
    9. एक नए यू-बॉटम 96-वेल प्लेट में प्रोटीन के 2-गुना सीरियल कमजोर पड़ने को तैयार करें।
      1. HBS / HSA (BSA) बफर के 200 μL की कुल मात्रा में ब्याज के प्रोटीन के लिए 100 nM की शुरुआती एकाग्रता तैयार करें, पहले कॉलम में इस समाधान के 100 μL वितरित करें, और शेष 100 μL स्तंभ # 2 के शीर्ष पर जिसमें HBS / HSA (BSA) बफर के 100 μL शामिल हैं।
      2. कॉलम # 2 से कॉलम # 3 तक क्रमिक रूप से 100 μL स्थानांतरित करके जारी रखें और सभी अनुमापन बिंदुओं को कवर करने के लिए आवश्यक के रूप में दोहराएं। श्रृंखला के अंतिम स्तंभ को बिना किसी प्रोटीन के छोड़ दें, क्योंकि इसका उपयोग परिमाणीकरण के लिए रिक्त संदर्भ के रूप में किया जाएगा।
    10. तैयार BSLBs को एक मात्रा में इस तरह से निलंबित करें कि 5 × 105 BSLB HBS / HSA (BSA) बफर के 100 μL में निहित हैं।
    11. बीएसएलबी निलंबन के 100 μL को दूसरे यू-बॉटम 96-वेल प्लेट के कुओं में स्थानांतरित करें, जैसे कि प्रत्येक अच्छी तरह से 5 × 105 बीएसएलबी प्राप्त करता है।
    12. 300 × जी और आरटी पर 2 मिनट के लिए BSLBs युक्त दूसरी प्लेट नीचे स्पिन और supernatant त्याग.
    13. प्रोटीन अनुमापन प्लेट से 100 μL वॉल्यूम को तलछट वाले BSLBs वाली प्लेट में स्थानांतरित करें। धीरे से मिलाएं, पिपेटिंग करते समय अतिरिक्त बुलबुला पीढ़ी से बचें, और प्लेट शेकर का उपयोग करके आरटी पर 30 मिनट और 1,000 आरपीएम के लिए इनक्यूबेट करें। एल्यूमीनियम पन्नी के साथ प्रकाश से बचाने के लिए।
    14. RT पर 2 मिनट के लिए 300 × g के अवसादन चरणों का उपयोग करके HBS / HSA (BSA) बफर के साथ प्लेट को तीन बार धोएं।
    15. यदि अंशांकन में उपयोग किया जाने वाला पुनः संयोजक प्रोटीन सीधे फ्लोरोक्रोम के लिए संयुग्मित है और एफ / पी मूल्यों को जाना जाता है, तो चरण 5.8.20 पर आगे बढ़ें।
    16. यदि अंशांकन में उपयोग किया जाने वाला पुनः संयोजक प्रोटीन फ्लोरोक्रोम के लिए अनलेबल या संयुग्मित है या कोई एमईएसएफ मनका मानक उपलब्ध नहीं है, तो प्रोटीन-लेपित बीएसएलबी को दागने के लिए ज्ञात एफ / पी मूल्यों के साथ एलेक्सा फ्लोर 488 या 647-संयुग्मित एंटीबॉडी का उपयोग करें।
    17. परिमाणीकरण एंटीबॉडी की संतृप्त सांद्रता के साथ दाग।
      नोट:: लक्ष्य व्यंजक स्तर के आधार पर, ये श्रेणी 5 और 10 μg/mL के बीच है।
    18. आरटी पर 30 मिनट के लिए दाग और एक प्लेट शेकर का उपयोग करके 1,000 आरपीएम। एल्यूमीनियम पन्नी का उपयोग कर प्रकाश से बचाने के लिए।
    19. एचबीएस / एचएसए (बीएसए) बफर के साथ दो बार धोएं और एक बार पीबीएस के साथ आरटी पर 2 मिनट के लिए 300 × जी के अवसादन चरणों का उपयोग करके धोएं।
      नोट:: पीबीएस, पीएच 7.4 का उपयोग करने के लिए अधिग्रहण से पहले धोया BSLBs resuspend करने के लिए। प्रोटीन युक्त बफ़र्स का उपयोग न करें, क्योंकि यह उच्च-थ्रूपुट सैंपलर्स के साथ नमूनों के स्वचालित मिश्रण के दौरान बुलबुले के गठन की ओर जाता है।
    20. एमईएसएफ मानकों को प्राप्त करें, यह सुनिश्चित करें कि सबसे उज्ज्वल चोटियां परिमाणीकरण डिटेक्टर (चैनल) के लिए रैखिक पहचान सीमा में बनी रहें, जैसा कि चित्रा 1 बी (vii) में दिखाया गया है।
    21. मैन्युअल रूप से या HTS का उपयोग कर नमूनों को प्राप्त करें। यदि उत्तरार्द्ध का उपयोग करते हैं, तो पीबीएस के 100 μL में BSLBs को फिर से निलंबित करें और 2.5 और 3.0 μL / s के बीच प्रवाह दर का उपयोग करके 80 μL प्राप्त करें, 100 μL की मिश्रण मात्रा (या कुल आयतन का 50% यदि पुनर्सर्पन मात्रा कम है), 150 μL / s की मिश्रण गति, और BSLBs को सुनिश्चित करने के लिए पांच मिश्रण।
    22. FCS फ़ाइलें निर्यात करें।
    23. विश्लेषण (चित्रा 2A) के लिए एकल घटनाओं पर ध्यान केंद्रित करें, क्योंकि डबल्स या ट्रिपल्स निर्धारण में त्रुटि का परिचय देंगे। प्रोटोकॉल चरण 1.2.3 में इंगित के रूप में एकल ईवेंट की नेस्टेड पहचान का उपयोग करें।
    24. प्रत्येक एमईएसएफ अंश (1-4) के एमएफआई को मापें और सही एमएफआई (सीएमएफआई) निकालने के लिए खाली मोतियों के एमएफआई को घटाएं।
    25. MESF मानकों के लिए परिकलित cMFI पर MESF की ढलान (b) निकालने के लिए एक रैखिक प्रतिगमन विश्लेषण निष्पादित करें, जिसका उपयोग चरण 5.33 में किया जाएगा।
    26. प्रत्येक अनुमापन बिंदु के एमएफआई को निकालें और सीएमएफआई प्राप्त करने के लिए प्रोटीन के बिना मोतियों के एमएफआई को घटाएं।
    27. प्रत्येक अनुमापन बिंदु के लिए BSLBs के लिए बाध्य MESF निकालने के लिए चरण 5.31 में परिकलित ढलान के साथ cMFIs को विभाजित करें।
    28. प्रति BSLB बाध्य अणुओं की औसत संख्या निकालने के लिए परिमाणीकरण एंटीबॉडी के F/P मान से BSLBs से बंधे MESF को विभाजित करें।
    29. BSLBs (5.00 ± 0.05 μm) के व्यास का उपयोग करते हुए, प्रोटीन के अंतिम घनत्व की गणना करने के लिए मनका सतह क्षेत्र (SA = 4pr2) निकालें ताकि प्रति अनुमापन बिंदु (प्रोटीन एकाग्रता) के अंतिम घनत्व (molec./μm2) की गणना की जा सके।
    30. सबसे अच्छा फिट की रेखा की ढलान (बी) की गणना करने के लिए प्रोटीन घनत्व पर प्रोटीन एकाग्रता का एक नया प्रतिगमन विश्लेषण करें।
      नोट: डीजीएस-एनटीए (एनआई) के 12.5 मोल% की एकाग्रता टी कोशिकाओं के गैर-विशिष्ट सक्रियण को प्रेरित किए बिना या एसएलबी की पार्श्व गतिशीलता को प्रभावित किए बिना लगभग 10,000 मोलेक / μm210 की अधिकतम एंकरिंग क्षमता प्रदान करती है।

6. टी कोशिकाओं और BSLBs के बीच सिनैप्टिक स्थानांतरण प्रयोगों का प्रदर्शन

  1. सिनेप्टिक स्थानांतरण प्रयोग चलाने से पहले
    1. गैर-फ्लोरोसेंट BSLBs, फ्लोरोसेंट लिपिड के साथ BSLBs, unstained कोशिकाओं (या मुआवजा मोतियों; सामग्री की तालिका देखें), और उपकरण के प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रम इंटरैक्शन की पहचान करने के लिए एकल-रंग-सना हुआ कोशिकाओं (या मुआवजा मोती) प्राप्त करें। पॉलीक्रोमैटिक पैनल को फिर से डिजाइन करने, संवेदनशीलता बढ़ाने और महत्वपूर्ण डिटेक्टरों पर माप त्रुटि को कम करने के लिए उच्च स्पिलओवर प्रसार वाले उन डिटेक्टरों पर ध्यान केंद्रित करें ( 14 देखें)।
    2. इष्टतम एकाग्रता खोजने के लिए पता लगाने एंटीबॉडी को टाइटरेट करें, नकारात्मक का पता लगाने से समझौता किए बिना सकारात्मक घटनाओं का पता लगाने में सक्षम करें।
      नोट:: जब भी कोई एंटीबॉडी बहुत परिवर्तन होता है तो इस चरण को दोहराएं क्योंकि F/P मान और चमक बैच से बैच तक भिन्न होते हैं।
    3. वैकल्पिक: विभिन्न वोल्टेज श्रेणियों (यानी, एक वोल्टेज चलता है) पर नमूना प्राप्त करके पीएमटी वोल्टेज को अनुकूलित करें ताकि पीएमटी को शोर पर इष्टतम संकेत मिल सके (यानी, नकारात्मक और सकारात्मक का पृथक्करण सुनिश्चित करते हुए यह सुनिश्चित करते हुए कि सबसे उज्ज्वल आबादी का संकेत रैखिक सीमा में रहता है)।
  2. BSLBs के लिए टी-सेल आउटपुट स्थानांतरण का मापन
    1. पूरक RPMI 1640 (यहां R10 माध्यम) तैयार करें जिसमें गर्मी-निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), 100 μM गैर-आवश्यक अमीनो एसिड, 10 mM HEPES, 2 mM L-glutamine, 1 mM सोडियम पाइरूवेट, पेनिसिलिन के 100 U / ml, और स्ट्रेप्टोमाइसिन के 100 μg / mL का 100% शामिल है। संस्कृति और टी कोशिकाओं का विस्तार करने के लिए R10 माध्यम का उपयोग करें।
    2. दिन 1 पर, परिधीय रक्त या ल्यूकोरिडक्शन सिस्टम (एलआरएस) कक्षों से टी कोशिकाओं को अलग करें। मानव CD4+ और CD8+ T कोशिकाओं के संवर्धन के लिए immunodensity सेल अलगाव और पृथक्करण किट (सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करें।
    3. 1.5 और 2.0 × 106 कोशिकाओं / एमएल के बीच एक अंतिम एकाग्रता पर कोशिकाओं को बीज दें, 6-अच्छी तरह से प्लेटों का उपयोग करके प्रति अच्छी तरह से 5 एमएल कुल से अधिक नहीं।
    4. मानव टी सेल सक्रियण (एंटी-सीडी 3 / एंटी-सीडी 28) चुंबकीय मोतियों के 1: 1 अनुपात का उपयोग करके टी कोशिकाओं को सक्रिय करें ( सामग्री की तालिका देखें) और सेल प्रसार और अस्तित्व का समर्थन करने के लिए पुनः संयोजक मानव आईएल -2 के 100 आईयू जोड़ें।
    5. दिन 3 पर, चुंबकीय स्तंभों का उपयोग करके सक्रिय चुंबकीय मोतियों को हटा दें (सामग्री की तालिका देखें)। सुनिश्चित करें कि चुंबकीय मोती अतिरिक्त धोने के चरणों के लिए कोशिकाओं को पुनर्प्राप्त करने से पहले ट्यूब के किनारों से जुड़े रहें।
    6. चुंबकीय मोतियों को एक बार फिर से ताजा R10 माध्यम के 5 मिलीलीटर के साथ धोएं, अच्छी तरह से मिलाएं, और उन्हें चुंबक में वापस रखें। इस वॉल्यूम को पुनर्प्राप्त करें और चरण 6.2.5 में पुनर्प्राप्त कक्षों के साथ मिश्रण करें।
    7. आईएल -2 के 100 यू / एमएल वाले ताजा आर 10 में कोशिकाओं को 1.5-2 × 106 कोशिकाओं / एमएल तक फिर से निलंबित करें। 48 घंटे के बाद माध्यम को फिर से भरें, यह सुनिश्चित करें कि आईएल -2 का अंतिम जोड़ प्रयोग के दिन (संस्कृति के दिन 7 से 14) से पहले 48 घंटे है।
    8. Synaptic स्थानांतरण प्रयोग के दिन, 10% FBS, 100 μM गैर-आवश्यक अमीनो एसिड, 2 mM L-glutamine, 1 mM सोडियम पाइरूवेट, पेनिसिलिन के 100 U / ml, और स्ट्रेप्टोमाइसिन के 100 μg / mL के साथ फिनोल रेड-फ्री RPMI 1640 माध्यम के पूरक द्वारा Synaptic Transfer Assay माध्यम (तालिका 1 देखें) तैयार करें। पुनः संयोजक मानव IL-2 शामिल न करें।
    9. ट्राइपैन ब्लू स्टेनिंग या इलेक्ट्रिक करंट बहिष्करण का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें और उन्हें माध्यम में 2.5 × 106 कोशिकाओं / एमएल की अंतिम एकाग्रता के लिए फिर से निलंबित कर दें। यदि अत्यधिक कोशिका मृत्यु देखी जाती है (>10%), तो पॉलीसेकेराइड और सोडियम डायट्रिज़ोएट के मिश्रण का उपयोग करके मृत / मरने वाली कोशिकाओं को हटा दें ( सामग्री की तालिका देखें) निम्नानुसार:
      1. पॉलीसेकेराइड-सोडियम डायट्रिज़ोएट समाधान के 13 एमएल के शीर्ष पर सेल संस्कृति की परत 15 मिलीलीटर।
      2. न्यूनतम त्वरण और मंदी के साथ आरटी पर 20 मिनट के लिए 1,250 × जी के लिए सेंट्रीफ्यूज। माध्यम और पॉलीसेकेराइड-सोडियम डायट्रिज़ोएट समाधान के बीच इंटरफ़ेस में सेल परत (बादल) एकत्र करें।
      3. Prewarmed Synaptic स्थानांतरण परख माध्यम के साथ कम से कम दो बार कोशिकाओं को धोलें (चरण 6.2.7 में तैयार)।
      4. गिनती और 2.5 × 106 / mL Synaptic स्थानांतरण परख माध्यम का उपयोग कर की एक अंतिम एकाग्रता के लिए कोशिकाओं resuspend. BSLBs के साथ इस सेल निलंबन के Coculture 100 μL (चरण 6.2.15 देखें)।
    10. प्रयोग के लिए आवश्यक BSLBs की संख्या की गणना करें; परीक्षण किए जाने वाले सभी अलग-अलग प्रोटीन मास्टर मिक्स और एंटीजन अनुमापन पर विचार करें (या तो बायोटिनिलेटेड एचएलए / एमएचसी-पेप्टाइड मोनोमर्स या मोनोबायोटिनिलेटेड एंटी-सीडी 3 π फैब)।
    11. प्रोटोकॉल अनुभाग 5 से समान चरणों का पालन करके बीएसएलबी को इकट्ठा करें, लेकिन इस बार, एक जटिल एपीसी झिल्ली (चित्रा 3 ए) को पुनर्गठित करने के लिए आवश्यक प्रोटीन और लिपिड के सभी अनुमापन को संयोजित करें। एक ही वॉल्यूम रखें: प्रारंभिक सिलिका मोतियों की मात्रा और अंशांकन के दौरान उपयोग किए जाने वाले प्रोटीन मिश्रण की मात्रा के बीच वॉल्यूम संबंध, साथ ही साथ बीएसएलबी के लोडिंग में उपयोग किए जाने वाले समय और तापमान। उदाहरण के लिए, यदि सिलिका मोतियों / अच्छी तरह से 0.5 μL और प्रोटीन मिश्रण के 100 μL / अच्छी तरह से प्रारंभिक अंशांकन के लिए उपयोग किया गया था, तो BSLBs को टी कोशिकाओं के साथ सह-संवर्धित करने के लिए तैयार करने के लिए 5: 1,000 vol: vol अनुपात बनाए रखें।
    12. एक बार जब बीएसएलबी को ब्याज के प्रोटीन मिश्रण के साथ लोड किया जाता है, तो अतिरिक्त अनबाउंड प्रोटीन को हटाने के लिए एचबीएस / एचएसए (बीएसए) के साथ बीएसएलबी को दो बार धोएं। प्रत्येक धोने के चरण में आरटी पर 2 मिनट के लिए 300 × जी की अवसादन गति का उपयोग करें और supernatants को त्याग दें।
    13. 200 μL में 5 × 105 BSLBs प्रति अच्छी तरह से पुन: निलंबित करें।
    14. एक डुप्लिकेट बनाने के लिए एक नए यू-बॉटम 96-वेल प्लेट में प्रति अच्छी तरह से 100 μL स्थानांतरित करें, जैसे कि प्रति अच्छी तरह से बीएसएलबी की अंतिम मात्रा 2.5 × 105 है।
    15. 2 मिनट और आरटी के लिए 300 × जी पर बीएसएलबी को नीचे स्पिन करें और supernatant को त्याग दें।
    16. टी सेल निलंबन के 100 μL का उपयोग कर BSLBs को फिर से निलंबित करें; बुलबुले के गठन को रोकने के लिए धीरे से मिश्रण.
    17. 37 डिग्री सेल्सियस पर 90 मिनट के लिए cocultures incubate.
      नोट: वैकल्पिक रूप से, कोशिकाओं और मोतियों को HBS/HSA (BSA) बफ़र में फिनोल-रेड फ्री RPMI के बजाय coculture के लिए पुन: निलंबित किया जा सकता है। इस मामले में, इनक्यूबेशन को एक गैर-सीओ 2 इनक्यूबेटर में किया जाना चाहिए क्योंकि यह गैस बाइकार्बोनेट की अनुपस्थिति में बफर को तेजी से अम्लीकृत करेगी।
    18. BSLB-T सेल cocultures को पहले कम से कम 15 मिनट के लिए RT पर कोशिकाओं को incubating द्वारा ठंडा करें। उन्हें प्रकाश से बचाएं।
    19. 500 × जी और आरटी पर 5 मिनट के लिए कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें; supernatant त्याग.
    20. RT 2% BSA-PBS (Ca2+ और Mg2+ मुक्त) में ब्लॉकिंग के लिए कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। कोशिकाओं को 45 मिनट के लिए बर्फ पर रखें। प्रकाश से रक्षा करें।
    21. कोशिकाओं को इनक्यूबेट करते समय, बर्फ-ठंडा 0.22 μm-फ़िल्टर किए गए 2% बीएसए का उपयोग करके एंटीबॉडी मास्टर मिश्रण तैयार करें पीबीएस में एक धुंधला बफर के रूप में, जो अतिरिक्त ब्लॉकिंग प्रदान करेगा।
      नोट: शानदार वायलेट रंजक के लिए संयुग्मित एंटीबॉडी के कुछ बैचों को BSLBs nonspecifically करने के लिए बाध्य करते हैं। 5% बीएसए-पीबीएस के साथ अवरुद्ध करने से इस शोर को कम करने में मदद मिलती है। अब से कोल्ड चेन को अखंडित रखना सुनिश्चित करें।
    22. 5 मिनट और 4 डिग्री सेल्सियस के लिए 500 × जी पर cocultures नीचे स्पिन। supernatants को त्यागने से पहले, संक्षेप में सुनिश्चित करें कि गोली एक backlight का उपयोग कर 96-अच्छी तरह से प्लेट के नीचे का निरीक्षण करके मौजूद है।
    23. एक multichannel पिपेट का उपयोग करते हुए, अनुकूलित एंटीबॉडी सांद्रता युक्त धुंधला मास्टर मिश्रण में कोशिकाओं resuspend.
      नोट:: बुलबुले और धुंधला वॉल्यूम के वितरण में त्रुटियों की पीढ़ी को रोकने के लिए कोई फ़िल्टर के साथ पिपेट युक्तियों का उपयोग करें।
    24. आइसोटाइप-लेबल कोशिकाओं और बीएसएलबी, फ्लोरोसेंट और गैर-फ्लोरोसेंट बीएसएलबी, और कोशिकाओं और बीएसएलबी को अकेले दाग शामिल करें। सभी नियंत्रणों के लिए प्रति अच्छी तरह से घटनाओं की कुल संख्या का सम्मान करें (यानी, केवल BSLB जिसमें 5 × 105 BSLB / अच्छी तरह से शामिल हैं, और केवल सेल नियंत्रण जिसमें 5 × 105 कोशिकाएं / अच्छी तरह से प्रति दाग वाली घटना के प्रति एंटीबॉडी की सापेक्ष वृद्धि से बचने के लिए हैं)।
    25. मात्रा के आधे हिस्से को ऊपर और नीचे पाइप करके धीरे से मिलाएं और बर्फ पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। प्रकाश से रक्षा करें।
    26. बर्फ-ठंडे 2% बीएसए-पीबीएस, पीएच 7.4, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 500 × जी के अवसादन चरणों का उपयोग करके कोशिकाओं और बीएसएलबी को दो बार धोएं। पीबीएस के 100 μL में धोया cocultures resuspend और तुरंत प्राप्त करें।
    27. यदि निर्धारण की आवश्यकता है, तो 10 मिनट के लिए पीबीएस में पीएफए के 0.5% डब्ल्यू / वी का उपयोग करके ठीक करें, एक बार धोएं, और अधिग्रहण तक पीबीएस में रखें। प्रकाश से रक्षा करें।
    28. मुआवजे से पहले, एमईएसएफ मानकों का अधिग्रहण करें, यह सुनिश्चित करते हुए कि सबसे मंद और सबसे उज्ज्वल आबादी दोनों माप की रैखिक सीमा में आती हैं।
    29. मुआवजे के नमूने प्राप्त करें, मुआवजे की गणना करें, और प्रयोग के लिए मुआवजा मैट्रिक्स (लिंक) लागू करें।
    30. प्राप्त करें और प्रत्येक परिमाणीकरण चैनल के लिए न्यूनतम 2 × 104 कुल MESF मानकों को सहेजें।
    31. उच्च-थ्रूपुट सैंपलर्स का उपयोग करके अधिग्रहण के लिए, मानक के लिए उपकरण अधिग्रहण सेट करें, नमूना अधिग्रहण को 80 μL (या कुल मात्रा का 80%) पर सेट करें, 2.0 और 3.0 μL / s के बीच नमूना प्रवाह दर, 50 μL की नमूना मिश्रण मात्रा (या मिश्रण के दौरान बुलबुला गठन से बचने के लिए कुल मात्रा का 50%), 150 μL / s का नमूना मिश्रण, और 3 और 5 के बीच प्रति अच्छी तरह से मिश्रण।
    32. प्रति नमूना 1 × 104 एकल BSLBs की एक न्यूनतम प्राप्त करें (संदर्भ गेटिंग रणनीति के लिए चित्रा 3B पैनल (i) - (vi) देखें)।
    33. उपकरण को बंद करने से पहले 5 मिनट के लिए एक सफाई समाधान के बाद अल्ट्राप्योर पानी के 5 मिनट के बाद चल रहे साइटोमीटर को धोएं। HTS का उपयोग कर रहे हैं, तो टैब HTS और क्लीन विकल्प के अंतर्गत विकल्पों का पालन करें।
    34. FCS फ़ाइलें निर्यात करें.

7. BSLB के लिए कणों के synaptic हस्तांतरण को मापने

  1. प्रयोग FCS फ़ाइलें खोलें। कोशिकाओं और BSLBs की जनसंख्या को उनके पक्ष और आगे प्रकाश प्रकीर्णन क्षेत्रों (SSC-A बनाम FSC-A) के आधार पर चुनें, जैसा कि चित्र 3B (i) में दिखाया गया है।
  2. निरंतर अधिग्रहण विंडो (चित्रा 3B (ii)) के भीतर की घटनाओं का चयन करें।
  3. दोनों कोशिकाओं और BSLB की एकल घटनाओं पर ध्यान केंद्रित करें; अनुक्रमिक गेटों FSC-W/FSC-H (singlets-1, Figure 3B पैनल (iii)) और SSC-W/SSC-H (singlets-2) में कम W के आधार पर पहले एकल कोशिकाओं की पहचान करें; चित्रा 3B पैनल (iv)). आनुपातिक FSC-A और FSC-H (चित्रा 3B, पैनल (v)) के साथ घटनाओं का चयन करके एक अतिरिक्त singlets-3 गेट परिभाषित करें।
  4. प्रत्येक प्रयोग नमूने के लिए एकल कोशिकाओं और MESF से एमईएसएफ अंश रिक्त और 1 से 4 तक और एमईएसएफ के एमएफआई को निकालें।
  5. प्रत्येक भिन्न से रिक्त मनका जनसंख्या के MFI घटाकर MESF भिन्न 1 से 4 के लिए सही MFI (cMFI) मान जनरेट करें।
  6. एकल BSLBs और कोशिकाओं के लिए cMFIs उत्पन्न करें ( चित्रा 3C पैनल (i) को देखें)।
  7. प्रासंगिक टी सेल मार्करों के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ दाग बीएसएलबी के एमएफआई को सही करने के लिए आइसोटाइप नियंत्रण एंटीबॉडी के साथ सना हुआ बीएसएलबी से सिग्नल का उपयोग करें। चित्र 3C पैनल (ii) में दिखाए गए समीकरण का उपयोग करके सामान्यीकृत सिनैप्टिक स्थानांतरण प्रतिशत (NST%) की गणना करने के लिए cMFI का उपयोग करें।
  8. यदि TCR ट्रिगरिंग के जवाब में विशेष रूप से स्थानांतरित कणों में रुचि रखते हैं, तो एगोनिस्टिक BSLBs के MFI से null BSLBs से सिग्नल घटाएं। चित्र 3C पैनल (ii) में दिखाए गए समीकरण का उपयोग करके TCR-संचालित NST% की गणना करने के लिए इस cMFI का उपयोग करें।
  9. यदि टी सेल-बीएसएलबी इंटरफ़ेस में कण कार्गो के रूप में स्थानांतरित अणुओं की कुल संख्या निर्धारित करने में रुचि रखते हैं, तो टी सेल-बीएसएलबी सहसंस्कृतियों के लिए एक ही उपकरण सेटिंग्स और अधिग्रहण सत्र का उपयोग करके एमईएसएफ बेंचमार्क मोतियों का अधिग्रहण करें।
  10. एमईएसएफ मनका आबादी का विश्लेषण करें और प्रोटोकॉल चरणों 5.8.15 से 5.8.17 में दर्शाए गए अनुसार उनके सीएमएफआई निकालें। cMFI पर MESF के प्रतिगमन विश्लेषण के लिए सबसे अच्छा फिट की रेखा की ढलान की गणना करें।
  11. BSLBs पर जमा MESF की संख्या निकालने के लिए परिकलित ढलान का उपयोग करें। विशेष रूप से BSLBs को उत्तेजित करने के लिए स्थानांतरित MESF की संख्या निकालने के लिए रिक्त स्थान के रूप में या तो आइसोटाइप नियंत्रण या नल BSLB का उपयोग करके परिकलित cMFIs का उपयोग करें।
  12. प्रति बीएसएलबी परिकलित (औसत) एमईएसएफ को परिमाणीकरण एंटीबॉडी के एफ/पी मान से विभाजित करके बीएसएलबी में स्थानांतरित मार्करों के अणुओं की संख्या की गणना करें।

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Representative Results

सेल सतह पर पूर्ण प्रोटीन परिमाणीकरण के लिए FCM
लिगेंड के शारीरिक घनत्व को प्रस्तुत करने वाले बीएसएलबी के पुनर्गठन के लिए मॉडलिंग सेल सबसेट पर कुल प्रोटीन घनत्व के अनुमान की आवश्यकता होती है। BSLBs को पुनर्गठित करने के लिए, BSLB और कोशिकाओं के बीच आसंजन और कार्यात्मक बातचीत का समर्थन करने वाले प्रोटीन के साथ ब्याज के सिग्नलिंग अक्ष में भूमिका निभाने की उम्मीद करने वाले किसी भी प्रासंगिक लिगैंड को शामिल करें, जैसे कि आईसीएएम -1 और कोस्टिम्यूलेटरी अणु, उदाहरण के लिए, CD40, CD58, और B7 रिसेप्टर्स (CD80 और CD86)। हाथ में प्रश्न के आधार पर अतिरिक्त प्रोटीन जोड़े जा सकते हैं, जिसमें आईसीओएसएल 3, पीडी-एल 1 और पीडी-एल 215 जैसे कोस्टिमुलेटरी अणु शामिल हैं। किसी भी अन्य अणुओं के लिए, मात्रात्मक प्रवाह साइटोमेट्री के साथ कोशिकाओं का सीधे विश्लेषण करके निर्धारित आणविक घनत्व का उपयोग करके बीएसएलबी का पुनर्गठन करें। सीधे संयुग्मित एंटीबॉडी के लिए, BioLegend प्रत्येक एंटीबॉडी लॉट संख्या के लिए एफ / पी मान प्रदान करता है। एंटीबॉडी को इन-हाउस और स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री द्वारा निर्धारित एफ / पी अनुपात को भी लेबल किया जा सकता है, जो वांछित फ्लोरोक्रोम के लिए संयुग्मित कोई वाणिज्यिक एंटीबॉडी नहीं होने पर एक विकल्प प्रदान करता है। चूंकि हम कोशिकाओं और बीएसएलबी की सतह पर पुनः संयोजक प्रोटीन की संख्या को कैलिब्रेट करने के लिए एक ही एंटीबॉडी का उपयोग करते हैं, इसलिए एंटीबॉडी-बाइंडिंग वैलेंसी को सही करने की कोई आवश्यकता नहीं है क्योंकि यह स्थिर रहता है। यदि एंटीबॉडी-बाइंडिंग वैलेंसी की आवश्यकता होती है, तो बीएसएलबी को सजाने के लिए ज्ञात एफ / पी के साथ पुनः संयोजक प्रोटीन और एंटीबॉडी दोनों का उपयोग करें और संतृप्त परिस्थितियों में धुंधला होने के बाद बाध्य एंटीबॉडी की संख्या के साथ लोड किए गए पुनः संयोजक प्रोटीन के अणुओं की तुलना करें।

प्रति कोशिका बाध्य एंटीबॉडी अणुओं का अनुमान एक समर्पित मोनोक्रोमैटिक फ्लो साइटोमेट्रिक माप या एंटीबॉडी के पॉलीक्रोमैटिक पैनल का उपयोग करके लगाया जा सकता है, जिसका उद्देश्य ब्याज के ऊतक के भीतर कोशिकाओं के अपेक्षाकृत दुर्लभ सबसेट पर पूर्ण प्रोटीन घनत्व का अनुमान लगाना है, जैसे कि पैलेटिन टॉन्सिल। चित्रा 1 एक उदाहरण के रूप में CXCR5 + B कोशिकाओं और कूपिक टी कोशिकाओं (TFH) में ICAM-1 के घनत्व के प्रतिनिधि माप को दर्शाता है। चित्रा 1 ए में दिखाए गए एक ही धुंधला प्रोटोकॉल और प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण सिद्धांतों का उपयोग उपकला कोशिकाओं, स्ट्रोमल कोशिकाओं, मोनोसाइट्स, मोनोसाइट्स-व्युत्पन्न डेंड्रिटिक कोशिकाओं (एमओडीसी) पर प्रोटीन घनत्व को मापने के लिए किया जा सकता है, या अन्य मानव और माउस ऊतकों में बी और टी लिम्फोसाइट्स पर। रक्त और टॉन्सिल से अलग ऊतकों के लिए, प्रोटीज कॉकटेल का उपयोग करके कोशिकाओं को अलग करते समय सावधानी बरतनी चाहिए, क्योंकि एंजाइमों को पचाने के लिए कोशिकाओं के लंबे समय तक संपर्क में रहने से कोशिका सतह अभिव्यक्ति के स्तर को कम कर दिया जाता है।

निरंतर अधिग्रहण विंडो (चित्रा 1 ए ii) के भीतर एकल, लाइव कोशिकाओं पर अधिग्रहण और विश्लेषण पर ध्यान केंद्रित करें, क्योंकि समय निरंतरता के बाहर की घटनाएं प्रकाश को तितर-बितर करती हैं, परिमाणीकरण से समझौता करती हैं। निर्धारण की सटीकता को बढ़ाने के लिए, FcπRs के कुशल ब्लॉकिंग द्वारा APCs के nonspecific धुंधला को कम करें। एचएफसीबी में मौजूद मानव सीरम और ईडीटीए अपने हेरफेर और धुंधला के दौरान कोशिकाओं के सहज एकत्रीकरण को कम करने के लिए मुक्त Ca2 + को चेलेट करते समय कुशल FcπR ब्लॉकिंग को सक्षम करते हैं ( चित्रा 1A (iii) और (iv) में काले तीर टॉन्सिलर कोशिकाओं के निलंबन में शेष डबल्स दिखाते हैं)।

सेटअप का उपयोग करके उपकरण प्रदर्शन का ट्रैक रखना और मोतियों और सॉफ़्टवेयर (या इसी तरह; सामग्री की तालिका देखें) समय के साथ परिमाणीकरण की पुनरुत्पादन के लिए महत्वपूर्ण है, खासकर बाद के चरणों में जब बीएसएलबी में कणों के सिनैप्टिक हस्तांतरण को केवल एमएफआई का उपयोग करके मापा जाता है (यानी, फ्लोरोक्रोम के लिए जिसके लिए कोई एमईएसएफ मानक नहीं हैं)। इसी तरह, एमईएसएफ मानकों के साथ उपयोग किए जाने वाले परिमाणीकरण डिटेक्टर के लिए मनमाने ढंग से प्रतिदीप्ति इकाइयों की रैखिक सीमा (यानी, रैखिकता न्यूनतम और रैखिकता अधिकतम) की जांच करें ताकि प्रत्येक अंशांकन बिंदु प्रतिदीप्ति और फ्लोरोक्रोम की संख्या के बीच रैखिक संबंध बनाए रखे।

प्रतिदीप्ति के लिए नमूनों "रिक्त" की तैयारी, या पृष्ठभूमि धुंधला शोर का एक विचार प्रदान करने वाले नमूने, गैर-विशिष्ट फ्लोरोसेंट सिग्नल को घटाने के लिए आवश्यक हैं। आइसोटाइप नियंत्रण और / या जैविक रूप से शून्य नमूने (जैसे, नॉकआउट) कोशिकाओं की पृष्ठभूमि के संकेत के लिए सही करने और परिमाणीकरण एंटीबॉडी (चित्रा 1 ए पैनल (viii)) से व्युत्पन्न सच्चे संकेत को निकालने के लिए आवश्यक हैं। इसी तरह, मानक एमईएसएफ मोती प्रत्येक वास्तव में सकारात्मक मनका आबादी (चित्रा 1 बी पैनल (vii) और (viii)) से पृष्ठभूमि संकेत को घटाने के लिए एक समर्पित रिक्त आबादी का उपयोग करते हैं। एक बार प्रतिगमन विश्लेषण किया जाता है और एमईएसएफ और सही एमएफआई के बीच संबंध को परिभाषित करने वाली ढलान निकाली जाती है, पूर्ण आणविक घनत्व में रूपांतरण सरल गणितीय संचालन (चित्रा 1 सी) का अनुसरण करता है।

चित्रा 1 C में CSA का अनुमान लगाने के लिए, विद्युत धारा बहिष्करण (CASY-TT) का उपयोग हजारों कोशिकाओं से सेल आयतन और व्यास के माप को निकालने के लिए किया गया था। गोले (4pr2) के लिए सतह क्षेत्र की गणना से अनुमानित परिणामी सीएसए कोशिकाओं की सक्रियण स्थिति के साथ भिन्न होता है, जिसमें गैर-सक्रिय बी कोशिकाओं के लिए 170.37 ± 4.91 μm2 और गैर-सक्रिय और सक्रिय टी कोशिकाओं के लिए क्रमशः 234.52 ± 1.53 μm2 और 318 ± 24.45 μm2 के मनाया मूल्यों के साथ होता है। ये सीएसए इमेजिंग तकनीकों जैसे कि गैर-सक्रिय लिम्फोसाइट्स 16 के तीन आयामी अपवर्तक सूचकांक टोमोग्राफी द्वारा अनुमानित लोगों के लिए तुलनीय हैं।

एक बार जब शारीरिक घनत्व की सीमा को परिभाषित किया गया है (उदाहरण के लिए, विभिन्न सक्रियण कार्यक्रमों से गुजरने वाली कोशिकाओं पर सतह घनत्व की तुलना करके), बीएसएलबी का उपयोग उन सतहों को मॉडल करने के लिए किया जा सकता है। एनआईएच टेट्रामर सुविधा (या मोनोबायोटिनिलेटेड मोनोमेरिक एंटी-सीडी 3-फैब) द्वारा प्रदान किए गए बायोटिनिलेटेड एंटीजेनिक एचएलए-पेप्टाइड मोनोमर्स का एक अनुमापन आईसीएएम -1 12-उसके साथ एक विहित एपीसी झिल्ली के पुनर्गठन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। 6, 9, 12, और 14 के साथ टैग किए गए वाणिज्यिक प्रोटीन का उपयोग बीएसएलबी की सतह को सजाने के लिए किया जा सकता है (आईसीएएम -1 12-हिस के साथ उदाहरणों के लिए चित्रा 2 ए देखें)। मात्रात्मक एफसीएम विश्लेषण के साथ प्रोटीन अनुमापन शारीरिक एपीसी सतहों को पुनर्गठित करने और विभिन्न टी सेल सबसेट के सिनैप्टिक आउटपुट पर उनके प्रभाव का परीक्षण करने के लिए एक मजबूत पद्धति प्रदान करते हैं।

टी सेल synapses के आउटपुट का अध्ययन करने के लिए, यह सुनिश्चित करने के लिए 1: 1 BSLB-to-T सेल अनुपात का उपयोग करें कि, औसतन, एक सेल अध्ययन की गई अवधि में एक BSLB के साथ बातचीत करेगा। हमने देखा है कि सामग्री हस्तांतरण इनक्यूबेशन समय के लिए आनुपातिक है, जो सेल में कम मात्रा में स्थानांतरित अणुओं का पता लगाने के लिए एक बहुमुखी मंच प्रदान करता है: बीएसएलबी इंटरफ़ेस। एक उपयुक्त पैनल डिजाइन इस प्रकार ट्रांस-सिनैप्टिक सामग्री का पता लगाने की संवेदनशीलता और विश्वसनीयता को बढ़ाने के लिए महत्वपूर्ण है, जैसा कि टीएसवी के मामले में, आउटपुट 25 और 36 पुटिकाओं / सेल / 20 मिनट 2, 3 के बीच भिन्न होता है। पहले प्रत्येक फ्लोरोक्रोम-लेबल एंटीबॉडी और लिपिड के वर्णक्रमीय स्पिलओवर का परीक्षण करें। जब उच्च स्पिलओवर मनाया जाता है, तो हम धुंधला एंटीबॉडी के अनुमापन और बीएसएलबी की रचना करने वाले फ्लोरोसेंट लिपिड के प्रतिशत की सिफारिश करते हैं, साथ ही पीएमटी वोल्टेज क्रमशः क्षतिपूर्ति किए गए नमूनों पर फैलने वाली त्रुटि को कम करने और शोर अनुपात पर संकेत को बढ़ाने के लिए चलता है,(विषय के लिए एक समर्पित परिचय के लिए 12,14,17 देखें)।

शून्य BSLBs (एंटीजन या एंटी-सीडी 3 फैब की कमी) और या तो नॉकआउट कोशिकाओं या आइसोटाइप-लेबल वाले नमूनों 18 सहित परिमाणीकरण नियंत्रण का उपयोग, प्रभावक टीएसवी के हस्तांतरण को सटीक रूप से मापने के लिए आवश्यक है, जैसे कि एसई, साथ ही साथ सिनैप्टिक फांक के भीतर जारी किए गए सुपरमोलेक्यूलर हमले के कण। अत्यधिक प्रचुर मात्रा में सेल-सतह प्रोटीन जैसे सीडी 4, सीडी 2, या सीडी 45 के साथ-साथ सिंथेटिक फ्लोरोसेंट लिपिड (डोप एटो संयुग्म) का उपयोग करें ताकि संयुग्मों के ठंडे-आधारित पृथक्करण पर एकल कोशिकाओं और बीएसएलबी की आबादी की पहचान की जा सके। एकल बीएसएलबी और कोशिकाओं में प्रतिदीप्ति तीव्रता के ज्यामितीय माध्य या माध्यिका पर विश्लेषण पर ध्यान केंद्रित करें (सीडी 4 का उपयोग चित्र 3 बी में किया जाता है)। एसई प्लाज्मा झिल्ली (पीएम) से व्युत्पन्न एक विशेष प्रकार के टीएसवी हैं, और बीएसएलबी में उनका स्थानांतरण बातचीत करने वाली कोशिकाओं की सतह पर सिग्नल के लगातार नुकसान के साथ बीएसएलबी पर मार्कर सिग्नल के लाभ से स्पष्ट होता है (बीएसएलबी पर टीसीआर को देखें जैसा कि चित्रा 2 बी, बैंगनी तीर में दिखाया गया है)। शून्य BSLBs या तो एंटीजन या विरोधी CD3 की कमी एक उत्कृष्ट संदर्भ के लिए BSLB पर TCR (और अन्य टी सेल मार्करों) के विशिष्ट लाभ का ट्रैक रखने के लिए उनके TCR परिसर के माध्यम से बातचीत कोशिकाओं उत्तेजक के परिणामस्वरूप कर रहे हैं.

Figure 1
चित्रा 1: एपीसी की सतह पर प्रोटीन का पूर्ण परिमाणीकरण। (ए) टॉन्सिलर बी कोशिकाओं की सतह पर आईसीएएम -1 के मात्रात्मक प्रवाह साइटोमेट्री माप का उदाहरण (फोल)। बीसी) और सहायक टी कोशिकाएं (टीएफएच)। (i-vii) एकल CXCR5 + Bc और TFH मानव palatine tonsils से अलग विश्लेषण के लिए गेटिंग रणनीति. दिखाया गया है कि अधिग्रहण की निरंतर खिड़की के भीतर निहित एकल, लाइव घटनाओं की पहचान करने के लिए अनुक्रमिक गेटिंग रणनीति है। (iii-iv) काले तीर डबल्स को इंगित करते हैं। (viii) एफएमओ नियंत्रण (ग्रे हिस्टोग्राम) और एफएमओ नियंत्रण (ग्रे हिस्टोग्राम) की तुलना में आईसीएएम -1 (टील हिस्टोग्राम) की सेल सतह अभिव्यक्ति को दर्शाते हुए ओवरलेड हिस्टोग्राम और एफएमओ नियंत्रणों को प्रासंगिक आइसोटाइप (ब्लैक हिस्टोग्राम, जो ग्रे हिस्टोग्राम के साथ ओवरलैप होता है) के साथ लेबल किया जाता है। तीर CXCR5 + B कोशिकाओं (Bc) की पहचान करने के लिए उपयोग की जाने वाली नेस्टेड गेटिंग रणनीति के लिए दिशा को इंगित करते हैं; CD19+) और TFH (CD4+). (बी) एमएफआई से टॉन्सिलर कोशिकाओं की सतह पर निरपेक्ष अणुओं के निष्कर्षण के लिए एमईएसएफ बेंचमार्क मोतियों के प्रतिगमन विश्लेषण की आवश्यकता होती है जो ए में दिखाए गए कोशिकाओं के समान उपकरण सेटिंग का उपयोग करके अधिग्रहित किए जाते हैं। (i-v) दिखाया गया है कि अधिग्रहण की निरंतर खिड़की के भीतर निहित एकल, लाइव घटनाओं की पहचान करने के लिए अनुक्रमिक गेटिंग रणनीति है। (vi) विभिन्न मानक एमईएसएफ आबादी से एमएफआई की गेटिंग और मापन। (vii) में पहचानी गई एमईएसएफ आबादी के ओवरलेड हिस्टोग्राम दिखाए गए हैं (vi)। शीर्ष दाईं ओर प्रदर्शित मान 5 MESF आबादी (रिक्त, 1, 2, 3, और 4) में से प्रत्येक के लिए MFIs का प्रतिनिधित्व करते हैं। (viii) (vii) में दर्शाए गए एमईएसएफ आबादी के लिए सीएमएफआई पर एमईएसएफ का रैखिक प्रतिगमन। दिखाया गया है ढलान (बी) ए में डेटा से कोशिकाओं के लिए बाध्य एमईएसएफ निकालने के लिए। (C) अणुओं की संख्या के निष्कर्षण में, मापा MESF cMFI (cMFIM) और संदर्भ MESF मानों (MESFR) से (viii) में परिकलित ढलान के अनुप्रयोग के साथ शुरू होने वाले सरल गणितीय संचालन का पालन करें। कक्षों (MESFcells) से बाउंड MESF को निकालने के लिए, कोशिकाओं (cMFIcells) के सही MFI को परिकलित ढलान से विभाजित करें. फिर, कोशिकाओं से बंधे अणुओं की संख्या की गणना करने के लिए (Molec)। कोशिकाओं), पता लगाने (परिमाणीकरण) एंटीबॉडी के एफ / पी द्वारा MESFcells विभाजित। अंत में, कोशिकाओं की सतह पर आणविक घनत्व की गणना करने के लिए (Dcells), Molec विभाजित करें। अनुमानित सेल सतह क्षेत्र (CSAE) द्वारा कोशिकाएं। संक्षिप्त रूप: X = स्वतंत्र चर; Y = निर्भर चर (मापा प्रतिदीप्ति), cMFIM = मापा सही MFI; MESFR = संदर्भ MESF मान; MESFcells = अनुमानित MESF प्रति सेल; cMFIcells = सही MFI कोशिकाओं; मोलेक । कोशिकाएं = प्रति कोशिका अनुमानित अणु। Dcells = कोशिकाओं पर अनुमानित घनत्व; CSAE = अनुमानित सेल सतह क्षेत्र। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: पुनः संयोजक आईसीएएम -1 के साथ बीएसएलबी का पुनर्गठन और बीएसएलबी में पार्टिकुलेट ट्रांसफर का मापन (ए, आई-vi) पुनः संयोजक मोनोमेरिक आईसीएएम -1 12-हिस (आरआईसीएएम -1) के बढ़े हुए घनत्व के साथ पुनर्गठित बीएसएलबी के फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण। (i-v) चित्रा 1 के रूप में, अधिग्रहण की निरंतर खिड़की के भीतर एकल BSLBs पर गेटिंग रणनीति पर ध्यान केंद्रित करें। समय निरंतरता गेट से ठीक पहले अंतराल को नोट करें, जिसे माप की त्रुटियों को रोकने के लिए बाहर रखा गया था। (vi) अच्छी प्रोटीन गुणवत्ता के परिणामस्वरूप अक्सर उच्च सांद्रता पर बीएसएलबी की सजातीय कोटिंग होती है, संकीर्ण प्रतिदीप्ति वितरण के अवलोकन के साथ (भिन्नता का कम गुणांक, vi में हिस्टोग्राम देखें)। (बी) मापा घनत्व (डीएम) पर आईसीएएम -1 संदर्भ सांद्रता (सीआर) का प्रतिगमन विश्लेषण। चित्र 1 में प्रयोगों में मापी गई कोशिकाओं (Dcells) के घनत्व को प्राप्त करने के लिए प्रोटीन (सीटी) की लक्ष्य सांद्रता की गणना करने के लिए ढलान का उपयोग करें। संक्षिप्त रूप: 12-His = 12-हिस्टिडीन टैग; डीएम = मापा आणविक घनत्व; CR = rICAM-1 की संदर्भ सांद्रता; सीटी = लक्ष्य एकाग्रता (इंटरपोलेटेड होने के लिए); Dcells = कोशिकाओं में मापा घनत्व (यह भी देखें चित्र 1C)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: टी सेल synaptic कणों की माप BSLBs को स्थानांतरित कर दिया. (A; i-v) प्रवाह आरेख बीएसएलबी के साथ टी कोशिकाओं के सह-संवर्धन के लिए महत्वपूर्ण चरणों को दर्शाता है जो मॉडल झिल्ली को पुनर्गठित करता है और प्रवाह साइटोमेट्री के साथ कण हस्तांतरण के बाद के माप। (iv) नीले और गहरे पीले रंग के आरेख द्विपैरामीट्रिक प्रवाह साइटोमेट्री भूखंडों में कोशिकाओं और बीएसएलबी के सापेक्ष वितरण और स्थान को दर्शाते हैं। (v) प्रतिदीप्ति वितरण हिस्टोग्राम जो शून्य बीएसएलबी (ग्रे) की तुलना में एगोनिस्टिक बीएसएलबी (गहरे पीले) के प्रतिदीप्ति के सापेक्ष लाभ को प्रदर्शित करता है। (बी) अनुकरणीय सिनैप्टिक स्थानांतरण प्रयोग। (i-vi) दिखाया गया है निरंतर अधिग्रहण विंडो के भीतर एकल BSLBs और कोशिकाओं की पहचान करने के लिए गेटिंग रणनीति है। बैंगनी तीर विश्लेषण की दिशा को इंगित करते हैं, जो सी (सी) (i) में जारी है, एकल कोशिकाओं (नीले) और एकल बीएसएलबी (पीले) के एमएफआई पर विश्लेषण पर ध्यान केंद्रित करें। (ii) बीएसएलबी और कोशिकाओं के लिए परिकलित सीएमएफआई से सामान्यीकृत सिनैप्टिक अंतरण (एनएसटी%, शीर्ष) और Tmax% (नीचे) की गणना करने के लिए समीकरण। (iii-vi) ओवरलेड हिस्टोग्राम टी-सेल के विभिन्न घनत्वों में कोशिकाओं (नीले रंगों) और बीएसएलबी (पीले रंगों) के लिए प्रतिदीप्ति तीव्रता वितरण के परिवर्तन को दर्शाते हुए एंटी-सीडी 3-फैब को सक्रिय करते हैं, जिसमें गैर-सक्रिय (ग्रे) शामिल है और या तो 250 (नरम रंग मूल्य) या 1,000 (उच्च रंग मूल्य) molec./μm2 के साथ सक्रिय होता है। विभिन्न रंग मानों में संख्याएँ पीले रंग में दिखाए गए BSLB हिस्टोग्राम के लिए मापा NST% का प्रतिनिधित्व करती हैं। ओवरलेड हिस्टोग्राम विभिन्न मार्करों के लिए सकारात्मक टी सेल पुटिकाओं के सिनैप्टिक हस्तांतरण में अतिव्यापी पदानुक्रम दिखाते हैं। BSLBs की इस संरचना के लिए (आईसीएएम -1 के 200 molec./μm2 और एंटी-CD3π-Fab के बढ़ते घनत्व), tSVs को TCR + (iii) > CD81 + (iv) > CD4 + (v) > CD28 + (vi) के साथ BSLB में स्थानांतरित कर दिया जाता है। जैसा कि पिछले लेखों में दिखाया गया है, टीसीआर और सीडी 81 एसई के घटक हैं और अपेक्षाकृत उच्च दक्षता के साथ सीडी 4 में स्थानांतरित किए जाते हैं, बाद में तुलनात्मक रूप से उच्च सतह के स्तर पर व्यक्त किए जाने के बावजूद। एसई शेडिंग के परिणामस्वरूप सेल सतह CD81 और TCR का नुकसान होता है और BSLBs पर इन संकेतों का लाभ होता है (250 molec./μm2 के लिए खुले बैंगनी तीर, और पीले हिस्टोग्राम में 1,000 molec./μm2 के लिए बंद बैंगनी तीर)। (डी) संयुग्मों के अनुचित शीतलन से कोशिकाओं को सिलिका मोतियों से एसएलबी को चीरने की ओर जाता है जैसा कि इनपुट मोतियों (बाएं बाइपैरामीट्रिक प्लॉट) की तुलना करने से देखा जाता है और संयुग्मों को 37 डिग्री सेल्सियस (दाएं बाइपैरामीट्रिक प्लॉट) से 4 डिग्री सेल्सियस तक तेजी से ठंडा करने के अधीन किया जाता है। चित्रा 3B पैनल (vi) के साथ भी तुलना करें। संक्षिप्त रूप: PRF1 = perforin 1; NST% = सामान्यीकृत synaptic स्थानांतरण; Tmax% = अधिकतम मनाया हस्तांतरण का प्रतिशत (नियंत्रण या संदर्भ की स्थिति में); tSVs: ट्रांस-सिनैप्टिक पुटिकाओं; SEs: synaptic ectosomes. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 1: इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले बफ़र्स. इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

BSLBs मॉडल APC झिल्ली के साथ प्रेरित टी कोशिकाओं के कण आउटपुट का अध्ययन करने के लिए बहुमुखी उपकरण हैं। विधि का लचीलापन जटिल और न्यूनीकरणवादी झिल्ली रचनाओं के पुनर्गठन को टीएसवी और सुपरमोलेक्यूलर हमले के कणों और उनके घटकों के स्राव पर लिगेंड और उनके संकेतों के प्रभावों का अध्ययन करने की अनुमति देता है। हमने पूर्व-सक्रिय TH, CTL, Tregs और CART15 सहित विभिन्न टी कोशिकाओं पर इस तकनीक का परीक्षण किया है। यह प्रोटोकॉल ताजा अलग-थलग और क्विसेंट टी कोशिकाओं के सिनैप्टिक कण रिलीज के माप के लिए भी काम करता है। ताजा अलग-थलग टी कोशिकाओं का उपयोग करने की एक सीमा यह है कि ये क्विसेंट आबादी ट्रांस-सिनैप्टिक कणों की एक अलग प्रोफ़ाइल का उत्पादन करती है, जो उनकी सेल सतह संरचना के साथ सहसंबंधित है (अधिक जानकारी के लिए 15 देखें)।

एक साधारण प्रवाह साइटोमेट्री पैनल के रूप में, हम एंटी-टीसीआर क्लोन आईपी 26, एंटी-सीडी 81 क्लोन 5ए 6, एंटी-परफोरिन (पीआरएफ 1) क्लोन बी-डी 48 या एंटी-सीडी 40 एल क्लोन 24-31, और एटीटीओ 390 या एटीटीओ 565-युक्त लिपिड (बीएसएलबी को एक आंतरिक प्रतिदीप्ति प्रदान करने के लिए) के उपयोग की सलाह देते हैं। एकल BSLBs और conjugates से एकल कोशिकाओं को भेदभाव करने में मदद करने के लिए, हम एंटी-CD4 क्लोन OKT4 और / या एंटी-CD45 क्लोन HI30 के उपयोग की सिफारिश करते हैं, जो सेल सतह पर बहुत उच्च स्तर पर व्यक्त होने के बावजूद सीमित स्तर पर BSLBs में स्थानांतरित किए जाते हैं (फ्लोरोक्रोम और अन्य मान्य एंटीबॉडी पर अधिक जानकारी के लिए सामग्री की तालिका देखें)। फ्लोरोक्रोम की एक उच्च संख्या वाले पैनलों को डिजाइन किया जा सकता है लेकिन विश्लेषण किए गए प्रत्येक फ्लोरोक्रोम के प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रम स्पिलओवर के व्यवस्थित मूल्यांकन की आवश्यकता होती है। संवेदनशीलता बढ़ाने के लिए, 0.5 μg से लेकर 20 μg / mL अंतिम तक के परिमाणीकरण एंटीबॉडी के विभिन्न अनुमापन का प्रयास करें, और जब भी एंटीबॉडी के नए स्टॉक का उपयोग किया जाता है तो दोहराएं। कण हस्तांतरण के निरपेक्ष और सापेक्ष माप की पुनरुत्पादकता सुनिश्चित करने के लिए, टिट्रेट और बायोटिनिलेटेड और नी-युक्त फॉस्फोलिपिड्स के प्रत्येक नए लॉट की बाध्यकारी क्षमता की गणना करें, क्योंकि वे बहुत से बहुत अलग हो सकते हैं। टी सेल-बीएसएलबी संयुग्मों का क्रमिक कूल-डाउन कम बहुतायत वाले कणों का पता लगाने की संवेदनशीलता को बढ़ाने के लिए महत्वपूर्ण है। cocultures के तेजी से ठंडा नीचे BSLBs के विनाश की ओर जाता है, के रूप में लिपिड प्रतिदीप्ति के महत्वपूर्ण नुकसान से स्पष्ट (चित्रा 3 डी).

हाथ में प्रयोगात्मक प्रश्न के आधार पर टी सेल प्रतिरक्षा synapses के कण आउटपुट को मापने के लिए विभिन्न मैट्रिक्स का उपयोग किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, जब उभरते हुए एसई में क्रमबद्ध सतह प्रोटीन के आधारभूत अभिव्यक्ति स्तरों में मामूली अंतर की उम्मीद की जाती है, तो एक सामान्यीकृत सिनैप्टिक ट्रांसफर (एनएसटी%) मीट्रिक का उपयोग किया जा सकता है (चित्रा 3 सी पैनल (ii) शीर्ष समीकरण)। उत्तरार्द्ध कोशिकाओं और मोतियों के कुल, संयुक्त एमएफआई के एक समारोह के रूप में बीएसएलबी पर प्रतिशत एमएफआई सिग्नल को निर्धारित करता है। इस दृष्टिकोण से एक चेतावनी स्थानांतरित मार्करों का विश्लेषण है जो पीएम पर व्यक्त नहीं किए गए हैं, जैसे कि सुपरमोलेक्यूलर हमले के कणों के घटक19। चूंकि ये तत्व पीएम पारगमन से स्वतंत्र मार्गों द्वारा बीएसएलबी तक पहुंचते हैं, जैसे कि इंट्रासेल्युलर स्टोर एक्सोसाइटोसिस, एनएसटी% की गणना की सिफारिश नहीं की जाती है क्योंकि परिणाम फुलाया जाएगा क्योंकि अंश को तुलनात्मक रूप से छोटे भाजक (सेल सतह अभिव्यक्ति स्तर) द्वारा विभाजित किया जाएगा। इसके बजाय, सही एमएफआई का उपयोग करें ताकि शून्य बीएसएलबी और बीएसएलबी के बीच पर्फोरिन और ग्रैनजाइम के जमाव की तुलना की जा सके जो एंटीजन या एंटी-सीडी 3 फैब के बढ़ते घनत्व को प्रस्तुत करते हैं। वैकल्पिक रूप से, BSLBs में स्थानांतरित इंट्रासेल्युलर तत्वों को ट्रैक करने के लिए, तुलना के लिए उपयोग करें या तो अनुमानित निरपेक्ष अणुओं को स्थानांतरित कर दिया गया है या BSLBs (Tmax%) (चित्रा 3 C पैनल (ii) नीचे समीकरण) को स्थानांतरित किए गए अधिकतम संकेत के संबंध में संकेत का प्रतिशत। Tmax% के लिए, या तो cMFI या BSLB नमूने (या स्थिति) पर मापा अणुओं का उपयोग करें जो संदर्भ Tmax के रूप में उच्चतम एंटीजन घनत्व प्रस्तुत करते हैं। विभिन्न दाताओं का विश्लेषण करते समय, तुलना के लिए दाता-विशिष्ट Tmax का उपयोग करें। टीसीआर के विशिष्ट ट्रिगरिंग के जवाब में स्थानांतरित सामग्री का अध्ययन करते समय, एमएफआई को एंटीजन-नकारात्मक (शून्य) बीएसएलबी पर देखी गई पृष्ठभूमि हस्तांतरण के स्तर पर भी सही किया जा सकता है।

BSLBs में स्थानांतरित अणुओं की पूर्ण संख्या का अनुमान लगाना एक अधिक मजबूत विधि है, क्योंकि इसमें समापन बिंदु के रूप में अणुओं के माप के साथ MESF अंशांकन और स्वतंत्र प्रयोगों की बेहतर तुलना शामिल है। Tmax% स्वतंत्र प्रयोगों में एक समान सामान्यीकरण प्रदान करता है और विशेष रूप से तब उपयोगी होता है जब इंट्रासेल्युलर मार्करों के लिए पॉलीक्रोमैटिक एफसीएम का उपयोग किया जाता है, जैसे कि परफोरिन और ग्रैनजाइम, या मार्करों के लिए जिनके लिए कोई एमईएसएफ मानक उपलब्ध नहीं है। Tmax% बस नियंत्रण की स्थिति में उच्चतम हस्तांतरण के साथ स्थिति के लिए किसी भी स्थिति में संकेत का प्रतिशत है (उदाहरण के लिए, दवा के अध्ययन के लिए वाहन / अनुपचारित नियंत्रण, CRISPR / Cas9 पुस्तकालयों के लिए नियंत्रण गाइड आरएनए)। इसके अलावा, Tmax% का उपयोग cMFIs और अणुओं की एक पूर्ण संख्या दोनों के लिए किया जा सकता है और टी कोशिकाओं के सिनैप्टिक आउटपुट पर जीन विलोपन के प्रभावों की साइड-बाय-साइड तुलना के लिए विशेष रूप से उपयोगी रहा है। उत्तरार्द्ध स्पष्ट है जब जीन-संपादन स्वतंत्र दाताओं और प्रयोगों के बीच प्रतिरक्षा रिसेप्टर अभिव्यक्ति की गतिशील सीमा में उच्च परिवर्तनशीलता की ओर जाता है, जो पूर्ण और एनएसटी% माप को प्रभावित कर सकता है।

BSLBs ने विभिन्न टी सेल प्रकारों के सिनैप्टिक आउटपुट के कैप्चर और लक्षण वर्णन की सुविधा प्रदान की है, जो अन्यथा APCs2 द्वारा उनके तेजी से आंतरिककरण के कारण अलग करना मुश्किल है। BSLBs की भौतिक स्थिरता भी BSLBs के प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग के लिए एक मंच प्रदान करती है जिसे टी कोशिकाओं द्वारा सर्वेक्षण किया गया है, इस प्रकार मास स्पेक्ट्रोमेट्री और न्यूक्लिक एसिड अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों द्वारा अत्यधिक शुद्ध कण तैयारी के जैव रासायनिक लक्षण वर्णन को सक्षम करता है। उत्तरार्द्ध प्रयोगात्मक परिस्थितियों की एक विस्तृत श्रृंखला के तहत टी कोशिकाओं द्वारा बहाए गए अंतरकोशिकीय दूतों के विस्तृत लक्षण वर्णन की सुविधा प्रदान करता है। विभिन्न प्रश्नों को संबोधित किया जा सकता है, जिसमें ये पार्टिकुलेट मैसेंजर विभिन्न टी सेल प्रकारों और सक्रियण राज्यों के बीच कैसे बदलते हैं, कैसे विहित और गैर-कैनोनिकल एंटीजन रिसेप्टर्स (यानी, चिमेरिक एंटीजन रिसेप्टर्स), और एगोनिस्टिक और विरोधी झिल्ली संकेत कण संरचना को कैसे प्रभावित करते हैं। हम वर्तमान में इस तकनीक को प्रेरित टी कोशिकाओं के प्रतिरक्षा synapse पर स्रावित साइटोकिन्स के मात्रात्मक लक्षण वर्णन के लिए आगे विकसित कर रहे हैं। उत्तरार्द्ध को पुनः संयोजक साइटोकाइन रिसेप्टर्स और एंटीबॉडी के संयोजनों के सावधानीपूर्वक अध्ययन की आवश्यकता होती है, जो टी सेल सक्रियण के बाद बीएसएलबी पर जमा इंटरल्यूकिन्स, इंटरफेरॉन और केमोकिन्स के कुशल कैप्चर प्रदान करता है। बीएसएलबी को टी कोशिकाओं द्वारा टीएसवी रिलीज को ट्रिगर करने के लिए संदिग्ध अन्य एपीसी की सतह संरचना को मॉडल करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, जैसे कि स्ट्रोमल और जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाएं। BSLBs को कैंसर और अन्य विकृतियों के उपचार के लिए एक्सोसाइटिक और टीएसवी स्राव मशीनरी के सकारात्मक और नकारात्मक मॉडुलन की मांग करने वाले नए औषधीय यौगिकों को स्क्रीन करने के लिए भी अनुकूलित किया जा सकता है। अंत में, BSLBs का उपयोग संक्रामक रोगों में टी सेल फ़ंक्शन को मॉड्युलेट करने वाले विषाणु निर्धारकों की खोज करने के लिए भी किया जा सकता है20।

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Disclosures

लेखकों के पास घोषित करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

हम रचनात्मक वैज्ञानिक चर्चाओं के लिए हमारे प्रयोगशाला के सदस्यों और रुमेटोलॉजी समुदाय के कैनेडी इंस्टीट्यूट के आभारी हैं, विशेष रूप से हमारे प्रवाह साइटोमेट्री सुविधा प्रबंधक जोनाथन वेबर। इस काम को वेलकम ट्रस्ट प्रिंसिपल रिसर्च फेलोशिप 100262Z / 12 / Z, ERC उन्नत अनुदान (SYNECT AdG 670930), और रुमेटोलॉजी रिसर्च (KTRR) के लिए कैनेडी ट्रस्ट (सभी तीन एमएलडी) द्वारा वित्त पोषित किया गया था। PFCD EMBO दीर्घकालिक फैलोशिप (ALTF 1420-2015, यूरोपीय आयोग (LTFCOFUND2013, GA-2013-609409) और मैरी Sklodowska-Curie Actions) और एक ऑक्सफोर्ड-ब्रिस्टल मायर्स स्क्विब फैलोशिप के साथ संयोजन के रूप में समर्थित था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl] (nickel salt) Avanti Polar Lipids 790404C-25mg 18:1 DGS-NTA(Ni) in chloroform

PIPETMAN L Multichannel P8x200L, 20-200 µL		 Gilson FA10011
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Avanti Polar Lipids 850375C-25mg  18:1 (Δ9-Cis) PC (DOPC) in chloroform
1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) ATTO 390 ATTO-TEC AD 390-165 DOPE ATTO 390
1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) ATTO 488 ATTO-TEC AD 488-165 DOPE ATTO 488
1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) ATTO 565 ATTO-TEC AD 565-165 DOPE ATTO 565
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(cap biotinyl) (sodium salt) Avanti Polar Lipids 870273C-25mg 18:1 Biotinyl Cap PE in chloroform
200 µL yellow tips 10 x 96 Tips, Stack Starlab S1111-0206
5 mL polystyrene round-bottom tubes Falcon® 352052
5.00 ± 0.05 µm non-functionalized silica beads Bangs Laboratories Inc. SS05003
96 Well Cell Cultture Plate U-bottom with Lid, Tissue culture treated, non-pyrogenic. Costar® 3799 For FCM staining and co-culture of BSLB and cells.
96 Well Cell Cultture Plate V-bottom with Lid, Tissue culture treated, non-pyrogenic. Costar® 3894 For FCM staining of cells or beads in suspension.
Alexa Fluor 488 NHS Ester (Succinimidyl Ester) Thermo Fisher Scientific, Invitrogen™ A20000
Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) Thermo Fisher Scientific, Invitrogen™ A37573 and A20006
Allegra X-12R Centrifuge Beckman Coulter For normal in tube staining of biological samples for FCM
Aluminum Foil Any brand For protecting cells and BSLBs from light
anti-human CD154 (CD40L), clone 24-31 BioLegend 310815 and 310818 Alexa Fluor 488 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively.
anti-human CD185 (CXCR5) Brilliant Violet 711, clone J252D4 BioLegend 356934 For quantitative FCM analysis of tonsillar cells as shown in Fig. 1E
anti-human CD19 Brilliant Violet 421, clone HIB19 BioLegend 302234 For quantitative FCM analysis of tonsillar cells as shown in Fig. 1E
anti-human CD2, clone RPA-2.10 BioLegend 300202 Labeled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD2, clone TS1/8 BioLegend 309218 Brilliant Violet 421 conjugate.
anti-human CD252 (OX40L), clone 11C3.1 BioLegend Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human CD28, clone CD28.2 eBioscience 16-0289-85 Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD317 (BST2, PDCA-1), clone 26F8 ThermoFisher Scientific, invitrogen 53-3179-42 Alexa Fluor 488 conjugate, we found this clone to be cleaner than clone RS38E.
anti-human CD38, clone HB-7 BioLegend 356624 Alexa Fluor 700 conjugate
anti-human CD38, clone HIT2 BioLegend 303514 Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human CD39, clone A1 BioLegend Labeled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD4 Brilliant Violet 650, clone OKT4 BioLegend 317436 For quantitative FCM analysis of tonsillar cells as shown in Fig. 1E
anti-human CD4, clone A161A1 BioLegend 357414 and 357421 PerCP/Cyanine5.5 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively
anti-human CD4, clone OKT4 BioLegend 317414 and 317422 PE/Cy7 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively
anti-human CD40, clone 5C3 BioLegend 334304 Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD40, clone G28.5 BioLegend Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD45, clone HI30 BioLegend 304056 and 368516 Alexa Fluor 647 and APC/Cy7 conjugates
anti-human CD47, clone CC2C6 BioLegend 323118 Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human CD54 (ICAM-1), clone HCD54 BioLegend 322702 Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD63 (LAMP-3), clone H5C6 BioLegend 353020 and 353015 PerCP/Cyanine5.5 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively
anti-human CD73, clone AD2 BioLegend 344002 Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD80, clone 2D10 BioLegend 305216 Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human CD81, clone 5A6 BioLegend 349512 and 349502 PE/Cy7 conjugate and labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester), respectively.
anti-human CD82, clone ASL-24 BioLegend 342108 Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human CD86, clone IT2.2 BioLegend 305416 Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human CD8a, clone HIT8a BioLegend 300920 Alexa Fluor 700 conjugate
anti-human CD8a, clone SK1 BioLegend 344724 Alexa Fluor 700 conjugate
anti-human HLA-A/B/C/E, clone w6/32 BioLegend 311414 and 311402 Alexa Fluor 647 conjugate and Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human HLA-DR, clone L243 BioLegend 307656 and 307622 Alexa Fluor 488 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively.
anti-human ICAM-1, clone HCD54 BioLegend 322702 Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human ICOS, clone C398.4A BioLegend 313516 Armenian Hamster IgG
anti-human ICOSL, clone MIH12 BioLegend 329611 Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human ICOSL, clone MIH12 eBioscience 16-5889-82 Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human LFA-1, clone TS1/22 BioLegend Produced in house Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human OX40, clone Ber-ACT35 (ACT35) BioLegend 350018 Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human PD-1 , clone EH12.2H7 BioLegend 135230 and 329902 Alexa Fluor 647 conjugate and Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human PD-L1, clone 29E.2A3 BioLegend 329702 Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human PD-L2, clone 24F.10C12 BioLegend 329611 Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human PD-L2, clone MIH18 BioLegend 345502 Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human TCRab, clone IP26 BioLegend 306712 and 306714 Alexa Fluor 488 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively.
antti-human CD156c (ADAM10), clone SHM14 BioLegend 352702
antti-human CD317 (BST2, Tetherin), clone RS38E BioLegend 348404 Alexa Fluor 647 conjugate
Armenian Hamster IgG Alexa Fluor 647 Isotype control, clone HTK888 BioLegend 400902 Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
BD Cytometer Setup and Tracking beads Becton Dickinson & Company (BD) 641319 Performance track of instruments before quantitative FCM
BD FACSDiva Becton Dickinson & Company (BD) 23-14523-00 Acquisition software
Bovine Seum Albumin Merck, Sigma-Aldrich A3294
CaCl2, Calcium chloride Merck, Sigma-Aldrich C5670 anhydrous, BioReagent, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥96.0%
Casein from bovine milk, suitable for substrate for protein kinase (after dephosphorylation), purified powder Merck, Sigma-Aldrich C5890
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 ThermoFisher Scientific, Gibco 11132D
DynaMag-2 ThermoFisher Scientific, Invitrogen™ 12321D For the removal of Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 in volumes less than 2 mL
DynaMag™-15 ThermoFisher Scientific, Invitrogen™ 12301D For the removal of Dynabeads™ Human T-Activator CD3/CD28 in volumes less than 15 mL
Fetal Bovine Serum Qualified, One Shot ThermoFisher Scientific, Gibco A3160801 Needs heat inactivation for 30 min at 56 oC
Ficoll-Paque PLUS Cytiva, GE Healthcare GE17-1440-02 Sterile solution of polysaccharide and sodium diatrizoate for lymphocyte isolation
Fixable Viability Dye eFluor 780 eBiosciences 65-0865-14 For the exclusion of dead cells during analyses
FlowJo Becton Dickinson & Company (BD) Version 10.7.1 Analysis software
Grant Bio MPS-1 Multi Plate Shaker Keison Products MPS-1 For the mixing of either cells during stainings or BSLBs during staning or protein loading (as an alternative to orbital agitation)
HEPES Buffer Solution (1 M) ThermoFisher Scientific, Gibco 15630-056
HEPES, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid), 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid. Merck, Sigma-Aldrich H4034 For preparation of HBS/HAS or HBS/BSA buffer. BioPerformance Certified, ≥99.5% (titration), suitable for cell culture
HERACell 150i CO2 incubator, 150 L, Electropolished Stainless Steel ThermoFisher Scientific 51026282 For culturing and expanding purified CD4+ and CD8+ T cells.
Hula Mixer® Sample Mixer ThermoFisher Scientific, Life Technologies 15920D Vertical, variable-angle laboratory mixer used for the mixing of BSLBs and lipid master mix, blocking solutions, protein master mix and small scale antibody stainings.
Human Serum Albumin, 30% aqueous solution Merck, Sigma-Aldrich 12667-M
Human TruStain FcX Fc Receptor Blocking Solution BioLegend 422302 Fc Receptor Blocking Solution for blocking of Fc Receptors from biologically relevant samples
Innovatis CASY cell counter and analyzer TT Biovendis Products GmbH For the counting of cells and the determination of cell size and volume based on the exclusion of electric current.
KCl, Potassium chloride Merck, Sigma-Aldrich P5405 Powder, BioReagent, suitable for cell culture
L-Glutamine 200 mM (100x) ThermoFisher Scientific, Gibco 25030-024
MgCl2, Magessium chloride Merck, Sigma-Aldrich M2393 BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture
Microtube Insert for 24 x 1.5/2.0 mL tubes Keison Products P-2-24 Microtube insert for Grant Bio MPS-1 Multi Plate Shaker
Mini Incubator Labnet International  I5110A-230V For the incubation (co-culturing) of BSLB and cells in the absence of CO2
Minimum Essential Medium Non-Essential Amino Acids ThermoFisher Scientific, Gibco 11140-035
Mouse IgG polyclonal antibody control Merck, Sigma-Aldrich PP54 Used as positive control for the measurement of antibodies bound to mouse IgG capture bead standards
Mouse IgG1, k Isotype, clone MOPC-21 BioLegend 400129, 400112, 400130, 400144, 400128 and 400170 Alexa Fluor 488, PE, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 700, APC/Cyanine7 and Brilliant Violet 785  conjugates, respectively.
Mouse IgG1, k Isotype, clone X40 Becton Dickinson & Company (BD), Horizon 562438 Brilliant Violet 421 conjugate.
Mouse IgG1, κ Isotype control, clone P3.6.2.8.1 eBioscience 14-4714-82 Labeled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
Mouse IgG2a, k Isotype, clone MOPC-173 BioLegend 400240 Alexa Fluor 647 conjugate
Mouse IgG2b, k Isotype, clone MPC-11 BioLegend 400330 and 400355 Alexa Fluor 647 and Brilliant Violet 785 conjugates, respectively
Multiwell 6 well Tissue culture treated with vacuum gas plasma Falcon 353046 For culturing and expanding purified CD4+ and CD8+ T cells.
Na2HPO4, Disodium Phosphate Merck, Sigma-Aldrich S7907
NaCl, Sodium chloride Merck, Sigma-Aldrich S5886 BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥99%
NiSO4, Nickel(II) sulfate Merck, Sigma-Aldrich 656895 For saturating NTA sites; added during the blocking process
Penicillin Streptomycin [+]10,000 units Penicillin; [+] 10,000 µg/mL Streptomycin ThermoFisher Scientific, Gibco 15140-122
Phosphate Buffered Saline pH 7.4, sterile ThermoFisher Scientific, Gibco 10010 No Ca2+ or Mg2+ added
Polyethersulfone (PES) Filter unit Thermo Scientific Nalgene  UY-06730-43 Hydrophilic PES membrane with low protein binding facilitates the filtering of solutions with high protein content
PURESHIELD argon ISO 14175-I1-Ar BOC Ltd. 11-Y For the protection of lipid stocks stored at +4 ºC.
Purified Streptavidin BioLegend 280302
Quantum Alexa Fluor 488 MESF beads Bangs Laboratories Inc. 488 Benchmark beads for the interpolation of Alexa Fluor 488 molecules bound to cells and/or BSLB
Quantum Alexa Fluor 647 MESF beads Bangs Laboratories Inc. 647 Benchmark beads for the interpolation of Alexa Fluor 647 molecules bound to cells and/or BSLB
Rat anti-mouse IgG Kappa Light Chain, clone OX-20 ThermoFisher Scientific, invitrogen SA1-25258 Labeled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
Recombinant human IL-2 Peprotech 200-02-1MG
RMPI Medium 1640 (1x); [-] L-Glutamine ThermoFisher Scientific, Gibco 31870-025
Rosette Human B Cell Enrichment Cocktail STEMCELL Technologies 15064 Isolation of B cells for measuring densities of proteins in purified cell populations
Rosette Human CD4+ T Cell Enrichment Cocktail STEMCELL Technologies 15022C.1
Rosette Human CD4+CD127low T Cell Enrichment Cocktail STEMCELL Technologies 15361 Pre-enrichment of CD4+ CD127Low T cells for the downstream isolation of Tregs by FACS.
Rosette Human CD8+ T Cell Enrichment Cocktail STEMCELL Technologies 15063
RPMI Medium 1640 (1x); [-] Phenol Red ThermoFisher Scientific, Gibco 11835-063 For the incubation (co-culturing) of BSLB and cells in the absence of CO2. Phenol red-free media reduces the autofluorescence of cells in flow cytometry and microscopy based measurements.
Sodium Pyruvate (100 mM) ThermoFisher Scientific, Gibco 11360-070
Sprout mini centrifuge FisherScientific, Heathrow Scientific LLC 120301 Benchtop microcentrifuge used to wash silica beads and BSLB in 1.5 mL Eppendorf tubes.
Sterile cappeed 5 mL polystyrene round-bottom tubes Falcon 352058
UltraComp eBeads Compensation Beads ThermoFisher Scientific, invitrogen 01-2222-42
Zeba Spin Desalting Columns 7K MWCO Thermo Fisher Scientific, Invitrogen™ 89882

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References

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 182
मनका-समर्थित लिपिड बाईलेयर्स की तैयारी टी सेल प्रतिरक्षा Synapses के कण आउटपुट का अध्ययन करने के लिए
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Céspedes, P. F., Dustin, M. L.… More

Céspedes, P. F., Dustin, M. L. Preparation of Bead-supported Lipid Bilayers to Study the Particulate Output of T Cell Immune Synapses. J. Vis. Exp. (182), e63130, doi:10.3791/63130 (2022).

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