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Immunology and Infection

Préparation de bicouches lipidiques soutenues par des perles pour étudier la production de particules des synapses immunitaires des lymphocytes T

Published: April 1, 2022 doi: 10.3791/63130
Automatic Translation
1, 1
1Kennedy Institute of Rheumatology, Nuffield Department of Orthopaedics, Rheumatology and Musculoskeletal Sciences, The University of Oxford

Summary

Nous présentons ici le protocole pour la reconstitution par étapes de cellules synthétiques présentatrices d’antigènes à l’aide de bicouches lipidiques soutenues par des billes et leur utilisation pour interroger la sortie synaptique des cellules T activées.

Abstract

Les cellules présentatrices d’antigènes (APC) présentent trois signaux d’activation aux lymphocytes T engagés dans un contact physique : 1) l’antigène, 2) la costimulation/corépression et 3) les cytokines solubles. Les lymphocytes T libèrent deux types de particules effectrices en réponse à l’activation : les vésicules transsysylétiques (vST) et les particules d’attaque supramoléculaires, qui transfèrent respectivement des messagers intercellulaires et médient la cytotoxicité. Ces entités sont rapidement internalisées par les APC engagés dans un contact physique avec les lymphocytes T, ce qui rend leur caractérisation décourageante. Cet article présente le protocole de fabrication et d’utilisation des bicouches lipidiques supportées par des billes (BSLB) en tant que mimétiques de cellules présentatrices d’antigènes (APC) pour capturer et analyser ces particules transsynaptiques. Sont également décrits les protocoles pour les mesures absolues des densités de protéines à la surface des cellules, la reconstitution des BSLB avec de tels niveaux physiologiques et la procédure de cytométrie en flux pour suivre la libération de particules synaptiques par les cellules T. Ce protocole peut être adapté pour étudier les effets de protéines individuelles, de mélanges de ligands complexes, de déterminants de virulence pathogène et de médicaments sur la sortie effectrice des cellules T, y compris les cellules T auxiliaires, les lymphocytes T cytotoxiques, les cellules T régulatrices et les cellules T exprimant les récepteurs de l’antigène chimérique (CART).

Introduction

La synapse immunologique (IS) est une structure moléculaire pivot formée à l’interface des cellules engagées dans un contact physique qui facilite l’échange régulé d’informations sur la juxtracrine. Différents SYSTÈMES ont été décrits dans la littérature, et un nombre croissant de preuves suggère que ces centres moléculaires sont une caractéristique conservée des réseaux cellulaires. Diverses cellules immunitaires, y compris les cellules B, les cellules tueuses naturelles, les cellules dendritiques, les macrophages et les cellules T, échangent des informations via l’assemblage de contacts de courte durée1. Les études multiomiques font progresser la compréhension de nouveaux sous-ensembles de leucocytes et de cellules stromales conduisant des réseaux cellulaires pathogènes et exprimant des protéines de surface aux fonctions inconnues. En tant qu’APC synthétiques, les BSLEB permettent l’étude directe du rôle fonctionnel des protéines individuelles dans l’intégration des signaux activateurs, à savoir les antigènes et la costimulation/corépression, par les lymphocytes T et la libération résultante de particules effectrices appelées signal quatre.

Cet article décrit les protocoles et les points techniques critiques à prendre en compte lors de l’utilisation de BSLB pour imiter la composition de surface des APC modèles. Les protocoles pour la mesure quantitative des récepteurs immunitaires et d’autres protéines de surface sur les APC sont présentés avec le protocole pour la reconstitution des APC synthétiques contenant ces quantités mesurées. Ensuite, les étapes nécessaires à la coculture des lymphocytes T et du BSLB sont présentées avec le protocole de mesure quantitative du transfert transsynaptique de particules à l’aide de la cytométrie en flux. Plus remarquable encore, les BSLB facilitent l’étude d’une population dérivée de la membrane plasmique de tSV appelées ectosomes synaptiques (SE). Les SE enrichis en récepteurs d’antigènes des lymphocytes T (TCR+) sont éliminés en réponse au déclenchement du TCR2 et capturés efficacement par les BSLB3, ce qui représente une excellente lecture pour évaluer les propriétés agonistes des antigènes et la composition membranaire modélisée. Les exosomes CD63+ et les particules d’attaque supramoléculaire (SAP) sont également libérés par les lymphocytes T stimulés et capturés par les BSLB. Ils peuvent être utilisés comme lectures supplémentaires de l’activation et de la sécrétion de granules exocytaires et lytiques qui en résultent par les lymphocytes T. La mobilisation des vésicules exocytaires vers le pôle en interaction de la cellule T facilite également la libération directionnelle de cytokines, telles que l’IL-2, l’IFN-γ et l’IL-10 en réponse à l’activation4,5,6,7,8. Bien que les cytokines libérées par les lymphocytes T puissent également être détectées sur les BSLEB, une étude plus dédiée est actuellement en cours de développement pour valider l’analyse quantitative de la libération de cytokines au niveau de la synapse immunologique.

Pour interroger comment des compositions membranaires spécifiques influencent le rendement synaptique des lymphocytes T, il faut définir la densité physiologique du composant membranaire cible. Les quantifications basées sur la cytométrie en flux des protéines de surface cellulaire sont une étape essentielle de ce protocole et nécessitent : 1) l’utilisation d’anticorps avec un nombre connu de fluorochromes par anticorps (F/P), et 2) des billes de référence fournissant une référence standard pour l’interpolation des molécules de fluorochrome à partir des intensités moyennes de fluorescence (IMF) mesurées.

Ces étalons de référence se composent de cinq populations de billes, chacune contenant un nombre croissant de fluorochromes solubles équivalents (MESF), qui couvrent la plage dynamique de la détection arbitraire par fluorescence. Ces populations standard produisent des pics de fluorescence discrets, facilitant la conversion d’unités de fluorescence arbitraires en MESF par simple régression linéaire. Les MESF résultants sont ensuite utilisés avec les valeurs f/P des anticorps pour calculer le nombre moyen de molécules liées par cellule (ou BSLB dans les étapes ultérieures). L’application de surfaces cellulaires estimées au nombre moyen de molécules détectées permet alors le calcul de densités physiologiques sous forme de molécules/μm2. Ce protocole de quantification peut également être adapté à la mesure des densités protéiques sur les lymphocytes T et à la reconstitution biochimique des compositions membranaires médiant la formation de synapses homotypiques des lymphocytes T (c.-à-d. synapses T-T9). Si nécessaire, la valence de la liaison aux anticorps peut être davantage estimée en utilisant des cibles recombinantes marquées avec un nombre connu de fluorochromes par molécule. Ensuite, la valence de liaison aux anticorps peut être calculée pour la même population BSLB en comparant simultanément le nombre de protéines fluorescentes liées et d’anticorps de quantification (en utilisant deux fluorochromes de quantification différents et des normes MESF).

La reconstitution des membranes APC nécessite l’assemblage de bicouches lipidiques supportées (SLB) sur des billes de silice1. Les stocks de liposomes contenant différentes espèces de phospholipides peuvent être exploités pour former une matrice lipido-bicouche polyvalente, permettant l’ancrage de protéines recombinantes avec une chimie de liaison différente (la préparation des liposomes est détaillée en 10). Une fois que la densité physiologique (ou les densités) du ligand pertinent « sur les cellules » est définie, le même protocole de cytométrie en flux est adapté pour estimer la concentration de protéine recombinante nécessaire pour recouvrir les BSLB de la densité physiologique cible. Deux systèmes d’ancrage différents peuvent être utilisés en combinaison ou séparément.

Tout d’abord, le SLB contenant un dernier 12,5 mol% de phospholipides contenant du Ni2+ est suffisant pour fournir environ 10 000 sites de liaison His-tag par micron carré10 et fonctionne bien pour décorer les BSLB avec la plupart des protéines disponibles dans le commerce dont les densités physiologiques ne dépassent pas cette capacité de charge maximale. Le deuxième système de chargement exploite les phospholipides contenant de la biotine (en mol%) pour charger des anti-CD3e Fab biotinylés (ou monomères HLA/MHC) via des ponts streptavidines. La combinaison de ces deux méthodes de décoration BSLB permet ensuite la personnalisation flexible des BSLB en tant qu’APC synthétiques. Pour les compositions de surface APC très complexes, le mol% de phospholipides et de protéines peut être augmenté pour charger autant de protéines que la question en question l’exige. Une fois que les concentrations de travail des protéines et mol% des phospholipides biotinylés sont définies, les BSLB peuvent être assemblés pour interroger la sortie synaptique des lymphocytes T avec cytométrie en flux multiparamétrique.

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Protocol

1. Mesure des densités de protéines de surface cellulaire par cytométrie quantitative en flux

  1. Préparer un tampon de cytométrie en flux humain (hFCB) filtré à 0,22 μm en ajoutant de l’EDTA (à une concentration finale de 2 mM) et du sérum AB humain (jusqu’à un final de 10 %) à une solution saline tamponnée stérile au phosphate (PBS), pH 7,4 (voir le tableau 1). Filtrer la solution à l’aide d’un filtre à pores de 0,22 μm pour éliminer les impuretés sériques et conserver à 4 °C.
  2. Récupérer les cellules et les sédimenter par centrifugation à 300 × g pendant 5 min à température ambiante (RT).
  3. Lavez les cellules deux fois avec PBS. À chaque étape de lavage, remettre en suspension les cellules dans PBS au volume d’origine (avant centrifugation) et tourner vers le bas à 300 × g pendant 5 min à TA.
  4. Compter les suspensions de cellules colorées en bleu de trypan dans un hémocytomètre11. Vous pouvez également compter les cellules en utilisant l’exclusion du courant électrique. Pour ce dernier, suivez les instructions du fabricant CASY-TT (voir la Table des matériaux).
    REMARQUE: Le compteur de cellules CASY-TT permet de déterminer le pourcentage de cellules viables, la taille des cellules et le volume cellulaire.
  5. Calculer le volume de PBS contenant une dilution de 1:1 000 du colorant de viabilité fixable eFluor 780 ou similaire (voir le tableau des matériaux) nécessaire pour remettre les cellules en suspension à une concentration de coloration de 107 cellules/mL.
  6. Remettre en suspension les cellules à l’aide de la solution de colorant de viabilité-PBS et incuber sur de la glace pendant 30 min.
  7. Retirez le colorant de viabilité en ajoutant un volume de hFCB glacé. Tourner vers le bas à 300 × g pendant 5 min à 4 °C.
    REMARQUE: À partir de maintenant, gardez la chaîne du froid ininterrompue.
  8. Laver les cellules avec du hFCB contenant une dilution de 1:50 de la solution bloquante du récepteur Fc (voir le tableau des matériaux). Porter le volume à une concentration finale de 107 cellules/mL et incuber pendant 15 minutes supplémentaires pour obtenir un blocage Efficace du FcgR.
  9. Répartir 100 μL de la suspension cellulaire (c.-à-d. 106 cellules) par puits d’une plaque de 96 puits à fond en U ou à fond en V. Gardez les cellules sur la glace et à l’abri de la lumière (recouvrir de papier d’aluminium).
  10. Préparez un mélange maître d’anticorps dans le hFCB en définissant les concentrations optimales d’anticorps pour chaque anticorps conjugué au fluorochrome et, surtout, pour les anticorps utilisés pour déterminer les densités de protéines de surface. Par exemple, pour quantifier l’expression de l’ICAM-1 sur les populations de cellules amygdales, comme le montre la figure 1, préparer un mélange contenant 1:200 dilutions d’anti-CD4, d’anti-CD19 et d’anti-CXCR5 ainsi que des concentrations saturantes d’un anticorps anti-ICAM-1 avec des fluorochromes AF647 connus par anticorps (c.-à-d. 10 μg/mL, qui a été défini par des expériences indépendantes de titrage d’anticorps).
  11. Comme témoins supplémentaires, préparer un mélange maître d’anticorps contenant les témoins d’isotype d’anticorps pertinents (aux mêmes concentrations efficaces que leurs homologues conjugués avec les mêmes fluorochromes pour la soustraction de fond), c’est-à-dire utiliser 10 μg/mL d’un témoin d’isotype AF647 pertinent.
    REMARQUE: Dans l’exemple ci-dessus, un tel contrôle d’isotype est utilisé pour soustraire la fluorescence de fond du véritable signal ICAM-1 sur les cellules.
  12. Lors de la quantification des densités protéiques sur des sous-ensembles cellulaires présents à basse fréquence dans les tissus, préparer des témoins de fluorescence moins un (FMO) contenant tous les anticorps colorants à l’exception des marqueurs d’intérêt (voir plus de détails dans 12).
  13. Faire tourner la plaque de 96 puits contenant les cellules à 300 × g pendant 5 min à 4 °C, jeter le surnageant et remettre les cellules en suspension dans 50 μL du mélange maître d’anticorps de quantification ou du mélange maître d’anticorps isotypes.
  14. Incuber les cellules pendant au moins 30 min à 4 °C et 400 tr/min à l’aide d’un agitateur à plaques. Protégez les plaques de la lumière (couvercle avec du papier d’aluminium).
  15. Lavez les cellules trois fois à l’aide de hFCB et centrifugez à 300 × g pendant 5 min à 4 °C.
  16. Remettre en suspension la pastille cellulaire à l’aide de 200 μL de PBS (c.-à-d. jusqu’à une concentration finale de 5 × 106 cellules/mL).
  17. Pour l’acquisition :
    1. Si vous utilisez un chargeur BD FACS standard, transférez les échantillons dans des tubes à fond rond en polystyrène de 5 mL (voir la table des matériaux).
    2. Si vous utilisez des échantillonneurs à haut débit (HTS, également appelés lecteurs de plaques), passez immédiatement à l’étape 1.19.
  18. Avant de procéder à l’acquisition de données pour les normes MESF, vérifiez les limites maximales et minimales de linéarité de l’intensité de fluorescence pour les canaux de quantification.
  19. Avant la compensation, acquérez des données pour les normes MESF, en veillant à ce que les populations les plus faibles et les plus lumineuses se situent dans la plage linéaire de mesure.
  20. Acquérir les échantillons de compensation. Conservez inchangées les valeurs de tension du tube photomultiplicateur (PMT) pour les canaux de quantification afin de préserver la plage dynamique de détection. Effectuez de légers ajustements de la tension PMT des autres canaux avant de calculer les matrices de compensation.
  21. Calculer et appliquer la rémunération.
  22. Acquérir et économiser un minimum de 2 × 104 perles MESF au total pour chacun des canaux de quantification.
  23. Sélectionner la population de cellules individuelles en fonction de leurs zones de diffusion de la lumière latérale et avant (SSC-A et FSC-A, respectivement, comme le montre la figure 1A (i)), suivie de la sélection des événements à l’intérieur du continuum temporel (figure 1A (ii)) et faible pour le temps de vol (W) dans FSC et SSC par rapport à leurs hauteurs (c.-à-d. FSC-W/FSC-H, suivi du contrôle SSC-W/SSC-H, comme le montrent respectivement les figures 1A iii) et iv). Définir une porte d’événement unique finale contenant des événements avec une distribution proportionnelle FSC-A par rapport à FSC-H (Figure 1A (v)).
  24. Acquérir des échantillons de contrôle (contrôles étiquetés Isotype et FMO).
  25. Acquérir des échantillons et enregistrer jusqu’à ce qu’un minimum de 10 000 cellules cibles aient été acquises.
    REMARQUE: la détermination robuste des densités moléculaires moyennes nécessite l’analyse de plusieurs donneurs à travers des expériences indépendantes. Ceci est crucial lors de l’analyse de sous-ensembles cellulaires trouvés dans des fréquences réduites ou dérivés de matériel biologique rare (par exemple, de biopsies de tissus humains).
  26. Lavez le cytomètre pendant 5 min avec une solution de nettoyage FACS suivie de 5 min d’eau ultrapure avant d’éteindre l’instrument. Si vous utilisez le HTS, suivez les options sous l’onglet HTS et Clean Plate programme.
    REMARQUE: Pour réduire le transfert d’échantillon à échantillon, activez les options de rinçage assis (échantillonneur) ou de lavage d’échantillonneur à haut débit , qui lavent automatiquement le cytomètre entre les tubes ou les puits. Avant de commencer l’acquisition, faites couler de l’eau ultrapure pendant 10 minutes à un débit élevé pour éliminer tout contaminant biologique non lavé de la ligne d’échantillonnage du cytomètre.
  27. Exportez les fichiers FCS (Flow Cytometry Standard).

2. MesF surcorrigé les analyses de régression de l’intensité de fluorescence moyenne (ou médiane)

  1. Ouvrez le logiciel d’analyse de cytométrie en flux et chargez les fichiers FCS de l’expérience. Sélectionnez la population de perles en fonction de leurs zones de diffusion de la lumière latérales et avant (SSC-A par rapport à FSC-A), comme le montre la figure 1A (i).
  2. Contrôler la qualité des données en vérifiant la distribution des événements individuels dans le temps, comme indiqué à l’étape 1.24.
    REMARQUE: Les bulles créent des lacunes dans la distribution des événements au fil du temps; cela apparaît généralement au début de l’acquisition à l’aide du HTS. Évitez de sélectionner des événements flanquant des intervalles dans le temps d’acquisition, car ils ajoutent des erreurs de mesure dues à des aberrations optiques.
  3. Concentrez-vous sur les événements individuels.
    1. Cellules
      1. Identifier d’abord les cellules individuelles en fonction de leur distribution SSC-A et FSC-A (Figure 1A (i)), suivie des événements faibles pour W dans les portes séquentielles FSC-W/FSC-H (singlets-1, panneau Figure 1A (iii)) et SSC-W/SSC-H (singlets-2; Figure 1Un panneau (iv)). Définissez une porte singlets-3 supplémentaire en sélectionnant des événements avec FSC-A et FSC-H proportionnels (Figure 1A, panneau (v)). Enfin, identifiez les cellules vivantes comme étant négatives pour le colorant réparable de viabilité.
    2. Perles MESF
      1. Suivez la même discrimination singlets-1 à singlets-3 qu’à l’étape 2.3.1.1 (Figure 1B, panneaux (i) à (v)). Identifier chacune des populations MESF (vierge, 1, 2, 3 et 4) en fonction de leurs niveaux d’intensité de fluorescence (voir figure 1B, panneau (vi)).
  4. Extraire l’IFM des fractions MESF vierges et 1 à 4.
  5. Générez des valeurs MFI corrigées (cMFI) pour les fractions MESF 1 à 4 en soustrayant les IFM de la population de billes vierges de chaque fraction.
  6. Calculez la ligne la mieux adaptée à la relation entre les cMFI et les valeurs MESF fournies par le fournisseur (variable indépendante, fraction vide égale à zéro).
  7. Extraire la pente (b dans l’équation ci-dessous) de la régression linéaire de MESF sur cMFI (le panneau de la figure 1B (viii) montre une régression dans laquelle y = a + bx; avec a = 0).
  8. Extraire les intensités de fluorescence médianes (pour les distributions de fluorescence bimodales) ou moyennes (pour les distributions de fluorescence normales ou log-normales) des populations d’intérêt (cellules TFH et B dans le panneau figure 1A (vii)).
  9. Comme aux étapes 2.5 à 2.7, extraire les valeurs DMMI des cellules témoins marquées par isotype.
  10. Si le F/P des contrôles d’isotype est le même que celui des anticorps de quantification, corrigez les IFM des cellules colorées en soustrayant les IFM des cellules marquées à l’isotype.
  11. Si le F/P des isotypes diffère de ceux des anticorps de quantification, extraire le MESF des isotypes en divisant les IMF des cellules marquées par isotype avec la pente calculée à l’étape 2.7. Soustraire l’isotype MESF de la quantification MESF avant d’estimer les anticorps de quantification liés.
  12. Diviser le MESF par le F/P des anticorps de quantification pour estimer le nombre de molécules liées par cellule (Molec. comme le montre l’organigramme de la figure 1C).
  13. Divisez le nombre de molécules liées avec la surface cellulaire estimée (CSA (μm2)) pour extraire la densité des protéines sous forme de molec./μm2 (Figure 1C). Reportez-vous à la section des résultats représentatifs pour plus de détails.

3. Espèces de phospholipides fonctionnels à utiliser dans l’étalonnage des protéines enrobant les BSLB

  1. Utilisez 0,4 mM de DOPC (1,2-dioléoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) comme composant principal de la matrice lipidique formant la bicouche lipidique supportée. Diluer toutes les autres espèces de lipides dans cette solution de DOPC.
  2. Utiliser entre 0,2 et 1 mol % de 0,4 mM de DOPE (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoéthanolamine) conjugué à des colorants, dont ATTO 390, 488 ou 565 (voir la Table des matériaux), pour générer des BSLB à fluorescence intrinsèque.
    REMARQUE: La fluorescence intrinsèque des BSLEB facilite l’identification des BSLEB uniques et des cellules uniques dans les expériences de transfert synaptique.
  3. Utiliser 12,5 mol% de 0,4 mM DGS-NTA(Ni) (acide 1,2-dioléoyl-sn-glycero-3-[(acide iminodiacétique N-(5-amino-1-carboxypentyl)) pour ancrer les protéines marquées His. Gardez le mol% de DGS-NTA(Ni) constant et effectuez des titrages 2 fois plus élevés des protéines marquées His en commençant par 100 nM comme concentration la plus élevée. Laissez une condition sans protéine comme contrôle négatif pour les quantifications absolues.
    REMARQUE: Les signaux accessoires et les molécules d’adhésion, tels que ICAM-1, sont conçus avec une étiquette 12-His pour augmenter l’affinité de la protéine pour DGS-NTA(Ni).
  4. Utilisez Biotinyl Cap PE (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(cap biotinyl)) pour ancrer les protéines biotinylées via les ponts biotine-streptavidine-biotine. Utilisez un titrage en série 5 fois de 0,4 mM biotinyl cap PE couvrant entre 10 mol% et 0 mol% (comme contrôle négatif). Maintenir la concentration de streptavidine et de protéines biotinylées constante (200 nM) dans les expériences d’étalonnage et la reconstitution d’APC synthétiques pour les expériences de transfert synaptique.
    NOTE: Les analyses de régression des densités empiriques de protéines biotinylées sur le mol% final de Biotinyl Cap PE dans la matrice lipidique (contenant également DGS-NTA(Ni) pour ancrer les protéines marquées His) définiront le mol% à utiliser pour reconstituer les densités cibles de l’antigène.

4. Préparation d’une solution saline tamponnée HEPES supplémentée contenant 1% d’albumine sérique

REMARQUE : Une solution saline tamponnée HEPES complétée contenant 1 % d’albumine sérique humaine (HBS/HSA) ou 1 % d’albumine sérique bovine (HBS/BSA) est nécessaire aux étapes de lavage et de chargement en protéines des BSLEB (tableau 1). Préparer une solution mère HBS 10x et le tampon de travail aussi frais que possible; conserver au réfrigérateur et utiliser dans un délai d’un mois. Bien que le BSA soit une alternative moins chère au HSA, il offre un blocage efficace des lipides ni-chélatants13 et est recommandé pour les expériences à haut débit.

  1. Préparer une solution tampon mère 10x de HBS supplémenté contenant 200 mM HEPES, 7 mM Na2HPO4, 1400 mM NaCl, 50 mM KCl, 60 mM de glucose, 10 mM CaCl2 et 20 mM MgCl2.
    REMARQUE: La dissolution de MgCl2 est très exothermique et présente un risque de brûlure. Ajouter ce sel lentement et sur un grand volume de solvant. Évitez de préparer des solutions concentrées (c.-à-d. 1 M) de ces sels, car ils ont tendance à précipiter avec le temps, ce qui rend difficile leur ajout précis au tampon de travail.
  2. Filtrer la solution 10x à l’aide d’une unité de filtration de 0,22 μm et la garder stérile à 4 °C.
  3. Pour 500 mL de HBS/has, prendre 50 mL de la solution 10x HBS supplémentée, ajuster le pH à 7,4 si nécessaire et augmenter le volume à 483,4 mL avec de l’eau ultrapure.
  4. Ajouter 16,6 mL de solution de HSA à 30 % aux 483,4 mL de HBS, pH 7,4.
  5. Pour 500 mL de HBS/BSA, dissoudre 5 g de BSA dans HBS et incuber à 37 °C pendant 30 min. Ensuite, mélangez doucement à RT en inversant périodiquement le flacon jusqu’à ce qu’il n’y ait pas de cristaux de protéines ou d’amas visibles.
  6. Filtrer la solution résultante de l’étape 4.5 à l’aide d’une unité de filtration de 0,22 μm (voir le tableau des matériaux) et la stocker à 4 °C.

5. Étalonnages de la densité protéique sur les BSLB

  1. Avant de prendre les billes de silice non fonctionnalisées de 5,00 ±0,05 μm de diamètre, mélangez bien la solution mère et remettez en suspension les gros amas de perles sédimentés au fond des flacons.
    REMARQUE: Les billes de silice ont tendance à sédimenter rapidement, ce qui peut entraîner des erreurs de comptage. Mélanger vigoureusement en pipetant de haut en bas la moitié du volume maximal d’une micropipette P1000.
  2. Diluer 1 μL de solution de billes dans 1 000 μL de PBS, compter les billes à l’aide d’une chambre hémocytométrique et calculer leur concentration par mL.
    REMARQUE: La coloration bleu trypan n’est pas nécessaire pour visualiser les billes de silice.
  3. Calculer le volume de billes de silice nécessaire pour 5 × 105 BSLB finaux par point de titrage.
  4. Transférer le volume requis de billes de silice dans un tube de microcentrifugation stérile de 1,5 mL.
  5. Lavez les billes de silice trois fois avec 1 mL de PBS stérile, centrifugez les billes pendant 15 s sur une microcentrifugeuse de paillasse à RT (à régime fixe).
    REMARQUE: Lorsque vous retirez la solution de lavage, évitez de déranger la pastille de perle. Une petite colonne tampon n’affectera pas la propagation des liposomes composant le mélange maître de liposomes car ceux-ci sont également dans PBS.
  6. Préparer trois volumes du mélange maître de liposomes pour assembler le BSLB sur les billes de silice lavées (par exemple, si le volume total initial des billes de silice est de 20 μL, préparer un minimum de 60 μL du mélange maître de liposomes).
  7. Pour les titrages Biotinyl Cap PE mol%
    1. Préparez les mélanges maîtres lipidiques contenant 5 fois les dilutions de Biotinyl Cap PE.
      1. Diluer le Biotinyl Cap PE mol% de 0,4 mM dans une matrice DOPC à 100 %.
      2. Mélanger chaque point de titrage Biotinyl Cap PE mol% à un rapport 1:1 (vol:vol) avec une solution de 0,4 mM 25% DGS-NTA(Ni) de sorte qu’un dernier 12,5 mol% de lipides contenant du Ni est présent dans tous les titrages.
        REMARQUE: Les 12,5 mol% (vol: vol%) de lipides contenant du Ni représentent la composition lipidique mixte des BSLB sur laquelle les protéines marquées His peuvent également être testées dans des étalonnages parallèles. Par exemple, puisque tous les stocks de liposomes sont préparés à la même concentration molaire, pour atteindre le mélange cible en mol% dans 200 μL de mélange final de liposomes, il suffit de mélanger 100 μL de 25 mol% de DGS-NTA contenant du Ni avec 100 μL de 100 mol% de DOPC.
    2. Transférer 5 × 105 billes de silice lavées dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 mL, de sorte qu’un point de titrage Biotinyl Cap PE mol% soit assemblé par tube.
    3. Ajouter les mélanges maîtres de titrage Biotinyl Cap PE mol% aux billes de silice lavées et mélanger doucement en pipetant de haut en bas la moitié du volume total. Évitez de former des bulles qui, en excès, détruisent la bicouche lipidique.
    4. Ajouter de l’argon (ou de l’azote) gazeux sur le tube contenant les BSLB en formation actuelle pour déplacer l’air et protéger les lipides de l’oxydation pendant le mélange.
    5. Ajouter de l’argon aux stocks lipidiques de 0,4 mM avant le stockage et manipuler à l’aide d’une technique stérile.
      REMARQUE: Connectez un petit tuyau à la bouteille de gaz argon / azote. Avant d’ajouter du gaz aux tubes, ajustez le régulateur de la bouteille de gaz de sorte que la pression ne dépasse pas 2 psi. Connectez une pointe de pipette stérile au tuyau de sortie pour diriger le flux de gaz à l’intérieur du stock de liposomes pendant 5 s et fermez rapidement le couvercle. Dans le cas des stocks lipidiques, sceller le couvercle du tube avec un film de paraffine avant de le stocker à 4 °C.
    6. Déplacez les BSLB vers un mélangeur de laboratoire vertical à angle variable (voir le tableau des matériaux) et mélangez pendant 30 minutes à RT en utilisant un mélange orbital de 10 tr / min.
      REMARQUE: Cette étape empêchera la sédimentation des perles lors de la formation de la bicouche lipidique supportée.
    7. Faites tourner les billes en centrifugant pendant 15 s à RT sur une minicentrifugeuse de paillasse, puis lavez trois fois avec 1 mL de HBS/HSA (BSA) pour éliminer l’excès de liposomes.
    8. Bloquer les BSLEB formés en ajoutant 1 mL de caséine à 5 % ou 5 % de BSA contenant 100 μM de NiSO4 pour saturer les sites de NTA et 200 nM de streptavidine pour recouvrir uniformément tous les sites d’ancrage de la biotine sur les BSLB. Mélanger doucement en pipetant vers le haut et vers le bas la moitié du volume total et incuber dans le mélangeur vertical pendant 20 minutes au maximum à RT et 10 tr/min.
    9. Faites tourner les BSLB en centrifugant pendant 15 s à RT sur une minicentrifugeuse de paillasse, puis lavez trois fois avec 1 mL de tampon HBS/HSA (BSA).
      REMARQUE: Gardez les perles lavées verticalement avec un petit volume de tampon de lavage recouvrant les BSLEB. Évitez la déshydratation des BSLEB car l’air détruira la bicouche lipidique.
  8. Pour le titrage des protéines marquées His sur 12,5 mol% de BSLB contenant du DGS-(Ni) NTA
    1. Préparer trois volumes de mélange maître de liposomes contenant un dernier 12,5 mol% de DGS-NTA(Ni).
    2. Utilisez le mélange maître de liposomes pour remettre en suspension les billes de silice lavées et mélangez doucement en pipetant la moitié du volume total. Évitez de former des bulles qui endommagent excessivement la bicouche lipidique.
    3. Ajouter de l’argon (ou de l’azote) gazeux sur le tube contenant les BSLB en formation actuelle pour déplacer l’air et protéger les lipides de l’oxydation pendant le mélange.
    4. Ajouter de l’argon aux stocks lipidiques de 0,4 mM avant le stockage et manipuler à l’aide d’une technique stérile.
    5. Déplacez les BSLB vers le mélangeur vertical et mélangez pendant 30 min à RT en utilisant le mélange orbital à 10 tr/min.
    6. Faites tourner les billes en centrifugant pendant 15 s à RT sur une minicentrifugeuse de paillasse, puis lavez trois fois avec 1 mL de HBS/HSA (BSA) pour éliminer l’excès de liposomes.
    7. Bloquer les BSLEB formés en ajoutant 1 mL de caséine à 5 % (ou 5 % de BSA) contenant 100 μM de NiSO4 pour saturer les sites de NTA sur les BSLB. Mélanger doucement et incuber dans le mélangeur vertical pendant 20 min au maximum à RT et 10 tr/min.
    8. Laver trois fois à l’aide de HBS/HSA (BSA) pour éliminer l’excès de solution bloquante.
    9. Dans une nouvelle plaque de 96 puits à fond en U, préparez 2 fois les dilutions en série des protéines.
      1. Préparer une concentration initiale de 100 nM pour la protéine d’intérêt dans un volume total de 200 μL de tampon HBS/HSA (BSA), distribuer 100 μL de cette solution dans la première colonne et les 100 μL restants sur le dessus de la colonne #2 contenant 100 μL de tampon HBS/HSA (BSA).
      2. Continuez en transférant en série 100 μL de la colonne #2 à la colonne #3 et répétez si nécessaire pour couvrir tous les points de titrage. Laissez la dernière colonne de la série sans protéine, car elle sera utilisée comme référence vide pour la quantification.
    10. Remettre en suspension les BSLEB préparés dans un volume tel que 5 × 105 BSLB soient contenus dans 100 μL de tampon HBS/HSA (BSA).
    11. Transférer 100 μL de la suspension BSLB vers les puits d’une deuxième plaque de 96 puits à fond U, de sorte que chaque puits reçoive 5 × 105 BSLB.
    12. Faites tourner la deuxième plaque contenant des BSLB pendant 2 min à 300 × g et RT et jetez le surnageant.
    13. Transférer les volumes de 100 μL de la plaque de titrage des protéines vers la plaque contenant les BSLB sédimentés. Mélanger doucement, éviter la génération excessive de bulles lors du pipetage et incuber pendant 30 min à RT et 1 000 tr/min à l’aide d’un agitateur à plaques. Protéger de la lumière avec du papier d’aluminium.
    14. Lavez la plaque trois fois avec un tampon HBS/HSA (BSA) en utilisant des étapes de sédimentation de 300 × g pendant 2 min à TA.
    15. Si la protéine recombinante utilisée dans l’étalonnage est directement conjuguée aux fluorochromes et a des valeurs F/P connues, passez à l’étape 5.8.20.
    16. Si la protéine recombinante utilisée dans l’étalonnage n’est pas marquée ou conjuguée à des fluorochromes ou si aucun étalon de billes MESF n’est disponible, utilisez des anticorps conjugués Alexa Fluor 488 ou 647 avec des valeurs F / P connues pour colorer le BSLB enrobé de protéines.
    17. Coloration avec des concentrations saturantes d’anticorps de quantification.
      REMARQUE: Selon le niveau d’expression cible, ceux-ci varient entre 5 et 10 μg / mL.
    18. Tache pendant 30 min à RT et 1 000 tr/min à l’aide d’un agitateur à plaques. Protéger de la lumière à l’aide d’une feuille d’aluminium.
    19. Laver deux fois avec un tampon HBS/HSA (BSA) et une fois avec du PBS en utilisant des étapes de sédimentation de 300 × g pendant 2 min à TA.
      REMARQUE: Utilisez PBS, pH 7,4 pour remettre en suspension les BSLB lavés avant l’acquisition. N’utilisez pas de tampons contenant des protéines, car cela conduit à la formation de bulles lors du mélange automatique d’échantillons avec des échantillonneurs à haut débit.
    20. Acquérir les normes MESF, en s’assurant que les pics les plus brillants restent dans la plage de détection linéaire du détecteur de quantification (canal), comme le montre la figure 1B (vii).
    21. Acquérir les échantillons manuellement ou à l’aide de HTS. Si vous utilisez ces derniers, remettez en suspension les BSLEB dans 100 μL de PBS et acquérez 80 μL en utilisant un débit compris entre 2,5 et 3,0 μL/s, un volume de mélange de 100 μL (ou 50 % du volume total si le volume de remise en suspension est inférieur), une vitesse de mélange de 150 μL/s et cinq mélanges pour s’assurer que les BSLE sont monodispersés.
    22. Exportez les fichiers FCS.
    23. Concentrez-vous sur des événements uniques pour les analyses (Figure 2A), car les doublets ou les triplets introduiront une erreur dans la détermination. Utilisez l’identification imbriquée d’événements uniques comme indiqué à l’étape 1.2.3 du protocole.
    24. Mesurer l’IFM de chaque fraction MESF (1-4) et soustraire l’IFM des billes vierges pour en extraire les IFM corrigées (IFM).
    25. Effectuer une analyse de régression linéaire pour extraire la pente (b) du MESF sur l’IFM cM calculée pour les normes MESF, qui sera utilisée à l’étape 5.33.
    26. Extraire l’IFM de chaque point de titrage et soustraire l’IFM des billes sans protéine pour obtenir des CFI.
    27. Divisez les cFIM avec la pente calculée à l’étape 5.31 pour extraire le MESF lié aux BSLEB pour chaque point de titrage.
    28. Diviser mesF lié aux BSLB par la valeur F/P de l’anticorps de quantification pour extraire le nombre moyen de molécules liées par BSLB.
    29. En utilisant le diamètre des BSLB (5,00 ± 0,05 μm), extraire la surface de la bille (SA = 4pr2) pour calculer les densités finales de protéines (molec./μm2) par point de titrage (concentration en protéines).
    30. Effectuer une nouvelle analyse de régression de la concentration en protéines par rapport à la densité protéique pour calculer la pente (b) de la ligne la mieux ajustée.
      NOTE: La concentration de 12,5 mol% de DGS-NTA(Ni) confère une capacité d’ancrage maximale d’environ 10 000 molec./μm210 sans induire l’activation non spécifique des lymphocytes T ni affecter la mobilité latérale des SLB.

6. Réalisation d’expériences de transfert synaptique entre les lymphocytes T et les BSLB

  1. Avant d’exécuter l’expérience de transfert synaptique
    1. Acquérir des BSLB non fluorescents, des BSLEB avec des lipides fluorescents, des cellules non colorées (ou des perles de compensation; voir la table des matériaux) et des cellules colorées d’une seule couleur (ou des perles de compensation) pour identifier les interactions du spectre de fluorescence de l’instrument. Concentrez-vous sur les détecteurs à fort débordement pour redessiner le panneau polychromatique, augmenter la sensibilité et réduire l’erreur de mesure sur les détecteurs critiques (voir 14).
    2. Titrer les anticorps de détection pour trouver la concentration optimale, permettant la détection des événements positifs sans compromettre la détection des négatifs.
      REMARQUE: Répétez cette étape chaque fois qu’il y a un changement de lot d’anticorps car les valeurs F / P et la luminosité varient d’un lot à l’autre.
    3. Facultatif : Optimisez les tensions PMT en acquérant l’échantillon à différentes plages de tension (c.-à-d. une tension marche) pour trouver les PMT conduisant à un signal optimal sur le bruit (c.-à-d. séparation des négatifs et des positifs tout en s’assurant que le signal de la population la plus brillante reste dans la plage linéaire).
  2. Mesure du transfert de sortie des lymphocytes T vers les BSLB
    1. Préparer le RPMI 1640 supplémenté (ici milieu R10) contenant 10 % de sérum fœtal bovin (FBS) inactivé par la chaleur, 100 μM d’acides aminés non essentiels, 10 mM d’HEPES, 2 mM de L-glutamine, 1 mM de pyruvate de sodium, 100 U/ml de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine. Utilisez le milieu R10 pour cultiver et développer les lymphocytes T.
    2. Le jour 1, isolez les lymphocytes T des chambres du sang périphérique ou du système de leucoréduction (LRS). Utilisez des trousses d’isolement et de séparation des cellules d’immunodensité (voir la Table des matériaux) pour l’enrichissement des lymphocytes T CD4+ et CD8+ humains.
    3. Ensemencer les cellules à une concentration finale comprise entre 1,5 et 2,0 × 106 cellules/mL, à l’aide de plaques à 6 puits ne dépassant pas 5 mL au total par puits.
    4. Activer les lymphocytes T à l’aide d’un rapport de 1:1 de billes magnétiques d’activation des lymphocytes T humains (anti-CD3/anti-CD28) (voir la Table des matériaux) et ajouter 100 UI d’IL-2 humaine recombinante pour soutenir la prolifération et la survie des cellules.
    5. Le jour 3, retirez les billes magnétiques actives à l’aide de colonnes magnétiques (voir le Tableau des matériaux). Assurez-vous que les billes magnétiques restent attachées sur les côtés du tube avant de récupérer les cellules pour des étapes de lavage supplémentaires.
    6. Lavez à nouveau les billes magnétiques avec 5 mL de milieu R10 frais, mélangez bien et remettez-les dans l’aimant. Récupérez ce volume et mélangez-le avec les cellules récupérées à l’étape 6.2.5.
    7. Remettre les cellules à 1,5-2 × 106 cellules/mL dans du R10 frais contenant 100 U/mL d’IL-2. Reconstituer le milieu après 48 h, en s’assurant que le dernier ajout d’IL-2 est de 48 h avant le jour de l’expérimentation (jours 7 à 14 de culture).
    8. Le jour de l’expérience de transfert synaptique, préparer le milieu du test de transfert synaptique (voir tableau 1) en complétant le milieu RPMI 1640 sans phénol rouge avec 10 % de FBS, 100 μM d’acides aminés non essentiels, 2 mM de L-glutamine, 1 mM de pyruvate de sodium, 100 U/ml de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine. Ne pas inclure l’IL-2 humaine recombinante.
    9. Compter les cellules en utilisant soit la coloration bleu trypan ou l’exclusion du courant électrique et les remettre en suspension à une concentration finale de 2,5 × 106 cellules/mL dans le milieu. Si une mort cellulaire excessive est observée (>10 %), éliminer les cellules mortes/mourantes à l’aide d’un mélange de polysaccharide et de diatrizoate de sodium (voir la Table des matériaux) comme suit :
      1. Couche de 15 mL de culture cellulaire sur 13 mL de la solution de diatrizoate de polysaccharide-sodium.
      2. Centrifugeuse de 1 250 × g pendant 20 min à RT avec un minimum d’accélération et de désaccélération. Recueillir la couche cellulaire (nuage) dans l’interface entre le milieu et la solution de diatrizoate de polysaccharide-sodium.
      3. Lavez les cellules au moins deux fois avec un milieu de test de transfert synaptique préavertissé (préparé à l’étape 6.2.7).
      4. Compter et remettre en suspension les cellules à une concentration finale de 2,5 × 106/mL à l’aide d’un milieu de dosage synaptique. Coculture 100 μL de cette suspension cellulaire avec des BSLEB (voir étape 6.2.15).
    10. Calculer le nombre de BSLB nécessaires à l’expérience; considérez tous les différents mélanges maîtres de protéines et titrages d’antigènes à tester (soit des monomères de peptides HLA/MHC biotinylés, soit des monomères monobiotinylés anti-CD3ε Fab).
    11. Assemblez les BSLEB en suivant les mêmes étapes de la section 5 du protocole, mais cette fois, combinez tous les titrages de protéines et de lipides nécessaires à la reconstitution d’une membrane APC complexe (Figure 3A). Gardez les mêmes relations vol: vol entre le volume initial des billes de silice et le volume de mélange de protéines utilisé lors des étalonnages, ainsi que les temps et les températures utilisés dans le chargement des BSLB. Par exemple, si 0,5 μL de billes de silice/puits et 100 μL/puits de mélange de protéines ont été utilisés pour l’étalonnage initial, maintenir des rapports vol:000 vol:vol pour préparer les BSLEB à coculturer avec des lymphocytes T.
    12. Une fois que les BSLEB ont été chargés avec le mélange de protéines d’intérêt, lavez les BSLB deux fois avec HBS/HSA (BSA) pour éliminer l’excès de protéines non liées. Utilisez des vitesses de sédimentation de 300 × g pendant 2 min à TA à chaque étape de lavage et jetez les surnageants.
    13. Remettre en suspension les 5 × 105 BSLB par puits dans 200 μL.
    14. Transférer 100 μL par puits vers une nouvelle plaque de 96 puits à fond en U pour en faire un double, de sorte que la quantité finale de BSLB par puits soit de 2,5 × 105.
    15. Faites tourner les BSLB à 300 × g pendant 2 min et RT et jetez le surnageant.
    16. Remettre en suspension les BSLB en utilisant 100 μL de suspension de lymphocytes T; mélanger doucement pour éviter la formation de bulles.
    17. Incuber les cocultures pendant 90 min à 37 °C.
      REMARQUE: Alternativement, les cellules et les billes peuvent être remises en suspension dans un tampon HBS / HSA (BSA) au lieu de RPMI sans phénol-rouge pour la coculture. Dans ce cas, l’incubation doit être effectuée dans un incubateur sans CO2 car ce gaz va rapidement acidifier le tampon en l’absence de bicarbonate.
    18. Refroidir les cocultures de cellules BSLB-T en incubant d’abord les cellules à RT pendant au moins 15 min. Protégez-les de la lumière.
    19. Centrifuger les cellules pendant 5 min à 500 × g et RT; jeter le surnageant.
    20. Remettre les cellules en RT 2% BSA-PBS (sans Ca2+ et Mg2+) pour les bloquer. Placez les cellules sur de la glace pendant 45 min. Protéger de la lumière.
    21. Pendant l’incubation des cellules, préparez le mélange maître d’anticorps en utilisant du BSA glacé filtré à 0,22 μm et filtré à 2% dans le PBS comme tampon de coloration, ce qui fournira un blocage supplémentaire.
      REMARQUE: Certains lots d’anticorps conjugués à des colorants Brilliant Violet ont tendance à se lier aux BSLB de manière non spécifique. Le blocage avec 5% de BSA-PBS aide à réduire ce bruit. À partir de maintenant, assurez-vous de garder la chaîne du froid ininterrompue.
    22. Faire tourner les cocultures à 500 × g pendant 5 min et 4 °C. Avant de jeter les surnageants, assurez-vous brièvement que la pastille est présente en inspectant le fond de la plaque de 96 puits à l’aide d’un rétroéclairage.
    23. À l’aide d’une pipette multicanal, remettez en suspension les cellules du mélange maître de coloration contenant des concentrations d’anticorps optimisées.
      REMARQUE: Utilisez des embouts de pipette sans filtre pour éviter la génération de bulles et d’erreurs dans la distribution des volumes de coloration.
    24. Inclure les cellules marquées par isotype et les BSLECB, les BSLB fluorescents et non fluorescents, ainsi que les cellules et les BSLB colorés seuls. Respecter le nombre total d’événements par puits pour tous les témoins (c.-à-d. seulement les BSLB contenant 5 × 105 BSLB/puits, et seulement les témoins cellulaires contenant 5 × 105 cellules/puits pour éviter une augmentation relative des anticorps par événement coloré).
    25. Mélanger doucement en pipetant de haut en bas la moitié du volume et incuber pendant 30 min sur de la glace. Protéger de la lumière.
    26. Lavez les cellules et les BSLB deux fois à l’aide de BSA-PBS glacés à 2 %, pH 7,4 et d’étapes de sédimentation de 500 × g pendant 5 min à 4 °C. Resuspendez les cocultures lavées dans 100 μL de PBS et acquérez-les immédiatement.
    27. Si une fixation est nécessaire, fixez à l’aide de 0,5 % p/v de PFA dans le PBS pendant 10 min, lavez une fois et conservez-le dans le PBS jusqu’à l’acquisition. Protéger de la lumière.
    28. Avant la compensation, acquérez des normes MESF, en veillant à ce que les populations les plus sombres et les plus brillantes se situent dans la plage linéaire de mesure.
    29. Acquérir des échantillons de compensation, calculer la compensation et appliquer la matrice de compensation (lien) à l’expérience.
    30. Acquérir et enregistrer un minimum de 2 × 104 normes MESF au total pour chacun des canaux de quantification.
    31. Pour l’acquisition à l’aide d’échantillonneurs à haut débit, réglez l’acquisition d’instruments sur la norme, réglez l’acquisition d’échantillons à 80 μL (ou 80 % du volume total), le débit d’échantillonnage entre 2,0 et 3,0 μL/s, le volume de mélange d’échantillons de 50 μL (ou 50 % du volume total pour éviter la formation de bulles pendant le mélange), le mélange d’échantillons de 150 μL/s et le mélange par puits entre 3 et 5.
    32. Acquérir un minimum de 1 × 104 BSLB uniques par échantillon (voir les panneaux (i) à (vi) de la figure 3B pour la stratégie de contrôle de référence).
    33. Lavez le cytomètre en cours d’exécution pendant 5 min une solution de nettoyage suivie de 5 min d’eau ultrapure avant d’éteindre l’instrument. Si vous utilisez le HTS, suivez les options sous l’onglet HTS et l’option Nettoyer .
    34. Exportez les fichiers FCS.

7. Mesure du transfert synaptique des particules vers BSLB

  1. Ouvrez les fichiers FCS d’expérience. Sélectionnez la population de cellules et de BSLB en fonction de leurs zones de diffusion de la lumière latérales et avant (SSC-A par rapport à FSC-A), comme le montre la figure 3B (i).
  2. Sélectionnez les événements dans la fenêtre d’acquisition continue (Figure 3B (ii)).
  3. Concentrez-vous sur les événements uniques des cellules et du BSLB; identifier d’abord les cellules individuelles en fonction du faible W dans les portes séquentielles FSC-W/FSC-H (singlets-1, panneau figure 3B (iii)) et SSC-W/SSC-H (singlets-2; Figure 3B panneau (iv)). Définissez une porte singlets-3 supplémentaire en sélectionnant des événements avec FSC-A et FSC-H proportionnels (Figure 3B, panneau (v)).
  4. Extraire l’IMF des fractions MESF vierges et 1 à 4 et des cellules individuelles et MESF pour chaque échantillon d’expérience.
  5. Générez des valeurs MFI corrigées (cMFI) pour les fractions MESF 1 à 4 en soustrayant l’IFM de la population de billes vierges de chaque fraction.
  6. Générer des cMFI pour des BSLB et des cellules uniques (reportez-vous au panneau Figure 3C (i)).
  7. Utilisez le signal de BSLB coloré avec des anticorps de contrôle d’isotype pour corriger l’IMF de BSLB coloré avec des anticorps contre les marqueurs de lymphocytes T pertinents. Utilisez cMFI pour calculer le pourcentage de transfert synaptique normalisé (NST%) à l’aide de l’équation illustrée dans le panneau de la figure 3C (ii).
  8. Si vous vous intéressez plutôt aux particules spécifiquement transférées en réponse au déclenchement du TCR, soustrayez le signal des BSLB nuls de l’IFM des BSLB agonistes. Utilisez ce cMFI pour calculer le % NST induit par le TCR en utilisant l’équation illustrée dans le panneau de la figure 3C (ii).
  9. Si vous souhaitez déterminer le nombre total de molécules transférées en tant que cargaison de particules à travers l’interface cellule T-BSLB, acquérez des billes de référence MESF en utilisant les mêmes réglages d’instrument et la même session d’acquisition pour les cocultures T cell-BSLB.
  10. Analyser les populations de billes MESF et extraire leurs cMI comme indiqué dans les étapes de protocole 5.8.15 à 5.8.17. Calculer la pente de la ligne la mieux ajustée pour l’analyse de régression de MESF sur cMFI.
  11. Utilisez la pente calculée pour extraire le nombre de MESF déposés sur les BBSL. Utilisez des cMF calculées à l’aide de contrôles d’isotype ou de BSLB nuls comme blancs pour extraire le nombre de MESF transférés spécifiquement aux BSLE stimulants.
  12. Calculer le nombre de molécules de marqueurs transférés aux BSLEB en divisant les MESF calculés (moyens) par BSLB par la valeur F/P de l’anticorps de quantification.

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Representative Results

FCM pour la quantification absolue des protéines à la surface de la cellule
La reconstitution des BSLB présentant des densités physiologiques de ligands nécessite l’estimation des densités protéiques totales sur le sous-ensemble cellulaire modélisé. Pour reconstituer les BSLB, inclure tout ligand pertinent censé jouer un rôle dans l’axe de signalisation d’intérêt aux côtés des protéines soutenant l’adhésion et l’interaction fonctionnelle entre BSLB et les cellules, telles que l’ICAM-1 et les molécules costimulatoires, par exemple les récepteurs CD40, CD58 et B7 (CD80 et CD86). Des protéines supplémentaires peuvent être ajoutées en fonction de la question en question, y compris des molécules costimulatrices telles que ICOSL3, PD-L1 et PD-L215. Pour toute autre molécule, reconstituer les BSLB en utilisant des densités moléculaires déterminées en analysant directement les cellules avec cytométrie quantitative en flux. Pour les anticorps directement conjugués, BioLegend fournit des valeurs F/P pour chaque numéro de lot d’anticorps. Les anticorps peuvent également être marqués en interne et les rapports F / P déterminés par spectrophotométrie, offrant une alternative lorsqu’il n’y a pas d’anticorps commerciaux conjugués au fluorochrome souhaité. Puisque nous utilisons les mêmes anticorps pour calibrer le nombre de protéines recombinantes à la surface des cellules et des BSLB, il n’est pas nécessaire de corriger la valence de liaison aux anticorps car elle reste constante. Si la valence de liaison aux anticorps est requise, utilisez à la fois des protéines recombinantes et des anticorps avec F/P connus pour décorer les BSLB et comparez les molécules de protéines recombinantes chargées avec le nombre d’anticorps liés après coloration dans des conditions saturantes.

Les molécules d’anticorps liées par cellule peuvent être estimées à l’aide d’une mesure cytométrique en flux monochromatique dédiée ou d’un panel polychromatique d’anticorps destiné à estimer les densités protéiques absolues sur un sous-ensemble relativement peu fréquent de cellules dans un tissu d’intérêt, comme les amygdales palatines. La figure 1 montre des mesures représentatives des densités d’ICAM-1 dans les lymphocytes B CXCR5+ et les lymphocytes T folliculaires (TFH) à titre d’exemple. Le même protocole de coloration et les mêmes principes d’analyse par cytométrie en flux illustrés à la figure 1A peuvent être utilisés pour mesurer les densités de protéines sur les cellules épithéliales, les cellules stromales, les monocytes, les cellules dendritiques dérivées de monocytes (MODC) ou sur les lymphocytes B et T dans d’autres tissus humains et murins. Pour les tissus différents du sang et des amygdales, il faut faire preuve de prudence lors de l’isolement des cellules à l’aide de cocktails de protéase, car l’exposition prolongée des cellules aux enzymes de digestion réduit les niveaux d’expression de la surface cellulaire.

Concentrez l’acquisition et les analyses sur des cellules vivantes uniques dans la fenêtre d’acquisition continue (Figure 1A ii), car les événements en dehors du continuum temporel diffusent aberrantement la lumière, compromettant la quantification. Pour augmenter la précision des déterminations, réduisez la coloration non spécifique des APC en bloquant efficacement les FcγR. Le sérum humain et l’EDTA présents dans le hFCB permettent un blocage efficace du FcγR tout en chélatant du Ca2+ libre pour réduire l’agrégation spontanée des cellules lors de leur manipulation et de leur coloration (les flèches noires de la figure 1A (iii) et (iv) montrent les doublets restants dans les suspensions de cellules amygdales).

Le suivi des performances de l’instrument à l’aide des billes de configuration et de suivi et du logiciel (ou similaire; voir le tableau des matériaux) est essentiel pour la reproductibilité des quantifications au fil du temps, en particulier dans les étapes ultérieures lorsque le transfert synaptique des particules vers BSLB est mesuré en utilisant uniquement des IMF (c’est-à-dire pour les fluorochromes pour lesquels il n’existe pas de normes MESF). De même, vérifiez la plage linéaire (c’est-à-dire le minimum de linéarité et le maximum de linéarité) des unités de fluorescence arbitraires pour le détecteur de quantification à utiliser avec les étalons MESF de sorte que chaque point d’étalonnage conserve la relation linéaire entre la fluorescence et le nombre de fluorochromes.

La préparation d’échantillons « vierges » pour la fluorescence, ou d’échantillons donnant une idée du bruit de coloration de fond, est essentielle pour soustraire le signal fluorescent non spécifique. Les témoins d’isotypes et/ou les échantillons biologiquement nuls (p. ex., les knockouts) sont essentiels pour corriger le signal de fond des cellules et extraire le signal réel dérivé des anticorps de quantification (figure 1A du panneau (viii)). De même, les billes MESF standard utilisent une population vierge dédiée pour soustraire le signal de fond de chaque population de perles vraiment positives (panneaux figure 1B (vii) et (viii)). Une fois les analyses de régression effectuées et la pente définissant la relation entre mesF et les IMF corrigées extraite, la conversion en densités moléculaires absolues suit des opérations mathématiques simples (Figure 1C).

Pour estimer l’ASC à la figure 1C, l’exclusion du courant électrique (CASY-TT) a été utilisée pour extraire les mesures du volume et du diamètre des cellules de milliers de cellules. L’ASC résultante estimée à partir du calcul de la surface des sphères (4pr2) varie en fonction de l’état d’activation des cellules, avec des valeurs observées de 170,37 ± 4,91 μm2 pour les cellules B non activées et de 234,52 ± 1,53 μm2 et 318 ± 24,45 μm2 pour les cellules T non activées et activées, respectivement. Ces ASC sont comparables à ceux estimés par des techniques d’imagerie telles que la tomographie tridimensionnelle à indice de réfraction des lymphocytes non activés16.

Une fois que la gamme de densités physiologiques a été définie (par exemple, en comparant les densités de surface sur les cellules subissant différents programmes d’activation), les BSLB peuvent être utilisés pour modéliser ces surfaces. Un titrage de monomères de peptide hLA antigéniques biotinylés fournis par l’installation de tétramères NIH (ou anti-CD3ε-Fab monomère monobiotinylé) peut être utilisé aux côtés de l’ICAM-1 12-His pour reconstituer une membrane APC canonique. Les protéines commerciales marquées de 6, 9, 12 et 14 His peuvent être utilisées pour décorer la surface du BSLB (voir la figure 2A pour des exemples avec ICAM-1 12-His). Les titrages de protéines ainsi que les analyses quantitatives de FCM fournissent une méthodologie robuste pour reconstituer les surfaces physiologiques d’APC et tester leur effet sur la sortie synaptique de différents sous-ensembles de cellules T.

Pour étudier la sortie des synapses des lymphocytes T, utilisez un rapport BSLB-cellules T de 1:1 pour vous assurer qu’en moyenne, une cellule interagira avec une BSLB au cours de la période étudiée. Nous avons observé que le transfert de matière est proportionnel au temps d’incubation, fournissant une plate-forme polyvalente pour détecter les molécules transférées en faibles quantités à travers l’interface cellule:BSLB. Une conception de panneau appropriée est donc essentielle pour augmenter la sensibilité et la fiabilité de la détection du matériau transsyndyatique, car dans le cas des tSV, la sortie varie entre 25 et 36 vésicules / cellule / 20 min2,3. Testez d’abord le débordement spectral de chaque anticorps et lipide marqués au fluorochrome. Lorsque des débordements élevés sont observés, nous recommandons le titrage des anticorps de coloration et le pourcentage de lipides fluorescents composant le BSLB, ainsi que des marches de tension PMT pour réduire l’erreur de propagation sur les échantillons compensés et améliorer le rapport signal sur bruit, respectivement (voir 12,14,17 pour une introduction dédiée au sujet).

L’utilisation de témoins de quantification, y compris des BSLB nuls (dépourvus d’antigène ou d’anti-CD3 Fab) et des cellules knockout ou des échantillons marqués par isotype18, est essentielle pour mesurer avec précision le transfert du v.tS effecteur, tel que les SE, ainsi que les particules d’attaque supramoléculaire libérées dans la fente synaptique. Utiliser des protéines de surface cellulaire très abondantes telles que CD4, CD2 ou CD45 aux côtés de lipides fluorescents synthétiques (conjugués DOPE Atto) pour identifier la population de cellules individuelles et BSLB lors de la dissociation froide des conjugués. Concentrer les analyses sur la moyenne géométrique ou la médiane des intensités de fluorescence dans un seul BSLB et des cellules (CD4 est utilisé dans la figure 3B). Les SE sont un type spécialisé de tSV dérivé de la membrane plasmique (PM), et leur transfert au BSLB est mis en évidence par le gain de signal marqueur sur les BSLB avec la perte constante de signal à la surface des cellules en interaction (voir TCR sur les BSLB comme le montre la Figure 2B, flèches violettes). Les BSLB nuls dépourvus d’antigène ou d’anti-CD3 sont une excellente référence pour suivre le gain spécifique de TCR (et d’autres marqueurs de lymphocytes T) sur BSLB résultant de la stimulation des cellules en interaction via leur complexe TCR.

Figure 1
Figure 1 : Quantification absolue des protéines à la surface des APC. (A) Exemple de mesures quantitatives par cytométrie en flux de l’ICAM-1 à la surface des lymphocytes B amygdaliens (Foll. Bc) et les lymphocytes T auxiliaires (TFH). (i-vii) Stratégie de contrôle pour l’analyse d’un seul CXCR5+ Bc et TFH isolés à partir d’amygdales palatines humaines. La stratégie de contrôle séquentielle pour identifier les événements uniques en direct contenus dans la fenêtre d’acquisition continue est illustrée. (iii-iv) les flèches noires indiquent les doublets. (viii) des histogrammes superposés montrant l’expression de la surface cellulaire de l’ICAM-1 (histogrammes sarcelles) par rapport aux témoins FMO (histogrammes gris) et aux contrôles FMO étiquetés avec des isotypes pertinents (histogrammes noirs, qui chevauchent les histogrammes gris) des populations indiquées au point vii). Les flèches indiquent la direction de la stratégie de contrôle imbriqué utilisée pour identifier les cellules CXCR5+ B (Bc; CD19+) et TFH (CD4+). (B) L’extraction de molécules absolues à la surface des cellules amygdales à partir d’IMF nécessite des analyses de régression des billes de référence MESF acquises en utilisant le même réglage d’instrument que les cellules indiquées dans A. (i-v) La stratégie de contrôle séquentielle pour identifier les événements uniques en direct contenus dans la fenêtre d’acquisition continue est illustrée. vi) Contrôle et mesure des IFM de différentes populations MESF standard. (vii) sont représentés des histogrammes superposés des populations MESF identifiées au point (vi). Les valeurs affichées en haut à droite représentent les IMF pour chacune des 5 populations MESF (vierge, 1, 2, 3 et 4). (viii) Régression linéaire du MESF par rapport à l’IFM pour les populations du MESF indiquées au point vii). La pente (b) pour extraire mesF lié aux cellules à partir des données dans A est montrée. (C) Dans l’extraction du nombre de molécules, suivre des opérations mathématiques simples en commençant par l’application de la pente calculée en (viii) à partir des valeurs MESF cMFI (cMFIM) mesurées et des valeurs MESF de référence (MESFR). Pour extraire le MESF lié aux cellules (MESFcells), divisez l’IMF corrigée des cellules (cMFIcells) par la pente calculée. Ensuite, pour calculer le nombre de molécules liées aux cellules (Molec. cellules), divisent les MESFcells par le F/P de l’anticorps de détection (quantification). Enfin, pour calculer la densité moléculaire à la surface des cellules (Dcells), divisez Molec. cellules selon la surface cellulaire estimée (CSAE). Abréviations : X = variable indépendante ; Y = variable dépendante (fluorescence mesurée), cMFIM = IMF corrigée mesurée; MESFR = valeurs MESF de référence; MESFcells = MESF estimé par cellule; cMFIcells = cellules MFI corrigées; Molec. cellules = molécules estimées par cellule. Dcells = densité estimée sur les cellules; CSAE = surface cellulaire estimée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Reconstitution du BSLB avec ICAM-1 recombinant et mesure du transfert de particules aux BSLB. (A, i-vi) Analyse par cytométrie en flux des BSLEB reconstitués avec des densités accrues d’ICAM-1 monomérique recombinant 12-His (rICAM-1). (i-v) Comme à la figure 1, concentrez la stratégie de contrôle sur des BSLB uniques dans la fenêtre d’acquisition continue. Notez l’écart immédiatement avant la porte du continuum temporel, qui a été exclue pour éviter les erreurs de mesure. (vi) Une bonne qualité des protéines se traduit souvent par un revêtement homogène de BSLB à des concentrations élevées, avec l’observation de distributions de fluorescence étroites (faible coefficient de variation, voir histogrammes en vi). (B) Analyses de régression de la concentration de référence (CR) ICAM-1 par rapport à la densité mesurée (DM). Utilisez la pente pour calculer les concentrations cibles de protéines (CT) afin d’atteindre la densité de cellules (Dcells) mesurée dans les expériences de la figure 1. Abréviations : 12-His = 12-histidines tag; DM = densités moléculaires mesurées; CR = concentrations de référence du rICAM-1; CT = concentration cible (à interpoler); Dcells = densités mesurées dans les cellules (voir aussi Fig. 1C). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Mesure des particules synaptiques des lymphocytes T transférées aux BSLB. (A; i-v) Diagramme de flux montrant les étapes critiques pour la co-culture de lymphocytes T avec des BSLB reconstituant des membranes modèles et la mesure ultérieure du transfert de particules avec cytométrie en flux. iv) Les diagrammes bleu et jaune foncé montrent la distribution relative et l’emplacement des cellules et des BSLEB dans les diagrammes biparamétriques de cytométrie en flux. (v) Histogrammes de distribution de fluorescence affichant le gain relatif de fluorescence des BSLE Agonistiques (jaune foncé) par rapport aux BSLB nuls (gris). (B) Expérience exemplaire de transfert synaptique. (i-vi) La stratégie de contrôle pour identifier les BSLB et les cellules uniques dans la fenêtre d’acquisition continue est illustrée. Les flèches violettes indiquent la direction de l’analyse, qui se poursuit en C. (C) (i) Focaliser les analyses sur l’IMF des cellules individuelles (bleu) et des BSLB simples (jaune). (ii) Équations pour calculer le transfert synaptique normalisé (NST%, en haut) et Tmax% (en bas) à partir de l’IFM calculée pour le BSLB et les cellules. (iii-vi) Histogrammes superposés montrant le changement des distributions d’intensité de fluorescence pour les cellules (nuances bleues) et les BSLB (nuances jaunes) sur différentes densités de l’anti-CD3ε-Fab activant les cellules T, y compris sans activation (gris) et activation avec 250 (valeur de couleur douce) ou 1 000 (valeur de couleur élevée) molec./μm2. Les nombres dans différentes valeurs de couleur représentent le % NST mesuré pour les histogrammes BSLB affichés en jaune. Les histogrammes superposés montrent la hiérarchie globale dans le transfert synaptique des vésicules de lymphocytes T positif pour différents marqueurs. Pour cette composition de BSLB (200 molec./μm2 d’ICAM-1 et densités croissantes d’anti-CD3ε-Fab), les tSV sont transférés à BSLB avec TCR+(iii) > CD81+(iv) > CD4+(v) > CD28+(vi). Comme démontré dans les articles précédents, le TCR et le CD81 sont des composants des SE et sont transférés avec des rendements comparativement plus élevés au CD4, bien que ce dernier soit exprimé à des niveaux de surface comparativement plus élevés. L’excrétion de SE entraîne la perte de CD81 et de TCR à la surface cellulaire et le gain de ces signaux sur les BSLB (flèches violettes ouvertes pour 250 molec./μm2 et flèches violettes fermées pour 1 000 molec./μm2 dans les histogrammes jaunes). (D) Un refroidissement inadéquat des conjugués conduit les cellules à arracher le SLB des billes de silice, comme en témoigne la comparaison des billes d’entrée (diagramme biparamétrique gauche) et des conjugués soumis à un refroidissement rapide jusqu’à 4 °C à partir de 37 °C (tracé biparamétrique droit). Comparer également avec le panneau de la figure 3B (vi). Abréviations : PRF1 = perforine 1 ; NST% = transfert synaptique normalisé; Tmax % = pourcentage du transfert maximal observé (dans un état de contrôle ou de référence); vST: vésicules trans-synaptiques; SE : ectosomes synaptiques. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Tampons utilisés dans ce protocole. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

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Discussion

Les BSLB sont des outils polyvalents pour étudier la production de particules des lymphocytes T stimulés par des membranes APC modèles. La flexibilité de la méthode permet la reconstitution de compositions membranaires complexes et réductionnistes pour étudier les effets des ligands et de leurs signaux sur la sécrétion de tSV et de particules d’attaque supramoléculaire et leurs composants. Nous avons testé cette technologie sur diverses cellules T, y compris les cellules TH, CTL, Tregs et CART15 préactivées. Ce protocole fonctionne également pour la mesure de la libération de particules synaptiques de lymphocytes T fraîchement isolés et quiescents. L’une des limites de l’utilisation de lymphocytes T fraîchement isolés est que ces populations quiescentes produisent un profil différent de particules transsynaptiques, ce qui est en corrélation avec leur composition de surface cellulaire (voir 15 pour plus de détails).

En tant que panel de cytométrie en flux simple, nous recommandons l’utilisation d’un clone anti-TCR IP26, d’un clone anti-CD81 5A6, d’un clone anti-perforine (PRF1) B-D48 ou anti-CD40L clone 24-31, et de lipides contenant ATTO 390 ou ATTO 565 (pour conférer aux BSLB une fluorescence intrinsèque). Pour aider à distinguer les cellules individuelles des BSLB et conjugués uniques, nous recommandons l’utilisation d’UN clone anti-CD4 OKT4 et/ou d’un clone anti-CD45 HI30, qui sont transférés aux BSLB à des niveaux limités bien qu’ils soient exprimés à des niveaux très élevés à la surface de la cellule (voir tableau des matériaux pour plus de détails sur les fluorochromes et autres anticorps validés). Des panneaux avec un plus grand nombre de fluorochromes peuvent être conçus, mais nécessitent une évaluation systématique du débordement du spectre de fluorescence de chaque fluorochrome analysé. Pour augmenter la sensibilité, essayez différentes titrations d’anticorps de quantification allant de 0,5 μg à 20 μg/ mL final, et répétez chaque fois que de nouveaux stocks d’anticorps sont utilisés. Pour assurer la reproductibilité des mesures absolues et relatives du transfert de particules, titrer et calculer la capacité de liaison de chaque nouveau lot de phospholipides biotinylés et contenant du Ni, car ils peuvent différer considérablement d’un lot à l’autre. Le refroidissement progressif des conjugués lymphocytes T-BSLB est essentiel pour augmenter la sensibilité de la détection des particules à faible abondance. Le refroidissement rapide des cocultures conduit à la destruction des BSLEB, comme en témoigne la perte significative de fluorescence lipidique (Figure 3D).

Différentes mesures peuvent être utilisées pour mesurer la production de particules des synapses immunitaires des lymphocytes T en fonction de la question expérimentale en question. Par exemple, lorsque des différences mineures sont attendues dans les niveaux d’expression de base des protéines de surface triées en SE bourgeonnantes, une métrique de transfert synaptique normalisé (NST%) peut être utilisée (figure 3C panneau (ii) équation supérieure). Ce dernier quantifie le pourcentage de signal MFI sur les BSLB en fonction de l’IFM totale et combinée des cellules et des perles. Une mise en garde de cette approche est l’analyse des marqueurs transférés non exprimés sur le PM, tels que les composants des particules d’attaque supramoléculaire19. Comme ces éléments atteignent les BSLC par des voies indépendantes du transit des particules, telles que l’exocytose intracellulaire, le calcul du pourcentage de NST n’est pas recommandé car le résultat sera gonflé car le numérateur sera divisé par un dénominateur relativement petit (niveau d’expression de la surface cellulaire). Utilisez plutôt des IFM corrigées pour comparer les dépôts de perforine et de granzymes entre les BSLB nuls et les BSLB présentant des densités croissantes d’antigène ou d’anti-CD3 Fab. Alternativement, pour suivre les éléments intracellulaires transférés aux BSLB, utilisez pour comparaison soit les molécules absolues estimées transférées, soit le pourcentage de signal par rapport au signal maximal transféré aux BSLB (Tmax%) (figure 3C panneau (ii) équation du bas). Pour Tmax%, utilisez soit cMFI, soit des molécules mesurées sur l’échantillon (ou la condition) BSLB présentant la densité d’antigène la plus élevée comme Tmax de référence. Lors de l’analyse de différents donneurs, utilisez Tmax spécifique au donneur pour les comparaisons. Lors de l’étude du matériel transféré en réponse au déclenchement spécifique du TCR, les IMF peuvent également être corrigées au niveau de transfert de fond observé sur les BSLB antigène négatifs (nuls).

L’estimation du nombre absolu de molécules transférées aux BSLB est une méthode plus robuste, car elle implique un étalonnage MESF avec la mesure des molécules comme point final et une meilleure comparaison des expériences indépendantes. Tmax% offre une normalisation similaire à travers des expériences indépendantes et est particulièrement utile lors de l’utilisation de LA FCM polychromatique pour les marqueurs intracellulaires, tels que la perforine et les granzymes, ou pour les marqueurs pour lesquels aucune norme MESF n’est disponible. Tmax% est simplement le pourcentage de signal dans une condition donnée à la condition avec le transfert le plus élevé dans la condition de contrôle (par exemple, les témoins de véhicule / non traités pour les études de médicaments, les ARN guides de contrôle pour les bibliothèques CRISPR / Cas9). En outre, Tmax% peut être utilisé à la fois pour les cMI et un nombre absolu de molécules et a été particulièrement utile pour les comparaisons côte à côte des effets des délétions de gènes sur la sortie synaptique des cellules T. Ce dernier point est évident lorsque l’édition de gènes entraîne une grande variabilité de la plage dynamique de l’expression des récepteurs immunitaires parmi les donneurs indépendants et les expériences, ce qui pourrait avoir un impact sur les mesures absolues et NST%.

Les BSLEB ont facilité la capture et la caractérisation de la sortie synaptique de différents types de lymphocytes T, qui sont autrement difficiles à isoler en raison de leur internalisation rapide par les APC2. La stabilité physique des BSLEB fournit également une plate-forme pour le tri cellulaire activé par fluorescence des BSLEB qui ont été étudiés par les lymphocytes T, permettant ainsi la caractérisation biochimique de préparations de particules très pures par spectrométrie de masse et technologies de séquençage des acides nucléiques. Ce dernier facilite la caractérisation détaillée des messagers intercellulaires excrétés par les lymphocytes T dans un large éventail de conditions expérimentales. Différentes questions peuvent être abordées, y compris comment ces messagers particulaires changent entre différents types de lymphocytes T et états d’activation, comment les récepteurs d’antigènes canoniques et non canoniques (c.-à-d. les récepteurs d’antigènes chimériques) et comment les signaux membranaires agonistes et antagonistes influencent la composition des particules. Nous développons actuellement cette technologie pour la caractérisation quantitative des cytokines sécrétées au niveau de la synapse immunitaire des lymphocytes T stimulés. Ce dernier nécessite l’étude minutieuse de combinaisons de récepteurs de cytokines recombinants et d’anticorps, permettant une capture efficace des interleukines, des interférons et des chimiokines déposés sur les BSLB après l’activation des lymphocytes T. Les BSLB peuvent être adaptés pour modéliser la composition de surface d’autres APC soupçonnés de déclencher la libération de tSV par les lymphocytes T, tels que les cellules immunitaires stromales et innées. Les BSLEB peuvent également être adaptés pour dépister de nouveaux composés pharmacologiques à la recherche de la modulation positive et négative de la machinerie de sécrétion exocytaire et tSV pour le traitement du cancer et d’autres pathologies. Enfin, les BSLB peuvent également être utilisés pour découvrir des déterminants de virulence modulant la fonction des lymphocytes T dans les maladies infectieuses20.

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Disclosures

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Acknowledgments

Nous sommes reconnaissants aux membres de notre laboratoire et à la communauté du Kennedy Institute of Rheumatology pour leurs discussions scientifiques constructives, en particulier notre gestionnaire d’installations de cytométrie en flux, Jonathan Webber. Ce travail a été financé par wellcome Trust Principal Research Fellowship 100262Z/12/Z, l’ERC Advanced Grant (SYNECT AdG 670930) et le Kennedy Trust for Rheumatology Research (KTRR) (tous trois à MLD). Le PFCD a été soutenu par embooca Long-Term Fellowship (ALTF 1420-2015, en collaboration avec la Commission européenne (LTFCOFUND2013, GA-2013-609409) et Marie Sklodowska-Curie Actions) et une bourse Oxford-Bristol Myers Squibb.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl] (nickel salt) Avanti Polar Lipids 790404C-25mg 18:1 DGS-NTA(Ni) in chloroform

PIPETMAN L Multichannel P8x200L, 20-200 µL		 Gilson FA10011
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Avanti Polar Lipids 850375C-25mg  18:1 (Δ9-Cis) PC (DOPC) in chloroform
1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) ATTO 390 ATTO-TEC AD 390-165 DOPE ATTO 390
1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) ATTO 488 ATTO-TEC AD 488-165 DOPE ATTO 488
1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) ATTO 565 ATTO-TEC AD 565-165 DOPE ATTO 565
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(cap biotinyl) (sodium salt) Avanti Polar Lipids 870273C-25mg 18:1 Biotinyl Cap PE in chloroform
200 µL yellow tips 10 x 96 Tips, Stack Starlab S1111-0206
5 mL polystyrene round-bottom tubes Falcon® 352052
5.00 ± 0.05 µm non-functionalized silica beads Bangs Laboratories Inc. SS05003
96 Well Cell Cultture Plate U-bottom with Lid, Tissue culture treated, non-pyrogenic. Costar® 3799 For FCM staining and co-culture of BSLB and cells.
96 Well Cell Cultture Plate V-bottom with Lid, Tissue culture treated, non-pyrogenic. Costar® 3894 For FCM staining of cells or beads in suspension.
Alexa Fluor 488 NHS Ester (Succinimidyl Ester) Thermo Fisher Scientific, Invitrogen™ A20000
Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) Thermo Fisher Scientific, Invitrogen™ A37573 and A20006
Allegra X-12R Centrifuge Beckman Coulter For normal in tube staining of biological samples for FCM
Aluminum Foil Any brand For protecting cells and BSLBs from light
anti-human CD154 (CD40L), clone 24-31 BioLegend 310815 and 310818 Alexa Fluor 488 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively.
anti-human CD185 (CXCR5) Brilliant Violet 711, clone J252D4 BioLegend 356934 For quantitative FCM analysis of tonsillar cells as shown in Fig. 1E
anti-human CD19 Brilliant Violet 421, clone HIB19 BioLegend 302234 For quantitative FCM analysis of tonsillar cells as shown in Fig. 1E
anti-human CD2, clone RPA-2.10 BioLegend 300202 Labeled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD2, clone TS1/8 BioLegend 309218 Brilliant Violet 421 conjugate.
anti-human CD252 (OX40L), clone 11C3.1 BioLegend Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human CD28, clone CD28.2 eBioscience 16-0289-85 Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD317 (BST2, PDCA-1), clone 26F8 ThermoFisher Scientific, invitrogen 53-3179-42 Alexa Fluor 488 conjugate, we found this clone to be cleaner than clone RS38E.
anti-human CD38, clone HB-7 BioLegend 356624 Alexa Fluor 700 conjugate
anti-human CD38, clone HIT2 BioLegend 303514 Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human CD39, clone A1 BioLegend Labeled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD4 Brilliant Violet 650, clone OKT4 BioLegend 317436 For quantitative FCM analysis of tonsillar cells as shown in Fig. 1E
anti-human CD4, clone A161A1 BioLegend 357414 and 357421 PerCP/Cyanine5.5 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively
anti-human CD4, clone OKT4 BioLegend 317414 and 317422 PE/Cy7 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively
anti-human CD40, clone 5C3 BioLegend 334304 Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD40, clone G28.5 BioLegend Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD45, clone HI30 BioLegend 304056 and 368516 Alexa Fluor 647 and APC/Cy7 conjugates
anti-human CD47, clone CC2C6 BioLegend 323118 Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human CD54 (ICAM-1), clone HCD54 BioLegend 322702 Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD63 (LAMP-3), clone H5C6 BioLegend 353020 and 353015 PerCP/Cyanine5.5 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively
anti-human CD73, clone AD2 BioLegend 344002 Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD80, clone 2D10 BioLegend 305216 Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human CD81, clone 5A6 BioLegend 349512 and 349502 PE/Cy7 conjugate and labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester), respectively.
anti-human CD82, clone ASL-24 BioLegend 342108 Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human CD86, clone IT2.2 BioLegend 305416 Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human CD8a, clone HIT8a BioLegend 300920 Alexa Fluor 700 conjugate
anti-human CD8a, clone SK1 BioLegend 344724 Alexa Fluor 700 conjugate
anti-human HLA-A/B/C/E, clone w6/32 BioLegend 311414 and 311402 Alexa Fluor 647 conjugate and Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human HLA-DR, clone L243 BioLegend 307656 and 307622 Alexa Fluor 488 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively.
anti-human ICAM-1, clone HCD54 BioLegend 322702 Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human ICOS, clone C398.4A BioLegend 313516 Armenian Hamster IgG
anti-human ICOSL, clone MIH12 BioLegend 329611 Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human ICOSL, clone MIH12 eBioscience 16-5889-82 Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human LFA-1, clone TS1/22 BioLegend Produced in house Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human OX40, clone Ber-ACT35 (ACT35) BioLegend 350018 Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human PD-1 , clone EH12.2H7 BioLegend 135230 and 329902 Alexa Fluor 647 conjugate and Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human PD-L1, clone 29E.2A3 BioLegend 329702 Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human PD-L2, clone 24F.10C12 BioLegend 329611 Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human PD-L2, clone MIH18 BioLegend 345502 Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human TCRab, clone IP26 BioLegend 306712 and 306714 Alexa Fluor 488 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively.
antti-human CD156c (ADAM10), clone SHM14 BioLegend 352702
antti-human CD317 (BST2, Tetherin), clone RS38E BioLegend 348404 Alexa Fluor 647 conjugate
Armenian Hamster IgG Alexa Fluor 647 Isotype control, clone HTK888 BioLegend 400902 Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
BD Cytometer Setup and Tracking beads Becton Dickinson & Company (BD) 641319 Performance track of instruments before quantitative FCM
BD FACSDiva Becton Dickinson & Company (BD) 23-14523-00 Acquisition software
Bovine Seum Albumin Merck, Sigma-Aldrich A3294
CaCl2, Calcium chloride Merck, Sigma-Aldrich C5670 anhydrous, BioReagent, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥96.0%
Casein from bovine milk, suitable for substrate for protein kinase (after dephosphorylation), purified powder Merck, Sigma-Aldrich C5890
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 ThermoFisher Scientific, Gibco 11132D
DynaMag-2 ThermoFisher Scientific, Invitrogen™ 12321D For the removal of Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 in volumes less than 2 mL
DynaMag™-15 ThermoFisher Scientific, Invitrogen™ 12301D For the removal of Dynabeads™ Human T-Activator CD3/CD28 in volumes less than 15 mL
Fetal Bovine Serum Qualified, One Shot ThermoFisher Scientific, Gibco A3160801 Needs heat inactivation for 30 min at 56 oC
Ficoll-Paque PLUS Cytiva, GE Healthcare GE17-1440-02 Sterile solution of polysaccharide and sodium diatrizoate for lymphocyte isolation
Fixable Viability Dye eFluor 780 eBiosciences 65-0865-14 For the exclusion of dead cells during analyses
FlowJo Becton Dickinson & Company (BD) Version 10.7.1 Analysis software
Grant Bio MPS-1 Multi Plate Shaker Keison Products MPS-1 For the mixing of either cells during stainings or BSLBs during staning or protein loading (as an alternative to orbital agitation)
HEPES Buffer Solution (1 M) ThermoFisher Scientific, Gibco 15630-056
HEPES, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid), 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid. Merck, Sigma-Aldrich H4034 For preparation of HBS/HAS or HBS/BSA buffer. BioPerformance Certified, ≥99.5% (titration), suitable for cell culture
HERACell 150i CO2 incubator, 150 L, Electropolished Stainless Steel ThermoFisher Scientific 51026282 For culturing and expanding purified CD4+ and CD8+ T cells.
Hula Mixer® Sample Mixer ThermoFisher Scientific, Life Technologies 15920D Vertical, variable-angle laboratory mixer used for the mixing of BSLBs and lipid master mix, blocking solutions, protein master mix and small scale antibody stainings.
Human Serum Albumin, 30% aqueous solution Merck, Sigma-Aldrich 12667-M
Human TruStain FcX Fc Receptor Blocking Solution BioLegend 422302 Fc Receptor Blocking Solution for blocking of Fc Receptors from biologically relevant samples
Innovatis CASY cell counter and analyzer TT Biovendis Products GmbH For the counting of cells and the determination of cell size and volume based on the exclusion of electric current.
KCl, Potassium chloride Merck, Sigma-Aldrich P5405 Powder, BioReagent, suitable for cell culture
L-Glutamine 200 mM (100x) ThermoFisher Scientific, Gibco 25030-024
MgCl2, Magessium chloride Merck, Sigma-Aldrich M2393 BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture
Microtube Insert for 24 x 1.5/2.0 mL tubes Keison Products P-2-24 Microtube insert for Grant Bio MPS-1 Multi Plate Shaker
Mini Incubator Labnet International  I5110A-230V For the incubation (co-culturing) of BSLB and cells in the absence of CO2
Minimum Essential Medium Non-Essential Amino Acids ThermoFisher Scientific, Gibco 11140-035
Mouse IgG polyclonal antibody control Merck, Sigma-Aldrich PP54 Used as positive control for the measurement of antibodies bound to mouse IgG capture bead standards
Mouse IgG1, k Isotype, clone MOPC-21 BioLegend 400129, 400112, 400130, 400144, 400128 and 400170 Alexa Fluor 488, PE, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 700, APC/Cyanine7 and Brilliant Violet 785  conjugates, respectively.
Mouse IgG1, k Isotype, clone X40 Becton Dickinson & Company (BD), Horizon 562438 Brilliant Violet 421 conjugate.
Mouse IgG1, κ Isotype control, clone P3.6.2.8.1 eBioscience 14-4714-82 Labeled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
Mouse IgG2a, k Isotype, clone MOPC-173 BioLegend 400240 Alexa Fluor 647 conjugate
Mouse IgG2b, k Isotype, clone MPC-11 BioLegend 400330 and 400355 Alexa Fluor 647 and Brilliant Violet 785 conjugates, respectively
Multiwell 6 well Tissue culture treated with vacuum gas plasma Falcon 353046 For culturing and expanding purified CD4+ and CD8+ T cells.
Na2HPO4, Disodium Phosphate Merck, Sigma-Aldrich S7907
NaCl, Sodium chloride Merck, Sigma-Aldrich S5886 BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥99%
NiSO4, Nickel(II) sulfate Merck, Sigma-Aldrich 656895 For saturating NTA sites; added during the blocking process
Penicillin Streptomycin [+]10,000 units Penicillin; [+] 10,000 µg/mL Streptomycin ThermoFisher Scientific, Gibco 15140-122
Phosphate Buffered Saline pH 7.4, sterile ThermoFisher Scientific, Gibco 10010 No Ca2+ or Mg2+ added
Polyethersulfone (PES) Filter unit Thermo Scientific Nalgene  UY-06730-43 Hydrophilic PES membrane with low protein binding facilitates the filtering of solutions with high protein content
PURESHIELD argon ISO 14175-I1-Ar BOC Ltd. 11-Y For the protection of lipid stocks stored at +4 ºC.
Purified Streptavidin BioLegend 280302
Quantum Alexa Fluor 488 MESF beads Bangs Laboratories Inc. 488 Benchmark beads for the interpolation of Alexa Fluor 488 molecules bound to cells and/or BSLB
Quantum Alexa Fluor 647 MESF beads Bangs Laboratories Inc. 647 Benchmark beads for the interpolation of Alexa Fluor 647 molecules bound to cells and/or BSLB
Rat anti-mouse IgG Kappa Light Chain, clone OX-20 ThermoFisher Scientific, invitrogen SA1-25258 Labeled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
Recombinant human IL-2 Peprotech 200-02-1MG
RMPI Medium 1640 (1x); [-] L-Glutamine ThermoFisher Scientific, Gibco 31870-025
Rosette Human B Cell Enrichment Cocktail STEMCELL Technologies 15064 Isolation of B cells for measuring densities of proteins in purified cell populations
Rosette Human CD4+ T Cell Enrichment Cocktail STEMCELL Technologies 15022C.1
Rosette Human CD4+CD127low T Cell Enrichment Cocktail STEMCELL Technologies 15361 Pre-enrichment of CD4+ CD127Low T cells for the downstream isolation of Tregs by FACS.
Rosette Human CD8+ T Cell Enrichment Cocktail STEMCELL Technologies 15063
RPMI Medium 1640 (1x); [-] Phenol Red ThermoFisher Scientific, Gibco 11835-063 For the incubation (co-culturing) of BSLB and cells in the absence of CO2. Phenol red-free media reduces the autofluorescence of cells in flow cytometry and microscopy based measurements.
Sodium Pyruvate (100 mM) ThermoFisher Scientific, Gibco 11360-070
Sprout mini centrifuge FisherScientific, Heathrow Scientific LLC 120301 Benchtop microcentrifuge used to wash silica beads and BSLB in 1.5 mL Eppendorf tubes.
Sterile cappeed 5 mL polystyrene round-bottom tubes Falcon 352058
UltraComp eBeads Compensation Beads ThermoFisher Scientific, invitrogen 01-2222-42
Zeba Spin Desalting Columns 7K MWCO Thermo Fisher Scientific, Invitrogen™ 89882

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References

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Immunologie et infection numéro 182
Préparation de bicouches lipidiques soutenues par des perles pour étudier la production de particules des synapses immunitaires des lymphocytes T
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Céspedes, P. F., Dustin, M. L.… More

Céspedes, P. F., Dustin, M. L. Preparation of Bead-supported Lipid Bilayers to Study the Particulate Output of T Cell Immune Synapses. J. Vis. Exp. (182), e63130, doi:10.3791/63130 (2022).

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