Denne protokol beskriver en metode til at etablere en human blod-hjerne barriere (BBB) in vitro model. Endotelcellerne og pericytterne er podet på hver side af et indsatsfilter (blodrum), og astrocytter er podet i bundbrønden (hjernerummet). Den karakteriserede model blev brugt til nanopartikler transporteksperimenter.
Levering af lægemidler til hjernen er fortsat en udfordring på grund af blod-hjerne-barrierens (BBB) meget specifikke og restriktive egenskaber, som styrer og begrænser adgangen til hjernens parenchyma. Men med udviklingen af nanoteknologi blev der udviklet store paneler af nye nanomaterialer for at forbedre lægemiddelafgivelsen, hvilket understreger behovet for pålidelige in vitro-mikrosystemer til at forudsige hjerneindtrængning inden for rammerne af prækliniske assays. Her er en ligetil metode til at oprette et mikrofysiologisk system til at modellere BBB ved udelukkende at bruge humane celler. I sin konfiguration består modellen af en tredobbelt kultur, herunder hjernelignende endotelceller (BLEC’er), pericytter og astrocytter, de tre vigtigste BBB-cellulære aktører, der er nødvendige for at inducere og regulere BBB-egenskaberne på en mere fysiologisk måde uden krav om stramningsforbindelser. Modellen udviklet i et 12-brønds pladeformat, klar efter 6 dages tredobbelt kultur, er karakteriseret i fysiske egenskaber, gen- og proteinudtryk og anvendes til polymer nanogeltransportmåling. Modellen kan bruges til en lang række eksperimenter under sunde og patologiske forhold og repræsenterer et værdifuldt værktøj til prækliniske vurderinger af molekyle- og partikeltransport samt inter- og intracellulær handel.
BBB, lokaliseret på niveau med hjernekapillærendotelceller (EC’er), kontrollerer og regulerer adgangen til hjernens parenchyma, hvilket er afgørende for at opretholde hjernens homeostase og funktionen af neurale celler 1,2. Men i tilfælde af hjernepatologi udgør manglen på adgang til hjernens parenchyma en reel hindring for at udvikle terapeutiske strategier.
BBB EC’erne har et komplekst sæt egenskaber, herunder TJ-proteiner (tight junction), som forsegler det intercellulære rum, der er forbundet med et system af udstrømningspumper, specifikke transportører og receptorer, som styrer den transcellulære vej 1,2,3. Desuden induceres og vedligeholdes alle disse egenskaber takket være kommunikation med pericytterne indlejret i BBB EC-kældermembranen og astrocytterne, hvis endefødder omgiver hjernekapillærerne 1,2,3. Derfor er det en udfordring at studere BBB in vitro i betragtning af kompleksiteten af dens arkitektur og kommunikationen mellem de forskellige celletyper, der udgør den neurovaskulære enhed (NVU)2. Desuden er de forskellige celletyper afgørende for induktion og vedligeholdelse af BBB-egenskaber og påvirker følgelig forudsigelsen af krydsningen gennem BBB. Forskellige strategier for lægemiddellevering til hjernen blev allerede testet ved hjælp af et stort panel af taktikker for at omgå BBB-begrænsede egenskaber4. På det seneste er der med nanoteknologiens fremskridt ved at blive udviklet nye materialer til anvendelser som lægemiddelbærere 5,6. Ud over deres højere belastning, reducerede toksicitet og øgede lægemidlers biotilgængelighed kan disse nye nanomaterialer funktionaliseres til en trojansk heststrategi for at krydse BBB og specifikt målrette celler i parenchymen 5,6. Blandt de forskellige typer nanomaterialer, der evalueres, har nanogeler tiltrukket sig betydelig opmærksomhed, hovedsageligt på grund af deres kolloide egenskaber og evne til at skræddersy den kemiske struktur til at introducere stimuli-responsive egenskaber 7,8,9,10,11,12,13,14,15.
In vitro-modeller er nu udviklet til prækliniske undersøgelser, hvor man bruger humane celler til at forudsige hjernens penetration af lægemidler16. Forskellige indstillinger af disse modeller er tilgængelige, fra monolag af hjerne-EC’er til flere cellesystemer16. I betragtning af NVU-cellernes betydning i BBB-induktion og vedligeholdelse og det koordinerede respons på det patologiske miljø skal BBB in vitro-modeller overveje alle disse hovedpersoner for at forbedre relevansen af forudsigelsen 2,17.
Den nuværende metode beskriver opsætning af en tredobbelt kultur in vitro-model af den humane BBB, som er fuldt udviklet med humane celler til at studere specifikke cellulære og humane molekylære mekanismer. For at være fysiologisk relevant består modellen af BBB’s tre vigtigste cellulære aktører (EC’er, pericytter og astrocytter), der er nødvendige for at inducere og vedligeholde BBB-egenskaberne uden brug af tilspændingsforbindelser og viser et sæt egenskaber, der kræves for at blive betragtet som en in vitro BBB-model16,18. Modellen er opstillet i en konfiguration, der afgrænser blod- og hjernerummet, og som er egnet til prækliniske undersøgelser af lægemiddel- og partikeltransport for at forudsige hjernens penetration. Modellens anvendelighed illustreres ved at måle transporten af polymere nanogeler.
Behandling af hjernesygdomme er fortsat en udfordring i betragtning af lægemidlernes vanskeligheder med at hindre BBB for at nå deres cellulære og molekylære mål i hjernens parenchyma.
Lægemiddeludvikling til hjernesygdomme udviser i øjeblikket en lav succesrate, da de fleste lægemidler, der viser lovende resultater i prækliniske modeller, ikke viste nogen fordel, når de blev brugt i klinikken. I overensstemmelse med “3R-reglen”, der sigter mod at reducere antallet af dyr, der anvendes til forsøg, udvikles in vitro-modeller af BBB til at studere hjernepatologier og forudsige hjerneindtrængning af lægemidler29. In vitro-modeller af BBB er hovedsagelig blevet udviklet ved hjælp af dyreceller og er blevet mere sofistikerede for at forbedre relevansen af de opnåede resultater16. Et af de betydelige fremskridt i brugen af humane celler, som bringer ubestridelig ny indsigt og mere specificitet på celle- og molekylært niveau til at studere menneskelige sygdomsmekanismer16. Udviklingen af relevante modeller kræver imidlertid, at man overvejer at forbedre BBB’s in vitro-modelindstillinger og den viden, der opstår, takket være dyremodeller. Derfor skal det overveje kompleksiteten af BBB-arkitekturen og vigtigheden af cellecellekommunikationen for at studere BBB under fysiologiske og patologiske forhold30.
Den protokol, der præsenteres her, beskriver en metode til at oprette en fuld human BBB in vitro-model , der omfatter de tre hovedcelletyper i BBB, uden begrænsning af adgangen til hjernevæv. Som et flercellesystem er induktion og vedligeholdelse af BBB-egenskaber uden kunstig brug af tilspændingsforbindelser, men i stedet induceret af cellecellekommunikation, mere fysiologisk relevant og i overensstemmelse med in vivo-induktionen af BBB-egenskaberne31. Derfor er respekten for protokollens kronologi af største betydning for protokollens succes. Desuden repræsenterer inkubationstiderne under indstillingen af den tredobbelte kultur, og når de tre celletyper er samlet, de vigtigste kritiske trin i protokollen.
BBB-egenskaberne i EC’er induceres af co-kulturen med pericytter, som beskrevet for co-kulturmodellen24. Derfor er pericyternes kultur på bagsiden af indsatsfilteret det mest kritiske punkt og kræver nøje at følge protokollen med risiko for ikke at have nok pericytter til induktion af BBB-egenskaberne. Først og fremmest skal man under belægningsproceduren og også cellesåning være opmærksom på ikke at have petriskålens dækning i kontakt med belægningen og også mediet, når cellerne er podet for at sikre en god belægning af filteret og ikke miste celler (trin 2.2.1 og 2.2.4). Når pericytterne er sået, er det desuden vigtigt at vente på det angivne tidspunkt for fastgørelse af pericytterne (trin 2.2.4), før indsatsfilteret vendes tilbage til belægning og såning af EC’er på den anden side (trin 2.2.5 og 2.3). Når de er sået, kræves der seks dage for at inducere BBB-egenskaberne gennem cellecellekommunikation (trin 2.4).
Modellen er valideret med hensyn til begrænset permeabilitet (forbundet med indstillingen af de stramme kryds), da EC’erne i den tredobbelte kulturmodel viser permeabilitetsværdier til BBB-integritetsmarkører svarende til den validerede samkulturmodel og også målt i validerede dyre- eller menneskemodeller 16,27,32. Desuden kræver valideringen af en in vitro BBB-model ud over den begrænsede permeabilitet reaktionsevnen over for andre celletyper i NVU og ekspression af funktionelle receptorer og transportører16. Derudover er modellen reproducerbar og producerer flere indsatsfiltre og brønde til at udføre adskillige analyser (gen- og proteinekspression, fluorescerende farvning, toksicitetstest) på hver celletype separat uden at kræve en cellesorteringsmetode.
Modellen blev udviklet ved hjælp af et 0,4 μm porestørrelsesfilter til at have en celletype på hver side af indsatsfilteret. Insertfiltersystemet tillod undersøgelse af celle-cellekommunikation under fysiologiske forhold ved at overføre det på velholdige astrocytter. Tilstedeværelsen af astrocytter i systemet repræsenterer en plusværdi sammenlignet med den oprindelige co-kultur in vitro model24. I betragtning af astrocytternes betydning i BBB’s fysiologi tillader denne tredje celletype yderligere forståelse af cellecellekommunikationen inden for BBB. Desuden kan det tredobbelte cellekultursystem også studeres under patologiske tilstande som slagtilfælde, hvor astrocytterne spiller en væsentlig rolle 33,34,35. Derudover kan designet af BLEC’er / pericytter på begge sider af indsatsfilteret let placeres på andre celletyper for at efterligne patologiske tilstande såsom hjernekræft23.
Porestørrelsen på indsatsfilteret kan medføre begrænsninger med nogle eksperimenter, såsom celletransmigration over BBB. Udviklingen af modellen med en større porestørrelse kræver imidlertid tilpasning af protokollen for at sikre dannelsen af et fysiologisk monolag af EC’er og ikke flere lag, hvilket ikke er fysiologisk relevant for at efterligne BBB36.
Modellens anvendelighed er blevet demonstreret ved hjælp af NGs transporteksperiment, der viser muligheden for at udføre transporteksperiment ved hjælp af et flercellet system. Ikke desto mindre bør man være opmærksom på vanskelighederne ved at have en kontrolforbindelse eller molekyle til transporteksperimentet, der deler sammenlignelige egenskaber med NG’er, da hver nanostruktur udviser et unikt sæt egenskaber (molekylvægt, ladning, form, fysiske egenskaber, proteinkoronadannelse).
En begrænsning af modellen er fraværet af forskydningsspænding, som viste sig at påvirke differentieringen af EC’er og ekspressionen af TJ-proteiner37. Imidlertid er det udfordrende at udvikle et fluidisk system, der efterligner hjernekapillæren i betragtning af kompleksiteten ved at tilføje en fluidisk del, der kræver en bestemt enhed, i et flercellet system. Desuden er den pågældende enhed normalt ikke kommercielt tilgængelig og tillader ikke mange replikater, hvilket gør fluidiske systemer mindre tilpassede til brug med høj kapacitet.
Sammenfattende gengiver dette tredobbelte kultursystem bestående af humane celler in vitro BBB’s arkitektur. Det tillader generering af mange indsatser, der kan bruges til omfattende screening af forbindelser.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde tildeles af EU’s Horizon 2020-forsknings- og innovationsprogram under tilskudsaftale nr. 764958 som en del af NANOSTEM-projektet, et Marie Skłodowska-Curie Innovative Training Network (ITN) (Fellowship Eleonora Rizzi). Denne undersøgelse er bevilget af »Conseil régional du Nord-Pas-de-Calais« (Fellowship to Clémence Deligne), »Société Française de lutte contre les Cancers et les leucémies de l’Enfant et de l’adolescent« (SFCE), Association »l’étoile de Martin« og foreningen »Cassandra contre la leucémie«.
Cell Culture | |||
Astocyte Medium (AM) | ScienCell | 1801 | |
Astrocyte Growth Supplement | ScienCell | 1852 | Astrocyte Growth Supplement is provided in the AM set. |
Cell culture dish 100 mm | Corning | 430293 | 100 mm x 20 mm; dish used for the thawing of ECs and PCs before the triculture setting |
Cell culture dish 150 mm | Corning | 430599 | The height of these dishes (25 mm) allows the seeding of PCs in the reverted insert for the setting of the triculture model. |
Collagen I | Corning | 354236 | Rat tail |
Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 31600-083 | Powder |
Endothelial Cell Growth Supplement | ScienCell | 1051 | Endothelial Cell Growth Supplement is provided in the ECM set. |
Endothelial Cell Medium (ECM) | ScienCell | 1001 | |
Fetal Calf Serum | Sigma | F7524 | |
Gelatin | Sigma | G2500 | 2% gelatin from porcine skin in PBS-CMF |
Gentamicin | BiochromA6 | A-2712 | |
Glucose | Sigma | G6152 | Powder |
Glutamine | Merck | 1002891000 | |
Human Brain Cortex Astrocytes | ScienCell | 1800-SC | |
Malassez cell counting chamber | vWR | HECH40453702 | The count was performed manually. |
Matrigel | Corning | 354230 | Extracellular matrix-based hydrogel |
Penicillin/Streptomycin | ScienCell | 0503 | Penicillin/Streptomycin solution is provided in the ECM and AM sets. |
Poly-L-lysine | ScienCell | 0413 | |
Steritop | Millipore System | SCGPT0SRE | 0.22 µm pore size |
Transwell insert | Corning | 3401 | 0.4 µm pore polycarbonate filter |
Trypsin/EDTA neutralization solution | ScienCell | 0113 | |
Trypsin/EDTA solution | ScienCell | 0103 | |
Immunocytochemistry | |||
SEA BLOCK blocking buffer | ThermoScientific | 37527 | |
Alexa Fluor 568 anti-Mouse secondary antibody | Thermofisher | A11031 | Dilution 1:500 |
Alexa Fluor 568 anti-Rabbit secondary antibody | Thermofisher | A11036 | Dilution 1:500 |
Anti-Claudin-5 primary antibody | InVitrogen | 34-1600 | Dilution 1:100 |
Anti-Desmin primary antibody | Abcam | ab6322 | Dilution 1:200 |
Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein primary antibody | Dako | Z0334 | Dilution 1:500 |
Anti-Platelet-Derived Growth Factor-β primary antibody | Abcam | ab51090 | Dilution 1:200 |
Anti-VE-cadherin primary antibody | Abcam | ab207732 | Dilution 1:200 |
Anti-Zona Occludens-1 primary antibody | InVitrogen | 61-7300 | Dilution 1:200 |
Normal Goat Serum | Sigma | G6767 | |
ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI | Invitrogen | P36962 | |
Gene expression | |||
NucleoSpin Rna/Protein Macherey Nagel Kit | Macherey-Nagel | 740,933,250 | |
96 multiplate well | Biorad | HSP9601 | |
iSCRIPT | Biorad | 1708841 | |
Sealer sheet | Biorad | MSB1001 | |
SsoFast EvaGreen Supermix | Biorad | 172-5201 | |
Protein expression | |||
2x Laemli Sample Buffer | Biorad | 161-0737 | Add 50 µL of bMercaptoetanol to 950 µL of Laemmli Buffer and store at -20°C. Dilute 1:1 with the protein sample for the assay. |
Anti-Breast Cancer Resistance Protein primary antibody | Abcam | ab207732 | Pre-treatment 15 minutes at RT under agitation; dilution 1:1000, O.N. at 4°C |
Anti-Claudin-5 primary antibody | Abcam | ab15106 | Pre-treatment 5 minutes at 95°C; dilution 1:1000, O.N. at 4°C |
Anti-Glucose Transporter 1 primary antibody | Millipore | 07-1401 | Pre-treatment 5 minutes at 95°C; dilution 1:1000, O.N. at 4°C |
Anti-Mouse secondary antibody | Dako | P0447 | Dilution 1:5000 in TBS-Tween |
Anti-P-glycoprotein primary antibody | Genetex | GTX23364 | Pre-treatment 15 minutes at RT under agitation; dilution 1:400, 3 hours at RT |
Anti-Rabbit secondary antibody | Dako | P0448 | Dilution 1:8000 in TBS-Tween |
Anti-Transferrin Receptor primary antibody | Abcam | ab84036 | Pre-treatment 5 minutes at 95°C; dilution 1:1000, O.N. at 4°C |
Anti-Zona occludens-1 primary antibody | Abcam | ab216880 | Pre-treatment 5 minutes at 95°C; dilution 1:1000, O.N. at 4°C |
Criterion TGX Gel | Biorad | 5678083 | |
ECL Prime Solution | Amersham | RPN2236 | Revelation solution to keep in the dark |
Phospatase inhibitor cocktail 2 | Sigma | P5726 | |
Phospatase inhibitor cocktail 3 | Sigma | P0044 | |
Protease Inhibitor | Sigma | P8340 | |
Protein Standards | Biorad | 161-0373 | Molecular weight markers |
RIPA 10x | Millipore | 20-188 | |
TBS 10x | Biorad | 1706435 | |
TRIS-Glycine | Biorad | 1610771 | |
Tween | Biorad | 1706531 | |
BBB integrity assay | |||
Sodium Fluorescein | Ampresco | 0681 | λex= 490 nm; λem= 525 nm |
Elacridar | Sigma | SML0486 | GF120918 |
FITC-Dextran 20 kDa | Sigma | FD-20S | λex= 490 nm; λem= 525 nm |
Rhodamine 123 | Sigma | R8004 | λex= 501 nm; λem= 538 nm |
SynergyTM H1 | BioTek Instruments | Fluorescent multiplate reader | |
Nanogel Transport | |||
Syringe | Terumo | SS+01T1 | 1 mL syringe |
Filter | FisherScientific | 15161499 | 0.2 µm PTFE membrane filter, 15 mm diameter |
N-Isopropylacrylamide (NIPAM)-based hydrogels | The nanogels (NGs) used in the study are provided by our collaborator in Queen Mary University London, Department of Chemistry. The NGs are covalently tagged with a fluorescent molecule (λex= 477 nm; λem= 540 nm). NGs are freeze dried and shipped as powder, in this state they are stable at room temperature for long period of time. |