Summary
DetectSyn is een onbevooroordeelde, snelle fluorescerende test die veranderingen meet in het relatieve synapsnummer (pre- en postsynaptische betrokkenheid) over behandelingen of ziektetoestanden. Deze techniek maakt gebruik van een nabijheidsligatietechniek die zowel in gekweekte neuronen als in vast weefsel kan worden gebruikt.
Abstract
Synapsen zijn de plaats van communicatie tussen neuronen. Neuronale circuitsterkte is gerelateerd aan synaptische dichtheid en de afbraak van synapsen is kenmerkend voor ziektetoestanden zoals depressieve stoornis (MDD) en de ziekte van Alzheimer. Traditionele technieken om synapsgetallen te onderzoeken omvatten genetische expressie van fluorescerende markers (bijv. Groen fluorescerend eiwit (GFP)), kleurstoffen die een neuron vullen (bijv. Carbocyaninekleurstof, DiI) en immunofluorescente detectie van wervelkolommarkers (bijv. Postsynaptische dichtheid 95 (PSD95)). Een belangrijk voorbehoud bij deze proxytechnieken is dat ze alleen postsynaptische veranderingen identificeren. Toch is een synaps een verbinding tussen een presynaptische terminal en een postsynaptische wervelkolom. De gouden standaard voor het meten van synapsvorming/-eliminatie vereist tijdrovende elektronenmicroscopie of arraytomografietechnieken. Deze technieken vereisen gespecialiseerde training en dure apparatuur. Verder kan slechts een beperkt aantal neuronen worden beoordeeld en worden ze gebruikt om veranderingen in een heel hersengebied weer te geven. DetectSyn is een snelle fluorescerende techniek die veranderingen in synapsvorming of -eliminatie identificeert als gevolg van een ziektetoestand of medicijnactiviteit. DetectSyn maakt gebruik van een snelle nabijheidsligatietest om naast elkaar geplaatste voor- en postsynaptische eiwitten en standaard fluorescerende microscopie te detecteren, een techniek die gemakkelijk beschikbaar is voor de meeste laboratoria. Fluorescerende detectie van de resulterende puncta maakt een snelle en onbevooroordeelde analyse van experimenten mogelijk. DetectSyn biedt meer representatieve resultaten dan elektronenmicroscopie omdat grotere gebieden kunnen worden geanalyseerd dan een beperkt aantal fluorescerende neuronen. Bovendien werkt DetectSyn voor in vitro gekweekte neuronen en vaste weefselplakken. Ten slotte wordt een methode geboden om de gegevens die uit deze techniek worden verzameld, te analyseren. Over het algemeen biedt DetectSyn een procedure voor het detecteren van relatieve veranderingen in synapsdichtheid tussen behandelingen of ziektetoestanden en is toegankelijker dan traditionele technieken.
Introduction
Synapsen zijn de fundamentele eenheid van communicatie tussen neuronen1. Veel synapsen tussen neuronen binnen dezelfde regio's geven aanleiding tot circuits die gedrag bemiddelen2. Synapsen bestaan uit een presynaptische terminal van een neuron die neurotransmitters of neuropeptiden vrijgeeft die informatie doorgeven aan postsynaptische receptoren van een ander neuron. De som van presynaptische signalen bepaalt of het postsynaptische neuron een actiepotentiaal zal afvuren en de boodschap naar andere neuronen zal verspreiden.
Synaptopathologie, het afbreken van synapsen, ontstaat bij ziekten en aandoeningen die gekenmerkt worden door een verminderd neuraal volume, zoals de ziekte van Alzheimer en depressieve stoornis, waardoor circuits die niet meer optimaal presteren 3,4,5. Het herstellen van de synapsdichtheid ligt waarschijnlijk ten grondslag aan de werkzaamheid van mogelijke behandelingen voor deze aandoeningen. Onlangs werd bijvoorbeeld aangetoond dat toenemende synapsen ten grondslag liggen aan de gedragsmatige werkzaamheid van snelle antidepressiva6. Om mogelijke synaptopathologische behandelingen snel te screenen, hebben onderzoekers technieken nodig die snel veranderingen in synapsnummers identificeren.
De huidige methodologieën zijn ofwel tijdrovend en duur (elektronenmicroscopie, arraytomografie), of ze onderzoeken alleen postsynaptische veranderingen zonder presynaptische betrokkenheid op te nemen (wervelkolomanalyses, immunofluorescentie / colocalisatie). Kleurstoffen zoals DiI of fluorescerende eiwitten zoals GFP helpen neuronen te visualiseren en postsynaptische stekels te karakteriseren. Wervelkolomanalyse maakt echter gebruik van door onderzoekers gedefinieerde verhoudingen om morfologie te bepalen, wat de reproduceerbaarheid kan verminderen7. Verder wordt nog steeds blootgelegd hoe de verschillende wervelkolomklassen zich verhouden tot functionele synapsen8. Wervelkolomvorming kan van voorbijgaande aard zijn en kan postsynaptische plasticiteit weerspiegelen, maar deze stekels kunnen worden geëlimineerd voordat ze stabiliseren in een synaps met een presynaptisch neuron9.
Colocalisatie biedt een betere proxy voor synapsen dan wervelkolomanalyse omdat men presynaptische en postsynaptische eiwitten kan immunostainen. Synaptische eiwitten kunnen echter lage colocalisatiewaarden opleveren omdat de eiwitten naast elkaar staan en mogelijk niet consistent overlappen. Dus, omdat de eiwitten niet volledig over elkaar heen liggen, kunnen colocalisatietechnieken veranderingen in synapsvorming niet nauwkeurig meten als gevolg van deze ontbrekende informatie. Ten slotte, hoewel zowel elektronenmicroscopie (EM) als arraytomografie beelden met hoge resolutie van synapsen bieden, zijn ze tijdrovend. EM vereist verder gespecialiseerde apparatuur en onderzoekers zijn beperkt tot kleine hoeveelheden weefsel voor een bepaald experiment. Hoewel arraytomografie elegant de mogelijkheid biedt om te screenen op veel eiwitten op ultradunne secties en kan worden gecombineerd met EM10, kan deze techniek te arbeidsintensief zijn en buiten het bereik van experimenten vallen die snel moeten scannen op veranderingen in synapsvorming.
DetectSyn is een specifieke toepassing van de Duolink Proximity Ligation Assay. De PLA-test maakt de algemene detectie van eiwit-eiwitinteracties mogelijk. DetectSyn overbrugt proxy postsynaptische metingen door een fluorescerend signaal te versterken dat wordt uitgezonden door gelabelde pre- en postsynaptische eiwitten binnen 40 nm van elkaar. Als de synaptische eiwitten zich binnen 40 nm bevinden, zoals in een synaptische spleet, dan zullen de secundaire antilichamen, die DNA-sondes bevatten, hybridiseren tot circulair DNA. Dit gehybridiseerde cirkelvormige DNA drukt een fluorescerende sonde uit, die vervolgens wordt versterkt en gedetecteerd met standaard fluorescerende microscopietechnieken (zie figuur 1). Cruciaal is dat deze techniek, in tegenstelling tot EM- en arraytomografie, geen gespecialiseerde apparatuur vereist en ongeveer evenveel tijd in beslag neemt als standaard immunohistochemie. De toegankelijkheid van deze techniek stelt onderzoekers buiten onderzoeksintensieve instellingen dus in staat om deel te nemen aan synaptopathologisch onderzoek. Verder kan deze techniek veranderingen in synaptische dichtheid in meerdere hersengebieden binnen één experiment onderzoeken, waardoor een meer holistische weergave van synaptische veranderingen als gevolg van ziekte of behandeling wordt geboden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Isolatie van cellen en weefsel van dieren was in overeenstemming met de Gids voor de Verzorging en het Gebruik van Proefdieren van de National Institutes of Health en goedgekeurd door de Wake Forest Institutional Animal Care and Use Committee
OPMERKING: Dit protocol wordt gebruikt op monsters die al zijn behandeld en vastgelegd volgens specifieke experimentele paradigma's en vereisten. Voor demonstratiedoeleinden wordt synapsvorming als gevolg van snelle antidepressieve behandeling gebruikt om deze synapsdetectietechniek te benadrukken6. Neuronen die eerder op coverslips zijn gekweekt, behandeld, gefixeerd in 4% paraformaldehyde (PFA) en opgeslagen in 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) zullen worden gebruikt om de in vitro procedures te benadrukken. Eerder gesneden hippocampusweefsel (25 μm dik) van behandelde muizen, transcardiaal geperfuseerd met ijskoude PBS en 4% PFA, en vervolgens opgeslagen in cryoprotectant zal worden gebruikt om de plakprocedures te markeren. Zie11,12 voor meer informatie over het kweken van neuronen of het transcardiaal perfuseren van knaagdieren. Zie figuur 1 voor een grafische weergave van deze procedure.
Figuur 1: Grafische weergave van DetectSyn assay. Na het permeabiliseren van celmembranen binden primaire antilichamen voor Synapsin1 en PSD95 zich aan deze synaptische eiwitten. Secondaries met oligonucleotide tags binden zich vervolgens aan de primaire antilichamen. Als Synapsin1 en PSD95 zich binnen 40 nm bevinden, zoals bij een synaps, dan interageren de oligonucleotiden en wordt een fluorescerende tag versterkt. Dit fluorescerende signaal kan vervolgens via standaardmicroscopie in beeld worden gebracht en geanalyseerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
1. Spoel monsters
- Spoel de monsters met 500 μL 1x PBS + 0,75% glycine gedurende 5 min 3 keer met voorzichtig roeren op een orbitale shaker om resterende PFA of cryoprotectant te verwijderen.
2. Blokkeer en permeabiliseer monsters
- Bereid een blokkerende en permeabilisatieoplossing (10% normaal ezelserum, 0,25% Tween 20) voor in 1x PBS. Bereid je voldoende voor om te gebruiken voor blokkerende, primaire en secundaire incubaties.
- Voeg aan monsters (bijv. coverslips of vrij zwevende plakjes) in 24 putplaten 500 μL blokkerings- en permeabilisatieoplossing toe. Zorg ervoor dat elke put een ander monster bevat en op de juiste manier is geëtiketteerd om te voorkomen dat monsters worden gewisseld.
- Incubeer de monsters bij kamertemperatuur (RT) gedurende 60 minuten voor gekweekte cellen of 2 uur voor gesneden weefsel. Gebruik een orbitale shaker voor zachte agitatie.
3. Incubate monsters in primaire antilichamen
- Bereid primaire antilichamen voor in blokkerende buffer:
- Bereid postsynaptische dichtheid 95 voor (PSD95; 1:500, konijn polyklonaal), Synapsin1 (1:500, muis monoklonaal), MAP2 (1:400, kip polyklonaal)
- Bereid een negatieve controle aliquot voor die een van de synaptische paren weglaat (bijvoorbeeld zonder PSD95)
- Verwijder de blokkerende oplossing voorzichtig met een plastic Pasteur-pipet. Probeer zoveel mogelijk te verwijderen zonder de cellen te storen of weefsel te scheuren.
- Voor gekweekte cellen:
- Bekleed een grote plastic petrischaal met parafilm. Breng de deklapjes voorzichtig over op de parafilm met behulp van een tang.
- Voeg voorzichtig 60 μL van de primaire antilichaamoplossing toe aan de bovenkant van de coverslips. Zorg ervoor dat u de primaire antilichaamoplossing niet over de zijkant van de deklip morst.
- Om vocht te bieden en te voorkomen dat monsters tijdens de incubatietijd uitdrogen, voegt u ultrapuur water toe aan een kleinere petrischaal en schikt u de kleine petrischaal voorzichtig rond de dekens.
- Bedek de grote petrischaal en incubeer gekweekte cellen gedurende 1 uur bij RT.
- Voor gesneden weefsel:
- Voeg voorzichtig 250 μL van de primaire antilichaamoplossing toe aan vrij zwevende plakjes in een plaat met 24 putjes.
- Bedek de plaat en incubeer het weefsel een nacht bij 4 °C met zachte agitatie op een orbitale shaker.
4. Was monsters en incubeer vervolgens in secundaire antilichamen
- Bereid secundaire antilichamen voor in de blokkerende buffer:
- Bereid Ezel anti-muis (1:5), ezel anti-konijn (1:5), ezel anti-kip (1:400).
- Bij deze stap kunnen aanvullende technische controles worden verkregen door een secundair aliquot voor te bereiden dat de anti-muis of anti-konijn secundair weglaat.
- Voor gekweekte cellen:
- Tik met een tang voorzichtig de primaire oplossing van de dekenslips op een papieren handdoek
- Breng met een tang de coverslips voorzichtig terug naar hun oorspronkelijke 24 putplaat gevuld met 500 μL 1x PBS.
- Voor gesneden weefsel:
- Verwijder voorzichtig de primaire antilichaamoplossing met een plastic Pasteur-pipet. Probeer zoveel mogelijk te verwijderen zonder weefsel te scheuren.
- Voeg 500 μL 1x PBS toe
- Was de monsters gedurende 10 min 3 keer in 1x PBS met zachte agitatie op een orbitale shaker. Breng gedurende deze tijd alle wasbuffers naar RT.
- Verander gedurende deze tijd de parafilm in de grote petrischaal
- Voor gekweekte cellen:
- Breng met een tang de deklapjes voorzichtig terug naar de geparafilmde grote petrischaal
- Voeg voorzichtig 40 μL van de secundaire antilichaamoplossing toe aan de bovenkant van de coverslips. Zorg ervoor dat u de secundaire antilichaamoplossing niet over de zijkant van de deklip morst.
- Voeg indien nodig meer ultrapuur water toe aan een kleinere petrischaal en schik de kleine petrischaal voorzichtig rond dekmantels.
- Dek de grote petrischaal af
- Voor gesneden weefsel:
- Voeg voorzichtig 250 μL van de secundaire antilichaamoplossing toe aan vrij zwevende plakjes in een plaat met 24 putjes.
- Dek de plaat af
OPMERKING: Bescherm vanaf hier monsters tegen licht door de bovenkanten van de platen met folie te wikkelen.
- Incubeer de monsters bij 37 °C gedurende 1 uur
5. Ligatie
- Meng de ligatievoorraad 1:5 in water van moleculaire kwaliteit.
- Breng, net als in rubriek 4, voorzichtig de coverslips over en verwijder het secundaire mengsel uit het gesneden weefsel.
- Was de monsters in 500 μL wasbuffer A
- Voor gekweekte cellen, was 2 keer gedurende 5 minuten. Voor gesneden weefsel, was 2 keer gedurende 10 minuten. Gebruik zachte agitatie op een orbitale shaker voor beide.
- Verander gedurende deze tijd de parafilm in de grote petrischaal
- Terwijl u de ligase op een koud blok houdt, verdunt u de ligase 1:40 in de ligatievoorraad vanaf stap 5.1. Voer deze verdunning onmiddellijk uit voordat u de ligase aan de monsters toevoegt.
- Verwijder net als in rubriek 4 zoveel mogelijk van de wasbuffer A uit monsters voordat u de ligase toevoegt.
- Voor gekweekte cellen: Breng coverslips terug naar de geparafilmde petrischaal. Voeg 40 μL van het ligatiemengsel toe aan coverslips, schik kleine met water gevulde petrischalen rond de coverslips en dek de grote petrischaal af.
- Voor gesneden weefsel: Voeg 250 μL van het ligatiemengsel uit stap 5.4 toe aan elke put en bedek de plaat.
- Incubeer de monsters gedurende 30 minuten bij 37 °C.
6. Versterking
- Meng de versterkingsvoorraad 1:5 in water van moleculaire kwaliteit.
- Breng, net als in rubriek 4, de coverslips voorzichtig over en verwijder het ligatiemengsel uit het gesneden weefsel.
- Wasmonsters in 500 μL wasbuffer A
- Voor gekweekte cellen, was 2 keer gedurende 2 min. Voor gesneden weefsel, was 2 keer gedurende 10 minuten. Gebruik zachte agitatie op een orbitale shaker voor beide.
- Verander gedurende deze tijd de parafilm in de grote petrischaal
- Voer deze verdunning uit onmiddellijk voordat u het polymerase aan monsters toevoegt. Terwijl u het polymerase op een koud blok houdt, verdunt u polymerase
- Voor gekweekte cellen, verdun polymerase 1:80 in de amplificatievoorraad uit stap 6.1.
- Voor gesneden weefsel, verdun polymerase 1:40 in de versterkingsvoorraad uit stap 6.1.
- Verwijder net als in stap 4 zoveel mogelijk van de wasbuffer A uit monsters voordat u het polymerase toevoegt.
- Voor gekweekte cellen: Breng de coverslips terug naar de geparafilmde petrischaal. Voeg 40 μL van het versterkingsmengsel uit stap 6.4.1 toe aan coverslips, schik kleine met water gevulde petrischaaltjes rond de coverslips en dek de grote petrischaal af. Incubeer de monsters gedurende 100 minuten bij 37 °C.
- Voor gesneden weefsel: Voeg 250 μL van het versterkingsmengsel uit stap 6.4.2 toe aan elke put en dek de plaat af. Incubeer de monsters gedurende 2 uur bij 37 °C.
OPMERKING: Bereid en label dia's gedurende deze tijd.
7. Montage
- Net als in stap 4, breng de coverslips voorzichtig over en verwijder het versterkingsmengsel uit het gesneden weefsel.
- Was de monsters gedurende 10 minuten 2 keer in 500 μL wasbuffer B met voorzichtig roeren op een orbitale shaker.
- Was de monsters gedurende 1 minuut in 500 μL van 1% wasbuffer B met voorzichtig roeren op een orbitale shaker.
- Voor gekweekte cellen:
- Laat 3 μL montagemedia op een dia vallen
- Tik overtollige wasbuffer van de afdekplaat af en plaats vervolgens de afdekplaat (met cellen naar beneden gericht) in de montagemedia. Sluit de zijkanten af met een kleine hoeveelheid doorzichtige nagellak om de dekenslip op zijn plaats te verzegelen.
- Voor gesneden weefsel:
- Breng voorzichtig een plakje weefsel over op de voorbereide dia en schik het, zodat het plakje plat ligt. Laat tussen 5-10 μL montagemedia (hoeveelheid is afhankelijk van de grootte van de plak) op de plak van het weefsel vallen
- Plaats voorzichtig een glazen afdekplaat over de plak tissues en sluit af met een kleine hoeveelheid heldere nagellak langs de rand om de dekzeil op zijn plaats te sluiten.
- Wacht ten minste 15 minuten voordat u onder de microscoop analyseert of bewaar bij -20 °C.
8. Verkrijg digitale beelden met een confocale microscoop
- Optimaliseer de acquisitie-instellingen (bijv. laservermogen, versterking, offset) voor monsters van alle behandelingen. Zorg ervoor dat de optimalisatie het verminderen van achtergrondruis en het verbeteren van het signaal omvat zonder de intensiteit van de fluorescerende signalen te oververzadigen. Zodra de instellingen zijn bepaald, past u dezelfde acquisitie-instellingen toe op alle verkregen afbeeldingen.
OPMERKING: De volgende acquisitiegegevens kunnen worden gebruikt met een Nikon A1 confocale microscoop en de Nikon NIS AR Elements-software. - Plaats de dia met monster op het podium en zoek het brandpuntsvlak voor het monster met behulp van DAPI door het oculair.
- Schakel de oogpoort uit door op Oogpoort te klikken en kies een optische configuratieknop om de instellingen aan te passen.
- Pas de versterking, offset en laservermogen voor elk fluorescerend kanaal aan om achtergrondruis te verminderen en het fluorescerende signaal te verbeteren. Zorg ervoor dat het fluorescerende signaal niet oververzadigd raakt, zoals vermeld in stappen 8.5-8.6.
- Controleer oververzadiging met behulp van een pseudokleur voor het fluorescerende signaal. Klik onder aan de live-afbeelding met de rechtermuisknop op het tabblad met het fluorescerende kanaal dat momenteel wordt gebruikt.
- Kies vervolgens Kanaalkleuring en kies een pseudokleur zoals Rainbow Dark om de fluorescentie-intensiteit te visualiseren in een heat-map-achtige pseudokleur. In Rainbow Dark geven koelere kleuren minder fluorescerende intensiteit aan en hetere kleuren duiden op meer fluorescerende intensiteit.
- Zodra alle fluorescerende kanalen zijn geoptimaliseerd, klikt u met de rechtermuisknop op de eerder gekozen optische configuratieknop en kiest u Huidige camera-instelling toewijzen voor deze knop.
- Controleer of de gekozen instellingen voldoende zijn voor een aselecte steekproef uit elke behandelingsgroep. Als de gekozen instellingen een van deze voorbeelden oververzadigen, herhaalt u stap 8.4 om de oververzadiging te elimineren.
- Voor gekweekte neuronen volgt u stappen 8.10-8.16.
- Zoek met behulp van de oogpoort naar een neuron met dendrieten die minimale overlap hebben met andere dendrieten.
- Schakel de oogpoort uit en gebruik het DAPI-kanaal om het cellichaam van het gekozen neuron te visualiseren. Dubbelklik op het midden van de soma om het neuron in het midden van het gezichtsveld te centreren.
- Zoek met behulp van het MAP2-kanaal het beste scherpstelvlak voor het MAP2-signaal met live scannen.
- Klik op het tabblad ND-acquisitie op Opslaan in bestand en kies een bestand om de afbeelding in op te slaan onder Bladeren. Voer vervolgens de bestandsnaam in.
- Selecteer op het tabblad Z de optie Symmetrische modus gedefinieerd door bereik . Stel de focus in op het beste MAP2-vlak en klik op de knop Relatief om dit brandpuntsvlak in te stellen als het midden van de z-stack.
- Stel het bereik in op 5 μm met stappen van 1 μm en zorg ervoor dat u Actieve sluiter sluiten tijdens Z-beweging aanvinkt. Selecteer op het tabblad Golflengte de naam van de optische knop met de eerder geconfigureerde acquisitie-instellingen onder Optical Conf. Klik vervolgens op Nu uitvoeren.
- Herhaal stap 8.1.10-8.1.15 voor ongeveer 10 neuronen per coverslip/behandeling.
- Voor gesneden weefsel volgt u de stappen 8.18-8.22.
- Zoek met behulp van de eye-port naar de regio van belang. Lokaliseer bijvoorbeeld CA1 van de hippocampus.
- Schakel de oogpoort uit en gebruik het MAP2-kanaal om het beste scherpstelvlak voor het MAP2-signaal te vinden met live scannen.
- Kies in het menu Acquire de optie Grote afbeelding scannen. Selecteer vervolgens de naam van de optische knop met de eerder geconfigureerde acquisitie-instellingen onder het deelvenster Vastleggen in het deelvenster dat wordt geopend. Zorg er ook voor dat u de juiste doelstelling in dit deelvenster selecteert.
- Gebruik onder het deelvenster Gebied en het oculair de pijltoetsen om de grenzen van het betreffende gebied in te stellen. Klik vervolgens op Grote afbeelding opslaan in bestand en maak een bestandsnaam voor het opslagpad voor de afbeelding.
- Controleer in het deelvenster Instellen of Multichannel Capture is ingeschakeld en kies vervolgens de naam van de optische knop met de eerder geconfigureerde acquisitie-instellingen onder Optical Conf.
OPMERKING: Een z-stack voor een grote afbeelding is mogelijk, maar zal de scantijd verlengen.
9. Analyse
- Gebruik, net als bij acquisitie-instellingen, monsters van alle behandelingen om drempelinstellingen te optimaliseren. Zorg ervoor dat de drempeloptimalisatie zich richt op het verminderen van achtergrondruis en het verbeteren van het signaal zonder de intensiteit van de fluorescerende signalen te oververzadigen. Zodra deze instellingen zijn bepaald, past u dezelfde drempelinstellingen toe op alle afbeeldingen die voor analyse worden gebruikt, zoals beschreven in stap 9.2-9.3.
- In ImageJ bevindt de drempeloptie zich onder het menu Afbeelding > > drempel aanpassen. Kies de optie Donkere achtergrond als de afbeelding een donkere achtergrond heeft.
- Pas vervolgens de boven- en ondergrenzen van de drempel aan per vooraf bepaalde geoptimaliseerde drempelinstellingen en klik vervolgens op Toepassen.
- Gebruik voor gekweekte cellen het MAP2-kanaal en een freehand region of interest (ROI) -tool om een ROI te trekken voor elk neuron, inclusief dendrieten en soma. Teken voor gesneden weefsel een ROI uit de vrije hand in de segmentafbeelding die het interessegebied inkapselt (bijvoorbeeld stratum radiatum van de CA1 in de hippocampus).
- Verkrijg het gebied van de ROI. Meet in AfbeeldingJ het gebied onder het menu Analyseren > meten.
- Detecteer het aantal puncta binnen elke ROI met behulp van een automatische detectietool zoals Deeltjesanalyse in ImageJ volgens stap 9.7-9.9.
- Zoek de optie Deeltjesanalyse onder het menu Analyseren > Deeltjes analyseren. Definieer eerst de puncta-groottediameter, meestal 0,1-3 μm2.
- Kies vervolgens de optie Overlaymaskers in het vervolgkeuzemenu Weergeven en vink de optie Resultaten weergeven aan. Klik vervolgens op OK.
- Als puncta niet worden gedetecteerd met het gekozen diameterbereik, past u het bereik aan totdat alle puncta met deze analyse zijn gedetecteerd. Zorg ervoor dat u dezelfde deeltjesanalyse-instellingen gebruikt voor alle afbeeldingen.
- Deel het aantal puncta door het gebied van een afzonderlijke interesseregio door de stappen 9.11-9.13 te volgen.
- Kopieer en plak de resultaten voor elke afbeelding uit het pop-upvenster Resultaten van ImageJ in een spreadsheet.
- Bepaal eerst uit welk bestand en monster de gegevens zijn verkregen. Deel vervolgens het gebied van de ROI door het aantal puncta.
- Wis vervolgens de gegevens uit het pop-upvenster Resultaten en herhaal stap 9.2-9.12.
- Resultaten normaliseren om monsters te controleren: Gemiddelde van de resultaten (aantal puncta/ROI-gebied) voor de controlemonsters. Deel vervolgens de verkregen resultaten van alle monsters door het gemiddelde van de controle om de genormaliseerde resultaten te verkrijgen. Het nieuwe gemiddelde van de controlemonsters moet gelijk zijn aan 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Gegevens die zijn gewijzigd van Heaney et al.6 worden gepresenteerd om een experiment aan te tonen waarbij verhoogde synapsvorming wordt verwacht (zie6 voor meer informatie en een meer diepgaande bespreking van het mechanisme). Eerder werd aangetoond dat snelle antidepressiva activering van de remmende metabotrope receptor, GABAB (gamma-aminoboterzuur subtype B), vereisen om effectief te zijn13. Verder gaven eerdere gegevens aan dat snelle antidepressiva postsynaptische markers verhogen14; zo werd DetectSyn gebruikt om de hypothese te testen dat snelle antidepressiva het aantal synapsen verhogen om effectief te zijn.
In gekweekte neuronen worden vier aandoeningen getest. Ten eerste werden in het bovenste paneel van figuur 2A gekweekte neuronen behandeld met het voertuig onder dezelfde omstandigheden als de experimentele controle. Het primaire PSD95-antilichaam wordt echter weggelaten om een technische controle te bieden voor de DetectSyn-test (zie figuur 1 voor hoe elke component bijdraagt aan het signaal). Vervolgens worden neuronen in het configuratiescherm opnieuw behandeld met het voertuig, maar krijgen ze zowel PSD95- als Synapsin1-primaries. Vervolgens worden gekweekte neuronen alleen behandeld met het snelle antidepressivum Ro-25-6981 (Ro) of Ro plus de GABAB-agonist, baclofen (Bac). Zoals eerder aangetoond13, zijn zowel het snelle antidepressivum Ro-25-6981 als de GABAB-agonist baclofen nodig voor de in vitro werkzaamheid van Ro-25-6981. Een toename van synapsvorming wordt dus aangetoond door een toename van witte puncta (figuur 2A). Zonder baclofen wordt geen toename van synapsvorming in vitro waargenomen.
In vivo zijn basale GABA-niveaus voldoende om het snelle antidepressivum te laten werken13, dus alleen het snelle antidepressivum Ro-25-6981 wordt toegediend via intraperitoneale injectie aan muizen (figuur 2B). Het linkerpaneel van Fig. 2B vertegenwoordigt een andere technische controle voor de DetectSyn-test. Hippocampusweefsel van een met zoutoplossing behandelde muis werd onderzocht met beide primaries voor PSD95 en Synapsin1, maar een van de secondaries werd weggelaten. Een toename van synapsvorming als gevolg van behandeling met het snelle antidepressivum Ro-25-6981 in vergelijking met met zoutoplossing behandelde muizen wordt aangetoond in de middelste en rechterpanelen van figuur 2B.
Representatieve beelden voor technische controles in vitro en ex vivo worden getoond. In figuur 2A wordt een van de primaries voor de synaptische paren weggelaten (d.w.z. PSD95) en in figuur 2B wordt een van de secondanten weggelaten. Hoewel sommige puncta in de technische controlebeelden voorkomen, zijn ze over het algemeen niet even groot, zoals blijkt uit het witte stipje in het bovenpaneel van figuur 2A in vergelijking met de grote puncta in de andere panelen. Bovendien bevinden deze puncta zich niet op dezelfde plaats als de gekwantificeerde puncta, zoals blijkt uit enkele puncta's die voorkomen in de soma van de technische controle in figuur 2B. Typisch, niet-specifieke puncta komen voor in de kernen, misschien als gevolg van de aanwezigheid van DNA.
Om de representatieve resultaten in figuur 2A te analyseren, werden dendrieten (gevisualiseerd door MAP2-kleuring en hier weergegeven in een grijze omtrek) getraceerd met behulp van een tekengereedschap uit de vrije hand om interessegebieden (ROI's) te maken. Eerst werd het gebied van de MAP2-ROI's verkregen met behulp van de NIS Elements-functie, ROI-gegevens onder het tabblad Geautomatiseerde meetresultaten . Vervolgens werden puncta gedetecteerd met behulp van de thresholding-functie in NIS Elements. Met deze functie maakt u een binair masker van objecten die binnen een gedefinieerde intensiteitsdrempel vallen. Vervolgens is het aantal binaire objecten binnen de MAP2-ROM's gedetecteerd met behulp van de nis-elementenfunctie Binair in ROI onder het tabblad Geautomatiseerde meetresultaten . De gegevens in de grafiek rechts van figuur 2A zijn de genormaliseerde waarden van de puncta gedeeld door het gebied van de ROI.
Om de representatieve resultaten in figuur 2B te analyseren, werd het stratum radiatum van de CA1 getraceerd met behulp van een tekengereedschap uit de vrije hand om een ROI te creëren. Ten eerste werd het gebied van de ROI verkregen met behulp van de ROI-gegevensfunctie, zoals beschreven in de bovenstaande paragraaf. Vervolgens werden puncta gedetecteerd met behulp van de spotdetectie - heldere vlekkenfunctie , die zich onder het binaire menu bevindt. Vervolgens werden de diameter- en contrastwaarden gekozen op basis van visuele inspectie van meerdere segmenten uit alle behandelingen. Zodra deze waarden waren vastgesteld, werden ze uniform toegepast op alle geanalyseerde afbeeldingen. Met de functie Spotdetectie maakt u binaire maskers van objecten binnen de gedefinieerde diameter en de ingestelde contrastparameters. Vervolgens is het aantal binaire objecten binnen de MAP2-ROM's gedetecteerd met behulp van de nis-elementenfunctie Binair in ROI onder het tabblad Geautomatiseerde meetresultaten . De gegevens in de grafiek rechts van figuur 2B zijn de genormaliseerde waarden van de puncta gedeeld door het gebied van de ROI.
Figuur 2: Detectie van synapsen met behulp van DetectSyn assay. Witte puncta vertegenwoordigen synapsen gedetecteerd met DetectSyn PSD95-Synapsin1 proximity ligation assay (gele pijlpunten) in (A) in vitro gekweekte primaire hippocampale neuronen en (B) ex vivo CA1 stratum radiatum. In (A) vertegenwoordigt de grijze omtrek MAP2-kleuring. In (A) vertegenwoordigt het bovenpaneel met het label PLA-besturing monsters die alleen met een voertuig zijn behandeld, zoals de Control. De PSD95 primary werd echter niet meegenomen in de reactie. In de laatste twee panels werden neuronen behandeld met het snelle antidepressivum Ro-25-6981 (Ro, 10 μM) of Ro plus de GABAB-agonist baclofen (Bac, 50 μM) gedurende 90 minuten. Het toegenomen aantal puncta (geïdentificeerd met gele pijlpunten) geeft aan dat in vitro de vorming van synapsen alleen toeneemt wanneer het snelle antidepressivum Ro-25-6981 wordt toegediend met de GABAB-agonist. In (B) staat groen voor dendrieten gekleurd met MAP2 en blauw voor kernen gekleurd met DAPI. Enkele dendrieten, omlijnd in gele rechthoeken in de samengevoegde afbeeldingen, worden geïsoleerd onder representatieve afbeeldingen om aan te tonen dat puncta lokaliseren naar dendrieten. De dieren werden behandeld met Ro-25-6981 (10 mg/kg) en 45 minuten na de behandeling werd weefsel verzameld. Het toegenomen aantal puncta (geïdentificeerd door gele pijlpunten) geeft aan dat in vivo het aantal synapsen toeneemt met basale GABA-signalering en het snelle antidepressivum Ro-25-6981. Kwantificering van representatieve resultaten wordt weergegeven door de staafdiagrammen en geeft het gemiddelde aantal DetectSyn puncta gedeeld door MAP2-gebied aan. De resultaten worden genormaliseerd naar de experimentele controle. Beelden werden verkregen met behulp van een Nikon A1plus confocale microscoop. Schaalbalken = (A) 10 μm; (B, boven) 50 μm; (B, onder) 5 μm. Balken vertegenwoordigen de gemiddelde +/- standaardfout van het gemiddelde. Resultaten geanalyseerd door eenrichtings-ANOVA: * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001, **** p < 0,0001 door post-hoc analyse. De figuur is aangepast van Heaney et al.6. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
DetectSyn is een snelle test die een nabijheidsligatietest gebruikt om eiwitten binnen 40 nm van elkaar te detecteren, wat de detectie van synapsvorming mogelijk maakt. Deze techniek verbetert de huidige fluorescerende assays, die alleen dienen als proxy-metingen voor synapsvorming. DetectSyn detecteert kwantificeerbare veranderingen in synaptische eiwitten gelokaliseerd binnen 40 nm, d.w.z. binnen de synaptische spleet, van elkaar. Verder is DetectSyn kosteneffectiever en kost het minder tijd dan technieken, zoals elektronenmicroscopie en arraytomografie, ontworpen om synapsen te meten en klassiek aangeduid als gouden standaardtechnieken.
DetectSyn is een zeer aanpasbare techniek. Elk synaptisch paar kan worden gebruikt om de vorming van specifieke soorten synapsen te identificeren, zolang het eiwitpaar zich binnen 40 nm van elkaar bevindt. Hoewel deze opwindende techniek veel toepassingen heeft, moet men ervoor zorgen dat antilichamen worden gevalideerd, inclusief optimale blokkering en primaire incubatieomstandigheden, en hun resultaten blijven ondersteunen met behulp van andere methoden zoals immunofluorescentie. Er wordt voorgesteld om deze ondersteunende experimenten uit te voeren in afzonderlijke experimenten die DetectSyn niet gebruiken om de antilichaambindingsconcurrentie te verminderen (bijvoorbeeld, het gebruik van geiten-anti-PSD95 en muis-anti-PSD95 in hetzelfde experiment kan de binding als gevolg van concurrentie verminderen). Zorg er bovendien voor dat u primaire antilichamen kiest die in verschillende gastheren zijn grootgebracht, bijvoorbeeld geitenanti-PSD95 en konijn-anti-synapsine1. Als dezelfde gastheer voor beide voorverkiezingen wordt gebruikt, zullen de secundaire sondes geen onderscheid maken tussen de twee voorverkiezingen.
Verder, omdat nabijheidsligatie een versterkingsstap heeft, is er beperkte informatie die men kan putten uit de resulterende puncta. Er worden bijvoorbeeld puncta van verschillende grootte waargenomen (duidelijk in figuur 2B), wat wijst op een verandering in synapsgrootte of meerdere synapsen die in hetzelfde gebied worden gerekruteerd. Hoewel elk monster binnen een experiment dezelfde omstandigheden ondergaat, maakt de versterkingsstap het moeilijk om deze conclusies categorisch te trekken.
Ten slotte omvatten kritieke stappen voor dit protocol ervoor te zorgen dat de ligase en polymerase op een ijsblok blijven en zo snel mogelijk aan monsters worden toegevoegd. Bovendien zal het opnemen van technische controles helpen identificeren waar niet-specifieke puncta in een bepaald experiment kan voorkomen. Bijvoorbeeld, zoals te zien is in figuur 2B, worden puncta in kernen gezien in technische controles. Het is dus van cruciaal belang om negatieve of technische controles op te nemen om ervoor te zorgen dat het signaal dat in experimentele monsters wordt gedetecteerd, groter is dan het signaal dat in deze controles wordt waargenomen. Meestal worden deze technische controles verkregen door een van de primaire of secundaire paren weg te laten. Zorg er ten slotte voor dat de incubatietemperatuur 37 °C is, te beginnen bij de secundaire stap.
Belangrijk is dat DetectSyn een toegankelijke manier biedt voor bijna elk laboratorium met toegang tot een standaard fluorescerende microscoop, ongeacht technische ervaring, om synaptopathologieën te bestuderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs melden geen belangenverstrengeling.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door national institutes of health NINDS R01 NS105005 (KRG) en NS105005-03S1 (KRG), Department of Defense USAMRMC W81XWH-14-1-0061 (KRG), NIAAA R01AA016852, NIAAA T32AA007565 (CFH), en een subsidie van FRAXA Research (CFH) en de Alzheimer's Association, AARG-NTF-21-852843 (KRG), AARF-19-614794-RAPID (KRG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x PBS | Fisher Scientific | BP39920 | PBS made in house works, as well. |
| 24 well plates | Fisher Scientific | FB012929 | For tissue slices, pre-sterilized plates may be unnecessary. |
| 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Aluminium foil | Fisher Scientific | 15-078-290 | |
| Chicken anti-MAP2 antibody | Abcam | ab5392 | |
| Clear nail polish | Fisher Scientific | NC1849418 | Other clear nail polish works, as well. |
| Cold block | Fisher Scientific | 13131012 | |
| Computer workstation | HP | ||
| Confocal or fluorescent microscope | Nikon | A1R HD25 | |
| Donkey anti-chicken FITC | Fisher Scientific | SA1-72000 | |
| Duolink donkey anti-Mouse PLUS | Sigma | DUO92001 | |
| Duolink donkey anti-Rabbit MINUS | Sigma | DUO92005 | |
| Duolink In Situ Detection Reagents Far Red | Sigma | DUO92013 | Contains ligation stock, amplification stock, ligase, and polymerase. |
| Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI | Sigma | DUO82040 | |
| Duolink In Situ Wash Buffers, Fluorescence | Sigma | DUO82049 | Contains Wash Buffer A and Wash Buffer B; dilute Wash Buffer B to 1% in diH20 for 1% Wash Buffer B. |
| Fine-tipped paintbrush | Fisher Scientific | NC9691026 | Sable hair, size 00 or 000, can also find at craft stores |
| Fisherbrand Cover Glasses: Rectangles | Fisher Scientific | 12545MP | Cover glass is unnecessary for cultured neurons already on glass coverslips. |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 1255015 | For cultured neurons already on glass coverslips, Superfrost slides may be unnecessary. |
| Freezer, -20°C | VWR | 76449-108 | |
| Glass coverslips | Fisher Scientific | 125480 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-1 | |
| Image processing software | e.g. NIS Elements, ImageJ | ||
| Incubator | Fisher Scientific | 15-015-2633 | |
| Large petri dish, 100mm | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Molecular grade water | Fisher Scientific | BP24701 | |
| Mouse anti-Synapsin1 antibody | Synaptic Systems | 106-011 | |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Orbital shaker | Fisher Scientific | 02-106-1013 | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-10 | |
| Pipette tips | Fisher Scientific | 02-707-025 | |
| Pipettes | Fisher Scientific | 14-388-100 | Working volumes range from 3 µL to 500 µL |
| Plastic pasteur pipette | Fisher Scientific | 02-708-006 | |
| Precision tweezers/foreceps | Fisher Scientific | 12-000-122 | |
| Rabbit anti-PSD95 antibody | Abcam | ab18258 | Other antibody pairs may work, as well, with optimization. |
| Refrigerator | VWR | 76470-402 | |
| Small petri dish, 60 mm | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Timer | Fisher Scientific | 14-649-17 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 |
References
- Südhof, T. C. Towards an understanding of synapse formation. Neuron. 100 (2), 276-293 (2018).
- Bliss, T. V., Collingridge, G. L. A synaptic model of memory: long-term potentiation in the hippocampus. Nature. 361 (6407), 31-39 (1993).
- Heaney, C. F., Raab-Graham, K. F. Dysregulated protein synthesis in major depressive disorder. The Oxford Handbook of Neuronal Protein Synthesis. , Oxford University Press. NY. 510-532 (2018).
- Masliah, E., Crews, L., Hansen, L. Synaptic remodeling during aging and in Alzheimer's disease. Journal of Alzheimer's Disease. 9, 91-99 (2006).
- van Spronsen, M., Hoogenraad, C. C. Synapse pathology in psychiatric and neurologic disease. Current Neurology and Neuroscience Reports. 10 (3), 207-214 (2010).
- Heaney, C. F., Namjoshi, S. V., Uneri, A., Bach, E. C., Weiner, J. L., Raab-Graham, K. F. Role of FMRP in rapid antidepressant effects and synapse regulation. Molecular Psychiatry. 26 (6), 2350-2362 (2021).
- Pchitskaya, E., Bezprozvanny, I. Dendritic spines shape analysis-Classification or clusterization? Perspective. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 12, 31 (2020).
- Alvarez, V. A., Sabatini, B. L. Anatomical and physiological plasticity of dendritic spines. Annual Review of Neuroscience. 30 (1), 79-97 (2007).
- Berry, K. P., Nedivi, E. Spine Dynamics: Are they all the same. Neuron. 96 (1), 43-55 (2017).
- Micheva, K. D., Smith, S. J. Array tomography: A new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits. Neuron. 55 (1), 25-36 (2007).
- Kaech, S., Banker, G.
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e3564 (2012).
- Workman, E. R., Niere, F., Raab-Graham, K. F. mTORC1-dependent protein synthesis underlying rapid antidepressant effect requires GABABR signaling. Neuropharmacology. 73, 192-203 (2013).
- Li, N., et al. mTOR-dependent synapse formation underlies the rapid antidepressant effects of NMDA antagonists. Science. 329 (5994), 959-964 (2010).
