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Biochemistry

DetectSyn: Synapse घनत्व में परिवर्तन का पता लगाने के लिए एक त्वरित, निष्पक्ष फ्लोरोसेंट विधि

Published: July 22, 2022 doi: 10.3791/63139
Automatic Translation
1,2, 2, 1,2
1Wake Forest Translational Alcohol Research Center, Wake Forest School of Medicine, 2Physiology and Pharmacology, Wake Forest School of Medicine

Summary

DetectSyn एक निष्पक्ष, तेजी से फ्लोरोसेंट परख है कि उपचार या रोग राज्यों भर में रिश्तेदार synapse (पूर्व और postsynaptic सगाई) संख्या में परिवर्तन को मापता है. यह तकनीक एक निकटता बंधन तकनीक का उपयोग करती है जिसका उपयोग सुसंस्कृत न्यूरॉन्स और निश्चित ऊतक दोनों में किया जा सकता है।

Abstract

Synapses न्यूरॉन्स के बीच संचार की साइट हैं। न्यूरोनल सर्किट ताकत सिनैप्टिक घनत्व से संबंधित है, और synapses का टूटना प्रमुख अवसादग्रस्तता विकार (एमडीडी) और अल्जाइमर रोग जैसे रोग राज्यों की विशेषता है। Synapse संख्याओं की जांच करने के लिए पारंपरिक तकनीकों में फ्लोरोसेंट मार्करों की आनुवंशिक अभिव्यक्ति (उदाहरण के लिए, हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP)), रंजक जो एक न्यूरॉन (जैसे, कार्बोसाइनिन डाई, DiI) को भरते हैं, और रीढ़ मार्करों का इम्यूनोफ्लोरोसेंट डिटेक्शन (उदाहरण के लिए, पोस्टसिनेप्टिक घनत्व 95 (PSD95)) शामिल हैं। इन प्रॉक्सी तकनीकों के लिए एक प्रमुख चेतावनी यह है कि वे केवल पोस्टसिनेप्टिक परिवर्तनों की पहचान करते हैं। फिर भी, एक synapse एक presynaptic टर्मिनल और एक postsynaptic रीढ़ के बीच एक कनेक्शन है। सिनैप्स गठन / उन्मूलन को मापने के लिए सोने के मानक को समय लेने वाली इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी या सरणी टोमोग्राफी तकनीकों की आवश्यकता होती है। इन तकनीकों के लिए विशेष प्रशिक्षण और महंगे उपकरणों की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, केवल सीमित संख्या में न्यूरॉन्स का मूल्यांकन किया जा सकता है और इसका उपयोग पूरे मस्तिष्क क्षेत्र में परिवर्तनों का प्रतिनिधित्व करने के लिए किया जाता है। DetectSyn एक तेजी से फ्लोरोसेंट तकनीक है जो एक रोग की स्थिति या दवा गतिविधि के कारण synapse गठन या उन्मूलन में परिवर्तन की पहचान करती है। DetectSyn एक तेजी से निकटता बंधाव परख का उपयोग करता है juxtaposed पूर्व और postsynaptic प्रोटीन और मानक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी का पता लगाने के लिए, एक तकनीक आसानी से सबसे प्रयोगशालाओं के लिए उपलब्ध है. परिणामी puncta के फ्लोरोसेंट पता लगाने प्रयोगों के त्वरित और निष्पक्ष विश्लेषण के लिए अनुमति देता है. DetectSyn इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी की तुलना में अधिक प्रतिनिधि परिणाम प्रदान करता है क्योंकि फ्लोरोसेंट न्यूरॉन्स की सीमित संख्या की तुलना में बड़े क्षेत्रों का विश्लेषण किया जा सकता है। इसके अलावा, DetectSyn इन विट्रो सुसंस्कृत न्यूरॉन्स और निश्चित ऊतक स्लाइस के लिए काम करता है। अंत में, इस तकनीक से एकत्र किए गए डेटा का विश्लेषण करने के लिए एक विधि प्रदान की जाती है। कुल मिलाकर, DetectSyn उपचार या रोग राज्यों में synapse घनत्व में सापेक्ष परिवर्तन का पता लगाने के लिए एक प्रक्रिया प्रदान करता है और पारंपरिक तकनीकों की तुलना में अधिक सुलभ है।

Introduction

Synapses न्यूरॉन्स1 के बीच संचार की मौलिक इकाई हैं। एक ही क्षेत्र के भीतर न्यूरॉन्स के बीच कई synapses सर्किट है कि मध्यस्थता व्यवहार2 को जन्म देते हैं. Synapses एक न्यूरॉन से एक presynaptic टर्मिनल से मिलकर बनता है जो न्यूरोट्रांसमीटर या न्यूरोपेप्टाइड्स जारी करता है जो किसी अन्य न्यूरॉन के पोस्टसिनेप्टिक रिसेप्टर्स को जानकारी रिले करता है। प्रीसिनेप्टिक संकेतों का योग यह निर्धारित करता है कि क्या पोस्टसिनेप्टिक न्यूरॉन एक एक्शन पोटेंशियल को आग लगाएगा और संदेश को अन्य न्यूरॉन्स को प्रचारित करेगा।

Synaptopathology, synapses का टूटना, बीमारियों और विकारों में उत्पन्न होता है जो अल्जाइमर रोग और प्रमुख अवसादग्रस्तता विकार जैसे कम तंत्रिका मात्रा से चिह्नित होते हैं, जिसके परिणामस्वरूप सर्किट होते हैं जो अब 3,4,5 का प्रदर्शन नहीं करते हैं। Synapse घनत्व बहाल करने की संभावना इन विकारों के लिए संभावित उपचार की प्रभावकारिता underlies. उदाहरण के लिए, यह हाल ही में प्रदर्शित किया गया था कि synapses में वृद्धि तेजी से antidepressants6 की व्यवहारिक प्रभावकारिता underlies. तेजी से संभव synaptopathology उपचार स्क्रीन करने के लिए, शोधकर्ताओं को तकनीकों की आवश्यकता होती है जो जल्दी से synapse संख्याओं में परिवर्तन की पहचान करते हैं।

वर्तमान तरीके या तो समय लेने वाली और महंगी हैं (इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, सरणी टोमोग्राफी), या वे केवल प्रीसिनैप्टिक सगाई (रीढ़ का विश्लेषण, इम्यूनोफ्लोरेसेंस / कोलोकलाइजेशन) को शामिल किए बिना पोस्टसिनेप्टिक परिवर्तनों की जांच करते हैं। डीआईआई या जीएफपी जैसे फ्लोरोसेंट प्रोटीन जैसे रंजक न्यूरॉन्स की कल्पना करने में मदद करते हैं और पोस्टसिनेप्टिक स्पाइन को चिह्नित करते हैं। हालांकि, रीढ़ का विश्लेषण आकृति विज्ञान को निर्धारित करने के लिए शोधकर्ता-परिभाषित अनुपात का उपयोग करता है, जो पुनरुत्पादन क्षमता को कम कर सकताहै 7। इसके अलावा, विभिन्न रीढ़ की हड्डी कक्षाएं कार्यात्मक synapses से कैसे संबंधित हैं, यह अभी भी उजागर किया जा रहा है8। रीढ़ की हड्डी का गठन क्षणिक हो सकता है और पोस्टसिनेप्टिक प्लास्टिसिटी को प्रतिबिंबित कर सकता है, लेकिन इन रीढ़ को प्रीसिनैप्टिक न्यूरॉन 9 के साथ एक सिनैप्स में स्थिर करने से पहले समाप्त किया जा सकताहै।

Colocalization रीढ़ की हड्डी के विश्लेषण की तुलना में synapses के लिए एक बेहतर प्रॉक्सी प्रदान करता है क्योंकि कोई भी प्रीसिनेप्टिक और पोस्टसिनेप्टिक प्रोटीन के लिए immunostain कर सकता है। हालांकि, सिनैप्टिक प्रोटीन कम कोलोकलाइजेशन मूल्यों को उत्पन्न कर सकते हैं क्योंकि प्रोटीन जुदा होता है और लगातार ओवरलैप नहीं हो सकता है। इस प्रकार, क्योंकि प्रोटीन पूरी तरह से अतिरंजित नहीं हैं, इसलिए कोलोकलाइजेशन तकनीकइस लापता जानकारी के कारण सिनैप्स गठन में परिवर्तनों को सटीक रूप से माप नहीं सकती है। अंत में, हालांकि इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएम) और सरणी टोमोग्राफी दोनों synapses की उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवियां प्रदान करते हैं, वे समय लेने वाले हैं। ईएम को आगे विशेष उपकरणों की आवश्यकता होती है, और शोधकर्ता किसी भी दिए गए प्रयोग के लिए ऊतक की छोटी मात्रा तक सीमित होते हैं। जबकि सरणी टोमोग्राफी सुरुचिपूर्ण रूप से अल्ट्राथिन वर्गों पर कई प्रोटीनों के लिए स्क्रीन करने की क्षमता प्रदान करती है और ईएम10 के साथ संयुक्त की जा सकती है, यह तकनीक बहुत श्रम-गहन और प्रयोगों के दायरे से परे हो सकती है जिन्हें सिनैप्स गठन में परिवर्तन के लिए तेजी से स्कैन करने की आवश्यकता होती है।

DetectSyn Duolink निकटता बंधाव परख का एक विशिष्ट आवेदन है. पीएलए परख प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन का सामान्य पता लगाने के लिए अनुमति देता है। डिटेक्टसिन पुलों प्रॉक्सी postsynaptic उपायों को एक दूसरे के 40 एनएम के भीतर टैग पूर्व और postsynaptic प्रोटीन टैग द्वारा उत्सर्जित एक फ्लोरोसेंट संकेत को बढ़ाने के द्वारा उपायों. यदि सिनैप्टिक प्रोटीन 40 एनएम के भीतर हैं, जैसा कि एक सिनैप्टिक फांक के भीतर है, तो द्वितीयक एंटीबॉडी, जिसमें डीएनए जांच होती है, परिपत्र डीएनए में संकरित हो जाएगी। यह संकरित परिपत्र डीएनए एक फ्लोरोसेंट जांच को व्यक्त करता है, जिसे तब मानक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी तकनीकों के साथ प्रवर्धित और पता लगाया जाता है ( चित्रा 1 देखें)। महत्वपूर्ण रूप से, ईएम और सरणी टोमोग्राफी के विपरीत, इस तकनीक को विशेष उपकरणों की आवश्यकता नहीं होती है और मानक इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के समान समय लगता है। इस तकनीक की पहुंच, इस प्रकार, अनुसंधान-गहन संस्थानों के बाहर के जांचकर्ताओं को सिनैप्टोपैथोलॉजी अनुसंधान में भाग लेने में सक्षम बनाती है। इसके अलावा, यह तकनीक एक ही प्रयोग के भीतर कई मस्तिष्क क्षेत्रों में सिनैप्टिक घनत्व में परिवर्तन की जांच कर सकती है, जो बीमारी या उपचार के कारण सिनैप्टिक परिवर्तनों का अधिक समग्र प्रतिनिधित्व प्रदान करती है।

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Protocol

जानवरों से कोशिकाओं और ऊतकों का अलगाव प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान की मार्गदर्शिका के अनुसार था और वेक वन संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था।

नोट: इस प्रोटोकॉल का उपयोग पहले से ही इलाज किए गए नमूनों पर किया जाता है और विशिष्ट प्रयोगात्मक प्रतिमानों और आवश्यकताओं के अनुसार तय किया जाता है। प्रदर्शन प्रयोजनों के लिए, तेजी से एंटीडिप्रेसेंट उपचार के कारण synapse गठन इस synapse का पता लगाने की तकनीक6 को उजागर करने के लिए उपयोग किया जाता है। न्यूरॉन्स पहले कवरलिप्स पर सुसंस्कृत, इलाज, 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड (पीएफए) में तय किया गया था, और 1x फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा (पीबीएस) में संग्रहीत किया गया था, इन विट्रो प्रक्रियाओं को उजागर करने के लिए उपयोग किया जाएगा। पहले कटा हुआ हिप्पोकैम्पस ऊतक (25 μm मोटी) चूहों से इलाज किया, transcardially बर्फ-ठंडे PBS और 4% PFA के साथ perfused, और फिर क्रायोप्रोटेक्टेंट में संग्रहीत स्लाइस प्रक्रियाओं को उजागर करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा। न्यूरॉन्स को कैसे संस्कृति या transcardially perfuse कृन्तकों के बारे में अधिक जानकारी के लिए कृपया 11,12 देखें। इस प्रक्रिया के ग्राफ़िकल निरूपण के लिए चित्र 1 देखें.

Figure 1
चित्रा 1: DetectSyn परख के ग्राफिकल प्रतिनिधित्व. कोशिका झिल्ली permeabilizing के बाद, Synapsin1 और PSD95 के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी इन synaptic प्रोटीन के लिए बाध्य। ओलिगोन्यूक्लियोटाइड टैग के साथ द्वितीयक तब प्राथमिक एंटीबॉडी से बंधते हैं। यदि Synapsin1 और PSD95 40 एनएम के भीतर हैं, जैसा कि एक synapse पर है, तो ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स बातचीत करते हैं, और एक फ्लोरोसेंट टैग को प्रवर्धित किया जाता है। इस फ्लोरोसेंट सिग्नल को तब मानक माइक्रोस्कोपी के माध्यम से चित्रित किया जा सकता है और विश्लेषण किया जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

1. कुल्ला नमूने

  1. अवशिष्ट पीएफए या क्रायोप्रोटेक्टेंट को हटाने के लिए एक कक्षीय शेकर पर कोमल आंदोलन के साथ 5 मिनट के लिए 5 मिनट के लिए 5 मिनट 3 बार के लिए 500 μL के साथ नमूनों को कुल्ला।

2. ब्लॉक और permeabilize नमूने

  1. 1x PBS में ब्लॉकिंग और permeabilization समाधान (10% सामान्य गधा सीरम, 0.25% Tween 20) तैयार करें। ब्लॉकिंग, प्राथमिक और माध्यमिक ऊष्मायन के लिए उपयोग करने के लिए पर्याप्त तैयार करें।
  2. 24 अच्छी तरह से प्लेटों में नमूनों (उदाहरण के लिए, coverslips या मुक्त-फ्लोटिंग स्लाइस) के लिए, 500 μL ब्लॉकिंग और permeabilization समाधान जोड़ें। सुनिश्चित करें कि प्रत्येक अच्छी तरह से एक अलग नमूना शामिल है और उचित रूप से नमूनों को स्विच होने से रोकने के लिए लेबल किया गया है।
  3. सुसंस्कृत कोशिकाओं के लिए 60 मिनट या कटा हुआ ऊतक के लिए 2 घंटे के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर नमूनों को इनक्यूबेट करें। कोमल आंदोलन के लिए एक कक्षीय शेकर का उपयोग करें।

3. प्राथमिक एंटीबॉडी में नमूने इनक्यूबेट

  1. बफर को अवरुद्ध करने में प्राथमिक एंटीबॉडी तैयार करें:
    1. पोस्टसिनेप्टिक घनत्व 95 (PSD95; 1:500, खरगोश polyclonal), Synapsin1 (1:500, माउस मोनोक्लोनल), MAP2 (1:400, चिकन polyclonal) तैयार करें
    2. एक नकारात्मक नियंत्रण एलीकोट तैयार करें जो सिनैप्टिक जोड़े में से एक को छोड़ देता है (उदाहरण के लिए, PSD95 के बिना)
  2. ध्यान से एक प्लास्टिक पाश्चर पिपेट के साथ अवरुद्ध समाधान निकालें। कोशिकाओं को परेशान किए बिना या ऊतक को फाड़ने के बिना जितना संभव हो उतना हटाने की कोशिश करें।
  3. सुसंस्कृत कोशिकाओं के लिए:
    1. पैराफिल्म के साथ एक बड़ी प्लास्टिक पेट्री डिश लाइन। संदंश का उपयोग करके पैराफिल्म में कवरलिप्स को सावधानीपूर्वक स्थानांतरित करें।
    2. ध्यान से कवरलिप्स के शीर्ष पर प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के 60 μL जोड़ें। सुनिश्चित करें कि कवरस्लिप के किनारे पर प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान न फैलाएं।
    3. आर्द्रता प्रदान करने और इनक्यूबेशन अवधि के दौरान नमूनों को सूखने से रोकने के लिए, एक छोटे पेट्री डिश में अल्ट्राप्योर पानी जोड़ें और कवरस्लिप के चारों ओर छोटे पेट्री डिश को सावधानीपूर्वक व्यवस्थित करें।
    4. बड़े पेट्री डिश को कवर करें और आरटी में 1 घंटे के लिए सुसंस्कृत कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
  4. कटा हुआ ऊतक के लिए:
    1. ध्यान से एक 24 अच्छी तरह से प्लेट में मुक्त-फ्लोटिंग स्लाइस के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के 250 μL जोड़ें।
    2. प्लेट को कवर करें और एक कक्षीय शेकर पर कोमल आंदोलन के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर ऊतक को इनक्यूबेट करें।

4. धोना नमूने, तो माध्यमिक एंटीबॉडी में इनक्यूबेट

  1. ब्लॉकिंग बफ़र में द्वितीयक एंटीबॉडी तैयार करें:
    1. गधा विरोधी माउस (1: 5), गधा विरोधी खरगोश (1: 5), गधा विरोधी चिकन (1: 400) तैयार करें।
    2. इस चरण में, अतिरिक्त तकनीकी नियंत्रण एक माध्यमिक ऐलीकोट तैयार करके प्राप्त किया जा सकता है जो या तो एंटी-माउस या एंटी-खरगोश द्वितीयक को छोड़ देता है।
  2. सुसंस्कृत कोशिकाओं के लिए:
    1. संदंश का उपयोग करते हुए, ध्यान से एक पेपर तौलिया पर coverslips से प्राथमिक समाधान बंद नल
    2. संदंश का उपयोग करते हुए, सावधानीपूर्वक कवरलिप्स को उनके मूल 24 अच्छी तरह से प्लेट में स्थानांतरित करें जो 1x PBS के 500 μL से भरा हुआ है।
  3. कटा हुआ ऊतक के लिए:
    1. ध्यान से एक प्लास्टिक पाश्चर पिपेट के साथ प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान को हटा दें। ऊतक को फाड़ने के बिना जितना संभव हो उतना हटाने की कोशिश करें।
    2. 1x PBS का 500 μL जोड़ें
  4. एक कक्षीय शेकर पर कोमल आंदोलन के साथ 1x PBS में 10 मिनट 3 बार के लिए नमूनों को धोएं। इस समय के दौरान, आरटी करने के लिए सभी धोने buffers लाने के लिए।
    1. इस समय के दौरान, बड़े पेट्री डिश में पैराफिल्म बदलें
  5. सुसंस्कृत कोशिकाओं के लिए:
    1. संदंश का उपयोग करते हुए, ध्यान से कवरलिप्स को पैराफिल्म किए गए बड़े पेट्री डिश में वापस स्थानांतरित करें
    2. ध्यान से कवरलिप्स के शीर्ष पर द्वितीयक एंटीबॉडी समाधान के 40 μL जोड़ें। सुनिश्चित करें कि कवरस्लिप के किनारे पर द्वितीयक एंटीबॉडी समाधान न फैलाएं।
    3. यदि आवश्यक हो, तो एक छोटे पेट्री डिश में अधिक अल्ट्राप्योर पानी जोड़ें और कवरलिप्स के चारों ओर छोटे पेट्री डिश को सावधानीपूर्वक व्यवस्थित करें।
    4. बड़े पेट्री पकवान को कवर करें
  6. कटा हुआ ऊतक के लिए:
    1. ध्यान से एक 24 अच्छी तरह से प्लेट में मुक्त फ्लोटिंग स्लाइस के लिए द्वितीयक एंटीबॉडी समाधान के 250 μL जोड़ें।
    2. प्लेट को कवर करें
      नोट: यहाँ से, पन्नी के साथ प्लेटों के सबसे ऊपर लपेटकर प्रकाश से नमूनों की रक्षा करें।
  7. 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों को इनक्यूबेट करें

5. बंधाव

  1. आणविक ग्रेड के पानी में बंधाव स्टॉक 1: 5 मिलाएं।
  2. अनुभाग 4 के रूप में, ध्यान से coverslips हस्तांतरण और कटा हुआ ऊतक से माध्यमिक मिश्रण को हटाने.
  3. वॉश बफर A के 500 μL में नमूनों को धोएं
    1. सुसंस्कृत कोशिकाओं के लिए, 5 मिनट के लिए 2 बार धोएं। कटा हुआ ऊतक के लिए, 10 मिनट के लिए 2 बार धोएं। दोनों के लिए एक कक्षीय शेकर पर कोमल आंदोलन का उपयोग करें।
    2. इस समय के दौरान, बड़े पेट्री डिश में पैराफिल्म बदलें
  4. एक ठंडे ब्लॉक पर लिगाज़ रखते हुए, चरण 5.1 से बंधाव स्टॉक में लिगाज़ 1:40 को पतला करें। नमूनों के लिए ligase जोड़ने से पहले तुरंत इस कमजोर पड़ने का प्रदर्शन करें।
  5. जैसा कि अनुभाग 4 में है, लिगेज़ को जोड़ने से पहले नमूनों से जितना संभव हो उतना वॉश बफर ए निकालें।
  6. सुसंस्कृत कोशिकाओं के लिए: स्थानांतरण कवर वापस parafilmed पेट्री पकवान के लिएlips. कवरस्लिप के लिए बंधाव मिश्रण के 40 μL जोड़ें, कवरलिप्स के चारों ओर छोटे पानी से भरे पेट्री व्यंजनों की व्यवस्था करें, और बड़े पेट्री डिश को कवर करें।
  7. कटा हुआ ऊतक के लिए: प्रत्येक अच्छी तरह से चरण 5.4 से बंधाव मिश्रण के 250 μL जोड़ें और प्लेट को कवर करें।
  8. 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए नमूनों को इनक्यूबेट करें।

6. प्रवर्धन

  1. आणविक ग्रेड पानी में प्रवर्धन स्टॉक 1: 5 मिलाएं।
  2. जैसा कि अनुभाग 4 में है, ध्यान से कवरलिप्स को स्थानांतरित करें और कटा हुआ ऊतक से बंधाव मिश्रण को हटा दें।
  3. धोने बफर A के 500 μL में धोने के नमूने
    1. सुसंस्कृत कोशिकाओं के लिए, 2 मिनट के लिए 2 बार धोएं। कटा हुआ ऊतक के लिए, 10 मिनट के लिए 2 बार धोएं। दोनों के लिए एक कक्षीय शेकर पर कोमल आंदोलन का उपयोग करें।
    2. इस समय के दौरान, बड़े पेट्री डिश में पैराफिल्म बदलें
  4. नमूनों में पोलीमरेज़ जोड़ने से तुरंत पहले इस कमजोर पड़ने का प्रदर्शन करें। एक ठंडे ब्लॉक पर पोलीमरेज़ रखते हुए, पोलीमरेज़ को पतला करें
    1. सुसंस्कृत कोशिकाओं के लिए, चरण 6.1 से प्रवर्धन स्टॉक में पोलीमरेज़ 1:80 पतला करें।
    2. कटा हुआ ऊतक के लिए, चरण 6.1 से प्रवर्धन स्टॉक में पोलीमरेज़ 1: 40 पतला करें।
  5. चरण 4 के रूप में, पोलीमरेज़ जोड़ने से पहले नमूनों से जितना संभव हो उतना वॉश बफर ए निकालें।
  6. सुसंस्कृत कोशिकाओं के लिए: कवरलिप्स को पैराफिल्मेड पेट्री डिश में वापस स्थानांतरित करें। कवरलिप्स के लिए चरण 6.4.1 से प्रवर्धन मिश्रण के 40 μL जोड़ें, coverslips के चारों ओर छोटे पानी से भरे पेट्री व्यंजनों की व्यवस्था करें, और बड़े पेट्री डिश को कवर करें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 100 मिनट के लिए नमूनों को इनक्यूबेट करें।
  7. कटा हुआ ऊतक के लिए: प्रत्येक अच्छी तरह से चरण 6.4.2 से प्रवर्धन मिश्रण के 250 μL जोड़ें और प्लेट को कवर करें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 ज के लिए नमूनों को इनक्यूबेट करें।
    नोट:: इस समय के दौरान, स्लाइड्स तैयार और लेबल करें।

7. बढ़ते

  1. चरण 4 के रूप में, ध्यान से coverslips हस्तांतरण और कटा हुआ ऊतक से प्रवर्धन मिश्रण को हटा दें।
  2. एक कक्षीय शेकर पर कोमल आंदोलन के साथ 10 मिनट के लिए 2 बार धोने बफर बी के 500 μL में नमूनों को धोएं।
  3. एक कक्षीय शेकर पर कोमल आंदोलन के साथ 1 मिनट के लिए 1% धोने बफर बी के 500 μL में नमूनों को धोएं।
  4. सुसंस्कृत कोशिकाओं के लिए:
    1. एक स्लाइड पर बढ़ते मीडिया के 3 μL ड्रॉप
    2. कवरस्लिप से अतिरिक्त धोने बफर को टैप करें और फिर बढ़ते मीडिया में कवरस्लिप (नीचे की ओर सामना करने वाली कोशिकाओं के साथ) रखें। जगह में coverslip सील करने के लिए स्पष्ट नेल पॉलिश की एक छोटी राशि के साथ पक्षों को सील.
  5. कटा हुआ ऊतक के लिए:
    1. तैयार स्लाइड पर एक ऊतक स्लाइस को सावधानीपूर्वक स्थानांतरित करें और इसे व्यवस्थित करें, इसलिए स्लाइस सपाट पड़ा हुआ है। बढ़ते मीडिया के 5-10 μL के बीच ड्रॉप (राशि स्लाइस के आकार पर निर्भर करेगा) ऊतक स्लाइस पर
    2. ध्यान से ऊतक स्लाइस पर एक ग्लास कवरस्लिप रखें और किनारे के साथ स्पष्ट नेल पॉलिश की एक छोटी मात्रा के साथ सील करें ताकि कवरस्लिप को जगह में सील किया जा सके।
  6. माइक्रोस्कोप के नीचे विश्लेषण करने से पहले कम से कम 15 मिनट प्रतीक्षा करें, या -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

8. एक confocal माइक्रोस्कोप के साथ डिजिटल छवियों को प्राप्त

  1. सभी उपचारों से नमूनों में अधिग्रहण सेटिंग्स (जैसे, लेजर शक्ति, लाभ, ऑफसेट) को अनुकूलित करें। सुनिश्चित करें कि अनुकूलन में पृष्ठभूमि शोर को कम करना और फ्लोरोसेंट संकेतों की तीव्रता को अतिरंजित किए बिना सिग्नल को बढ़ाना शामिल है। एक बार सेटिंग्स निर्धारित होने के बाद, प्राप्त सभी छवियों में एक ही अधिग्रहण सेटिंग्स लागू करें।
    नोट:: निम्न अधिग्रहण विवरण एक Nikon A1 confocal माइक्रोस्कोप और Nikon NIS AR तत्व सॉफ्टवेयर के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है।
  2. मंच पर नमूने के साथ स्लाइड सेट करें और आईपीस के माध्यम से DAPI का उपयोग करके नमूने के लिए फोकल प्लेन ढूंढें।
  3. आई पोर्ट पर क्लिक करके आंख पोर्ट को बंद करें और सेटिंग्स को समायोजित करने के लिए एक ऑप्टिकल कॉन्फ़िगरेशन बटन चुनें।
  4. पृष्ठभूमि शोर को कम करने और फ्लोरोसेंट सिग्नल को बढ़ाने के लिए प्रत्येक फ्लोरोसेंट चैनल के लिए लाभ, ऑफसेट और लेजर शक्ति को समायोजित करें। सुनिश्चित करें कि फ्लोरोसेंट सिग्नल ओवरसैचुरेटेड नहीं होता है जैसा कि चरण 8.5-8.6 में उल्लेख किया गया है।
  5. फ्लोरोसेंट सिग्नल के लिए एक छद्म रंग का उपयोग करके ओवरसैचुरेशन की निगरानी करें। लाइव छवि के नीचे, वर्तमान में उपयोग किए जा रहे फ्लोरोसेंट चैनल के साथ लेबल किए गए टैब पर राइट-क्लिक करें।
  6. अगला, चैनल रंग चुनें और इंद्रधनुष अंधेरे की तरह एक छद्म रंग लेने के लिए एक गर्मी मानचित्र की तरह छद्म रंग में प्रतिदीप्ति तीव्रता की कल्पना करने के लिए. रेनबो डार्क में, कूलर रंग कम फ्लोरोसेंट तीव्रता का संकेत देते हैं, और गर्म रंग अधिक फ्लोरोसेंट तीव्रता का संकेत देते हैं।
  7. एक बार जब सभी फ्लोरोसेंट चैनल अनुकूलित हो जाते हैं, तो पहले से चुने गए ऑप्टिकल कॉन्फ़िगरेशन बटन पर राइट-क्लिक करें और इस बटन के लिए वर्तमान कैमरा सेटिंग असाइन करें चुनें।
  8. सत्यापित करें कि चुनी गई सेटिंग्स प्रत्येक उपचार समूह से एक यादृच्छिक नमूने के लिए पर्याप्त हैं। यदि चुनी गई सेटिंग्स इन नमूनों में से किसी को भी ओवरसेरेट करती हैं, तो ओवरसेचुरेशन को समाप्त करने के लिए चरण 8.4 दोहराएँ।
  9. सुसंस्कृत न्यूरॉन्स के लिए, चरण 8.10-8.16 का पालन करें।
  10. आई-पोर्ट का उपयोग करके, डेंड्राइट्स के साथ एक न्यूरॉन की खोज करें जिसमें अन्य डेंड्राइट्स के साथ न्यूनतम ओवरलैप होता है।
  11. आंखों के पोर्ट को बंद करें और चुने गए न्यूरॉन के सेल बॉडी को विज़ुअलाइज़ करने के लिए DAPI चैनल का उपयोग करें। दृश्य के क्षेत्र के बीच में न्यूरॉन को केंद्र में रखने के लिए सोमा के केंद्र पर डबल-क्लिक करें।
  12. MAP2 चैनल का उपयोग करके, लाइव स्कैनिंग के साथ MAP2 सिग्नल के लिए फ़ोकस का सबसे अच्छा विमान खोजें।
  13. एनडी अधिग्रहण टैब के तहत, फ़ाइल में सहेजें पर क्लिक करें और ब्राउज़ करें के तहत छवि को सहेजने के लिए एक फ़ाइल चुनें। उसके बाद, फ़ाइल नाम इनपुट करें।
  14. Z टैब के अंतर्गत, श्रेणी द्वारा निर्धारित सममित मोड विकल्प का चयन करें. सबसे अच्छा MAP2 विमान के लिए फ़ोकस सेट करें और z-स्टैक के बीच के रूप में इस फोकल प्लेन सेट करने के लिए Relative बटन पर क्लिक करें।
  15. 1 μm चरणों के साथ 5 μm करने के लिए सीमा सेट करें, और Z आंदोलन के दौरान बंद सक्रिय शटर की जाँच करने के लिए सुनिश्चित करें। तरंग दैर्ध्य टैब के अंतर्गत, ऑप्टिकल कॉन्फ़ के अंतर्गत पहले कॉन्फ़िगर की गई अधिग्रहण सेटिंग्स के साथ ऑप्टिकल बटन के नाम का चयन करें. इसके बाद रन नाउ पर क्लिक करें।
  16. प्रति कवरस्लिप / उपचार के बारे में 10 न्यूरॉन्स के लिए चरण 8.1.10-8.1.15 को दोहराएं।
  17. कटा हुआ ऊतक के लिए, चरण 8.18-8.22 का पालन करें।
  18. आंख-बंदरगाह का उपयोग करके, ब्याज के क्षेत्र की खोज करें। उदाहरण के लिए, हिप्पोकैम्पस के CA1 का पता लगाएं।
  19. आंख-पोर्ट को बंद करें और लाइव स्कैनिंग के साथ MAP2 सिग्नल के लिए फ़ोकस का सबसे अच्छा विमान खोजने के लिए MAP2 चैनल का उपयोग करें।
  20. प्राप्त करें मेनू के अंतर्गत, बड़ी छवि स्कैन करें चुनें. अगला, खुलने वाले पैनल से कैप्चरिंग पैनल के तहत पहले से कॉन्फ़िगर की गई अधिग्रहण सेटिंग्स के साथ ऑप्टिकल बटन के नाम का चयन करें। इसके अलावा, इस पैनल में सही उद्देश्य का चयन करना सुनिश्चित करें।
  21. क्षेत्र पैनल और आईपीस के तहत, ब्याज के क्षेत्र की सीमाओं को सेट करने के लिए तीर कुंजियों का उपयोग करें। इसके बाद, फ़ाइल में बड़ी छवि सहेजें पर क्लिक करें और छवि के लिए एक सहेजें पथ फ़ाइल नाम बनाएँ।
  22. सेटअप पैनल के अंतर्गत, सुनिश्चित करें कि Multichannel कैप्चर चेक किया गया है, और उसके बाद ऑप्टिकल Conf के अंतर्गत पहले कॉन्फ़िगर की गई अधिग्रहण सेटिंग्स के साथ ऑप्टिकल बटन का नाम चुनें।
    नोट:: एक बड़ी छवि के लिए एक z-स्टैक संभव है, लेकिन स्कैन समय में वृद्धि होगी।

9. विश्लेषण

  1. अधिग्रहण सेटिंग्स के समान, थ्रेशोल्ड सेटिंग्स को अनुकूलित करने के लिए सभी उपचारों से नमूनों का उपयोग करें। सुनिश्चित करें कि थ्रेशोल्ड ऑप्टिमाइज़ेशन पृष्ठभूमि शोर को कम करने और फ्लोरोसेंट संकेतों की तीव्रता को अतिरंजित किए बिना सिग्नल को बढ़ाने पर केंद्रित है। एक बार जब ये सेटिंग्स निर्धारित हो जाती हैं, तो चरण 9.2-9.3 में वर्णित विश्लेषण के लिए उपयोग की जाने वाली सभी छवियों में समान थ्रेशोल्ड सेटिंग्स लागू करें।
  2. ImageJ में, थ्रेशोल्ड विकल्प मेनू छवि > > थ्रेशोल्ड समायोजित करें के अंतर्गत स्थित है। यदि छवि में एक अंधेरा पृष्ठभूमि है तो डार्क बैकग्राउंड विकल्प चुनें।
  3. अगला, पहले से निर्धारित अनुकूलित थ्रेशोल्ड सेटिंग्स के प्रति थ्रेशोल्ड की ऊपरी और निचली सीमाओं को समायोजित करें, फिर लागू करें पर क्लिक करें।
  4. सुसंस्कृत कोशिकाओं के लिए, MAP2 चैनल और प्रत्येक न्यूरॉन के लिए एक ROI आकर्षित करने के लिए ब्याज के एक फ्रीहैंड क्षेत्र (ROI) उपकरण का उपयोग करें, जिसमें डेंड्राइट्स और सोमा शामिल हैं। कटा हुआ ऊतक के लिए, स्लाइस छवि के भीतर एक फ्रीहैंड आरओआई खींचें जो ब्याज के क्षेत्र को समाहित करता है (उदाहरण के लिए, हिप्पोकैम्पस के भीतर सीए 1 के स्ट्रैटम रेडिएटम)।
  5. ROI के क्षेत्र को प्राप्त करें। ImageJ में, मेनू के अंतर्गत क्षेत्र को मापने > विश्लेषण करें.
  6. 9.7-9.9 चरणों के बाद ImageJ में कण विश्लेषण की तरह एक स्वचालित पहचान उपकरण का उपयोग कर प्रत्येक ROI के भीतर puncta की संख्या का पता लगाएं।
  7. कणों का विश्लेषण > विश्लेषण मेनू के तहत कण विश्लेषण विकल्प का पता लगाएं। सबसे पहले, puncta आकार व्यास को परिभाषित करें, आमतौर पर 0.1-3 μm2।
  8. इसके बाद, ड्रॉप-डाउन मेनू से ओवरले मास्क विकल्प चुनें और प्रदर्शन परिणाम विकल्प की जाँच करें। फिर, ठीक पर क्लिक करें।
  9. यदि puncta चुना व्यास सीमा के साथ पता नहीं चला है, तो सीमा को समायोजित करें जब तक कि सभी puncta इस विश्लेषण के साथ पता लगाया जाता है। सभी छवियों के लिए एक ही कण विश्लेषण सेटिंग्स का उपयोग करना सुनिश्चित करें।
  10. 9.11-9.13 चरणों का पालन करके रुचि के एक व्यक्तिगत क्षेत्र के क्षेत्र के क्षेत्र से puncta की संख्या को विभाजित करें।
  11. प्रतिलिपि बनाएँ और परिणाम पॉप-अप से एक स्प्रेडशीट में ImageJ से प्रत्येक छवि के लिए परिणाम चिपकाएँ।
  12. सबसे पहले, यह पहचानें कि कौन सी फ़ाइल और नमूना डेटा से प्राप्त किया गया था। फिर, आरओआई के क्षेत्र को पंक्टा की संख्या से विभाजित करें।
  13. उसके बाद, परिणाम पॉप-अप से डेटा साफ़ करें, और चरण 9.2-9.12 दोहराएँ।
  14. नमूनों को नियंत्रित करने के लिए परिणामों को सामान्य करें: नियंत्रण नमूनों के लिए परिणामों (puncta/ROI क्षेत्र की संख्या) का औसत करें। फिर, सामान्यीकृत परिणाम प्राप्त करने के लिए नियंत्रण के औसत से सभी नमूनों के प्राप्त परिणामों को विभाजित करें। नियंत्रण नमूनों का नया औसत 1 के बराबर होना चाहिए।

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Representative Results

Heaney et al.6 से संशोधित डेटा को एक प्रयोग का प्रदर्शन करने के लिए प्रस्तुत किया जाता है जहां सिनैप्स गठन में वृद्धि की उम्मीद की जाती है (कृपया अधिक जानकारी के लिए6 देखें और तंत्र की अधिक गहराई से चर्चा करें)। पहले, यह प्रदर्शित किया गया था कि तेजी से एंटीडिपेंटेंट्स को निरोधात्मक मेटाबोट्रोपिक रिसेप्टर, GABAB (गामा-एमिनोब्यूट्रिक एसिड उपप्रकार बी) के सक्रियण की आवश्यकता होती है, प्रभावी होने के लिए13। इसके अलावा, पिछले डेटा ने संकेत दिया कि तेजी से एंटीडिप्रेसेंट पोस्टसिनेप्टिकमार्करों को बढ़ाते हैं 14; इस प्रकार, DetectSyn का उपयोग इस परिकल्पना का परीक्षण करने के लिए किया गया था कि तेजी से एंटीडिप्रेसेंट्स प्रभावी होने के लिए synapse संख्या में वृद्धि करते हैं।

सुसंस्कृत न्यूरॉन्स में, चार स्थितियों का परीक्षण किया जाता है। सबसे पहले, चित्रा 2 ए के शीर्ष पैनल में, सुसंस्कृत न्यूरॉन्स को प्रयोगात्मक नियंत्रण के समान परिस्थितियों में वाहन के साथ इलाज किया गया था। हालांकि, PSD95 प्राथमिक एंटीबॉडी DetectSyn परख के लिए एक तकनीकी नियंत्रण प्रदान करने के लिए छोड़ दिया गया है (कैसे प्रत्येक घटक संकेत के लिए योगदान देता है के लिए चित्रा 1 देखें). अगला, नियंत्रण कक्ष में, न्यूरॉन्स को फिर से वाहन के साथ इलाज किया जाता है, लेकिन PSD95 और Synapsin1 प्राइमरी दोनों प्राप्त होते हैं। इसके बाद, सुसंस्कृत न्यूरॉन्स को केवल तेजी से एंटीडिप्रेसेंट Ro-25-6981 (Ro) या Ro प्लस GABAB एगोनिस्ट, बैक्लोफेन (बीएसी) के साथ इलाज किया जाता है। जैसा कि पहले13 का प्रदर्शन किया गया था, Ro-25-6981 और GABAB एगोनिस्ट बैक्लोफेन दोनों को Ro-25-6981 की इन विट्रो प्रभावकारिता के लिए आवश्यक है। इस प्रकार, synapse गठन में वृद्धि सफेद puncta (चित्रा 2A) में वृद्धि से प्रदर्शित किया जाता है। बैक्लोफेन के बिना, विट्रो में सिनैप्स गठन में कोई वृद्धि नहीं देखी जाती है।

विवो में, बेसल गाबा का स्तर तेजी से एंटीडिप्रेसेंट के लिए13 काम करने के लिए पर्याप्त है, इसलिए केवल तेजी से एंटीडिप्रेसेंट Ro-25-6981 चूहों को इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन के माध्यम से प्रशासित किया जाता है (चित्रा 2 बी)। चित्र 2B के बाएँ पैनल DetectSyn परख के लिए एक और तकनीकी नियंत्रण का प्रतिनिधित्व करता है. एक खारा-उपचारित माउस से हिप्पोकैम्पस ऊतक को PSD95 और Synapsin1 के लिए दोनों प्राइमरी के साथ जांच की गई थी, लेकिन द्वितीयक में से एक को छोड़ दिया गया था। खारा-उपचारित चूहों की तुलना में तेजी से एंटीडिप्रेसेंट Ro-25-6981 के साथ उपचार के कारण synapse गठन में वृद्धि चित्रा 2B के मध्य और दाएं पैनलों में प्रदर्शित की जाती है।

विट्रो और पूर्व विवो में तकनीकी नियंत्रण के लिए प्रतिनिधि छवियों को दिखाया गया है। चित्रा 2A में, सिनैप्टिक जोड़े के लिए प्राइमरी में से एक को छोड़ दिया गया है (यानी, PSD95), और चित्र 2B में, द्वितीयक में से एक को छोड़ दिया गया है। जबकि कुछ puncta तकनीकी नियंत्रण छवियों में दिखाई देते हैं, वे आम तौर पर एक ही आकार के नहीं होते हैं, जैसा कि अन्य पैनलों में बड़े puncta की तुलना में चित्रा 2A के शीर्ष पैनल में सफेद धब्बे द्वारा प्रदर्शित किया गया है। इसके अलावा, ये puncta puncta परिमाणित के रूप में एक ही स्थान पर नहीं हैं, जैसा कि चित्रा 2 B में तकनीकी नियंत्रण के सोमा के भीतर दिखाई देने वाले कुछ puncta द्वारा प्रदर्शित किया गया है। आमतौर पर, नाभिक के भीतर गैर-विशिष्ट पंक्टा होता है, शायद डीएनए की उपस्थिति के कारण।

चित्रा 2A में प्रतिनिधि परिणामों का विश्लेषण करने के लिए, डेंड्राइट्स (MAP2 धुंधला द्वारा विज़ुअलाइज़ किया गया और यहां एक ग्रे रूपरेखा में प्रतिनिधित्व किया गया) को ब्याज के क्षेत्रों (आरओआई) को बनाने के लिए एक फ्रीहैंड ड्राइंग टूल का उपयोग करके पता लगाया गया था। सबसे पहले, MAP2 ROIs का क्षेत्र NIS तत्वों फ़ंक्शन, ROI डेटा स्वचालित मापन परिणाम टैब के तहत का उपयोग करके प्राप्त किया गया था। अगला, PUNCTA एनआईएस तत्वों में थ्रेशोल्डिंग फ़ंक्शन का उपयोग करके पाया गया था। यह फ़ंक्शन उन ऑब्जेक्ट्स का बाइनरी मास्क बनाता है जो किसी परिभाषित तीव्रता थ्रेशोल्ड के भीतर आते हैं। उसके बाद, MAP2 ROIs के भीतर बाइनरी ऑब्जेक्ट्स की संख्या NIS तत्व फ़ंक्शन, ROI में बाइनरी, स्वचालित माप परिणाम टैब के अंतर्गत का उपयोग कर पाया गया। चित्र 2A के दाईं ओर ग्राफ में प्रस्तुत डेटा ROI के क्षेत्र से विभाजित puncta के सामान्यीकृत मान हैं।

चित्रा 2B में प्रतिनिधि परिणामों का विश्लेषण करने के लिए, CA1 के स्ट्रैटम रेडिएटम को ROI बनाने के लिए एक फ्रीहैंड ड्राइंग टूल का उपयोग करके ट्रेस किया गया था। सबसे पहले, ROI का क्षेत्र ROI डेटा फ़ंक्शन का उपयोग करके प्राप्त किया गया था, जैसा कि ऊपर पैराग्राफ में वर्णित है। इसके बाद, पंक्टा को स्पॉट डिटेक्शन - ब्राइट स्पॉट फ़ंक्शन का उपयोग करके पाया गया, जो बाइनरी मेनू के तहत स्थित था। अगला, व्यास और इसके विपरीत मूल्यों को सभी उपचारों से कई स्लाइस के दृश्य निरीक्षण के आधार पर चुना गया था। एक बार जब इन मूल्यों का निर्णय लिया गया, तो उन्हें सभी विश्लेषण की गई छवियों में समान रूप से लागू किया गया। स्पॉट डिटेक्शन फ़ंक्शन परिभाषित व्यास और कंट्रास्ट पैरामीटर सेट के भीतर ऑब्जेक्ट्स के बाइनरी मास्क बनाता है। उसके बाद, MAP2 ROIs के भीतर बाइनरी ऑब्जेक्ट्स की संख्या NIS तत्व फ़ंक्शन, ROI में बाइनरी, स्वचालित माप परिणाम टैब के अंतर्गत का उपयोग कर पाया गया। चित्र 2B के दाईं ओर ग्राफ़ में प्रस्तुत डेटा ROI के क्षेत्र से विभाजित puncta के सामान्यीकृत मान हैं।

Figure 2
चित्रा 2: DetectSyn परख का उपयोग कर synapses का पता लगाना. सफेद puncta का प्रतिनिधित्व synapses DetectSyn PSD95-Synapsin1 निकटता बंधाव परख (पीले arrowheads) में (ए) इन विट्रो सुसंस्कृत प्राथमिक हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स और (बी) पूर्व विवो CA1 स्ट्रैटम रेडिएटम के साथ पता चला. (ए) में, ग्रे रूपरेखा MAP2 धुंधला का प्रतिनिधित्व करती है। (ए) में, पीएलए नियंत्रण लेबल वाला शीर्ष पैनल नियंत्रण की तरह केवल वाहन के साथ इलाज किए गए नमूनों का प्रतिनिधित्व करता है, जैसे कि नियंत्रण। हालांकि, PSD95 प्राथमिक प्रतिक्रिया में शामिल नहीं किया गया था। अंतिम दो पैनलों में, न्यूरॉन्स को 90 मिनट के लिए तेजी से एंटीडिप्रेसेंट Ro-25-6981 (Ro, 10 μM) या Ro प्लस GABAB एगोनिस्ट बैक्लोफेन (बीएसी, 50 μM) के साथ इलाज किया गया था। puncta की बढ़ी हुई संख्या (पीले एरोहेड्स के साथ पहचानकी जाती है) इंगित करती है कि इन विट्रो में, synapse गठन केवल तब बढ़ता है जब तेजी से एंटीडिप्रेसेंट Ro-25-6981 को GABAB एगोनिस्ट के साथ प्रशासित किया जाता है। (बी) में, हरा एमएपी 2 के साथ दाग वाले डेंड्राइट्स का प्रतिनिधित्व करता है, और नीला डीएपीआई के साथ दाग वाले नाभिक का प्रतिनिधित्व करता है। एकल डेंड्राइट्स, विलय की गई छवियों में पीले आयतों में उल्लिखित, प्रतिनिधि छवियों के नीचे अलग-थलग कर रहे हैं ताकि यह प्रदर्शित किया जा सके कि पंक्टा डेंड्राइट्स के लिए स्थानीयकृत है। जानवरों को रो -25-6981 (10 मिलीग्राम / किग्रा) के साथ इलाज किया गया था, और उपचार के 45 मिनट बाद ऊतक एकत्र किया गया था। puncta की बढ़ी हुई संख्या (पीले एरोहेड्स द्वारा पहचानी गई) इंगित करती है कि विवो में, बेसल GABA सिग्नलिंग और तेजी से एंटीडिप्रेसेंट Ro-25-6981 के साथ synapses की संख्या बढ़ जाती है। प्रतिनिधि परिणामों का परिमाणीकरण बार ग्राफद्वारा दर्शाया जाता है और MAP2 क्षेत्र द्वारा विभाजित DetectSyn puncta की औसत संख्या को इंगित करता है। परिणाम प्रयोगात्मक नियंत्रण के लिए सामान्यीकृत कर रहे हैं। छवियों को एक Nikon A1plus confocal माइक्रोस्कोप का उपयोग करके प्राप्त किया गया था। स्केल सलाखों = (ए) 10 μm; (बी, शीर्ष) 50 μm; (बी, नीचे) 5 μm. सलाखों माध्य के माध्य +/- मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करते हैं। एक तरफा एनोवा द्वारा विश्लेषण किए गए परिणाम: * पी < 0.05, ** पी < 0.01, *** पी < 0.001, **** पी < 0.0001 पोस्ट-हॉक विश्लेषण द्वारा। यह आंकड़ा Heaney et al.6 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

DetectSyn एक तेजी से परख है कि एक निकटता बंधाव परख का उपयोग करता है एक दूसरे के 40 एनएम के भीतर प्रोटीन का पता लगाने के लिए, जो synapse गठन का पता लगाने के लिए अनुमति देता है के भीतर प्रोटीन का पता लगाने के लिए है. यह तकनीक वर्तमान फ्लोरोसेंट एसेस में सुधार करती है, जो केवल सिनैप्स गठन के लिए प्रॉक्सी माप के रूप में कार्य करती है। DetectSyn 40 एनएम के भीतर स्थानीयकृत सिनैप्टिक प्रोटीन में मात्रात्मक परिवर्तनों का पता लगाता है, यानी, एक दूसरे के सिनैप्टिक फांक के भीतर। इसके अलावा, DetectSyn अधिक लागत प्रभावी है और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी और सरणी टोमोग्राफी जैसी तकनीकों की तुलना में कम समय लेता है, जिसे synapses को मापने के लिए डिज़ाइन किया गया है और शास्त्रीय रूप से सोने के मानक तकनीकों के रूप में नामित किया गया है।

DetectSyn एक अत्यधिक अनुकूलन तकनीक है। किसी भी सिनैप्टिक जोड़ी का उपयोग विशिष्ट प्रकार के सिनैप्स के गठन की पहचान करने के लिए किया जा सकता है, जब तक कि प्रोटीन जोड़ी एक-दूसरे के 40 एनएम के भीतर रहती है। जबकि इस रोमांचक तकनीक में कई अनुप्रयोग हैं, किसी को इष्टतम ब्लॉकिंग और प्राथमिक इनक्यूबेशन स्थितियों सहित एंटीबॉडी को मान्य करने के लिए ध्यान रखना चाहिए, और इम्यूनोफ्लोरेसेंस जैसे अन्य तरीकों का उपयोग करके अपने परिणामों का समर्थन करना जारी रखना चाहिए। अलग-अलग प्रयोगों में इन सहायक प्रयोगों को करने का सुझाव दिया जाता है जो एंटीबॉडी बाध्यकारी प्रतियोगिता को कम करने के लिए DetectSyn का उपयोग नहीं करते हैं (उदाहरण के लिए, एक ही प्रयोग में बकरी एंटी-PSD95 और माउस एंटी-PSD95 का उपयोग करना प्रतियोगिता के कारण बाध्यकारी को कम कर सकता है)। इसके अतिरिक्त, विभिन्न मेजबानों में उठाए गए प्राथमिक एंटीबॉडी को चुनने के लिए ध्यान रखें- उदाहरण के लिए, बकरी विरोधी PSD95 और खरगोश विरोधी Synapsin1। यदि दोनों प्राइमरी के लिए एक ही मेजबान का उपयोग किया जाता है, तो माध्यमिक जांच दो प्राइमरी के बीच भेदभाव नहीं करेगी।

इसके अलावा, क्योंकि निकटता बंधाव में एक प्रवर्धन चरण है, इसलिए सीमित जानकारी है जो परिणामी पंक्टा से आकर्षित कर सकती है। उदाहरण के लिए, विभिन्न आकार के पंक्टा देखे जाते हैं ( चित्रा 2 बी में स्पष्ट), एक ही क्षेत्र में भर्ती किए गए सिनैप्स आकार या एकाधिक सिनेप्स में बदलाव का सुझाव देते हैं। हालांकि, भले ही एक प्रयोग के भीतर प्रत्येक नमूना एक ही स्थिति से गुजरता है, प्रवर्धन चरण इन निष्कर्षों को स्पष्ट रूप से आकर्षित करना मुश्किल बनाता है।

अंत में, इस प्रोटोकॉल के लिए महत्वपूर्ण चरणों में यह सुनिश्चित करना शामिल है कि लिगेज़ और पोलीमरेज़ एक बर्फ ब्लॉक पर बने रहें और नमूनों में जितनी जल्दी हो सके जोड़े जाएं। इसके अतिरिक्त, तकनीकी नियंत्रण सहित यह पहचानने में मदद मिलेगी कि किसी दिए गए प्रयोग में गैर-विशिष्ट puncta कहां दिखाई दे सकता है। उदाहरण के लिए, जैसा कि चित्र 2 बी में देखा गया है, नाभिक के भीतर पंक्टा को तकनीकी नियंत्रण में देखा जाता है। इस प्रकार, यह सुनिश्चित करने के लिए नकारात्मक या तकनीकी नियंत्रणों को शामिल करना महत्वपूर्ण है कि प्रयोगात्मक नमूनों में पाया गया संकेत इन नियंत्रणों में देखे गए संकेतों से अधिक है। आमतौर पर, ये तकनीकी नियंत्रण प्राथमिक या द्वितीयक जोड़े में से एक को छोड़कर प्राप्त किए जाते हैं। अंत में, सुनिश्चित करें इनक्यूबेशन तापमान माध्यमिक चरण से शुरू होने वाले 37 डिग्री सेल्सियस पर हैं।

महत्वपूर्ण रूप से, DetectSyn एक मानक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप तक पहुंच के साथ लगभग किसी भी प्रयोगशाला के लिए एक सुलभ तरीका प्रदान करता है, तकनीकी अनुभव की परवाह किए बिना, synaptopathologies का अध्ययन करने के लिए।

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Disclosures

लेखकों ने हितों के टकराव की कोई रिपोर्ट नहीं की है।

Acknowledgments

इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान NINDS R01 NS105005 (KRG) और NS105005-03S1 (KRG), रक्षा विभाग USAMRMC W81XWH-14-1-0061 (KRG), NIAAA R01AA016852, NIAAA T32AA007565 (CFH) और FRAXA-201 से एक अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x PBS Fisher Scientific BP39920 PBS made in house works, as well.
24 well plates Fisher Scientific FB012929 For tissue slices, pre-sterilized plates may be unnecessary.
50 mL conical tubes Fisher Scientific 14-432-22
Aluminium foil Fisher Scientific 15-078-290
Chicken anti-MAP2 antibody Abcam ab5392
Clear nail polish Fisher Scientific NC1849418 Other clear nail polish works, as well.
Cold block Fisher Scientific 13131012
Computer workstation HP
Confocal or fluorescent microscope Nikon A1R HD25
Donkey anti-chicken FITC Fisher Scientific SA1-72000
Duolink donkey anti-Mouse PLUS Sigma DUO92001
Duolink donkey anti-Rabbit MINUS Sigma DUO92005
Duolink In Situ Detection Reagents Far Red Sigma DUO92013 Contains ligation stock, amplification stock, ligase, and polymerase.
Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI Sigma DUO82040
Duolink In Situ Wash Buffers, Fluorescence Sigma DUO82049 Contains Wash Buffer A and Wash Buffer B; dilute Wash Buffer B to 1% in diH20 for 1% Wash Buffer B.
Fine-tipped paintbrush Fisher Scientific NC9691026 Sable hair, size 00 or 000, can also find at craft stores
Fisherbrand Cover Glasses: Rectangles Fisher Scientific 12545MP Cover glass is unnecessary for cultured neurons already on glass coverslips.
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific 1255015 For cultured neurons already on glass coverslips, Superfrost slides may be unnecessary.
Freezer, -20°C VWR 76449-108
Glass coverslips Fisher Scientific 125480
Glycine Fisher Scientific BP381-1
Image processing software e.g. NIS Elements, ImageJ
Incubator Fisher Scientific 15-015-2633
Large petri dish, 100mm Fisher Scientific FB0875712
Molecular grade water Fisher Scientific BP24701
Mouse anti-Synapsin1 antibody Synaptic Systems 106-011
Normal donkey serum Jackson ImmunoResearch 017-000-121
Orbital shaker Fisher Scientific 02-106-1013
Parafilm Fisher Scientific 13-374-10
Pipette tips Fisher Scientific 02-707-025
Pipettes Fisher Scientific 14-388-100 Working volumes range from 3 µL to 500 µL
Plastic pasteur pipette Fisher Scientific 02-708-006
Precision tweezers/foreceps Fisher Scientific 12-000-122
Rabbit anti-PSD95 antibody Abcam ab18258 Other antibody pairs may work, as well, with optimization.
Refrigerator VWR 76470-402
Small petri dish, 60 mm Fisher Scientific FB0875713A
Timer Fisher Scientific 14-649-17
Tween 20 Fisher Scientific BP337-100

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References

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DetectSyn: Synapse घनत्व में परिवर्तन का पता लगाने के लिए एक त्वरित, निष्पक्ष फ्लोरोसेंट विधि
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Heaney, C. F., McArdle, C. J.,… More

Heaney, C. F., McArdle, C. J., Raab-Graham, K. F. DetectSyn: A Rapid, Unbiased Fluorescent Method to Detect Changes in Synapse Density. J. Vis. Exp. (185), e63139, doi:10.3791/63139 (2022).

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