Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Модель эндоваскулярной перфорации субарахноидального кровоизлияния в сочетании с магнитно-резонансной томографией (МРТ)

Published: December 16, 2021 doi: 10.3791/63150
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 2,3, 2,3, 1, 1
1Department of Neurosurgery, Charité - Universitätsmedizin Berlin, corporate member of Freie Universität Berlin, and Humboldt-Universität zu Berlin, and Berlin Institute of Health, 2Department of Experimental Neurology and Center for Stroke Research Berlin, Charité - Universitätsmedizin Berlin, corporate member of Freie Universität Berlin, Humboldt-Universität zu Berlin, and Berlin Institute of Health, 3NeuroCure Cluster of Excellence and Charité Core Facility 7T Experimental MRIs, Charité - Universitätsmedizin Berlin
* These authors contributed equally

Summary

Здесь мы представляем стандартизированную модель мыши SAH, индуцированную перфорацией эндоваскулярной нити, в сочетании с магнитно-резонансной томографией (МРТ) через 24 ч после операции для обеспечения правильного места кровотечения и исключения других соответствующих внутричерепных патологий.

Abstract

Модель перфорации эндоваскулярной нити для имитации субарахноидального кровоизлияния (SAH) является широко используемой моделью, однако этот метод может вызвать высокий уровень смертности, а также неконтролируемый объем SAH и другие внутричерепные осложнения, такие как инсульт или внутричерепное кровоизлияние. В этом протоколе представлена стандартизированная модель мыши SAH, индуцированная перфорацией эндоваскулярной нити, в сочетании с магнитно-резонансной томографией (МРТ) через 24 ч после операции для обеспечения правильного места кровотечения и исключения других соответствующих внутричерепных патологий. Вкратце, мышей C57BL/6J анестезируют внутрибрюшинной инъекцией кетамина/ксилазина (70 мг/16 мг/кг массы тела) и помещают в лежачее положение. После разреза средней линии шеи обнажаются общая сонная артерия (CCA) и каротидная бифуркация, и нерассасывающийся монофиламентный полипропиленовый шов 5-0 вводится ретроградным способом в наружную сонную артерию (ECA) и продвигается в общую сонную артерию. Затем нить инвагинируется во внутреннюю сонную артерию (ICA) и выдвигается вперед для перфорации передней мозговой артерии (ACA). После восстановления после операции мыши проходят МРТ 7,0 Т через 24 ч. Объем кровотечения может быть количественно определен и оценен с помощью послеоперационной МРТ, что позволяет создать надежную экспериментальную группу SAH с возможностью выполнения дальнейших анализов подгрупп на основе количества крови.

Introduction

Субарахноидальное кровоизлияние (SAH) вызвано разрывом внутричерепной аневризмы и представляет собой опасную для жизни чрезвычайную ситуацию, связанную со значительной заболеваемостью и смертностью, что составляет около 5% инсультов 1,2. Пациенты с САГ с выраженными головными болями, неврологической дисфункцией и прогрессирующим нарушением сознания3. Около 30% пациентов с САГ умирают в течение первых 30 дней после первоначального кровотечения4. Клинически 50% пациентов испытывают отсроченную черепно-мозговую травму (DBI) после ранней черепно-мозговой травмы. ДБИ характеризуется отсроченной ишемией головного мозга и отсроченным неврологическим дефицитом. Современные исследования показали, что синергетические эффекты нескольких различных факторов приводят к потере неврологической функции, включая разрушение гематоэнцефалического барьера, сокращение мелких артерий, микроциркуляторную дисфункцию и тромбоз 5,6.

Одним из уникальных аспектов SAH является то, что патогенез возникает из экстрапаренхимального расположения, но затем приводит к пагубным каскадам внутри паренхимы: патология начинается с накопления крови в субарахноидальном пространстве, вызывая множество внутрипаренхимальных эффектов, таких как нейровоспаление, апоптоз нейронных и эндотелиальных клеток, кортикальная распространяющаяся деполяризация и образование отека мозга7, См. 8.

Клинические исследования ограничены несколькими факторами, что делает животную модель критическим элементом в последовательной и точной имитации патомеханистических изменений заболевания. Были предложены различные протоколы модели SAH, например, аутологичная инъекция крови в cisterna magna (ACM). Также модифицирован метод с двойной инъекцией аутологичной крови в цистерну магна и зрительный хиазм цистерны (БТР) соответственно 9,10. В то время как аутологичная инъекция в кровь является простым способом имитации патологического процесса спазма сосудов и воспалительных реакций после субарахноидального кровоизлияния, последующее повышение внутричерепного давления (ВЧД) происходит относительно медленно, и никаких заметных изменений проницаемости гематоэнцефалического барьера индуцируется11,12. Другой метод, периартериальное размещение крови, обычно используемый в больших моделях SAH (например, обезьяны и собаки), включает размещение антикоагулянтной аутологичной крови или сопоставимых продуктов крови вокруг сосуда. Изменения диаметра артерии можно наблюдать с помощью микроскопа, служащего индикатором церебрального спазма сосудов после SAH13.

Barry et al. впервые описали модель эндоваскулярной перфорации в 1979 году, в которой базилярная артерия обнажается после удаления черепа; затем артерию прокалывают вольфрамовыми микроэлектродами с использованием микроскопической стереотаксической техники14. В 1995 году Бедерсон и Велкен модифицировали модель Зеа-Лонга церебральной ишемии и установили эндоваскулярную перфорацию, которая постоянно улучшалась с 15,16. Этот метод основан на том, что мыши и люди имеют схожую внутричерепную сосудистую сеть, известную как круг Уиллиса.

Для послеоперационной оценки и классификации SAH в мышиной модели были предложены различные подходы. Sugawara et al. разработали шкалу оценок, которая широко используется с 2008 года17. Этот метод оценивает тяжесть САГ на основе морфологических изменений. Однако для этого метода морфология мозговой ткани мыши должна быть исследована под непосредственным зрением, и поэтому мышь должна быть принесена в жертву для оценки. Кроме того, было установлено несколько методов определения тяжести САГ in vivo. Подходы варьируются от простой неврологической оценки до мониторинга внутричерепного давления (ICP) и различных методов радиологической визуализации. Кроме того, оценка МРТ была показана как новый, неинвазивный инструмент для оценки тяжести SAH, коррелирующий с неврологическим баллом18,19.

Здесь представлен протокол для модели SAH, вызванной эндоваскулярной перфорацией, в сочетании с послеоперационной МРТ. В попытке создать систему для объективизации количества кровотечений в условиях in vivo , мы также разработали систему для классификации SAH и количественной оценки общего объема крови на основе МРТ с высоким разрешением 7,0 Т с высоким разрешением T2. Такой подход обеспечивает правильную индукцию САГ и исключение других патологий, таких как инсульт, гидроцефалия или внутримозговое кровоизлияние (ICH) и осложнения.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Эксперименты проводились в соответствии с руководящими принципами и правилами, установленными Landesamt fuer Gesundheit und Soziales (LaGeSo), Берлин, Германия (G0063/18). В этом исследовании использовали самцов мышей C57Bl/6J (8-12 недель) весом 25 ± 0,286 г (средняя ± т.е. м.).

1. Подготовка животных

  1. Индуцировать анестезию путем введения кетамина (70 мг/кг) и ксилазина (16 мг/кг) внутрибрюшинно. Поддерживать нормальную температуру тела, способствуя быстрому введению глубокой анестезии. Проверьте адекватную седацию с болевым стимулом, таким как защемление пальца ноги, и проверьте отсутствие реакции.
  2. Тщательно сбрите волосы шеи мыши бритвой, очистите их 70% этанолом с последующим бетадином / хлоргексидином и нанесите 1% лидокаина на поверхность кожи для местного контроля боли.
  3. Поместите мышь в положение лежа на спине. Используйте ленту для фиксации конечностей и хвоста, осторожно растягивая кожу шеи на противоположную сторону операции. Одновременно немного приподнимите шею.
  4. Используйте офтальмологическую мазь (например, 5% декспантенол) для предотвращения обезвоживания глаз во время операции.

2. Индукция SAH

Figure 1
Рисунок 1: Пошаговые изображения хирургической техники. (А) Изображение обнаженной анатомии правой сонной артерии: идентифицированы ОАС и ее бифуркация в ИКА и ЭКА, а также небольшие ветви ЭКА (ОА и СТА). (B) ЭКА мобилизуется из окружающих тканей и перевязывается двумя швами перед ее разрезанием. Третья перевязка должна быть размещена свободно рядом с бифуркацией, не закупоривая ее. (C) ICA и CCA временно закупориваются (либо с перевязкой, либо клипсами) для предотвращения чрезмерного кровотечения при тщательном надрезе ЭКА. D) нить накала вставляется в ЭКА и переносится в ОАС. Предварительно организованная перевязка должна быть тщательно затянута, чтобы не возникало выпота крови, но продвижение нити остается возможным. (E) МКА и ОАС вновь открываются, а пень ЭКА необходимо отрегулировать в сторону черепа. Проталкивая нить ~ 9 мм вперед в ICA, бифуркация ACA-MCA будет достигнута, и сосуд затем перфорируется путем проталкивания нити накала ~ 3 мм дальше. (F) Нить накала изымается после обеспечения временной религации ОАС. Предварительно организованная лигирование ЭКА быстро закупоривается, и ОАС вновь открывается, чтобы разрешить реперфузию. Сокращения: ACA = передняя мозговая артерия, CCA = общая сонная артерия, ECA = наружная сонная артерия, MCA = средняя мозговая артерия, ICA = внутренняя сонная артерия, OA = затылочная артерия, PPA = крылогопалатиновая артерия, STA = верхняя щитовидная артерия. Шкала = 2 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

  1. Откройте кожу шеи стерильным скальпелем, от подбородка до верхнего края грудины (1,5 см), и тупо отделите слюнные железы от окружающей их соединительной ткани.
  2. Отделите группу мышц вдоль одной стороны [в данном случае правой стороны] трахеи, обнажив оболочку общей сонной артерии (ОАС), покрытую питательными кровеносными сосудами и венулами. ОАС и блуждающий нерв расположены в непосредственной близости друг от друга.
  3. Диссоциировать ВСС и оставить свободным 8-0 шелковый шов вокруг КЦА без его перевязки заранее. Обратите внимание на защиту блуждающего нерва, так как он легко повреждается (рисунок 1А).
  4. Тройная бифуркация CCA, ICA и ECA видна вдоль нижней задней трети диастаза. Рассекните дистальный конец ЭКА и сажайте сосуд в два раза дальше, насколько это возможно.
  5. Отсоедините ЭКА в средней точке дважды перевязанного сегмента, создав культю сосуда.
  6. Предварительно организуйте одну перевязку нити накала вокруг культи ЭКА, не закрывайте ее до успешного введения нити накаливания.
  7. Используйте шов или микрозажим для временного закрытия ICA и CCA (рисунок 1B).
  8. Сделайте небольшой разрез (примерно половину диаметра ЭКА) в ЭКА с помощью микрососудистых ножниц. Вставьте проленовую нить 5-0 (альтернативно 4-0) в ЭКА и перенесите ее в ОАС.
  9. Слегка закройте лигатуру на ЭКА, ослабив микрозажим на ICA и CCA (рисунок 1C).
  10. Осторожно оттяните нить накаливания и отрегулируйте культю ECA в черепном направлении, инвагинируя нить через бифуркацию в ICA (рисунок 1D).
  11. Направьте наконечник нити медиально под углом ~30° к средней линии трахеи и ~30° к горизонтальной плоскости. Вытолкните нить накаливания вперед внутри ICA. После достижения бифуркации ACA-MCA встречается сопротивление (~9 мм).
  12. Продвиньте нить на 3 мм дальше, перфорируя правый ACA. Быстро выводят нить на культю ЭКА, позволяя крови течь в субарахноидальное пространство.
  13. Держите нить накала в этом положении около 10 с (рисунок 1Е). Наличие мышечного тремора, ипсилатерального миоза, задыхания, измененного сердечного ритма и недержания мочи может быть подтверждающим свидетельством успешной операции.
  14. Временно закройте ККА, чтобы избежать избыточной кровопотери. Вытащите нить мгновенно и обжарьте ЭКА заранее подготовленным швом. Вновь открыть ОАС и разрешить реперфузию и дальнейший выпот крови в субарахноидальное пространство (рисунок 1F).
  15. После проверки на утечку кровотечения продезинфицируйте кожу, окружающую рану, чтобы предотвратить послеоперационные инфекции кожи, и зашить рану нерассасывающимся швом из полиэфирного волокна 4-0.
  16. Поместите мышь в термобокс до тех пор, пока сознание не восстановится. Подождите, пока животное полностью проснется, и убедитесь, что оно восстановило достаточное сознание для поддержания грудинного покоя. Не возвращайте животных в компанию других мышей до полного выздоровления.
  17. Вводят 200-300 мг/кг парацетамола с массой тела для послеоперационного обезболивания.
  18. Проверяйте мышей ежедневно после операции.

3. Измерение МРТ

  1. Через 24 часа после операции выполните МРТ с помощью сканера грызунов (Таблица материалов) и специального резонатора головы мыши - здесь использовался 20-миллиметровый квадратурный объемный резонатор передачи/приема.
  2. Поместите мышь на подогретое одеяло для циркуляции воды, чтобы обеспечить постоянную температуру тела ~ 37 °C. Индуцировать анестезию 2,5% изофлурана в смеси O2/N2O (30%/70%) и поддерживать 1,5-2% изофлурана через лицевую маску под непрерывным контролем вентиляции.
  3. Сначала выполните быстрое эталонное сканирование, получив 3 ортогональных пакета срезов (Tri-Pilot-Multi, FLASH со временем повторения TR/echo TE = 200 мс/3 мс, 1 среднее, угол сальто FA = 30°, поле зрения FOV = 28 мм x 28 мм, матрица MTX = 256 x 256, толщина среза 1 мм, общее время захвата TA = 30 с).
  4. Затем для визуализации используйте для визуализации 2D-взвешенную T2-взвешенную 2D-спин-эхо-последовательность (параметры визуализации TR/TE = 5505 мс/36 мс, коэффициент RARE 8, 6 средних значений, 46 смежных осевых срезов толщиной среза 0,35 мм для покрытия всего мозга, FOV = 25,6 мм x 25,6 мм, MTX = 256 x 256, TA = 13 мин).
  5. Если результат неясен, используйте дополнительную градиентную эхо-последовательность, вызванную дыханием T2*, с той же изодантностью, что и при сканировании T2w (2D FLASH, TR/TE = 600 мс/6,3 мс, FA = 30°, 1 среднее, 20 осевых срезов толщиной 0,35 мм, FOV и MTX идентичны T2w, TA = 5-10 мин в зависимости от скорости дыхания).
  6. Перенесите данные в формат изображения DICOM и используйте программное обеспечение ImageJ для классификации SAH и объемной обработки сгустков крови. Подробная информация о количественной оценке приведена в качестве пошагового руководства в дополнительном материале (дополнительный рисунок 1).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Смертность
Для этого исследования в общей сложности 92 самца мышей C57Bl/6J в возрасте от 8 до 12 недель были подвергнуты операции SAH; в них мы наблюдали общий уровень смертности 11,9% (n = 12). Смертность наблюдалась исключительно в течение первых 6-24 ч после операции, предполагая периоперационную смертность, а также само кровотечение SAH в качестве наиболее вероятных способствующих факторов.

Степень кровотечения SAH
В общей сложности 50 мышей получили МРТ 24 ч после операции, чтобы подтвердить SAH и обеспечить обнаружение других сопутствующих патологий, включая подострый ишемический инсульт и гидроцефалию. Остальные животные были использованы для более ранних сканирований, чтобы выбрать адекватное время для послеоперационной МРТ. Среди 50 исследованных мышей в 24-часовую точку времени n = 7 животных, у которых не было SAH (степень кровотечения 0) и n = 5 мышей, у которых был обнаружен дополнительный инсульт и / или ICH (кровотечение IV степени). Степень кровотечения SAH была количественно оценена на основе Т2-взвешенного МРТ-сканирования следующим образом (рисунок 2A, B):

степень 0: SAH или кровоизлияние не идентифицированы (14%)
марка I: толщина SAH ≤0,80 мм (24%)
марка II: толщина SAH >0,8 и <1,6 мм (28%)
марка III: Толщина SAH ≥1,6 мм (24%)
степень IV: SAH с ICH и / или инсультом (10%).

Figure 2
Рисунок 2: Система классификации SAH с соответствующим объемом крови и изображениями МРТ. (A) Т2-взвешенные осевые участки МРТ, изображающие репрезентативные изображения, классифицирующие класс SAH. Степень 0: не выявлено САГ или кровоизлияния (14%); марка I: SAH толщиной ≤0,80 мм; сорт II: толщина SAH >0,8 и <1,6 мм; марка III: толщина SAH ≥1,6 мм; степень IV: SAH с ICH и/или инсультом. (B) Круговая диаграмма, показывающая распределение класса SAH у экспериментальных мышей. (С,Э) Расчетный объем кровотечения SAH на основе формулы V = A1 + A2 + ... + Ax) · d, с помощью которого область кровотечения определяется с помощью ImageJ на каждом участке слайда, а сумма всех кровоточащих областей умножается на соответствующую толщину слайда МРТ. (D) Общий объем кровотечения каждого сорта SAH на основе оценки объема Kothari abc/2. Значения выражаются как среднее ± SEM. Сокращения: ICH = внутримозговое кровоизлияние, МРТ = магнитно-резонансная томография. Шкала = 5 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Объем кровотечения
Для I-III степени объем кровотечения количественно определялся двумя различными методами:

Метод A: Общий объем кровотечения был рассчитан на основе оценки объема abc/2 Kathari et al., модификации уравнения для объема эллипсоида, которое широко использовалось в клинических условиях для оценки объема ICH (рисунок 2D)20.

Метод B: Расчетный объем кровотечения SAH оценивали на основе формулы V = (A1 + A2 + ... + Ax) · d, с помощью которого область кровотечения определяли с помощью ImageJ на каждом участке слайда и сумму всех кровоточащих участков умножали на соответствующую толщину слайда МРТ («Ai» соответствует области кровотечения на срезе 'i', 'x' - общее количество срезов, 'd' соответствует толщине среза). Этот метод учитывал неравномерность формы (рисунок 2C,E). Как и ожидалось, метод B показал больший диапазон значений в каждой подгруппе. Однако оба метода показали существенную разницу в соответствующих классах кровотечения, которые были основаны на осевой толщине SAH и описаны в следующем пункте. На дополнительном рисунке 2 показан объем SAH всех подгрупп; как и ожидалось, iv класс носил гетерогенный характер, поскольку он также содержал сопутствующий ICH.

Статистический анализ и цифры
Данные были проанализированы с использованием GraphPad Prism для статистического анализа. Односторонний анализ ANOVA использовался для сравнения нескольких групп. Значения отображаются как средние ± стандартных погрешностей, а p-значения p < 0,05 считались статистически значимыми. Элементы рисунка 1 и рисунка 2 были составлены с использованием BioRender.com.

Дополнительный рисунок 1: Пошаговое руководство по количественной оценке объема кровотечения с помощью ImageJ. Импортируйте изображения с помощью ImageJ и введите «Strg+I», чтобы отобразить размерные данные. Затем установите масштаб для изображения. Определите все изображения, на которых можно увидеть SAH. Для метода А определите срез с наибольшей областью кровотечения и измерьте краниокаудальную длину (=a), а также посредственную длину (=b) двух ортогональных осей, которые охватывают эллипсоидный объем SAH. Вентродорная размерность (=c) формы эллипсоида может быть оценена на основе толщины среза и количества срезов, на которых виден SAH [c = толщина среза x количество срезов]. Рассчитайте объем на основе формулы:V= abc/2. Для метода B измерьте области кровотечения на каждом срезе отдельно, а затем рассчитайте объем на основе формулы: V = (A1 + A2 + ... + Ax) · d, по которому d= толщина среза. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 2: Объемы кровотечений всех подгрупп. (A) Объем кровотечения (мм3) в каждой подгруппе на основе метода A с использованием формулы V= abc/2. (B) Объемы кровотечения (мм3) соответствующих подгрупп с использованием метода B (формула V = (A1 + A2 + ... + Ax) · г; d= толщина среза). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Таким образом, стандартизированная модель мыши SAH, индуцированная операцией перфорации эндоваскулярной нити, представлена с незначительной инвазией, коротким оперативным временем и приемлемыми показателями смертности. МРТ проводится 24 ч после операции для обеспечения правильного места кровотечения и исключения других соответствующих внутричерепных патологий. Кроме того, мы классифицировали различные классы кровотечения SAH и измерили объемы кровотечения, что позволило проводить дальнейший анализ подгрупп на основе степени кровотечения.

Адекватное позиционирование мыши влияет на успешность правильной перфорации. Шея мыши должна быть слегка вытянута в противоположную сторону операции, при этом голова должна быть слегка приподнята. Это обнажает трифуркацию и облегчает доступ к проколу. Если продвижение нити накала не удается, может быть полезно немного отвести нить накаливания к трифуркации и отрегулировать положение головки до тех пор, пока продвижение не станет возможным без какого-либо сопротивления.

Интраоперационная защита нервов имеет решающее значение. Нарушения блуждающего нерва и шейного сплетения могут вызвать изменения дыхательного и сердечного ритмов, а некоторые мыши могут даже погибнуть из-за злокачественных аритмий. Если эти симптомы возникают, важно приостановить процедуру на несколько минут, пока дыхание и частота сердечных сокращений не стабилизируются.

Уменьшение интраоперационной кровопотери жизненно важно для улучшения выживаемости мышей. Основываясь на нашем опыте, перевязку двойным швом лучше всего применять близко к ЭКА. Мы отключаем ЭКА в середине двух перевязок, чтобы предотвратить обратный поток крови из дистальной культи ЭКА. Когда нить вставлена в ЭКА, предварительно подготовленный шов должен быть перевязан, чтобы предотвратить выпот крови из разреза. Очень важно не слишком плотно сжимать сосуд, так как это препятствует правильному продвижению нити.

Соответствующая глубина введения нити накаливания имеет важное значение для успешной индукции SAH. Из-за возраста используемых мышей (8-12 недель) мы вставляем нить ~ 9 мм внутрь ICA и останавливаемся при столкновении с сопротивлением, а затем продвигаемся примерно на 3 мм дальше для перфорации. Введение нити накала недостаточно глубоко может привести к недостаточной перфорации, не вызывая SAH, тогда как чрезмерное введение может привести к инсульту и/или ICH (рисунок 3). В то же время оригинальная анатомия и сосудистые структуры мышей должны быть сохранены как можно лучше во время операции. Например, затылочная артерия (ОА) или верхняя щитовидная артерия (STA), а также питательные кровеносные сосуды на оболочке должны быть сохранены как можно больше.

Figure 3
Рисунок 3: Анатомия мозга мыши и макроскопические изображения SAH. (A) Схема сосудистой анатомии мыши, показывающая место перфорации нити. (B) Классическое макроскопическое изображение успешной индукции SAH. Перед удалением мозга была выполнена перфузия 1x PBS. (C) Макроскопический вид мыши, в которой нить накала была задвинута слишком глубоко, вызывая ICH. Сокращения: ACA = передняя мозговая артерия, ECA = наружная сонная артерия, CCA = общая сонная артерия, ICA = внутренняя сонная артерия, ICH = внутримозговое кровоизлияние, L = левая, MCA = средняя мозговая артерия, PPA = крылогопалатиновая артерия, R = правая. Шкала = 3 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Модель эндоваскулярной перфорации является широко используемой животной моделью для изучения SAH, но средства для обеспечения степени кровотечения и исключения других патологий, таких как инсульт или внутримозговое кровоизлияние, недостаточно стандартизированы в литературе21. Как и в случае с любой оперативной моделью на животных, успешность и надежность индукции SAH зависят от опыта хирурга.

В настоящее время модель эндоваскулярной перфорации является одним из самых популярных методов экспериментальной индукции SAH у мышей. Такой подход не требует трепанации черепа и точно напоминает процессы, происходящие у людей, страдающих аневризмальным САГ22. К преимуществам можно отнести близкую имитацию патофизиологии после аневризматического САГ, относительно острых и отсроченных реакций23. Кроме того, было показано, что показатели смертности в этой модели аналогичны показателям клинических исследований у пациентов, страдающих аневризмальным SAH23. По сравнению с моделями инъекций в кровь, изменения проницаемости гематоэнцефалического барьера более точно имитируются, и более высокие показатели спазма сосудов достигаются при перфорации нити11,24. Модели инъекций в кровь являются более инвазивными и, следовательно, представляют больший риск повреждения тканей по сравнению с менее инвазивной моделью эндоваскулярной перфорации. Тем не менее, следует отметить, что основным преимуществом методов инъекций крови является легко контролируемый объем крови23. Важно учитывать стандартизацию скорости впрыска, поскольку изменения ВЧД в значительной степени зависят от скорости впрыска23. Помимо этих классических моделей, комбинация инъекций эластазы для индуцирования образования аневризмы и гипертонии путем односторонней нефрэктомии, в конечном итоге приводящей к разрыву аневризмы, представляет собой интересную модель для изучения субарахноидального кровоизлияния в более патофизиологически реалистичной обстановке25. Интеграция таких методов с генетически модифицированными мышами будет представлять интерес для будущих исследований.

Предыдущие системы классификации SAH для модели перфорации нити основаны на количестве видимой субарахноидальной крови в разных сегментах мозга после того, как мышь была принесена в жертву17. Следовательно, эти системы классификации не позволяют проводить долгосрочные исследования, когда кровь уже была резорбирована во время жертвоприношения. В клинических условиях SAH классифицируется на основе клинической картины, а также толщины SAH на визуализации, соответствующей клиническому исходу 1,26,27,28. Следовательно, в попытке классифицировать тяжесть кровотечения неинвазивно, мы добавили стандартизированное последующее обследование МРТ к рентгенографической оценке SAH, с помощью которого классификация была основана на ранее существовавших шкалах классификации человека, адаптируя систему классификации ранее опубликованной системы классификации МРТ у мышей SAH Egashira et al.18. Этот подход также обеспечивает количественную оценку общего объема крови и исключение животных с другими сопутствующими внутричерепными патологиями (например, инсульт, ICH, гидроцефалия). Некоторые исследования предложили внутричерепное давление (ВЧД), церебральную перфузию и мониторинг артериального давления в качестве доказательства успешной индукции SAH, что может быть дополнительными полезными инструментами29. Косвенные способы оценки тяжести SAH и потенциального внутрипаренхимального повреждения включают объединение клинических результатов с гистологическим окрашиванием для маркеров гибели клеток, таких как p53, TUNEL или каспаза-3. Тем не менее, эти косвенные инструменты, такие как мониторинг ВЧД, а также неврологические, могут не различать аккуратно другие патологии, такие как инсульт, внутричерепное кровоизлияние или гидроцефалия. Несмотря на преимущества классификации МРТ, есть один существенный недостаток этого подхода в отношении его осуществимости: МРТ не так широко доступна для лабораторий, как другие методы. Это ограничивает широкое внедрение систем классификации МРТ в экспериментальных SAH. Однако, когда она доступна, представленная система классификации МРТ добавляет инструмент для стандартизации экспериментальных моделей SAH, что облегчает воспроизводимость и сопоставимость экспериментов23. В этом исследовании, несмотря на наблюдаемые клинические изменения во время операции, все еще было 14% уровень мышей без признаков SAH на послеоперационной МРТ. Возможно, мыши в этой подгруппе страдали от микрогемортов, не обнаруживаемых на МРТ (аналогично пациентам с САГ с отрицательной КТ, но наличием ксантохромии при люмбальной пункции). Эти мыши были исключены из этой экспериментальной установки для дальнейшего анализа. Технической причиной этих «отсутствий кровотечений» на МРТ может быть недостаточное введение нити накаливания, что приводит к отсутствию перфорации (например, из-за неправильного размещения в ОА или крыловидной небной артерии (PPA)). Кроме того, успешно перфорированный сосуд может снова закрыться после снятия нити накала, предотвращая САГ.

Таким образом, представлена стандартизированная модель экспериментальной аневризмальной САГ по эндоваскулярной перфорации в сочетании с МР-визуализацией через 24 ч после операции для подтверждения и оценки кровотечения и исключения других соответствующих внутричерепных патологий.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Отсутствие конфликта интересов

Acknowledgments

SL был поддержан Китайским советом по стипендиям. КТ была поддержана стипендией БИГ-МД Берлинского института здравоохранения и Фонда Зонненфельда. RX поддерживается Программой ученых-клиницистов БИГ-Шарите, финансируемой Charité-Universitätsmedizin Berlin и Берлинским институтом здравоохранения. Мы признаем поддержку со стороны Немецкого исследовательского фонда (DFG) и Фонда публикаций открытого доступа Charité - Universitätsmedizin Berlin.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Eye cream Bayer 815529836 Bepanthen
Images analysis software ImageJ Bundled with Java 1.8.0_172
Ligation suture (5-0) SMI Silk black USP
Light source for microscope Zeiss CL 6000 LED
Ketamine CP-pharma 797-037 100 mg/mL
MRI Bruker Pharmascan 70/16  7 Tesla
MRI images acquired software Bruker Bruker Paravision 5.1
Paracetamol (40 mg/mL) bene Arzneimittel 4993736
Prolene filament (5-0) Erhicon EH7255
Razor Wella HS61
Surgical instrument (Fine Scissors) FST 14060-09
Surgical instrument (forceps#1) AESCULAP FM001R
Surgical instrument (forceps#2) AESCULAP FD2855R
Surgical instrument (forceps#3) Hammacher HCS 082-12
Surgical instrument (Needle holder) FST 91201-13
Surgical instrument (Vannas Spring Scissors) FST 15000-08
Surgical microscope Zeiss Stemi 2000 C
Ventilation monitoring Stony Brook Small Animal Monitoring & Gating System
Wounding suture(4-0) Erhicon CB84D
Xylavet CP-pharma 797-062 20 mg/mL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Macdonald, R. L., Schweizer, T. A. Spontaneous subarachnoid haemorrhage. The Lancet. 389 (10069), 655-666 (2017).
  2. van Gijn, J., Kerr, R. S., Rinkel, G. J. Subarachnoid haemorrhage. The Lancet. 369 (9558), 306-318 (2007).
  3. Abraham, M. K., Chang, W. -T. W. Subarachnoid hemorrhage. Emergency Medicine Clinics of North America. 34 (4), 901-916 (2016).
  4. Schertz, M., Mehdaoui, H., Hamlat, A., Piotin, M., Banydeen, R., Mejdoubi, M. Incidence and mortality of spontaneous subarachnoid hemorrhage in martinique. PLOS ONE. 11 (5), 0155945 (2016).
  5. Okazaki, T., Kuroda, Y. Aneurysmal subarachnoid hemorrhage: intensive care for improving neurological outcome. Journal of Intensive Care. 6 (1), 28 (2018).
  6. Kilbourn, K. J., Levy, S., Staff, I., Kureshi, I., McCullough, L. Clinical characteristics and outcomes of neurogenic stress cadiomyopathy in aneurysmal subarachnoid hemorrhage. Clinical Neurology and Neurosurgery. 115 (7), 909-914 (2013).
  7. de Oliveira Manoel, A. L., et al. The critical care management of spontaneous intracranial hemorrhage: a contemporary review. Critical Care. 20 (1), 272 (2016).
  8. Schneider, U. C., et al. Microglia inflict delayed brain injury after subarachnoid hemorrhage. Acta Neuropathologica. 130 (2), 215-231 (2015).
  9. Delgado, T. J., Brismar, J., Svendgaard, N. A. Subarachnoid haemorrhage in the rat: angiography and fluorescence microscopy of the major cerebral arteries. Stroke. 16 (4), 595-602 (1985).
  10. Piepgras, A., Thomé, C., Schmiedek, P. Characterization of an anterior circulation rat subarachnoid hemorrhage model. Stroke. 26 (12), 2347-2352 (1995).
  11. Suzuki, H., et al. Heme oxygenase-1 gene induction as an intrinsic regulation against delayed cerebral vasospasm in rats. Journal of Clinical Investigation. 104 (1), 59-66 (1999).
  12. Dudhani, R. V., Kyle, M., Dedeo, C., Riordan, M., Deshaies, E. M. A Low mortality rat model to assess delayed cerebral vasospasm after experimental subarachnoid hemorrhage. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (71), e4157 (2013).
  13. Iuliano, B. A., Pluta, R. M., Jung, C., Oldfield, E. H. Endothelial dysfunction in a primate model of cerebral vasospasm. Journal of Neurosurgery. 100 (2), 287-294 (2004).
  14. Barry, K. J., Gogjian, M. A., Stein, B. M. Small animal model for investigation of subarachnoid hemorrhage and cerebral vasospasm. Stroke. 10 (5), 538-541 (1979).
  15. Bederson, J. B., Germano, I. M., Guarino, L. Cortical blood flow and cerebral perfusion pressure in a new noncraniotomy model of subarachnoid hemorrhage in the rat. Stroke. 26 (6), 1086-1092 (1995).
  16. Veelken, J. A., Laing, R. J. C., Jakubowski, J. The Sheffield model of subarachnoid hemorrhage in rats. Stroke. 26 (7), 1279-1284 (1995).
  17. Sugawara, T., Ayer, R., Jadhav, V., Zhang, J. H. A new grading system evaluating bleeding scale in filament perforation subarachnoid hemorrhage rat model. Journal of Neuroscience Methods. 167 (2), 327-334 (2008).
  18. Egashira, Y., Shishido, H., Hua, Y., Keep, R. F., Xi, G. New grading system based on magnetic resonance imaging in a mouse model of subarachnoid hemorrhage. Stroke. 46 (2), 582-584 (2015).
  19. Mutoh, T., Mutoh, T., Sasaki, K., Nakamura, K., Taki, Y., Ishikawa, T. Value of three-dimensional maximum intensity projection display to assist in magnetic resonance imaging (MRI)-based grading in a mouse model of subarachnoid hemorrhage. Medical Science Monitor. 22, 2050-2055 (2016).
  20. Kothari, R. U., et al. The ABCs of measuring intracerebral hemorrhage volumes. Stroke. 27 (8), 1304-1305 (1996).
  21. Leclerc, J. L., et al. A comparison of pathophysiology in humans and rodent models of subarachnoid hemorrhage. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 71 (2018).
  22. Titova, E., Ostrowski, R. P., Zhang, J. H., Tang, J. Experimental models of subarachnoid hemorrhage for studies of cerebral vasospasm. Neurological Research. 31 (6), 568-581 (2009).
  23. Marbacher, S., et al. Systematic review of in vivo animal models of subarachnoid hemorrhage: Species, standard parameters, and outcomes. Translational Stroke Research. 10 (3), 250-258 (2019).
  24. Marbacher, S., Fandino, J., Kitchen, N. D. Standard intracranial in vivo animal models of delayed cerebral vasospasm. British Journal of Neurosurgery. 24 (4), 415-434 (2010).
  25. Thompson, J. W., et al. In vivo cerebral aneurysm models. Neurosurgical Focus. 47 (1), 1-8 (2019).
  26. Frontera, J. A., et al. Prediction of symptomatic vasospasm after subarachnoid hemorrhage: The modified fisher scale. Neurosurgery. 59 (1), 21-26 (2006).
  27. Fisher, C. M., Kistler, J. P., Davis, J. M. Relation of cerebral vasospasm to subarachnoid hemorrhage visualized by computerized tomographic scanning. Neurosurgery. 6 (1), 1-9 (1980).
  28. Wilson, D. A., et al. A simple and quantitative method to predict symptomatic vasospasm after subarachnoid hemorrhage based on computed tomography: Beyond the fisher scale. Neurosurgery. 71 (4), 869-875 (2012).
  29. Schüller, K., Bühler, D., Plesnila, N. A murine model of subarachnoid hemorrhage. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (81), e50845 (2013).

Tags

Неврология выпуск 178
Модель эндоваскулярной перфорации субарахноидального кровоизлияния в сочетании с магнитно-резонансной томографией (МРТ)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liu, S., Tielking, K., von Wedel,… More

Liu, S., Tielking, K., von Wedel, D., Nieminen-Kelhä, M., Mueller, S., Boehm-Sturm, P., Vajkoczy, P., Xu, R. Endovascular Perforation Model for Subarachnoid Hemorrhage Combined with Magnetic Resonance Imaging (MRI). J. Vis. Exp. (178), e63150, doi:10.3791/63150 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter