Summary
このプロトコールは、脱細胞化された精密切断肺スライスに肺胞上皮2型細胞、線維芽細胞、および内皮細胞を再移入することによって、再現性のある小規模の操作された肺組織を生成する方法を記載している。
Abstract
エクスビボでの天然肺胞の建築的および細胞的複雑さを再現する改良された3次元(3D)肺モデルが必要である。最近開発されたオルガノイドモデルは、インビトロでの肺上皮前駆細胞の拡大および研究を促進したが、これらのプラットフォームは、典型的には、マウス腫瘍由来マトリックスおよび/または血清に依存し、1つまたは2つの細胞系譜のみを組み込んでいる。ここでは、脱細胞化精密切断肺スライス(PCLS)の多系統再細胞化に基づいて人工肺組織(ELT)を生成するためのプロトコルについて説明する。ELTは、天然の肺によく似た細胞外マトリックス(ECM)基質内に、肺胞上皮、間葉、および内皮を含む肺胞様構造を含む。組織を生成するために、ラット肺をアガロースで膨張させ、厚さ450μmのスライスにスライスし、ストリップに切断し、脱細胞化する。得られた無細胞ECM足場を、次いで、初代内皮細胞、線維芽細胞、および肺胞上皮2型細胞(AEC2s)で再播種する。AEC2sは、無血清の化学的に定義された増殖培地を用いてELT培養で少なくとも7日間維持することができる。組織調製および培養プロセス全体を通して、スライスはカセットシステムにクリップされ、複数のELTの取り扱いおよび標準化された細胞播種を並行して容易にする。これらのELTは、肺胞内の細胞間および細胞-マトリックス相互作用、ならびにAEC2sおよびそのニッチを調節する生化学的シグナルの調査を容易にする有機型培養プラットフォームを表す。
Introduction
肺胞は遠位肺の機能単位であり、肺胞上皮1型細胞(AEC1)および2型細胞(AEC2s)によって裏打ちされたガス交換空域の網目を含む。上皮の根底にあるのは、毛細血管の緻密なネットワークと支持する間葉であり、これらはすべて、これらの繊細な気嚢1に強度と柔軟性の両方を提供する細胞外マトリックス(ECM)足場によって支えられている。肺胞はまた、特発性肺線維症2、急性呼吸窮迫症候群3、および重度のコロナウイルス疾患-19(COVID-19)4を含む多数の肺病理における傷害部位でもある。過去10年間の研究により、肺上皮内の顕著な可塑性が明らかになりましたが、一部の環境では遠位肺修復を可能にし、他の環境では修復を妨げるメカニズムは、依然として激しい調査の領域です5。肺胞をモデル化するための改良された in vitro プラットフォームの開発は、肺胞生物学、再生、および治療の研究を容易にするであろう。
AEC2sは自己再生してAEC1に分化し、したがって遠位肺6、7、8の初代幹細胞と考えられている。しかしながら、これらの細胞は、表現型9を失うことなく初代AEC2sを培養することに関連する困難さを考えると、in vitro研究に特に課題を提起する。従来の2次元(2D)培養では、AEC2sはAEC1様細胞10の平坦化およびいくつかの特徴を採用する。対照的に、3D培養戦略(最も一般的にはオルガノイド)は、初代AEC2s6、11、12の分化特徴の維持を支持し、多能性幹細胞(PSC)由来AEC2s 13、14の長期培養を可能にする。オルガノイドは、遠位肺発生15、ウイルス感染11、15、およびAEC2関連遺伝病13、16、17をモデル化するために使用されており、AEC2の生物学および再生に関する重要な洞察を可能にしている。しかしながら、これらの培養モデルは、典型的には、1つまたは2つの細胞系譜のみを含み、天然肺胞のアーキテクチャまたはECM基質のいずれかを反復することができないゲル型マトリックスに細胞を埋め込む。
ECMは、分子的、トポロジカル、および機械的手がかりを介して細胞表現型および挙動の重要な調節因子である。幹細胞の運命を調節する組織特異的ニッチの重要な構成要素を含む;局所的に分泌される成長因子18、19、20、21の利用可能性を調節する貯水池として機能する。したがって、天然ECM上で細胞を培養することは、インビボ組織の生物学をモデル化するためのインビトロシステムの予測能力を増加させる可能性がある。脱細胞化は、洗剤、酵素、または物理的もしくは他の方法を介して組織から細胞材料を除去するプロセスであり、慎重に実施すれば、天然器官のECM足場の大部分を保存することができる22,23。このような足場は、3D生体模倣培養のために細胞を再移入することができる。しかしながら、脱細胞化足場は組織工学用途に広く使用されているが、日常的な細胞培養のためのそれらの使用は限られていた。いくつかの以前の研究は、肺スライスまたは小さな肺組織セグメントの脱細胞化および再細胞化を報告している。概念実証研究24,25,26に加えて、再移入肺スライスは、線維芽細胞-マトリックス接着27,28を研究し、線維芽細胞表現型に対する罹患肺マトリックスの影響を調査するために使用されている27,29。精密に切断された組織スライスを生成するために利用可能な改良された技術により、脱細胞化肺スライスは、肺胞、気道、および血管部分構造を維持しながら、細胞を培養するための便利で小規模のプラットフォームを提供することができる。複数の細胞タイプを組み込むことで、生理学的に関連する3D環境内での細胞間相互作用の研究が可能になります。しかし、培養プロセス全体を通して組織の取り扱いを容易にし、既知の数の細胞で組織を制御および再現性のある播種を確実にするために、改善された戦略が必要である。
ここでは、脱細胞化精密切断肺スライス(PCLS)に一次内皮細胞、AEC2s、および線維芽細胞を再移入することによって、人工肺組織(ELT)を生成するためのプロトコルを提示する。先に述べた人工心臓組織システム30および肺全体の脱細胞化-再細胞化戦略22,31の適応において、我々は、ラット肺からPCLSを切断し、下流の操作を簡素化および標準化する再利用可能な組織培養カセットにスライスをクリップする手順を説明する。クリッピングされたスライスは、非細胞ECM足場を形成するために脱細胞化され、カスタマイズされた播種浴に再移入される。肺スライス足場は、重要なECMコンポーネントとアーキテクチャを保存し、少なくとも7日間、多系統肺胞様構造内のAEC2の成長をサポートします。ELTは、生理学的に関連する3Dマトリックス内の新しい肺胞共培養システムであり、AEC2sおよび肺胞の基本的な生物学的研究を促進しながら、肺組織工学戦略の開発をサポートするはずである。
Protocol
この論文に記載されているすべての動物実験手順は、エール大学施設動物ケアおよび使用委員会によって承認されました。
1. 組織培養カセットの作成と播種浴
注:一旦作られた組織培養カセットおよび播種浴は、オートクレーブ処理され、ELT培養の反復ラウンドに再利用され得る。
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組織培養カセット
- レーザーカッターを使用して、組織培養カセットフレームを切断し、 それぞれ補足ファイル1および補足ファイル 2に記載されている設計に従って、厚さ3/ 32インチのポリテトラフルオロエチレン(PTFE)から切り取ります。レーザーカッターを使用して、 補足ファイル3に従って厚さ1/16インチのPTFEから組織培養カセットタブを切断します。80%のパワーと15%の速度(30Wレーザーカッターの場合)を使用して3倍の輪郭をカットします。
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播種バス
- 播種浴のCADファイル(補足ファイル4と補足ファイル5)を使用して、透明な樹脂を使用して、播種浴金型のベースとリングをそれぞれ3Dプリントします。
- PDMS放出を助けるために、使用前に蒸留水中の10%ポロクサマー407の溶液に金型を一晩浸す。風乾させた後、リングを金型のベースに嵌め込み、漏れを防ぐために柔軟なプラスチックフィルムで包みます。
- PDMSエラストマーを硬化剤と10:1の比率で混合して、ポリジメチルシロキサン(PDMS)をモールドあたり少なくとも60g調製し、3Dプリントモールドに注ぎます。真空デシケーターでPDMSを30分間脱気し、気泡を除去します。
- 60°Cで8時間播種浴を焼く。
2. ラット肺からの精密切断肺スライスの調製
- 臓器収穫
- 図 1 に示すように、重力駆動肢とポンプ駆動肢で構成される分割灌流システムを準備します。肺動脈(PA)カニューレをチューブの端部に接続し、長さ1/2インチのLS 14シリコンチューブに取り付けられた1/16インチの有刺鉄線Yコネクタと3/32インチのメスルアーロックコネクタで構成されています(図1参照)。この時点でカニューレに逆止弁を取り付けないでください。
- 抗凝固および血管拡張のために、それぞれ100U/mLヘパリンおよび0.01mg/mLニトロプルシドナトリウム(SNP)を含むPBSでラインをプライミングする。灌流ポンプを30mL/minにあらかじめ設定してください。
注:ヘパリン溶液に新鮮なSNPを加え、光から保護してください。 - 成人(8〜12週齢、約300〜350g)のSprague-Dawleyラットに、抗凝固のために400U / kgのヘパリンの腹腔内(IP)注射、続いて麻酔のためにケタミン(75mg / kg)およびキシラジン(5mg / kg)のIP注射を投与する。有害な刺激(つま先のピンチ)に対する反応の欠如を介して麻酔の外科的平面を確認する。
- バリカンを使って毛皮の胸と腹部をトリミングします。その後、70%エタノールをスプレーし、10%ポビドンヨウ素で3xを拭きます。
- ラットの歯の鉗子で横隔膜のレベルの下の皮膚をつかみます。次に、細かい尖ったはさみで皮膚に1/2インチの横切開を行います。露出した腹筋膜を鉗子でつかみ、筋膜に1/2インチの横切開を行い、上腹部の幅を横切って皮膚と筋膜を通して切開部を広げる。
- 細かいはさみの先端を使用して、前横隔膜の中心に小さな切開(1/8インチ以下)を作り、肺を胸郭に後退させます。横隔膜の切開部を胸部の全幅にわたって広げる。
- 肺を傷つけないように注意しながら、胸郭の全高を通って首に向かって2つの垂直切開を行います。左肋骨を通して切開を伸ばして鎖骨を切断し、首の側面に沿って喉頭のレベルまで切り取り、気管を露出させる。
- 周囲の結合組織および食道から自由の気管を解剖する。喉頭に近い2つの軟骨リングの間の気管の前半分を横切って横切開を行う。切開部のレベルより下の気管の後ろに4-0ポリプロピレン縫合糸を通し、外科医の結び目の前半を2つのねじれでゆるやかに結びます。
- 一方向逆止弁に接続された1/16インチ有刺鉄線Yコネクタと、3/32インチメスルアーロックコネクタ( 図1参照)を備えた1/2インチの長さのLS 14シリコーンチューブからなるカニューレを気管内に置き、Yコネクタの片肢を肺の方向に向かって気管切開部に挿入します。
- あらかじめ結ばれた縫合ループを気管の周りに挿入されたカニューレのレベルに置き、挿入されたYコネクタの周りを締めてカニューレを所定の位置に固定します。縫合糸の2つのシングルツイストスローを追加して結び目を完成させます。
- 10mLシリンジに空気を満たし、気管カニューレのルアーロックに接続します。
- 湾曲した止血剤を用いて下大静脈を横隔膜に近づけ、右心室(RV)を介して150Uヘパリン(1000U/mL)を心臓に注入する。
- 重力線活栓を部分的に開き、ステップ2.1.1で準備したPAカニューレからPBS/ヘパリン/SNPのゆっくりとした、しかし安定した滴下を生成する。
- 4-0ポリプロピレン縫合糸の針を、RVから出るPAの基部の後ろに通します。外科医の結び目の前半を使用して、PAの基部の周りに縫合糸の緩いループを事前に結びます。
- 細かいはさみを使用して、RVのすぐ下とPAに垂直な小さな切開(1/8インチ以下)を行い、PAカニューレYコネクタの片肢をPAのベースに挿入します。PAと挿入されたコネクタの周りに縫合糸を固定し、外科医の結び目を完成させるためにシングルツイストスローを追加します。
注:PAを流動下でカニュレートすると、血管系への気泡の導入が防止され、肺の適切な除去を妨げる可能性があります。 - PAカテーテルYコネクタのもう一方の端に一方向弁を取り付け、心臓の頂点を切断して左心室を介した血流の流出を可能にする。
注:ポンプを介して灌流する前に心臓の頂点を遮断しないと、血液ガスバリアに損傷を与え、空気空間への流体の漏れにつながる可能性があります。 - 2本のラインをつなぐ活栓で灌流ラインをポンプ側に切り替え、30mL/minでポンプの電源を入れます。PAを介して肺を灌流しながら、10mL気管シリンジを介して約10〜15呼吸/分で肺を手動で換気し、肺の血液を除去しやすくする。肺がほとんど白くなるまで灌流し、通常は40mL以下のPBS/ヘパリン/SNPを必要とします。
注:肺の血液の不十分な除去は、下流の脱細胞化を損なう可能性がある。 - 気管カニューレのレベルのすぐ上の後気管を切断し、残りの結合組織をすべて含まずに肺と心臓を解剖し、肺と心臓を 一括して抽出します。
- フェノールレッドを含まないハンクス平衡塩溶液(HBSS)に2%低融点アガロースを含む10mLシリンジを充填し、42°Cに予温した。
注:必要なアガロースの正確な量は、肺のサイズによって異なります。より大きな肺(すなわち、400gを超えるラットから)は、10mL以上のアガロースを必要とする。 - 抽出した肺3xを10mLの空気で手動で膨らませ(すなわち、ほぼ総肺容量まで)、気管カニューレを介して、崩壊した実質を募集するのを助ける。
- 肺葉の最も遠位先端が膨張するまで、気管カニューレを介してアガロースを約40mL/minの速度で手動で注入することによって、アガロースの調製された注射器で直ちに肺を膨らませる。肺の遠位領域が崩壊したままの場合は、さらに1〜2mLのアガロースを注射する。
- 4方向活栓から気管カニューレの女性のルアーロックに白いキャップを取り付けて気管をキャップします。肺を氷の上の150mmのペトリ皿に入れて、アガロースが固まるようにします。
注:抽出直後の肺の膨張は、肺実質の均一な充填、およびその後の組織スライスの成功を確実にするために重要である。肺が非常に不均一に膨張する場合は、スライスの品質が悪くなるため、肺スライスを進めないでください。
- 肺スライシング
注:正確なスライス手順は、使用されている振動ミクロトーム(ビブラトーム)に基づいて調整する必要があるかもしれません。種々の組織スライサーを用いたPCLS調製のさらなる例は、以前に公開されている32、33、34。- 金属冷却ブロックを-20°Cでプレチルし、スライス手順全体を通して使用しないときは氷上に保管してください。
- シアノアクリレート接着剤の小さな滴を使用して、ブレードホルダーにブレードを取り付けます。アレンレンチを使用してブレードホルダーをビブラートームに慎重に取り付け、バッファートレイに挿入された試料チューブの端にちょうど揃うようにします。
- フェノールレッドを含まない1ウェルあたり3mLの滅菌氷冷HBSSで6ウェルプレートを調製し、スライスを回収する。
- メスを使用して、肺組織を約1〜1.5cm3切断する。
注:左葉の下部および中央部、ならびに右中葉および下葉からの肺組織は、肺胞面積を最大化するより大きな組織スライスを最も容易に得る。膨張していない組織領域または結合組織の領域が存在する場合は、はさみでこの組織を切り取るか、プランジャーに向かって下向きにします。このような組織はきれいに切断されない傾向があります。 - シアノアクリレート接着剤の小さな滴を試料チューブのプランジャーの上に置きます。紙に肺組織を軽くたたいて拭き取って余分な水分を取り除き、すぐに一対の鉗子を使って肺組織をプランジャーの上に置きます。
- 試料チューブの金属管を組織の上部のレベルまでスライドさせ、プランジャーを後退させた状態で所定の位置に保持する。ピペットは、HBSS中の2%アガロースをチューブの上部に予め加温し、組織を完全に囲んだ。
- 氷冷冷却ブロックを組織の周りに約1分間置き、アガロースが固化できるようにします。
- 試料チューブをバッファートレイに挿入します。トレイに氷冷PBSを充填して、ティッシュブロックの途中まで入れます。モーターボックススイッチを早送り(FF)に回して、モーターボックスプランジャーを前進させ、試料チューブの基部に触れるだけにします。
- スライスの厚さ、切削速度、発振周波数(厚さ450μm、速度4、発振周波数5など)を希望して設定します。 [連続モード] を選択し、スイッチを [オン] に切り替えてスライスを開始します。
- 組織スライスがバッファートレイに落ちるように、接種ループまたはヘラを使用して、調製した6ウェルプレートに移します。
- 約2mm厚の組織が標本チューブに残っている場合はスライスを停止し、刃の損傷や接着剤を含む組織の切断を回避します。
- 上記の手順を繰り返して、必要に応じて追加の肺組織をスライスします。
- 足場の準備のためにスライスを直ちに脱細胞化するか、スナップフリーズして-80°Cで最大2ヶ月間保存する。凍結するには、4〜6枚のスライスを35mmのペトリ皿に移し、スライスの周囲から余分な液体を慎重に吸引します。ドライアイスと100%エタノールの入った浴に皿を入れて急速凍結させた後、ホイルで包み、ビニール袋に密封し、-80°Cに移す。
注:凍結速度が比較的遅いと氷の結晶が形成され、組織を損傷する可能性があるため、新鮮なスライスを-80°Cの冷凍庫に直接置かないでください。
3. 肺組織足場材の作製
- 材料および脱細胞化溶液の調製
- オートクレーブフレーム、クリップ、タブ。
- 表 1 に概説されているように脱細胞化ソリューションを準備します。
注:使用直前にベンゾナーゼヌクレアーゼを予め温めた緩衝液および滅菌フィルターに加える。Triton X-100およびデオキシコール酸ナトリウム(SDC)溶液を、脱細胞化手順の24〜48時間以内に調製する。抗生物質/抗真菌剤溶液およびベンゾナーゼ緩衝液を30dまで予め調製し、4°Cで保存する。
- 肺スライスの切断とクリッピング
注:切断とクリッピングはベンチトップで非滅菌で行うことができますが、セクション3.3の脱細胞化ステップとそれに続く組織足場のすべての取り扱いは、層流フード内で実行する必要があります。- 100mmのペトリ皿に約3分の1をPBSでいっぱいにします。カセット(それぞれ2つのクリップを含むフレーム)とタブを鉗子を使用して皿に移します。
- 冷凍スライスを使用する場合は、室温のPBSをディッシュに流し込んでスライスを覆うように一度に1つのディッシュを解凍する。残りの皿をドライアイスの上に置きます。
- 解凍したスライスを150mmのペトリ皿に移す。必要に応じて、細かい鉗子を使用してスライスを静かに展開し、平らになるようにしてから、組織の周囲から余分なPBSを慎重に吸引します。
- 定規を目安にカミソリの刃を使い、刃の全長を皿にしっかりと押し付け、刃の端を所定の位置に保持してわずかに左右に揺らすことで、スライスから幅3mmのストリップを切り取ります。あるいは、3mmのカスタムメイドのスペーサー(例えば、アセタール[ポリオキシメチレン]製)で区切られた2つの平行なブレードで後付けされたロータリーカッターを使用して、組織ストリップを切断する。涙、穴、大きな気道や血管、または厚い結合組織を避けてください。
メモ: クリッピングを成功させるには、ストリップの長さが 9 mm 以上である必要があります。 - 鉗子を使用して、組織ストリップを調製した100mmペトリ皿に移す。
- 組織ストリップをカセットにクリップする:組織をカセットの上に浮かべ、両端のクリップの穴が張り出すように組織を中央にセンタリングする。細かい鉗子で、タブを一方の端の穴に部分的に入れ、組織を静かにまっすぐにしてから、2番目のタブを置きます。各手に鉗子を使用して、各タブを完全に押し込んで組織を固定します。
メモ:クリッピングする前に組織を所定の位置に保つのが難しい場合は、皿からPBSを吸引して液量を下げてください。2番目のクリップを配置する際に組織を引き伸ばさないように注意してください, これは引き裂くにつながる可能性があるため、. - ステップ 3.2.2 ~ 3.2.6 の解凍、切断、およびクリッピングの手順を、必要な数の組織に対して繰り返します。
- スライス脱細胞化
- すべてのスライスが切り取られたら、カセットを入れた100 mmの皿を層流フードに移します。
- 脱細胞化プロトコルのステップ1を開始する( 表2参照):湾曲した止血剤を使用して各カセットの切り欠きのある側面を把持し、カセットを1ウェルあたり3mLのPBS +イオン+抗生物質/抗真菌剤で満たされた6ウェルプレート(2組織/ウェル)に移す( 表1の溶液レシピを参照)。
- ウェルプレートをオービタルシェーカー上に30rpmで10分間置きます。
- 脱細胞化プロトコルのステップ2( 表2参照)に進みます:各ウェルから流体を吸引し、3mL/ウェルPBS+イオンと交換し、プレートを30rpmでオービタルシェーカーに置き、5分間インキュベートします。
- 表 2 の脱細胞化プロトコルに概説されているように、各ソリューションおよび対応する期間について、ステップ 3.3.4 を繰り返します。
- PBS +抗生物質/抗真菌薬による最終すすぎ工程( 表2のステップ20)の後、組織を新鮮なPBS +抗生物質/抗真菌薬を含む滅菌6ウェルプレートに移し、37°Cで48時間インキュベートする。
注:抗生物質/抗真菌剤で滅菌した後、肺組織足場材を直ちに播種するか、4°Cで最大30dまで保存することができます。
4. スライス再細胞化と培養
注: 図2 は、スライスを最初にラット肺微小血管内皮細胞で播種し、低血清内皮培地で培養する、組織播種および培養のための提案されたタイムラインを示す。次いで、ラットAEC2sおよびラット肺線維芽細胞を無血清AEC2増殖培地で播種する(Jacob et al.13 およびYouら35から適合); 表 3 の結果および培養培地の詳細で使用した細胞源に関する追加の注記を参照してください。この戦略は、AEC2単分子層を含む肺胞様構造をもたらす。
- 播種のための組織足場の準備(-4日目または-3日目)
- 4°Cで保存した組織足場を使用する場合は、播種前に新鮮なPBS +抗生物質/抗真菌剤(10%ペニシリン/ストレプトマイシン、4%アンホテリシンB、PBS中の0.4%ゲンタマイシン)で足場を37°Cで一晩インキュベートする。
- 足場3xを滅菌PBS(5mL/ウェル)でそれぞれ5分間すすいでください。
- 位相差顕微鏡で足場を倍率5倍で調べ、播種する組織を選択します。
注:播種に最適な足場には涙や穴がなく、大きな気道や血管は含まれていません。特徴のある足場は正常に播種されるかもしれないが、再集団パターンは肺胞領域で観察されたものとは異なる可能性がある。
- 内皮細胞播種(-3日目)
- 血球計数器を用いて内皮細胞を計数し、内皮培地(表3参照)中の内皮細胞懸濁液を5 x 106細胞/mLで調製し、1スライスあたり500,000個の内皮細胞を播種するのに十分な細胞を有する(例えば、12スライスの場合、6 x 106細胞を1.2mL培地に再懸濁する)。
- オートクレーブで播種浴を100mmのペトリ皿に入れます。すすぎ足場を逆さまにして播種浴に移す:細かい湾曲したヘモスタットを使用して切り欠かれた側面でカセットをつかみ、まっすぐなヘモスタットまたは鉗子を使用してカセットの一端をつかみ(組織自体に触れないように注意して)、反転してから、切り欠かれた側面に沿った穴を介して細かい湾曲したヘモスタットの先端でカセットを再びつかみます。 そして播種風呂によく置く。残りのカセットについても繰り返します。
メモ: 正しく配置すると、足場は各ウェルの底に上下逆さまに中央に配置されます。必要に応じて、カセットの角を止水で軽く押し下げて、カセットがウェルに平らに収まっていることを確認します。カセットの不適切な着座は、貧弱な組織播種につながる可能性がある。ウェルが少量のPBSを含む場合、それは許容される。 - 調製した細胞懸濁液を穏やかに旋回させて混合し、次いで手動ピペットを使用してウェルの底部にある各組織の上に100μLの細胞を直接ピペットし、ピペットチップで組織を損傷しないように注意する。
- 播種した組織を37°C/5%CO2で細胞培養インキュベーターに移す。
- 2時間後、手動ピペットを用いて予め加温した培養培地を各ウェルに900 μL加え、次いでインキュベーターに戻す。培地を加えた際にカセットが外れた(浮いた)場合は、ピペットチップでカセットの角をウェル内で平らになるように静かに押し下げます。
- -2日目に培地を交換してください。ペトリ皿を傾けて媒体を取り除き、カセットを乱さないように、ウェルの隅に軽く置いたピペットチップで手動でピペッティングします。1ウェルあたり1mLの新鮮な内皮培地と交換する。
- AEC2および線維芽細胞播種および組織培養(0日目)
- 血球計数器を用いてAEC2sおよび線維芽細胞を計数する。AEC2および線維芽細胞の1:1細胞懸濁液をAEC2増殖培地(上皮ベース培地+AEC2サプリメント;表3参照)に5 x 106総細胞/mLで調製し、1スライスあたり500,000細胞(250,000個のAEC2sおよび250,000個の線維芽細胞)を播種するのに十分な細胞を有する(例えば、12スライスの場合、3 x 106 AEC2s + 3 x 106線維芽細胞を1.2mL培地に一緒に再懸濁する)。
- ステップ4.2.6に記載されるように播種浴の各ウェルから培地をピペットで出す。調製した細胞懸濁液を穏やかに旋回させて混合し、次いでウェルの基部にある各組織の上に100 μLの細胞を直接ピペットで移す。
注:AEC2/線維芽細胞播種前に少量の内皮培地がウェルに残っている場合は許容されます。 - 播種した組織を37°C/5%CO2で細胞培養インキュベーターに移す。
- 2時間後、予め加温したAEC2増殖培地900 μLを各ウェルに加え、次いでインキュベーターに戻す。
- 24時間培養後(1日目)、カセットあたり1ウェルあたり1ウェルあたり1mLの予め加温したAEC2増殖培地を含む12ウェルプレートを作製した。
- 播種浴の各ウェルから800μLの培地をピペットで送る。播種浴からカセットを取り外す:切り欠かれた側面に沿った穴を介して細かい湾曲したヘモスタットでそれぞれをつかみ、まっすぐなヘモスタットまたは鉗子に移してカセットを一端につかんで反転させ、次に湾曲したヘモスタットを使用してノッチ付き側面を介してカセットをつかみ、右側を上にして、ウェルごとに1つずつ、準備された12ウェルプレートに移す。
- 12ウェルプレート内の培養培地を7日目まで1日おきに、または所望の培養期間にわたって交換する:ガラスパスツールピペットを使用して各ウェルから培地を吸引し、組織に触れないように注意する。1ウェルあたり1mLの新鮮なAEC2増殖培地中のピペット。
注:組織再集団化の程度は、培養期間中、5倍の倍率で位相差顕微鏡によってモニターすることができる。
5. 組織採取とサンプル分析
- 組織学および免疫蛍光染色のためにELTを固定するために、組織培養カセットを10%中性緩衝ホルマリンに移し、ロッカー上で室温で3〜4時間インキュベートする。細かい尖った鉗子の先端を使用してカセットから組織を取り出し、タブに接する組織を切断します。パラフィン包埋および組織学のための日常的な方法に従って組織を処理する;特別な技術は必要ありません。
- qRT-PCRのためにELTを処理するには、PBS 2x中のカセット内の組織をすすぎ、組織を除去してスナップ凍結するか、RNA抽出のための溶解を続行する。
注: 1 x106 個の細胞を播種し、7 日間培養したスライスを少なくとも 2 枚プールすると、下流 PCR 分析用に十分な RNA が得られるはずです。
Representative Results
ELTを生成するプロセス(肺スライス、スライスクリッピングおよび脱細胞化、および足場再集団化を含む)の概要を図3に示す。ここで提示されたELTsを、初代ラット肺微小血管内皮細胞(材料の表を参照のこと)、新生児ラットAEC2s、およびリポ線維芽細胞富化新生児ラット肺線維芽細胞36を用いて培養した。AEC2sは、前述のように磁気ビーズベースの選別によって新たに単離された37;代替の分離プロトコルは、他の場所で詳細および議論されている38、39、40。単離されたラットAEC2sの純度は、ラット特異的AEC2表面マーカーRTII-7041のフローサイトメトリー、またはRTII-70またはプロサーファクタントプロテインC(pSPC)の細胞遠心細胞サンプルの染色によって評価することができる。ラット肺線維芽細胞を、公表されたプロトコル42の適応に従って生後7〜9日目のラット仔から単離し、継代1〜2で使用した。代替の分離プロトコルは、他の箇所で説明されている43、44。単離された線維芽細胞の純度は、間葉系マーカービメンチンについての培養細胞または細胞遠心分離細胞の染色を介して評価することができ、リポ線維芽細胞濃縮は、オイルレッドO45に対する染色を介して評価することができる。
肺組織をアガロースで均一に膨張させ、組織片を戦略的に選択し、総実質組織面積を最大化するようにスライスするように配向させると、1匹のラット肺が>100個の肺胞ELTのための組織を生じ得る。PCLSのストリップは、引き裂きの事例がほとんどない(<5%)組織カセットにクリップするのに十分な機械的完全性を示す(図3B)。
肺スライスを脱細胞化するためのプロトコルは、以前に発表された肺全細胞化プロトコルに密接に基づいており、定量的プロテオミクスによって、多くのECM成分を天然の肺のものと有意に異ならないレベルで保存することが実証された22。脱細胞化スライス足場は、ヘマトキシリンおよびエオジン(H&E)染色(図4A、B)および位相差顕微鏡(図4C)によって見られるように、肺胞の天然構造を保存する。我々は通常、大きな気道または血管(図4D)または涙を含む足場を除外するが、研究者にとって関心のある場合は前者を含めることができる。脱細胞化は、二本鎖DNAのアッセイによって測定される組織DNA含量の96%の減少をもたらす(材料表を参照;天然組織対脱細胞化組織では、それぞれ0.073μg/mg対0.018μg/mg±0.018μg/mg±0.0035μg/mg、SEM±平均)(図5Aを参照)、ヘマトキシリン染色によってDNAが見えない(図4B)。脱細胞化足場の組織学的および免疫蛍光染色は、天然肺切片と同様の構造および量を有するECMタンパク質コラーゲン、エラスチン、コラーゲンIV、およびラミニンの維持を明らかにする(図5B-E)。天然組織の核は、三丁目(コラーゲン用)とEVG(エラスチン用)の汚れで青/黒く染まることに注意してください。免疫蛍光染色は、組織37を染色するための標準的な方法を用いて、前述のように実施した。使用した抗体およびそれらのそれぞれの濃度を表4に列挙する。
足場の再移植が成功すると、7日後に高度に細胞化されたELTが得られ、肺胞様の再増殖パターンが光学顕微鏡で可視となった(図6A-C)。場合によっては、非常に高い細胞性で、オルガノイド型構造が見えることがあります(図6A、B)。播種に失敗した組織は、培養中の位相差顕微鏡によって視覚化することができる(図6C)。AEC2s、線維芽細胞、および内皮細胞で組織足場を培養した後、ELTは、3つの細胞系譜すべてを含む肺胞様構造で密集して再移入される(図6D、E)。7日目または8日目に、AEC2は直方体形態を維持し、AEC1sへの有意な分化の証拠なしに、界面活性剤タンパク質B(SPB)および層状体タンパク質ABCA3を発現する(図6E、F)。AEC2はELTにおいて非常に増殖性があり、10μMで2時間パルスした後の5-エチニル-2'-デオキシウリジン(EdU)の取り込みによって実証されています(図6G)。
図1:肺の抽出およびクリアリングのための灌流システムの概略 。 (A)灌流システムは、流れの下での肺動脈の初期カニューレに使用される重力駆動肢を含む。ポンプ駆動の四肢は、最初のカニューレ後に肺を効率的にクリアするために使用されます。ポンプラインには、ポンプによって引き起こされる圧力のスパイクを減衰させる「パルスダンパー」が含まれています。気管および肺動脈カニューレの設計は、左に詳述されている。SNP = ニトロプルシドナトリウム。(B)パルスダンパーアセンブリの詳細。BPTとシリコーンはチューブの種類を指します。(c)肺摘出時に置かれた気管および肺動脈カニューレの位置。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:三系統再細胞化のための培養タイムライン。 二相播種のタイミングを含む三系統ELT播種および培養のための提案されたタイムライン。各相の培地と播種するための細胞番号が示される。表3の培養培地の詳細を参照 されたい。AEC2 = 肺胞上皮2型細胞。EC = 内皮細胞。FB = 線維芽細胞。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:操作された肺組織調製の概略図。 (A)天然の肺組織は、ビブラートームを用いてスライスに切断される。(B)精密に切断された肺スライスを標準化された幅3mmのストリップに切断し、ポリテトラフルオルエチレン(PTFE)組織培養カセットにクリップし、洗剤脱細胞化して無細胞細胞外マトリックススキャフォールドを得る。(C)足場は、播種領域を組織の領域に限定する特殊な播種浴に再播種され、次いで標準的なウェルプレートで培養される。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:脱細胞化肺足場の構造 天然(A)および脱細胞化(B)肺スライスのH&E染色は、脱細胞化後の肺胞構造の保存を示す。(C、D)位相差顕微鏡によって5倍の倍率で見た脱細胞化ECM足場の例は、主に肺胞組織(C)を含むか、または大きな分岐気道および血管(D、黒および赤の矢印)を含む。スケールバー、50μm(A、B);500 μm (C、D). この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
(A)天然および脱細胞化肺切片におけるDNAの定量(SEM±平均、n=5)。ウェルチのt検定、**P<0.01です。デセル = デセル化。(B,C)コラーゲン(B)およびエラスチン(C)に対する天然および脱細胞化肺スライスの組織学的染色。矢じりは、エラスチンが脱細胞化組織の肺胞入口リングに保存される。(D,E)コラーゲンIV(D)およびラミニン(E)に対する天然および脱細胞化肺スライスの免疫蛍光染色。スケールバー、50μm。すべてのパネルで、点線のボックスは、各パネルで右に拡大された画像領域の輪郭を描きます。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:操作された肺組織の細胞再集団化。 (A-C)培養7日目の再細胞化ELTの例を、位相差顕微鏡によって培養中に可視化するようにする。再細胞化パターンは、組織の肺胞構造を反映している。細胞性の高いいくつかの領域では、オルガノイド様構造(矢じり)が形成され得る。(A)および(B)は細胞再集団化の成功を表し、一方(C)は培養7日後の再細胞化の貧弱なレベルを表す。(D-G)培養7日目または8日目の再細胞化ELTの染色。(d)肺胞中隔の細胞再集団化を示すH&E染色。(e)免疫蛍光染色標識は、proCollagenIα1+線維芽細胞、ABCA3+ AEC2s、およびCD31+内皮細胞に生着した。(F)組織にはSPB+AEC2が豊富に含まれているが、これらの条件下ではRTI-40(ポドプラニン)+AEC1はほとんど含まれていない。(G)多くのAEC2は、EdUの取り込みによって測定されるように、ELTにおいて増殖している。スケールバー、500μm(A-C);25 μm (D-G).この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
表 1: 脱細胞化ソリューション 脱細胞化溶液の調製の詳細。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表 2: 脱細胞化プロトコル。 肺スライスを脱細胞化するためのプロトコルの詳細。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表3:培養培地。 内皮およびAEC2増殖培地についての調製の詳細。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表4:免疫染色に用いた抗体。免疫染色に用いた抗体とその濃度の詳細。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイル1: 組織培養カセットフレームをレーザー切断するための設計。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイル2: 組織培養カセットクリップをレーザー切断するための設計。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイル3: 組織培養カセットタブをレーザー切断するための設計。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイル4: バスモールドベースを播種するためのCADファイル。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイル5: バスモールドリングを播種するためのCADファイル。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
Discussion
この論文では、多系統肺胞様構造を含むインビトロで操作された肺組織を生成するためのプラットフォームとして、脱細胞化精密切断肺スライスの使用について説明する。全肺工学22,31用の高忠実度無細胞ECM肺足場を再移入するために以前に開発した戦略と、小規模で操作された心臓組織30を培養するための堅牢なシステムを組み合わせることにより、このプロトコルは、生理学的に関連する肺ECMを組織培養基質として、反復可能かつ中程度のスループットの方法で使用することができます。
ここで提示された方法は、ラット肺からのELT足場調製を詳述し、容易に達成可能であり、アガロース膨張のために無傷の気道に直接アクセスして 一括 して抽出することができ、マウス肺よりも大きいサイズである。しかしながら、アガロースで膨張させ、長さが少なくとも9mmのスライスを生じることができる任意の肺組織を、このシステム内で使用することができる。組織源に関係なく、アガロースによる肺組織の均一な膨張は、下流組織スライス、クリッピング、および組織処理を確実に成功させるための最も重要なステップです。膨らみすぎた肺組織はきれいにスライスされない傾向がありますが、膨らみすぎた組織はクリッピング中に裂けることがあります。アガロースゲル化に続いて、適切に膨張した組織領域はしっかりしているが、鉗子で穏やかに押すと少し与える。無傷のラット肺の場合、抽出した肺を空気で数回事前に膨張させ、抽出後できるだけ早くアガロースインフレーションを行うと、最良のスライス結果と結果として得られる組織足場の最高の品質が得られることを見出した。アガロースの適切な量は経験的に最適化する必要があります。ラットの肺の場合、肺を総肺容量まで膨らませるのに必要な体積は約30mL/kgの動物質量(例えば、350gラットの肺の場合は10.5mLアガロース)である。気道アクセスがあまり単純ではないより大きな切除肺組織(ヒトドナーからのものなど)の場合、気管支32を介して組織を膨らませるために、いくつかの追加のトラブルシューティングが必要となり得る。その後の肺スライスの間、プランジャー上の組織の選択および配向は、1)スライスが組織培養カセットにクリップすることができる組織ストリップを生成するのに十分な大きさであることを確認し、2)大きな気道または血管を除く実質(肺胞)組織面積を最大化するためのもう1つの重要なステップである。
PCLSを組織培養カセットにクリッピングすることは、最初は困難なステップになる可能性がありますが、カセットは脱細胞化および播種中の組織ハンドリングを大幅に簡素化します。起こり得る2つの潜在的な問題は、組織の引き裂き(クリッピングのプロセス中、または脱細胞化の間のいずれか)、または下流の播種が不十分になるクリップ内の組織位置決め(例えば、播種なし、または端部のみの播種)である。引き裂きは、アガロースのオーバーインフレーション、タブ挿入時の組織のオーバーストレッチ、またはタブを挿入するときに適切な組織グリップを提供するにはオーバーハングが少なすぎる結果である可能性があります。片方のクリップの端で裂けたスライスは正常に播種され得るが、組織が平坦ではないため、培養中に顕微鏡下で視覚化することは困難である。貧弱な組織播種( 図6Cのような)は、スライスが2つのクリップの間に平らに横たわっていないため、逆さまにひっくり返したときに播種浴の基部との接触が良好に悪くなるためである可能性が高い。別の考えられる原因は、播種浴の底部にカセットをうまく不適切に装着することである。クリッピングに関しては、2番目のクリップを配置するときに組織に少しだけ張力を加えて、平らに横たわるようにします。いくつかのスライスはわずかに凹みを持っています。このような場合は、凸面を上にしてスライスをクリップします。練習では、通常、スライスの2%未満でシードに失敗します。
このプロトコルの1つの制限は、ELT準備の初期材料を生成するために、レーザーカッターと3Dプリンタなどの特殊な機器の要件です。しかし、組織培養カセットおよび播種浴が作成されると、追加の特別な材料は必要ありません。ELT足場調製物の肺スライスおよび脱細胞化ステップは、適度に時間がかかる。しかしながら、これらのステップは、事前に、または同時に複数の実験の準備をするのに十分な数で実行してもよい。多くのPCLS(実質領域用に最適化する場合は>100)は、単一の肺から切断し、後で使用するためにスナップ凍結することができます。単一の凍結融解サイクルがECM46に軽微な超構造的損傷を引き起こす可能性があるが、複数の凍結融解サイクルでさえ、ECM23、47において有意な損失を引き起こさないことが実証されている。PCLSはまた、実験に先立ってクリッピングおよび脱細胞化され、1ヶ月以内に使用されるようにしてもよい。(注目すべきことに、記載された脱細胞化プロトコルは、約6時間で達成することができ、これは、1日以上を必要とする前述の方法に対する有意な利点を表す27、28。足場が準備されると、細胞播種プロセスは簡単で高速であり、ELTの培養は特別な技術を必要としない。
記載されたELT法の警告は、領域特異的な播種の欠如、すなわち、血管空間へのAEC2s特異的な送達、または血管空間への内皮細胞特異的な送達である。それにもかかわらず、細胞は単に組織足場の上に播種されるが、再細胞化のパターンは非ランダムであり、上皮リングを含む肺胞様組織のいくつかの類似性を有する。我々は、細胞間相互作用、ならびにECM組成および幾何学的形状20,21の局所的な差異が、観察された再細胞化パターンに寄与している可能性が高いと疑っている。この仮説を支持するために、線維芽細胞を脱細胞化肺スライスに非特異的に播種した以前に発表された研究は、組織再集団化および関連する細胞表現型のパターンが、顕微鏡組織領域およびECM足場源(例えば、健康なか罹患したか)によって有意に異なることを実証した27。線維芽細胞はまた、間質−それらが天然の肺組織に存在する場所1、27に侵入することが観察された。真に地域特異的な方法で肺スライス上の細胞を培養することが想像できる主要な代替方法は、気道31、48および血管区画49、50を介して無傷の脱細胞化肺を播種し、次いで再細胞化組織をスライスすることを含むであろう。ただし、この代替案 1) は、コスト、時間、およびリソースを大量に消費します。2)はスループットが低い。3)動物の数を増やす必要があります。4)は、肺培養全体およびその後の播種された肺のスライスの課題による汚染のリスクの増加と関連している。ELTプラットフォームは、天然の細胞組織のすべての側面を要約するわけではありませんが、生理学的に関連するECM基板上で、より多くのラボがアクセスできる方法で肺細胞培養を可能にします。
ELTシステムの柔軟性は、このプラットフォームの主な利点であり、任意の数の組織足場、細胞、または関心のある培養培地を用いた小規模の肺組織培養を可能にするべきである。罹患組織または傷害モデルに由来する足場の使用は、疾患改変ECM 27,29,51の設定における細胞間相互作用または細胞−マトリックス相互作用の研究を可能にし得る。しかしながら、脱細胞化プロトコルは、種52間のマトリックスの違いを説明するために適合させる必要があるかもしれないことに留意されたい。記載された播種戦略は、任意の細胞タイプに使用でき、培養タイムラインは研究者のニーズに合うように適合した。出発点として、足場あたり1 x106細胞は培養後7日以内に高度に細胞組織を生成するはずであるが、1 x105の総細胞は細胞性不良をもたらす。タイムラインの任意の適応において、組織培養カセットは、最後の組織播種後24時間後に播種浴から除去されるべきである。ここでは、肺胞の細胞の複雑さの一部をモデル化することを目的として、肺胞様構造における高分化新生児AEC2の維持を少なくとも7日間サポートする三培養再細胞化戦略について説明する。我々の結果はまた、ELTにおける線維芽細胞および内皮細胞の両方の生着の成功を実証し、培養基材の広範な適用性および共培養研究への適合性を強調している。成体細胞をELTに播種すると、より静止した肺胞構造のモデリングが容易になるかもしれないが、遺伝子組み換えを含むヒトPSC由来AEC2sを播種すると、ヒト疾患の翻訳研究が容易になる可能性がある13,53。一般に、ELTプラットフォームによって可能になるボトムアップアプローチは、AEC2増殖や分化状態など、関心のある読み出しに対する特定の細胞タイプの寄与を調査する機会を提供します。
要約すると、このプロトコルは、無細胞ECM肺スライス足場内のAEC2s、線維芽細胞、および内皮細胞の共培養研究のために操作された肺組織を生成するための堅牢なシステムを概説する。ELTは、初代AEC2の新規な3D培養戦略であり、今日まで、十分に分化した表現型を維持するために、生理学的でないゲル型マトリックスに典型的に依存してきた6、11、12。現在のプラットフォームは、脱細胞化肺スライス24,25,26,27,28,29の再集団化における以前の研究に基づいているが、いくつかの利点を提供する:1)脱細胞化、播種、および培養中のELT取り扱いを容易にする組織培養カセットシステム。2)各スライス足場に既知の数の細胞を正確に播種するためのカスタマイズされた播種浴;3)上皮細胞、間葉系細胞、および内皮細胞による肺胞組織再増殖を可能にする三培養再播種戦略。したがって、ELTは、天然の肺胞およびAEC2幹細胞ニッチの細胞および基質の複雑さを捕捉する再現性のあるin vitroモデルの作成に向けた重要な一歩である。
Disclosures
L.E.N.は、再生医療企業であるHumacyte, Inc.の創設者兼株主です。Humacyteは、血管手術のために同種異系平滑筋細胞から操作された血管を産生する。L.E.N.の配偶者はHumacyteの株式を保有しており、L.E.N.はHumacyteの取締役会のメンバーです。L.E.N.は、Humacyteにライセンス供与され、L.E.N.のロイヤリティを生み出す特許の発明者であり、エール大学の彼女の研究室での研究を支援するための無制限の研究ギフトを受け取りました。Humacyteは、この報告書の調査結果の行動、説明、または解釈に影響を与えなかった。
Acknowledgments
著者らは、このプロトコルで使用される組織培養カセットデザインを開発したLorenzo SewananとJorge Nunez、ビブラートームの使用のためのKaminski研究室、肺スライスの支援のためのMaurizio ChioccioliとJessica Nouws、最初のパイロット実験の支援のためのAllie LaRocco、およびプロトコルの注意深い読書のためのHong Qianに感謝したい。この研究は、NIH助成金F30HL143880(K.L.L.)、医学科学者トレーニングプログラムトレーニンググラントT32GM136651(K.L.L.)、およびU01HL145567(L.E.N.)によって支援されました。Humacyte Inc.(L.E.N.)からの無制限の研究ギフトによって。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D Printer: Form 2 | Formlabs | ||
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma | I5879 | |
| 8-Bromo cAMP | Sigma | B7880 | |
| Agarose, UltraPure LMP | Invitrogen | 15517-014 | |
| Amphotericin B | Sigma | A2942 | |
| Barbed reducer fitting, 3/8 inch x 1/4 inch | McMaster-Carr | 5121K271 | |
| Benzonase nuclease | Sigma | E1014 | |
| Bovine serum albumin (BSA) Fraction V | Gemini | 700-104P | For AEC2 growth medium |
| Bovine serum albumin (BSA), standard grade | Gemini | 700-100P | For benzonase buffer |
| Check valve, polypropylene, 1/8 inch hose barb | Cole-Parmer | SK-98553-10 | |
| CHIR99021 | PeproTech | 2520691 | |
| Clear Resin, 1 L | Formlabs | RS-F2-GPCL-04 | |
| Cyanoacrylate glue, such as Krazy Maximum Bond Permanent Glue | Any hardware, craft, or drug store | KG483 or similar | |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | |
| DMEM (low glucose) | Gibco | 11885-084 | |
| DMEM (high glucose) | Gibco | 11965-092 | |
| DNA assay (Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit) | Invitrogen | P7589 | |
| EDTA, 0.5 M, pH 8.0 | AmericanBio | AB00502-01000 | |
| EdU kit (Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 647) | Invitrogen | C10340 | Used according to manufacturer's directions |
| Elbow fitting, 3/8 inch | McMaster-Carr | 5121K907 | |
| F12 | Gibco | 11765-054 | |
| Fetal bovine serum (FBS), characterized | Hyclone | SH30071.03 | |
| Gentamicin sulfate | Gemini | 400-100P | Reconstituted in diH2O for a stock solution at 50 mg/mL |
| Hair clippers | Wahl | MiniArco | |
| Hank's balanced salt solution (HBSS), Phenol Red Free | Gibco | 14175-095 | |
| Heparin sodium injection, USP, 1000 U/mL | Sagent | NDC: 25021-400-30 | For intraperitoneal and intracardiac injection |
| Heparin sodium salt | Sigma | H4784 | For pulmonary artery perfusion; prepare stock solution at 100 U/mL in PBS |
| HEPES Buffer | Corning | 25-060-Cl | |
| Inline tee fitting, 3/8 inch x 1/8 inch | McMaster-Carr | 5121K851 | |
| Inoculating loop, disposable | Fisherbrand | 22-363-600 | |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma | I6634 | |
| Ketamine injection, 100 mg/mL | Covetrus (Butler Animal Health) | 010177 | |
| KGF, recombinant human | PeproTech | 100-19 | |
| Laser cutter, VLS 3.50 30 watt | Universal Laser Systems | ||
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| Luer-lock, female, 3/32 inch | Cole-Parmer | 45508-02 | |
| Luer-lock, male, 1/8 inch | Cole-Parmer | 30800-24 | |
| Luer-lock, male, 1/4 inch | McMaster-Carr | 51525K146 | |
| MCDB-131 Complete without serum | VEC Technologies | MCDB-131 WOFBS | |
| Magnesium chloride (MgCl2), 1 M | AmericanBio | AB09006-00100 | |
| NaCl | American Bioananalytical | AB01915 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), without Ca2+ and Mg2+, 10X | Sigma | D1408 | Reconstitute to 1X with diH2O |
| Phosphate buffered saline (PBS), with Ca2+ and Mg2+ | Gibco | 21300-058 | |
| PDMS - SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning Corporation | 4019862 | |
| Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL penicillin/10,000 μg/mL streptomycin) | Gibco | 15140-122 | |
| Petri dish, 150 mm | Falcon | 351058 | |
| Plastic film (parafilm) | Bemis | PM-996 | |
| Pharmed BPT tubing, LS 16 | Masterflex | 06508-16 | |
| Pharmed BPT tubing, LS 17 | Masterflex | 06508-17 | |
| Platinum-cured silicone tubing, LS 14 | Masterflex | 96420-14 | |
| Platinum-cured silicone tubing, LS 16 | Masterflex | 96420-16 | |
| Platinum-cured silicone tubing, LS 36 | Masterflex | 96410-36 | |
| Poloxamer 407 (Pluronic F-127) | Sigma | P2443 | |
| Povidone/iodine prep pads, 10% | Dynarex Corporation | 1108 | |
| PTFE sheet, 0.060 inch (1/16 inch) thick | ePlastics | PTFENAT0.060X12X12 | For tissue culture cassette tabs |
| PTFE sheet, 0.093 inch (3/32 inch) thick | ePlastics | PTFENAT0.093X12X12 | For tissue culture cassette frames and clips |
| Peristaltic pump drive: Masterflex L/S Variable-Speed Digital Drive | Cole-Parmer | ZM-07528-30 | |
| Peristaltic pump head: Masterflex L/S Easy-Load II Pump Head | Cole-Parmer | EW-77202-60 | |
| Rat, Sprague Dawley | Charles River | Strain Code: 400 | |
| Razor blade | Any hardware or craft store | Personna 94-120-71 or similar | |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | |
| Rotary blades, 28 mm | Omnigrid | 2046 | |
| Rotary cutter, 28 mm | Olfa | Model 9551 | |
| Sodium deoxycholate (SDC) | Sigma | D6750 | |
| Sodium nitrorusside (SNP) | Sigma | 71778 | |
| Stopcock, 4-way | Edwards | 594WSC | |
| Suture, 4-0 monofilament polypropylene | Covidien | VP-557-X | |
| Syringe, 10 mL | BD | 302995 | |
| Syringe, 50 mL | BD | 309653 | |
| Tissue culture dish, 35 mm | Falcon | 353001 | |
| Tissue culture dish, 100 mm | Corning | 430167 | |
| Tissue culture plate, 6-well | Falcon | 353046 | |
| Tissue culture plate 12-well | Falcon | 353043 | |
| Transferrin human | Sigma | T8158 | |
| Tris, 1 M solution, pH 8.0 | AmericanBio | AB14043-01000 | |
| Triton X-100 | American Bioanalytical | AB02025-00500 | |
| Vibratome, Compresstome VF-300-0Z | Precisionary Instruments LLC | ||
| Xylazine, 100 mg/mL | Henry Schein | NDC: 11695-4022-1 | |
| Y-connector, 1/16 inch barbed | Cole-Parmer | 30614-43 |
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