Summary
Усовершенствованная платформа для культивирования всего эмбриона позволяет непрерывно и надежно развивать ex utero постимплантационные эмбрионы мышей в течение шести дней, от стадий прегаструляции до продвинутого органогенеза. В этом протоколе мы подробно описываем стандартную процедуру успешного культивирования эмбрионов с использованием статических пластин и вращающихся бутылочных систем.
Abstract
Постимплантационные методы культивирования эмбрионов млекопитающих были, как правило, неэффективными и ограничивались короткими периодами после рассечения матки. Недавно были разработаны платформы для высокопрочной и длительной внеутробной культуры эмбрионов мышей от стадий яичного цилиндра до продвинутого органогенеза. Эти платформы обеспечивают надлежащее и достоверное развитие прегаструлирующих эмбрионов (E5.5) до стадии формирования задних конечностей (E11). Поздние гаструлирующие эмбрионы (E7.5) выращиваются во вращающихся баллонах в этих условиях, в то время как расширенная культура со стадий предварительной гаструляции (E5.5 или E6.5) требует комбинации статических и вращающихся культур бутылок. Кроме того, чувствительная регуляция концентрации O2 и CO2 , газового давления, уровня глюкозы и использования конкретной внеутробной питательной среды имеют решающее значение для правильного развития эмбриона. Здесь представлен подробный пошаговый протокол для расширенной культуры эмбрионов ex utero мыши. Способность выращивать нормальные эмбрионы мышей ex utero от гаструляции до органогенеза представляет собой ценный инструмент для характеристики эффекта различных экспериментальных возмущений во время эмбрионального развития.
Introduction
Внутриутробное развитие эмбриона млекопитающего ограничило изучение ранних стадий постимплантационного развития1,2. Недоступность развивающегося эмбриона препятствует пониманию ключевых процессов развития, происходящих после имплантации эмбриона в матку, таких как создание плана тела животного, спецификация зародышевых слоев или формирование тканей и органов. Кроме того, очень маленький размер раннего постимплантированного эмбриона затрудняет наблюдение с помощью прижизненной визуализации в утробе матери до E103. Неспособность наблюдать и манипулировать живыми эмбрионами на этих стадиях ограничила изучение раннего постимплантационного эмбриогенеза моментальными снимками во время развития.
Протоколы культивирования in vitro эмбрионов млекопитающих до имплантации хорошо зарекомендовали себя, надежны и регулярно используются4. Тем не менее, попытки создать системы внеутробных культур, способные поддерживать правильный рост эмбрионов млекопитающих после имплантации, имели ограниченный успех5. На протяжении более века предлагались различные методы культивирования, главным образом путем культивирования эмбрионов в обычных статических пластинах6,7,8 или вращающихся бутылках (роликовых культурах)5,9,10. Эти платформы оказались полезными в расширении знаний о развитии млекопитающих после имплантации11,12, несмотря на то, что они крайне неэффективны для нормальной выживаемости эмбрионов и ограничены короткими периодами. Эмбрионы начали проявлять задержку развития и морфологические аномалии уже через 24-48 ч после начала культивирования.
Это исследование дает подробное описание для создания системы культивирования эмбрионов ex utero , которая позволяет непрерывно развиваться от прегаструляции до продвинутых стадий органогенеза в течение шести дней постимплантационного развития13. В этой статье описывается улучшенный протокол культивирования роликов, который поддерживает рост эмбрионов E7.5 (нейронная пластина и стадия головы) до стадии формирования задних конечностей (~ E11) и расширенная культура из E5.5 / E6.5 путем объединения культуры на статических пластинах и платформах для культивирования роликов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты на животных проводились в соответствии с Руководством по защите животных Института науки Вейцмана и одобрены соответствующим Институтом Вейцмана IACUC (#01390120-1, 01330120-2, 33520117-2). Здоровых беременных женщин попросили дать свое информированное согласие на забор крови из пуповины, как это было одобрено Хельсинкским комитетом Медицинского центра Рамбам (#RMB-0452-15). У здоровых взрослых людей спрашивали их информированное согласие на сбор крови в соответствии с руководящими принципами Хельсинкского комитета Института науки Вейцмана (#1566-3).
1. Подготовка СМИ
- Приготовьте среду для рассечения, используя 500 мл модифицированной орлиной среды Dulbecco (DMEM) без фенольного красного и L-глутамина, дополненного 10% фетальной бычьей сывороткой, 5 мл пенициллина / стрептомицина, и фильтруйте-стерилизуйте с помощью фильтра 0,22 мкм.
ПРИМЕЧАНИЕ: Держите среду для рассечения при 4 °C до 1 месяца. - Готовьте культуральную среду ex utero embryo culture (EUCM) каждый день культивирования внутри биологического капюшона, используя 25% эмбриональной среды плюс 50% сыворотки крыс и 25% сыворотки пуповинной крови человека (HCS) или сыворотки крови взрослого человека (HBS).
- Для получения эмбриональной среды добавляют 5 мл глутамина, 5 мл HEPES и 5 мл пенициллина/стрептомицина в 500 мл DMEM без фенольного красного и L-глутамина. Приготовьте 10-15 мл аликвот и храните их при 4 °C до двух месяцев.
ПРИМЕЧАНИЕ: Удвоение концентрации антибиотиков при наличии какого-либо загрязнения. - Термоактивируют сыворотку крыс при 56 °C в течение 30-45 мин и фильтруют через фильтр 0,22 мкм поливинилидендифторида. Используйте сыворотку для посева в тот же день инактивации. Разморозьте HCS или HBS и немедленно используйте его для экспериментов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Коммерческая крысиная сыворотка дает стабильные результаты (минимум 4 партии были протестированы без очевидных изменений). Альтернативно, высококачественная крысиная сыворотка может быть получена собственными силами, как описано ранее8,14. Если HCS недоступен, замените его на HBS, собранный собственными силами. Крысиная сыворотка, HCS и HBS могут быть повторно заморожены один раз и сохранены при -20 ° C для использования в другой день. Разморозьте и соедините замороженную сыворотку с большим объемом свежеотмороженной сыворотки и не замораживайте ее повторно.
2. Коллекция сыворотки пуповинной крови человека и сыворотки крови взрослого человека
- Чтобы изолировать HCS, соберите пуповинную кровь у здоровых беременных женщин в день планового кесарева сечения.
- Двойной зажим пуповины на 5-7 см от пупка и трансекция между зажимами сразу после родов младенца.
- Вручную извлекайте кровь с помощью большой иглы 14 Г и шприца 50 мл непосредственно из пупочной вены, в то время как плацента остается на месте, чтобы избежать каких-либо следов гемолиза.
ПРИМЕЧАНИЕ: Соберите кровь после того, как младенец был удален из области хирургии, и пуповинная кровь была взята для клинических испытаний.
- Дозируют собранную кровь до 5 мл прокоагулянта в стерильных пробирках и сразу же переносят их до 4 °C в течение 15 мин, чтобы обеспечить полную коагуляцию. Центрифугировать коагулированные пробирки при 2 500 × г в течение 10 мин при 4 °C.
- Выбросьте трубки с признаками гемолиза (розово-красная сыворотка). Соберите сыворотку (желтого цвета) с помощью пипетки 5 мл и отфильтруйте ее через фильтр 0,22 мкм. Нагрейте сыворотку сразу же на водяной бане при температуре 56 °C в течение 45 мин.
- Приготовьте 1-1,5 мл аликвоты инактивированной сыворотки и храните их при -80 °C до шести месяцев. При необходимости отправляйте судно при температуре -70 °C с использованием сухого льда.
- Для сбора сыворотки крови взрослого человека возьмите кровь у здоровых взрослых и немедленно выделите сыворотку в соответствии с тем же протоколом, описанным для сыворотки пуповинной крови. Храните HBS в виде термоинактивированных и отфильтрованных аликвот при -80 °C в течение шести месяцев.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сыворотка пуповины человека и сыворотка для взрослых людей, приготовленная только что на месте , дали превосходные результаты по сравнению с коммерчески доступной сывороткой. Собирайте HCS у здоровых женщин в возрасте старше 18 лет и младше 40 лет, запланированных на кесарево сечение. Исключить женщин, которые родили вагинально, и женщин с любым хроническим заболеванием или активными заболеваниями, включая гестационный диабет или гипертонию.
3. Ex utero роликовая культура эмбрионов от E7.5 до E11
- Настройка роликового культивируемого инкубатора и газового регулятора
- Культивирование Е7.5 или более продвинутых эмбрионов с использованием системы роликовых культур инкубатора. Включите ротатор и нагревательный блок при 37 °C в течение не менее 1 ч до рассечения эмбриона. Добавьте автоклавную воду в газовый баллон и выходную пробирку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поместите термометр рядом с вращающимся барабаном и часто проверяйте стабильность температуры внутри инкубатора. Открытие инкубатора как можно быстрее, так как длительное время открытия повысит температуру и повлияет на развитие эмбриона. При необходимости добавьте больше автоклавной воды в газовый входной баллон и выходную пробирку, чтобы сохранить их на минимальной половинной емкости во время посева. Защитите эмбрионы внутри инкубатора от света, накрыв инкубатор тканью. - Включите модуль газового регулятора, нажав на главный переключатель и впоследствии включив контроллеры кислорода/азота и CO2 (рисунок 1A). Установите значения кислорода и CO2 на 5% с помощью соответствующих контроллеров. Откройте газовый регулятор и установите давление газа на ~6,5-7 фунтов на квадратный дюйм (psi), переместив переключатель напряжения в преобразователе давления (рисунок 1B). Подтвердите значение давления газа с помощью цифрового манометра.
- Контролируйте поток газа, проверяя скорость пузырьков, создаваемых внутри заполненной водой пробирки, выделенной внутри прецизионного инкубатора. Установите правильную скорость пузырьков, закрыв/открыв клапан потока газа на крышке бутылки с водой. Убедитесь, что поток газа допускает образование пузырьков со скоростью 2-4 пузырька в секунду или установите пузырьковый поток в первой точке, где пузырьки выходят в заполненную водой выходную трубку.
- Наполните бутылки культуры 2 мл питательной среды и заткните их в полый вращающийся барабан для предварительного выравнивания на 1 ч. Используйте полые силиконовые бунги, чтобы запечатать бутылки на барабане. Держите герметичными пустые пространства во вращающемся барабане с помощью сплошных бунгов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Отсутствие пузырьков в выпускной трубке (нет газа, проходящего через систему) или исключительно высокий поток газа могут повлиять на развитие эмбриона. В случае отсутствия пузырькового потока к выходной пробирке проверьте, что все кремниевые бунги правильно расположены во вращающемся барабане и герметизируют систему, и убедитесь, что бутылка с водой закрыта правильно и все трубки подключены правильно. Отсутствие пузырьков, поступающих в бутылку с водой, может свидетельствовать о неисправности в газовом регуляторе.
- Культивирование Е7.5 или более продвинутых эмбрионов с использованием системы роликовых культур инкубатора. Включите ротатор и нагревательный блок при 37 °C в течение не менее 1 ч до рассечения эмбриона. Добавьте автоклавную воду в газовый баллон и выходную пробирку.
- Вскрытие эмбрионов мышей от беременных мышей
- Предварительно выравнивайте среду для рассечения внутри инкубатора при 37 °C и 5% CO2 в течение не менее 1 ч. Оставьте крышку слегка открытой, чтобы обеспечить газообмен.
- Принесите беременную самку при вывихе шейки матки, очистите живот самки 70% этанолом, а ножницами разрезайте кожу и брюшную стенку. Найдите один конец матки и разрезайте на пересечении между яичником и маткой. Затем нарежьте матку до другого конца и переложите ее в 100-миллиметровую чашку Петри, наполненную фосфатно-буферным физиологическим раствором Dulbecco комнатной температуры (DPBS).
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использовать не гормонально-праймированные, естественно спаренные самки. - Быстро мойте концептуалы в DPBS и разрезайте попарно, чтобы облегчить обработку эмбрионов. Переместите все пары концептуусов на предварительно уравновешенную среду рассечения в 60-миллиметровой чашке Петри и разделите на отдельные концептуалы.
- Удаляют стенку матки концептусов, разрывая ткань матки с помощью пары грубых щипцов. Используйте тонкие микрохирургические щипцы, чтобы разрезать кончик грушевидной децидуа. Вставьте щипцы рядом с эмбрионом параллельно его длинной оси и откройте щипцы, чтобы разделить децидуу на половинки.
- Наконец, оставьте неповрежденный эктоплацентарный конус, прикрепленный к цилиндру яйцеклетки, захватив эмбрион из децидуа и сняв теменной желточный мешок с эмбриона с помощью тонких щипцов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать воздействия на эмбрион, выполните вскрытие на микроскопе, оснащенном нагревательной пластиной при 37 °C в течение максимум 30-40 мин. Рассекайте по одному помету эмбрионов за раз. - Сразу после рассечения перенесите эмбрионы на новую пластину, заполненную уравновешенной средой для рассечения, используя стеклянную пипетку Пастера, чтобы предотвратить прилипание эмбрионов к обломкам тканей.
- Выберите те эмбрионы, которые находятся на стадии нервной пластинки / ранней складки головки, не показывающие повреждения в эпибласте, и перенесите 5-6 эмбрионов на бутылку в предварительно уравновешенные стеклянные бутылочки для культивирования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы подготовить стеклянную пипетку Пастера, разрежьте отверстие пипетки до подходящего размера, чтобы соответствовать эмбрионам, используя стеклорез, и храните его в этаноле, чтобы избежать загрязнения. Вымойте стеклянную пипетку PBS перед переносом эмбрионов. При переносе эмбрионов в бутылочку для культивирования убедитесь, что вы переносите как можно меньший объем среды для рассечения, чтобы избежать разбавления EUCM. - Поместите бутылки во вращающуюся культуральную систему при 37 °C, в атмосферу с содержанием 5% O2 и 5% CO2.
- Каждый день культивирования извлекайте бутылочки один за другим из инкубатора, чтобы оценить развитие эмбриона под стереомикроскопом. Обязательно закройте пустое отверстие в барабане твердым бунгом при извлечении бутылки. Вырежьте кончик стерильной пластиковой пипетки Пастера, чтобы она соответствовала размеру эмбриона, и переместите эмбрионы в чашку Петри, чтобы облегчить наблюдение. Убедитесь, что эмбрионы всегда покрыты средой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сведите к минимуму время, в течение которого эмбрионы находятся вне инкубатора, чтобы избежать пагубных последствий для эмбрионов из-за снижения температуры тела. Обращайтесь с эмбрионами осторожно, чтобы избежать разрыва кровеносных сосудов желточного мешка, влияющего на выживаемость эмбрионов. - На 1-й день культивирования (эквивалент Е8.5) переносят группы из 3 эмбрионов в новый флакон с 2 мл свежего и предварительно уравновешенного EUCM, содержащего дополнительные 3 мг/мл D-глюкозы и газовую смесь 13% O2, 5% CO2.
- Через 48 ч (эквивалентно Е9,5) переносят группы из двух эмбрионов в новый флакон со свежим предварительно нагретым EUCM плюс 3,5 мг/мл глюкозы в газовой атмосфере 18% O2 и 5% CO2.
- Через 72 ч культуры (эквивалентно Е10,5) переместите каждый эмбрион в отдельный флакон, содержащий 1,5-2 мл свежей среды, дополненной 4 мг/мл глюкозы и газоснабжением 21% O2 и 5% CO2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эмбрионы достигают своего максимального роста около полуночи 4-го дня культивирования. - Используйте тонкие щипцы, чтобы удалить желточный мешок и амнион, и отсоедините пуповину для правильного наблюдения за морфологией эмбриона. Выключите модуль регулирования газа и прецизионный инкубатор.
ПРИМЕЧАНИЕ: Предварительное выравнивание питательной среды в течение 1 часа путем инкубации внутри стеклянной бутылки в роликовой культуре с адекватной газовой атмосферой в соответствии со стадией эмбриона. Очищайте бутылки для культивирования и всю стеклянную посуду инкубатора после каждого использования, выполняя три промывки с проточной дистиллированной водой с последующей ночной промывкой, погруженной в 70% этанол. Трижды промыть проточной дистиллированной водой, дать бутылкам высохнуть на ночь и стерилизовать автоклавом. Аналогичным образом, регулярно автоклавируйте кремниевые пробки. Тщательно очистите все инструменты для рассечения 70% этанолом и стерилизуйте их.
4. Расширенная культура эмбрионов от E5.5/E6.5 до E11
- Культивировать прегаструляцию (Е5.5) и раннюю гаструляцию (Е6.5) эмбрионы до ранней стадии сомита (Е8.5) в статические пластины.
- Предварительно уравновешивают среду рассечения в течение 1 ч в инкубаторе с 5% CO2 при 37 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы обеспечить газообмен, не закрывайте крышку трубки полностью. - Подготовьте формы для культивирования, добавив в каждую лунку по 250 мкл свежеприготовленного EUCM. Поместите пластины внутрь CO2-инкубатора при температуре 37 °C для предварительного уравновешивания.
ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя 8-луночные пластины хорошо подходят для роста эмбрионов, культивирование может быть выполнено в любой другой пластине путем регулировки объема среды в соответствии с размером пластины. - Рассечение эмбрионов яичного цилиндра из матки по методике, описанной для E7.5. Удалите теменный желточный мешок эмбриона и оставьте неповрежденный эктоплацентарный конус, прикрепленный к цилиндру яйца.
- Перенесите отдельные эмбрионы в каждую лунку 8-луночной пластины с помощью микропипетки и поместите пластину внутрь инкубатора с 5% CO2 при 37 °C.
- Визуализируйте эмбрионы под стереомикроскопом и выбирайте для культивирования только эмбрионы с хорошо сформированной амниотической полостью, без видимых повреждений и без мембраны Райхерта.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте наконечники пипеток объемом 20 мкл для переноса эмбрионов E5.5 и наконечники 200 мкл для переноса эмбрионов E6.5. В случае культур, начинающихся с E6.5, HCS может быть заменен свежесобранным HBS. - Удалите половину среды и добавьте 250 мкл свежеприготовленного предварительно приготовленного EUCM после 24 ч культивирования, гарантируя, что эмбрионы всегда погружаются в культуральную среду. В случае культур, начинающихся с E5.5, после двух дней культивирования (эквивалентно E7.5) удаляют 200 мкл и добавляют 250 мкл нового EUCM.
ПРИМЕЧАНИЕ: Во время статической культуры эмбрионы могут прикрепляться к пластине (в основном при использовании пластиковых пластин), что серьезно помешает развитию эмбриона. Прикрепление эмбриона к пластине происходит чаще в первый день культивирования эмбрионов Е5.5. Чтобы предотвратить прикрепление, осторожно оттолкните эмбрионы от поверхности пластины с помощью тонких, стерильных щипцов. Убедитесь, что к поверхности пластины остается только эктоплацентарный конус. - Перенос эмбрионов в роликовую культуру на ранней стадии сомита (4-7 сомитов; после трех дней культивирования для эмбрионов, эксплантированных при Е5,5 и двух дней для культур, начатых при Е6,5), следуя тем же показаниям, описанным ранее для эмбрионов стадии Е8.5.
ПРИМЕЧАНИЕ: Перенос эмбрионов в роллеровую культуру на стадиях сомита, отличных от указанных выше, приводит к сбою дальнейшего развития. В отличие от E7.5 ex utero культур, можно поддерживать эмбрионы в постоянной атмосфере 21% кислорода и 5% CO2, обеспечивая несколько более высокую эффективность развития эмбриона, чем атмосферы с динамической концентрацией кислорода.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Условия культивирования роликов, описанные для эмбрионов E7.5 (стадия поздней гаструляции), поддерживают постоянный и нормальный рост эмбриона со средней эффективностью, близкой к 75% через 4 дня культивирования (рисунок 2 и таблица 1). Эффективность развития эмбриона может варьироваться в зависимости от различных генетических фонов мышей, но неизменно надежна (рисунок 2C). Добавки с HBS вместо HCS дают эффективность ~ 68% после 4 дней внеутробной культуры, в зависимости от генетического фона мышей (рисунок 2D и таблица 2). Эмбрионы, развившиеся ex utero , рекапитулируют правильное развитие примерно до 44-сомитной стадии. После этого эмбрионы представляют эмбриональные аномалии из-за отсутствия аллантоической плаценты, что приводит к недостаточной оксигенации и снабжению питательными веществами, учитывая увеличение размера тела на этом этапе.
Развитие эмбрионов E6.5 (ранняя полоса) в статических пластинах корректно рекапитулируется с эффективностью >90% до ранней стадии сомита E8.5 с использованием EUCM как с HCS, так и с HBS (рисунок 3, таблица 3 и таблица 4) (см. подробное описание стадии эмбриона между E5.5 и E8.5). Ex utero культура от гаструляции до продвинутого органогенеза путем объединения культур на статических пластинах с последующей вальцовой культурой в постоянной 21% кислородной атмосфере дает расчетную эффективность правильного развития 55% и 26% до 44-сомитовой стадии с использованием HCS и HBS соответственно (рисунок 3A, таблица 3 и таблица 4). Существует задержка 1-2 пар сомита в этих эмбрионах по сравнению с эмбрионами, развитыми в утробе матери. Наибольшее падение эффективности происходит при переходе с Е8,5 на Е9,5 из-за отказа осевого поворота и закрытия нервной трубки.
Культуры, начиная с прегаструлирующих эмбрионов Е5.5, показывают эффективность правильного развития до ранней стадии сомита (Е8.5) примерно 46%, и почти 17% эмбрионов завершат правильное развитие через шесть дней культивирования после переноса в роллер-культуру (рисунок 4 и таблица 5). Расширенная культура ex utero продлевает задержку развития у эмбрионов, причем эмбрионы, эксплантированные в E5.5, показывают задержку в 2-4 пары сомитов по сравнению с эмбрионами in vivo . Тем не менее, морфогенез и развитие тканей протекают должным образом примерно до 42-сомитовой стадии.
Наиболее распространенные дефекты, наблюдаемые в эмбрионах для культур, инициированных из E7.5, E6.5 и E5.5, проиллюстрированы на рисунке 5A-C. В момент рассечения эмбрионы с даже незначительным повреждением эпибласта или внеэмбриональной области, а также эмбрионы, сохраняющие мембрану Райхерта, должны быть отброшены. Аналогичным образом, ранние эмбрионы не будут расти должным образом (см. Рисунок 5B для мертвых эмбрионов) или демонстрировать серьезные задержки развития (см. Рисунок 5B для отсроченного эмбриона). Прикрепление эмбрионального эпибласта к поверхности пластины будет влиять на развитие в зависимости от положения и степени прикрепления. Присоединение части эпибласта или всего эмбриона приведет к сбою дальнейшего развития (см. Рисунок 5B для присоединенного эмбриона).
Основными аномалиями, наблюдаемыми в процентном соотношении дефектных эмбрионов на Е8,5 (ранняя стадия сомита), являются развитие задней области вне желточного мешка или дефекты роста нервных складок (рисунок 5А,В). В случае культур, начатых с E5.5, часто наблюдаемым дефектом развития является наличие небольшого, недоразвитого эпибласта (рисунок 5C). Во время, эквивалентное E9.5, дефекты в закрытии нервных складок, сбой осевого поворота или недостаток роста мозга представляют собой наиболее часто наблюдаемые аномалии (рисунок 5). Наиболее часто наблюдаемыми дефектами развития при Е10,5/Е11 являются аномалии в области головы, нарушение нормального кровообращения в желточном мешке и выпот перикарда (рисунок 5). Разрыв одного основного кровеносного сосуда и отток крови могут стать причиной последующей гибели эмбриона. Примечательно, что правильный рост самого эмбриона может быть достигнут даже при отсутствии явной циркуляции желточного мешка. Эмбрионы, хранящиеся в культуре за пределами стадии, эквивалентной E11, демонстрируют усадку тела и смерть через несколько часов из-за отсутствия надлежащей оксигенации тканей.
Рисунок 1: Система регулирования газа и давления, адаптированная к роликовому инкубатору культуры. (A) Вид сверху модуля регулирования газа, подключенного к роликовому инкубатору культуры. N2 и CO2 входят в газовый регулятор, чтобы обеспечить точный контроль концентраций кислорода / CO2 и давления газа. Газы направляются в сторону смесительной коробки, в которой они смешиваются центробежной воздуходувкой и впрыскиваются в инкубатор насосом, который создает положительное давление. Газ течет через входное отверстие в бутылку с водой, а затем в герметичные баллоны. (B) Внутренняя конфигурация электронного модуля для регулирования газа и давления. Значение напряжения, установленное на преобразователе давления, регулирует давление, создаваемое насосом внутри газосмесительной коробки (5-6 В для достижения давления 6-7 фунтов на квадратный дюйм в этой конкретной модели). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Платформа культур Ex utero поддерживает рост эмбрионов E7.5 до продвинутого органогенеза. (A) Диаграмма, изображающая протокол культивирования эмбрионов E7.5 ex utero . (B) Репрезентативные изображения яркого поля групп культивируемых эмбрионов, развивающихся ex utero в течение 4 дней, от поздней гаструляции (E7.5) до 44-сомитовой стадии (E11). Указано типичное изменение числа сомита, оцениваемое каждые 24 ч. Шкала стержней = 500 мкм. (C, D) Процент нормально развитых эмбрионов через 1-4 дня культивирования, начиная с E7.5, разделенный на мышиные родительские штаммы и добавки сыворотки (C, сыворотка пуповинной крови человека; D, сыворотка крови взрослого человека). Панель A была изменена с 13. Сокращения: EUCM = экстра маточная культуральная среда эмбриона; HCS = сыворотка пуповинной крови человека; HBS = сыворотка крови взрослого человека. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3. Расширенный протокол ex utero culture для выращивания раннегаструлирующих эмбрионов мышей E6.5 до позднего органогенеза. (A) Схематическая иллюстрация расширенного протокола культивирования ex utero, сочетающего статические пластины и системы вращающихся бутылок. (B) Ярко-полевые изображения эмбрионов, культивируемых ex utero в течение пяти дней от E6.5 до стадии 44-somite. Указано типичное изменение числа сомита, оцениваемое каждые 24 ч. Шкала = 500 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Непрерывная внеутробная культура эмбрионов мышей прегаструляции от Е5.5 до поздних стадий органогенеза. (A) Схематическое изображение внеутробной культуры протокола для эмбрионов E5.5. (B) Репрезентативные изображения эмбрионов с ярким полем, культивируемых ex utero в течение шести дней от E5.5 до стадии 42-somite. Указано типичное изменение числа сомита, оцениваемое каждые 24 ч. Шкала = 500 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Репрезентативные дефекты развития, наблюдаемые у эмбрионов, культивируемых ex utero. (А-С) Ярко-полевые микроскопические изображения аномальных эмбрионов мышей, выращенных ex utero, начиная с E7.5 (A), E6.5 (B) или E5.5 (C). Общее описание дефекта приводится на каждом изображении. Шкала = 500 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Таблица 1: Эффективность правильного развития эмбрионов, выделенных через Е7,5 дней после койтума. Эмбрионы культивировали ex utero в течение 4 дней в EUCM (25% сыворотки пуповинной крови человека). [-] указывает на то, что культуры не продолжаются из-за экспериментальных требований. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Таблица 2: Эффективность правильного развития эмбрионов, выделенных при Е7.5, культивируемых ex utero в течение 4 дней, заменяя сыворотку пуповинной крови человека свежеизолированной сывороткой крови взрослого человека. [-] указывает на то, что культуры не продолжаются из-за экспериментальных требований. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Таблица 3: Эффективность правильного развития эмбрионов (B6D2F1/ICR), выделенных при E6.5 и культивируемых ex utero в течение 5 дней с использованием EUCM (25% сыворотки пуповинной крови человека). Ex utero культуру делали в статической культуре в течение двух дней (21% O2), а затем три дня во вращающихся флаконах при 21% O2. [-] указывает на то, что культуры не продолжаются из-за экспериментальных требований. Аббревиатура: NA = не приобретено. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Таблица 4: Эффективность правильного развития эмбрионов (B6D2F1/ICR), выделенных при E6.5 и культивируемых ex utero в течение 5 дней с использованием EUCM (замена сыворотки пуповинной крови человека свежеизолированной сывороткой крови взрослого человека). Эмбрионы развивали в статической культуре в течение двух дней (21% O2), а затем три дня во вращающихся флаконах при 21% O2. [-] указывает на то, что культуры не продолжаются из-за экспериментальных требований. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Таблица 5: Эффективность правильного развития эмбрионов (B6D2F1/ICR), выделенных при E5.5 и культивируемых ex utero в течение 6 дней с использованием EUCM (25% сыворотки пуповинной крови человека). Эмбрионы развивали в статической культуре в течение трех дней (21% O2), а затем три дня во вращающихся флаконах при 21% O2. [-] указывает на то, что культуры не продолжаются из-за экспериментальных требований. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Протокол культивирования, представленный в настоящем описании, может поддерживать правильное и непрерывное развитие эмбриона мыши ex utero в течение шести дней, от E5.5 до E11. Ранее эмбрионы на этих стадиях развития могли нормально развиваться в культуре только в течение коротких периодов (до 48 ч)15. Соединение модуля регулирования газа с инкубатором роликовых культур для точного контроля концентрации кислорода и гипербарического давления газа имеет решающее значение для правильной культуры эмбриона мыши, описанной в настоящем описании. Повышение давления газа до 7 фунтов на квадратный дюйм усиливает диффузию кислорода, позволяя эмбриону развиваться до E11 в атмосфере до 21% O2/5% CO2, в отличие от ранее используемых условий 95% O216, которые могут быть вредны для эмбриона в долгосрочной перспективе. Кроме того, известно, что концентрация кислорода играет решающую роль в эмбриональном развитии, поскольку ранний постимплантационный эмбриогенез происходит в гипоксических условиях17. Соответственно, успешная культура позднегаструлирующих эмбрионов требует начальной 5% атмосферы O2 с динамическим увеличением концентрации кислорода по мере роста эмбриона. Примечательно, что культивирование эмбрионов до/ранней гаструлации в статической культуре при 5% O2 резко снижало эффективность правильного развития эмбрионов по сравнению с 21% O2, и они не могли развиваться дальше до E9,5. Последнее может быть объяснено более медленной скоростью диффузии питательных веществ и кислорода через эмбриональные ткани в статической культуре по сравнению с культурой во вращающихся флаконах1,10.
Кроме того, высокое содержание сыворотки пуповинной крови крыс и человека обеспечивает более последовательные результаты для выращивания ранних постимплантированных эмбрионов, чем среды, дополненные только сывороткой крысы13,18. Важно отметить, что сыворотка, используемая для культивирования эмбрионов, должна быть приготовлена из свежеизвлеченной крови. Хотя высококачественная крысиная сыворотка для культивирования цельного эмбриона коммерчески доступна, сыворотка человека должна быть изолирована внутри компании. Добавки с сывороткой пуповинной крови человека могут быть заменены сывороткой, выделенной из крови взрослого человека, которая широко доступна и по-прежнему обеспечивает последовательный и эффективный рост эмбриона.
Успешное и эффективное развитие эмбриона ex utero также сильно зависит от точного выделения эмбриона. Во-первых, процедуру рассечения следует проводить в среде для рассечения, нагретой при 37 °C, а рассеченные эмбрионы должны быть перенесены в бутылочки/тарелки для культивирования в течение 30 мин. Во-вторых, точное выделение эмбриона из децидуа и удаление мембраны Райхерта без повреждения эпибласта является ключом к получению высокой эффективности развития эмбриона. В-третьих, для культивирования следует отбирать только эмбрионы на адекватной стадии, так как ранние/отсроченные эмбрионы не будут расти должным образом.
Обработка эмбрионов во время переноса является еще одним важным моментом во время культуры ex utero , главным образом после развития эмбрионального желточного мешка. Эмбрионы должны быть перенесены осторожно, потому что повреждение кровеносных сосудов крупного желточного мешка может повлиять на правильное развитие. Как правило, чем дольше период культивирования эмбрионов, тем ниже эффективность нормального развития эмбриона, т.е. эмбрионы, эксплантированные при E7.5, будут развиваться с более высокой эффективностью, чем те, которые эксплантированы при E6.5 или E5.5. Кроме того, присутствие антибиотиков в среде имеет основополагающее значение для предотвращения загрязнения, если диссекционный микроскоп, выделенный внутри биологической вытяжки, недоступен.
Нельзя исключать, что другие платформы, уровни давления или условия могут обеспечить аналогичные или улучшенные результаты, полученные с помощью настоящего протокола. Необходима дальнейшая оптимизация условий, описанных в данном исследовании, для достижения эффективности развития эмбриона, равной той, которая наблюдается при внутриутробном развитии. Кроме того, будущая разработка определенной среды, свободной от сыворотки, может помочь определить конкретные метаболические и химические требования во время развития эмбриона млекопитающих и уменьшить изменчивость сыворотки от партии к партии. Потребность в постоянном смешивании питательных веществ и газов после E8.5 с использованием культуры вращающихся баллонов в современных условиях ограничивает возможности долгосрочной визуализации на этапах органогенеза. Будущая разработка микрофлюидных устройств, позволяющих смешивать газ и питательные вещества в статической культуре в сочетании с установками микроскопии, может помочь преодолеть эту проблему.
Эмбрионы, культивируемые ex utero, могут быть экспериментально обработаны и сохранены в культуре до продвинутых стадий органогенеза вне матки. Ранее мы продемонстрировали способность вводить различные возмущения в развивающиеся эмбрионы, такие как генетические манипуляции путем электропорации или лентивирусной инфекции, живая визуализация, клеточная трансплантация и тератогенные исследования13. В конечном счете, эта платформа может помочь раскрыть спецификацию судьбы клеток и механизмы формирования органов у млекопитающих, позволяя экспериментировать в режиме реального времени на живых эмбрионах мышей в течение шести дней раннего постимплантационного развития.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
J.H.H. является консультантом Biological Industries Ltd и подала патентную заявку, охватывающую условия валика и статической культуры, описанные в настоящем документе (подана J.H.H. и Институтом науки Вейцмана). Другие авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.
Acknowledgments
Эта работа финансировалась Паскалем и Иланой Манту; Европейский исследовательский совет (ERC-CoG-2016 726497-Cellnaivety); Совет по медицинским исследованиям стюардессы (FAMRI); Профессор Израильского фонда исследований рака (ICRF), BSF, Институт исследований стволовых клеток Хелен и Мартина Киммеля, премия Хелен и Мартина Киммеля за инновационные исследования; Израильский научный фонд (ISF), Минерва, Институт медицинской химии Шермана, Центр неврологических заболеваний Неллы и Леона Бенозийо, Семейный центр исследований генетических расстройств Дэвида и Фелы Шапелл, Институт медицинской генетики семьи Кекст, Фонд исследований стволовых клеток доктора Бет Ром-Раймер, Фонды Эдмонда де Ротшильда, Благотворительный фонд Занткера, поместье Звиа Зерони.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm pore size filter (250 mL) | JetBiofil | FCA-206-250 | |
| 0.22 µm pore size syringe PVDF filter | Millipore | SLGV033RS | |
| 8-well µ-plates glass bottom/ibiTreat | iBidi | 80827/80826 | |
| Bottle with adaptor cap for gas inlet | Arad Technologies | ||
| Bungs (Hole) | B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering | BTC 06 | Used to seal the bottles to the drum |
| Bungs (Solid) | B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering | BTC 07 | Used to seal the rotating drum |
| Culture bottles | B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering | BTC 03/BTC 04 | Either Glass Bottles (Small) BTC 03 or Glass Bottles (Large) BTC 04 |
| D(+)-glucose Monohydrate | J.T. Baker | ||
| Diamond knife | Fine Science Tools | 10100-30/45 | |
| Digital Pressure Gauge | Shanghai Benxu Electronics Technology co. Ltd | BX-DPG80 | |
| DMEM | GIBCO | 11880 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Biological industries | 02-020-1A | |
| Fetal Bovine Serum | Biological industries | 04-013-1A | |
| Gas regulation module | Arad Technologies | HannaLab1 | |
| Glutamax | GIBCO | 35050061 | glutamine |
| Graefe forceps | Fine Science Tools | 11052-10 | |
| HEPES | GIBCO | 15630056 | |
| Microsurgical forceps (Dumont #5, #55) | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Pasteur pipettes (glass) | Hilgenberg | 3150102 | |
| Pasteur pipettes (plastic) | Alexred | SO P12201 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biological industries | 03-031-1B | |
| Petri Dishes (60 mm and 100 mm) | Falcon | 351007/351029 | |
| Precision incubator system | B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering | BTC01 | BTC01 model with gas bubbler kit |
| Pro-coagulant sterile test tubes (5 mL) | Greiner Bio-One | #456005 | |
| Rat whole embryo culture serum | ENVIGO Bioproducts | B-4520 | |
| Stereoscopic microscope equipped with heating plate | Nikon | SMZ18 | |
| Sterile syringes (5, 10 ml) for sera filtration | Pic Solution | ||
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 14094-11 |
References
- New, D. A. Whole-embryo culture and the study of mammalian embryos during organogenesis. Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society. 53 (1), 81-122 (1978).
- Tam, P. P., Behringer, R. R. Mouse gastrulation: the formation of a mammalian body plan. Mechanisms of Development. 68 (1-2), 3-25 (1997).
- Huang, Q., et al.
- White, M. D., et al. Long-lived binding of Sox2 to DNA predicts cell fate in the four-cell mouse embryo. Cell. 165 (1), 75-87 (2016).
- Tam, P. P. Postimplantation mouse development: whole embryo culture and micro-manipulation. International Journal of Developmental Biology. 42 (7), 895-902 (1998).
- Nicholas, J. S., Rudnick, D. The development of rat embryos in tissue culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 20 (12), 656-658 (1934).
- New, D. A., Stein, K. F.
- Rivera-Pérez, J. A., Jones, V., Tam, P. P. L. Culture of whole mouse embryos at early postimplantation to organogenesis stages: developmental staging and methods. Methods in Enzymology. 476, 185-203 (2010).
- New, D. A. T., Coppola, P. T., Terry, S. Culture of explanted rat embryos in rotating tubes. Journal of Reproduction and Fertility. 35 (1), 135-138 (1973).
- Cockroft, D. L. A comparative and historical review of culture methods for vertebrates. International Journal of Developmental Biology. 41 (12), 127-137 (1997).
- Parameswaran, M., Tam, P. P. L. Regionalisation of cell fate and morphogenetic movement of the mesoderm during mouse gastrulation. Developmental Genetics. 17 (1), 16-28 (1995).
- Beddington, R. S. Induction of a second neural axis by the mouse node. Development. 120 (3), 613-620 (1994).
- Aguilera-Castrejon, A., et al. Ex utero mouse embryogenesis from pre-gastrulation to late organogenesis. Nature. 593 (7857), 119-124 (2021).
- Takahashi, M., Makino, S., Kikkawa, T., Osumi, N. Preparation of rat serum suitable for mammalian whole embryo culture. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (90), e51969 (2014).
- Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K. V., Nagy, A. Isolation, culture and manipulation of postimplantation embryos. Manipulating the Mouse Embryo: a Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. 149-193 (2014).
- Takahashi, M., Nomura, T., Osumi, N. Transferring genes into cultured mammalian embryos by electroporation. Development, Growth and Differentiation. 50 (6), 485-497 (2008).
- Mathieu, J., Ruohola-Baker, H. Metabolic remodeling during the loss and acquisition of pluripotency. Development. 144 (4), 541-551 (2017).
- Sturm, K., Tam, P. P. L. Isolation and culture of whole postimplantation embryos and germ layer derivatives. Methods in Enzymology. 225, 164-190 (1993).
