Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Ex Utero Kultur af museembryoner fra prægastrulation til avanceret organogenese

Published: October 19, 2021 doi: 10.3791/63160
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular Genetics, Weizmann Institute of Science

Summary

En forbedret platform for helembryokultur muliggør kontinuerlig og robust ex utero-udvikling af museembryoner efterimplantation i op til seks dage, fra prægastrulationsstadier til avanceret organogenese. I denne protokol beskriver vi standardproceduren for vellykket embryokultur ved hjælp af statiske plader og roterende flaskesystemer.

Abstract

Metoder til dyrkning af pattedyr efterimplantation har generelt været ineffektive og begrænset til korte perioder efter dissektion ud af livmoderen. Platforme er for nylig blevet udviklet til meget robust og langvarig ex utero-kultur af museembryoner fra ægcylinderstadier til avanceret organogenese. Disse platforme muliggør en hensigtsmæssig og trofast udvikling af prægaststyrende embryoner (E5.5) indtil bagbensdannelsestrinnet (E11). Sengassende embryoner (E7.5) dyrkes i roterende flasker i disse indstillinger, mens udvidet kultur fra prægastrulationsstadier (E5.5 eller E6.5) kræver en kombination af statiske og roterende flaskekulturer. Derudover er følsom regulering af O2 - og CO2-koncentration , gastryk, glukoseniveauer og brugen af et specifikt ex utero-dyrkningsmedium afgørende for korrekt embryonudvikling. Her tilvejebringes en detaljeret trin-for-trin protokol for udvidet embryokultur med ex utero-mus . Evnen til at dyrke normale museembryoner ex utero fra gastrulation til organogenese repræsenterer et værdifuldt redskab til at karakterisere effekten af forskellige eksperimentelle forstyrrelser under embryonal udvikling.

Introduction

Intrauterin udvikling af pattedyrembryoet har begrænset undersøgelsen af de tidlige stadier af postimplantationsudvikling1,2. Utilgængeligheden af det udviklende embryo hæmmer forståelsen af vigtige udviklingsprocesser, der forekommer efter embryoimplantaterne i livmoderen, såsom etablering af dyrekropsplanen, specifikation af kimlagene eller dannelse af væv og organer. Desuden gør den meget lille størrelse af det tidlige postimplanterede embryo det vanskeligt at observere ved intravital billeddannelse i livmoderen før E103. Manglende evne til at observere og manipulere levende embryoner på disse stadier har begrænset undersøgelsen af tidlig postimplantationsembryogenese til øjebliksbilleder under udvikling.

Protokoller for in vitro-dyrkning af præimplantationsfottedyrs embryoner er veletablerede, pålidelige og anvendes regelmæssigt4. Ikke desto mindre havde forsøg på at etablere ex utero-dyrkningssystemer, der kunne understøtte korrekt embryonvækst efter pattedyrs postimplantation, begrænset succes5. En række forskellige dyrkningsteknikker er blevet foreslået i over et århundrede, hovedsagelig ved at dyrke embryonerne i konventionelle statiske plader6,7,8 eller roterende flasker (rullekulturer)5,9,10. Disse platforme viste sig nyttige til at udvide viden om pattedyrs udvikling efter implantation11,12, på trods af at de var yderst ineffektive for normal embryooverlevelse og begrænset til korte perioder. Embryonerne begyndte at vise udviklingshæmning og morfologiske anomalier allerede 24-48 timer efter kulturinitiering.

Denne undersøgelse giver en detaljeret beskrivelse af oprettelsen af ex utero embryokultursystemet, der muliggør kontinuerlig udvikling fra prægastrulation til avancerede organogenesestadier over op til seks dages postimplantationsudvikling13. Dette papir beskriver den forbedrede rullekulturprotokol, der understøtter væksten af E7,5-embryoner (neural plade og hovedfold-stadium) indtil bagbensdannelsestrinnet (~ E11) og den udvidede kultur fra E5.5 / E6.5 ved at kombinere kultur på statiske plader og rullekulturplatforme.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyreforsøg blev udført i henhold til Animal Protection Guidelines fra Weizmann Institute of Science og godkendt af det relevante Weizmann Institute IACUC (#01390120-1, 01330120-2, 33520117-2). Raske gravide kvinder blev bedt om at give deres informerede samtykke til at indsamle blod fra navlestrengen, som godkendt af Rambam Medical Center Helsinki Committee (#RMB-0452-15). Raske voksne blev bedt om deres informerede samtykke til at få blod indsamlet i henhold til retningslinjerne fra Weizmann Institute of Science Helsinki Committee (# 1566-3).

1. Medieforberedelse

  1. Dissektionsmediet fremstilles ved hjælp af 500 ml Dulbeccos modified Eagle Medium (DMEM) uden phenolrødt og L-glutamin, suppleret med 10% føtalt kvægserum, 5 ml penicillin/streptomycin, og filtersteriliseres ved hjælp af et 0,22 μm filter.
    BEMÆRK: Opbevar dissektionsmediet ved 4 °C i op til 1 måned.
  2. Forbered ex utero embryokulturmedium (EUCM) frisk hver kulturdag inde i en biologisk hætte ved hjælp af 25% embryonalt medium plus 50% rotteserum og 25% humant navlesnorsblodserum (HCS) eller humant voksent blodserum (HBS).
  3. Til fremstilling af embryonalt medium tilsættes 5 ml glutamin, 5 ml HEPES og 5 ml penicillin/streptomycin i 500 ml DMEM uden phenolrød og L-glutamin. Forbered 10-15 ml alikvoter og opbevar dem ved 4 °C i op til to måneder.
    BEMÆRK: Fordobling af antibiotikakoncentrationen, hvis du oplever forurening.
  4. Varm-inaktivere rotteserumet ved 56 °C i 30-45 min og filtrer gennem et 0,22 μm polyvinylidendifluoridfilter. Brug serumet til dyrkning samme inaktiveringsdag. Optø HCS eller HBS og brug det straks til eksperimenter.
    BEMÆRK: Kommercielt rotteserum giver konsistente resultater (mindst 4 partier blev testet uden tydelig variation). Alternativt kan rotteserum af høj kvalitet fås internt som beskrevet tidligere8,14. Hvis HCS ikke er tilgængelig, skal du erstatte den med internt indsamlet HBS. Rotteserum, HCS og HBS kan genfryses én gang og opbevares ved -20 °C til brug på en anden dag. Tø op og kombiner det genfrosne serum med et større volumen frisk optøet serum og genfrys det ikke.

2. Indsamling af humant navlesnorsblodserum og humant blodserum til voksne

  1. For at isolere HCS skal du indsamle navlesnorsblod fra raske gravide kvinder på dagen for den planlagte kejsersnit.
    1. Dobbeltklemme navlestrengen 5-7 cm fra navlestrengen og transekt mellem klemmerne umiddelbart efter fødslen af spædbarnet.
    2. Manuelt trække blod ved hjælp af en storboret 14 G-nål og en 50 ml sprøjte direkte fra navlestrengen, mens moderkagen forbliver på stedet for at undgå spor af hæmolyse.
      BEMÆRK: Saml blod, efter at spædbarnet er fjernet fra operationsområdet, og navlestrengsblod er blevet trukket til kliniske tests.
  2. Dispenser det opsamlede blod til 5 ml prokoagulant sterile reagensglas og overfør dem straks til 4 ° C i 15 minutter for at muliggøre fuldstændig koagulation. Centrifugering af de koagulerede reagensglas ved 2.500 × g i 10 minutter ved 4 °C.
  3. Kassér rør, der viser tegn på hæmolyse (pink-rødt serum). Saml serumet (gulfarvet) ved hjælp af en 5 ml pipette og filtrer det gennem et 0,22 μm filter. Varm-inaktivere serumet straks i et 56 °C vandbad i 45 min.
  4. Forbered 1-1,5 ml alikvoter af det inaktiverede serum og opbevar dem ved -80 °C i op til seks måneder. Send om nødvendigt ved -70 °C ved hjælp af tøris.
  5. Ved indsamling af serum til voksne mennesker skal blod fra raske voksne trækkes og serum straks isoleres efter den samme protokol, der er beskrevet for navlesnorsblodserum. HBS opbevares som varmeinaktiverede og filtrerede alikvoter ved -80 °C i op til seks måneder.
    BEMÆRK: Humant navlestrengsserum og voksent humant serum tilberedt frisk internt gav overlegne resultater til kommercielt tilgængeligt serum. Saml HCS fra raske kvinder, over 18 år og under 40 år, der er planlagt til kejsersnit levering. Ekskluder kvinder, der fødte vaginalt, og kvinder med kronisk sygdom eller aktive medicinske tilstande, herunder svangerskabsdiabetes eller hypertension.

3. Ex utero rullekultur af embryoner fra E7.5 til E11

  1. Opsætning af rullekulturinkubatoren og gasregulatoren
    1. Kultur E7.5 eller mere avancerede embryoner ved hjælp af rullekulturinkubatorsystemet. Tænd rotatoren og varmeenheden ved 37 °C i mindst 1 time, før embryodissektionerne tændes. Tilsæt autoklaveret vand til gasindløbsflasken og udløbsreagensglasset.
      BEMÆRK: Placer et termometer ved siden af den roterende tromle, og kontroller ofte temperaturens stabilitet inde i inkubatoren. Åbn inkubatoren så hurtigt som muligt, da forlænget åbningstid vil øge temperaturen og påvirke embryonudviklingen. Når det er nødvendigt, tilsættes mere autoklaveret vand til gasindløbsflasken og udløbsrenagensglasset for at holde dem på mindst halv kapacitet under dyrkning. Beskyt embryonerne inde i inkubatoren mod lys ved at dække inkubatoren med en klud.
    2. Tænd for gasregulatormodulet ved at trykke på hovedkontakten og derefter tænde for ilt/nitrogen- og CO2-regulatorerne (figur 1A). Indstil ilt- og CO2-værdierne til 5% ved hjælp af de respektive controllere. Åbn gasregulatoren, og indstil gastrykket til ~ 6,5-7 pund pr. Kvadrattomme (psi) ved at flytte spændingsafbryderen i tryktransmitteren (figur 1B). Bekræft gastryksværdien ved hjælp af en digital manometer.
    3. Overvåg gasstrømmen ved at kontrollere hastigheden af bobler, der er skabt inde i det udløbsvandfyldte reagensglas, der er tildelt inde i præcisionsinkubatoren. Indstil den korrekte boblehastighed ved at lukke/åbne gasstrømningsventilen på låget på vandflasken. Sørg for, at gasstrømmen tillader dannelse af bobler med en hastighed på 2-4 bobler i sekundet , eller indstil boblestrømmen på det første punkt, hvor boblende kommer ud til det vandfyldte udløbsrør.
    4. Fyld kulturflaskerne med 2 ml kulturmedium og sæt dem i den udhulede roterende tromle til forligevægt i 1 time. Brug de udhulede siliciumbungs til at forsegle flaskerne til tromlen. Hold forseglede de tomme mellemrum i den roterende tromle ved hjælp af de faste bungs.
      BEMÆRK: Fraværet af bobler i udløbsrøret (ingen gas, der kommer gennem systemet) eller en usædvanlig høj gasstrøm kan påvirke embryonudviklingen. I tilfælde af manglende boblestrøm til udløbsgenstanderøret skal du kontrollere, at alle siliciumbungs er korrekt placeret i den roterende tromle og forsegle systemet, og kontroller, at vandflasken er lukket korrekt, og at alle slanger er tilsluttet korrekt. Manglende boblende kommer ind i vandflasken kan indikere en funktionsfejl i gasregulatoren.
  2. Dissektion af museembryoner fra gravide mus
    1. Forlige dissektionsmediet inde i en inkubator ved 37 °C og 5 % CO2 i mindst 1 time. Lad låget stå lidt åbent for at tillade gasudveksling.
    2. Ofre den gravide kvinde ved cervikal dislokation, rengør kvindens underliv med 70% ethanol og skær huden og abdominalvæggen med en saks. Find den ene ende af livmoderen og skær i krydset mellem æggestokken og livmoderen. Skær derefter langs livmoderen indtil den anden ende og overfør den til en 100 mm petriskål fyldt med stuetemperatur Dulbeccos fosfatbufrede saltvand (DPBS).
      BEMÆRK: Brug af ikke-hormonprimede, naturligt parrede hunner anbefales.
    3. Vask hurtigt konceptbrugerne i DPBS og skær dem parvis for at lette håndteringen af embryoner. Flyt alle par konceptbrug til et præequiliberet dissektionsmedium i en 60 mm petriskål og skær dem i individuelle koncepter.
    4. Fjern livmodervæggen i konceptbrugerne ved at rive livmodervævet ved hjælp af et par grove tang. Brug fine mikrokirurgiske tang til at skære spidsen af den pæreformede decidua. Indsæt tangen ved siden af embryoet parallelt med dets lange akse, og åbn tangen for at opdele decidua i halvdele.
    5. Til sidst skal du lade den intakte ektoplacentale kegle være fastgjort til ægcylinderen ved at gribe embryoet fra decidua og skrælle parietal æggeblommesækken af embryoet ved hjælp af fine tang.
      BEMÆRK: For at undgå at påvirke embryoet skal du udføre dissektioner på et mikroskop udstyret med en varmeplade ved 37 °C inden for højst 30-40 min. Dissekere et kuld embryoner ad gangen.
    6. Umiddelbart efter dissektion overføres embryonerne til en ny plade fyldt med ligevægtig dissektionsmedium ved hjælp af en pasteur-pipette af glas for at forhindre embryonerne i at klæbe til vævsresterne.
    7. Vælg de embryoner i neurale plade/tidlige hovedfoldningstrin, der ikke viser nogen skade i epiblasten, og overfør 5-6 embryoner pr. flaske til de udruglatterede glaskulturflasker.
      BEMÆRK: For at forberede glaspastepa-pipetten skal du skære pipettens åbning til en passende størrelse, så den passer til embryonerne ved hjælp af en glasskærer, og opbevar den i ethanol for at undgå forurening. Vask glaspipetten med PBS, inden du overfører embryoner. Når embryonerne overføres til kulturflasken, skal du sørge for at overføre så lidt volumen af dissektionsmediet som muligt for at undgå fortynding af EUCM.
    8. Flaskerne anbringes i det roterende dyrkningssystem ved 37 °C i en atmosfære på 5 % O2 og 5 % CO2.
    9. Hver kulturdag skal du fjerne flaskerne en efter en fra inkubatoren for at evaluere embryonudvikling under et stereomikroskop. Sørg for at lukke det tomme hul i tromlen med en solid bung, når du fjerner en flaske. Skær spidsen af en steril pasteurpipette af plast, så den passer til embryostørrelsen, og flyt embryonerne til en petriskål for at lette observationen. Sørg for, at embryonerne altid er dækket af medium.
      BEMÆRK: Minimer den tid, hvor embryonerne er uden for inkubatoren for at undgå skadelige virkninger i embryonerne på grund af et fald i kropstemperaturen. Håndter embryonerne omhyggeligt for at undgå brud på æggeblommesækkens blodkar, hvilket påvirker embryoets overlevelse.
    10. På dyrkningsdag 1 (svarende til E8.5) overføres grupper på 3 embryoner til en ny flaske med 2 ml frisk og præequiliberet EUCM indeholdende ekstra 3 mg/ml D-glucose og en gasblanding på 13 % O2 og 5 % CO2.
    11. Efter 48 timer (svarende til E9,5) overføres grupper af to embryoner til en ny flaske med frisk forvarmet EUCM plus 3,5 mg/ml glucose i en gasatmosfære på 18 % O2 og 5 % CO2.
    12. Ved 72 timers dyrkning (svarende til E10,5) flyttes hvert embryo til en individuel flaske indeholdende 1,5-2 ml frisk medium suppleret med 4 mg/ml glucose og en gasforsyning på 21 % O2 og 5 % CO2.
      BEMÆRK: Embryoner når deres maksimale vækst omkring midnat på kulturdag 4.
    13. Brug fine tang til at fjerne æggeblommesækken og amnionen, og løsn navlestrengen for korrekt observation af embryomorfologi. Sluk for gasreguleringsmodulet og præcisionsinkubatoren.
      BEMÆRK: Forudligning af kulturmediet i 1 time ved inkubation inde i en glasflaske i rullekulturen med en passende gasatmosfære i henhold til embryotrinnet. Rengør kulturflaskerne og alle inkubatorglas efter hver brug ved at udføre tre vaske med rindende destilleret vand efterfulgt af en vask natten over nedsænket i 70% ethanol. Rewash tre gange med rindende destilleret vand, lad flaskerne tørre natten over og steriliser med autoklave. Ligeledes autoklaver siliciumpropperne regelmæssigt. Rengør alle dissektionsværktøjer grundigt med 70% ethanol og tørsteriliser dem.

4. Udvidet embryokultur fra E5.5/E6.5 til E11

  1. Kulturprægastrulation (E5.5) og tidlig gastrulation (E6.5) embryoner indtil det tidlige somitstadium (E8.5) i statiske plader.
  2. Forequiliber dissektionsmediet i 1 time i en inkubator med 5% CO2 ved 37 °C.
    BEMÆRK: For at tillade gasudveksling må du ikke lukke låget på røret helt.
  3. Forbered kulturpladerne ved at tilsætte 250 μL frisklavet EUCM til hver brønd. Anbring pladerne i en CO2-inkubator ved 37 °C for at få udlignet.
    BEMÆRK: Selvom 8-brøndsplader er velegnede til embryovækst, kan kultur udføres i enhver anden plade ved at justere mediets volumen i henhold til pladens størrelse.
  4. Dissekere æggecylinderembryoner ud af livmoderen efter den teknik, der er beskrevet for E7.5. Fjern embryoets parietale æggeblommesæk og lad den intakte ektoplacentale kegle være fastgjort til ægcylinderen.
  5. Overfør individuelle embryoner til hver brønd på 8-brøndspladen ved hjælp af en mikropipette, og anbring pladen inde i inkubatoren med 5% CO2 ved 37 °C.
  6. Forestil dig embryonerne under et stereomikroskop, og vælg kun dem med et velformet fosterhulrum, uden tydelig skade og uden Reicherts membran.
    BEMÆRK: Brug 20 μL pipettespidser til at overføre E5,5 embryoner og 200 μL spidser til at overføre E6,5 embryoner. I tilfælde af kulturer, der starter ved E6.5, kan HCS erstattes af frisk indsamlet HBS.
  7. Halvdelen af mediet fjernes, og der tilsættes 250 μL frisklavet forvarmet EUCM efter 24 timers dyrkning, så det sikres, at embryonerne altid nedsænkes i kulturmediet. For kulturer, der starter ved E5.5, fjernes 200 μL efter to dages dyrkning (svarende til E7.5), og der tilsættes 250 μL ny EUCM.
    BEMÆRK: Under statisk dyrkning kan embryoner fastgøres til pladen (hovedsageligt ved brug af plastplader), hvilket i alvorlig grad vil kompromittere embryonudviklingen. Vedhæftning af embryoet til pladen er hyppigere på den første dag med dyrkning af E5.5 embryoner. For at forhindre fastgørelse skal du forsigtigt skubbe embryonerne væk fra pladeoverfladen ved hjælp af fine, sterile tang. Kontroller, at kun den ektoplacentale kegle forbliver fastgjort til pladens overflade.
  8. Overfør embryonerne til valsekulturen på det tidlige somitstadium (4-7 somitter; efter tre dages dyrkning for embryoner, der er udplantet ved E5,5, og to dage for kulturer påbegyndt ved E6,5) efter de samme indikationer, der tidligere er beskrevet for embryoner i E8,5-stadiet.
    BEMÆRK: Overførsel af embryoner til rullekulturen på somitstadier, der er forskellige fra angivet ovenfor, resulterer i manglende videre udvikling. I modsætning til E7.5 ex utero-kulturer er det muligt at opretholde embryonerne i en konstant atmosfære på 21% ilt og 5% CO2, hvilket giver en lidt højere effektivitet af embryoudvikling end atmosfærer med dynamisk iltkoncentration.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De rullekulturbetingelser, der er beskrevet for E7,5-embryoner (sen gastrulationsfase), understøtter konstant og normal embryovækst med en gennemsnitlig effektivitet tæt på 75 % efter 4 dyrkningsdage (figur 2 og tabel 1). Effektiviteten af embryonudvikling kan variere på tværs af forskellige musegenetiske baggrunde, men er konsekvent robust (figur 2C). Tilskud med HBS i stedet for HCS giver en effektivitet på ~68% efter 4 dages ex utero-dyrkning , afhængigt af musenes genetiske baggrund (figur 2D og tabel 2). De embryoner, der er udviklet ex utero , rekapitulerer korrekt udvikling indtil ca. 44-somit-stadiet. Derefter præsenterer embryonerne embryonale abnormiteter på grund af fraværet af den allantoiske placenta, hvilket resulterer i utilstrækkelig iltning og næringsstofforsyning i betragtning af den øgede kropsstørrelse på dette stadium.

Udviklingen af E6,5-embryoner (tidlig stribe) i statiske plader rekapituleres korrekt med en effektivitet på >90 % indtil det tidlige somitstadium E8.5 ved anvendelse af EUCM med både HCS og HBS (figur 3, tabel 3 og tabel 4) (se 8,13 for en detaljeret beskrivelse af embryoiscenesættelse mellem E5.5 og E8.5). Ex utero-kultur fra gastrulation til avanceret organogenese ved at kombinere kulturer på statiske plader efterfulgt af rullekulturen i en konstant 21% oxygenatmosfære giver en estimeret effektivitet af korrekt udvikling på 55% og 26% til 44-somit-stadiet ved anvendelse af henholdsvis HCS og HBS (figur 3A, tabel 3 og tabel 4). Der er en forsinkelse på 1-2 somitpar i disse embryoner sammenlignet med embryoner udviklet i livmoderen. Det største fald i effektiviteten sker ved overgangen fra E8.5 til E9.5 på grund af svigt i aksial drejning og lukning af neuralrøret.

Kulturer, der starter fra E5.5 prægaststyrende embryoner, viser effektivitet af korrekt udvikling til det tidlige somitstadium (E8.5) på ca. 46%, og næsten 17% af embryonerne vil fuldføre korrekt udvikling efter seks dages kultur efter at være blevet overført til rullekulturen (figur 4 og tabel 5). Udvidet ex utero-kultur forlænger udviklingsforsinkelsen i embryonerne, idet embryoner udplantet ved E5.5 viser en forsinkelse på 2-4 par somitter sammenlignet med in vivo-embryoner . Ikke desto mindre fortsætter morfogenese og vævsudvikling korrekt indtil ca. 42-somit-stadiet.

De mest almindelige defekter, der ses i embryoner for kulturer initieret fra E7.5, E6.5 og E5.5, er eksemplificeret i figur 5A-C. På dissektionstidspunktet bør embryoner med selv mindre skade på epiblasten eller den ekstraembryonale region samt embryoner, der bevarer Reicherts membran, kasseres. Ligeledes vil tidlige embryoner ikke vokse ordentligt (se figur 5B for døde embryoner) eller udvise alvorlige udviklingsforsinkelser (se figur 5B for et forsinket embryo). Fastgørelse af den embryonale epiblast til overfladen af pladen vil påvirke udviklingen afhængigt af fastgørelsens position og kvalitet. Vedhæftning af en del af epiblasten eller hele embryoet vil medføre svigt i den videre udvikling (se figur 5B for et vedhæftet embryo).

De vigtigste abnormiteter, der observeres i procentdelen af defekte embryoner ved E8.5 (tidligt somitstadium), er udviklingen af den bageste region uden for æggeblommesækken eller defekter i væksten af de neurale folder (figur 5A,B). I tilfælde af kulturer startet ved E5.5 er en hyppigt observeret udviklingsdefekt tilstedeværelsen af en lille, underudviklet epiblast (figur 5C). På det tidspunkt, der svarer til E9.5, repræsenterer defekter i lukningen af de neurale folder, svigt i aksial drejning eller en mangel på hjernevækst de mest almindeligt observerede abnormiteter (figur 5). De hyppigst observerede udviklingsdefekter ved E10.5 / E11 er anomalier i hovedområdet, forstyrrelse af normal blodcirkulation i æggeblommesækken og perikardial effusion (figur 5). Brud på et hovedblodkar og blodudstrømning kan forårsage efterfølgende død af embryoet. Navnlig kan en korrekt vækst af selve embryoet nås, selv i mangel af tydelig æggeblommesækcirkulation. Embryoner, der holdes i kultur ud over scenen svarende til E11, udviser kropskrympning og død efter få timer på grund af mangel på korrekt vævsiltning.

Figure 1
Figur 1: Gas- og trykreguleringssystem tilpasset en rullekulturinkubator. (A) Topbillede af gasreguleringsmodulet, der er forbundet med rullekulturinkubatoren. N2 og CO2 kommer ind i gasregulatoren for at muliggøre præcis kontrol af ilt/CO2-koncentrationerne og gastrykket. Gasserne ledes mod blandeboksen, hvor de blandes af en centrifugalblæser og injiceres i inkubatoren af en pumpe, der genererer positivt tryk. Gassen strømmer gennem indsejling til en vandflaske og senere til de forseglede flasker. (B) Intern konfiguration af det elektroniske modul til gas- og trykregulering. Spændingsværdien, der er indstillet på tryktransmitteren, regulerer det tryk, der genereres af pumpen inde i gasblandeboksen (5-6 V for at opnå et tryk på 6-7 psi i denne specifikke model). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Ex utero kulturplatform understøtter vækst af E7,5 embryoner indtil avanceret organogenese. A) Diagram, der viser E7.5 ex utero-protokollen for embryokultur. (B) Repræsentative lysfeltbilleder af grupper af dyrkede embryoner, der udvikler sig ex utero over 4 dage, fra sen gastrulation (E7.5) til 44-somit-stadiet (E11). Den typiske variation i somittal vurderet hver 24. time er angivet. Skalastænger = 500 μm. (C, D) Procentdel af normalt udviklede embryoner ved 1-4 dages dyrkning startende fra E7,5 divideret med museforædlelsesstammer og serumtilskud (C, humant navlesnorsblodserum; D, humant voksent blodserum). Panel A er blevet ændret fra 13. Forkortelser: EUCM = ex utero embryokulturmedium; HCS = humant navlestrengsblodserum; HBS = humant voksent blodserum. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3. Udvidet ex utero-dyrkningsprotokol til dyrkning af E6.5 tidligt gastrulerende museembryoner indtil sen organogenese. A) Skematisk illustration af den udvidede ex utero-kulturprotokol, der kombinerer statiske plader og roterende flaskesystemer. B) Lysfeltbilleder af embryoner dyrket ex utero i fem dage fra E6.5 til 44-somitstadiet. Den typiske variation i somittal vurderet hver 24. time er angivet. Skalabjælker = 500 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Kontinuerlig ex utero-kultur af prægastrulationsmusembryoner fra E5.5 til sene organogenesestadier. A) Skematisk afbildning af ex utero-kulturen protokollen for E5.5-embryoner. B) Repræsentative lysfeltbilleder af embryoner dyrket ex utero i seks dage fra E5.5 til 42-somitstadiet. Den typiske variation i somittal vurderet hver 24. time er angivet. Skalabjælker = 500 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Repræsentative udviklingsfejl observeret i embryoner dyrket ex utero. (A-C) Lysfeltmikroskopibilleder af unormale museembryoner dyrket ex utero startende fra E7.5 (A), E6.5 (B) eller E5.5 (C). En generel beskrivelse af fejlen findes på hvert billede. Skalabjælker = 500 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Tabel 1: Effektiviteten af korrekt udvikling af embryoner isoleret ved E7,5 dage efter coitum. Embryonerne blev dyrket ex utero i 4 dage i EUCM (25% Human Umbilical Cord Blood Serum). [-] angiver kulturer, der ikke fortsættes på grund af eksperimentelle krav. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 2: Effektiviteten af korrekt udvikling af embryoner isoleret ved E7.5, dyrket ex utero i 4 dage, der erstatter humant navlestrengsblodserum med nyligt isoleret humant voksenblodserum. [-] angiver kulturer, der ikke fortsættes på grund af eksperimentelle krav. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 3: Effektiviteten af korrekt udvikling af embryoner (B6D2F1/ICR) isoleret ved E6,5 og dyrket ex utero i 5 dage ved anvendelse af EUCM (25 % humant navlesnorsblodserum). Ex utero-kulturen blev udført i statisk kultur i to dage (21% O2) efterfulgt af tre dage i roterende flasker ved 21% O2. [-] angiver kulturer, der ikke fortsættes på grund af eksperimentelle krav. Forkortelse: NA = ikke erhvervet. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 4: Effektiviteten af korrekt udvikling af embryoner (B6D2F1/ICR) isoleret ved E6.5 og dyrket ex utero i 5 dage ved anvendelse af EUCM (erstatter humant navlesnorsblodserum med nyligt isoleret humant voksenblodserum). Embryonerne blev udviklet i statisk kultur i to dage (21% O2) efterfulgt af tre dage i roterende flasker ved 21% O2. [-] angiver kulturer, der ikke fortsættes på grund af eksperimentelle krav. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 5: Effektiviteten af korrekt udvikling af embryoner (B6D2F1/ICR) isoleret ved E5.5 og dyrket ex utero i 6 dage ved anvendelse af EUCM (25 % humant navlesnorsblodserum). Embryonerne blev udviklet i statisk kultur i tre dage (21% O2) efterfulgt af tre dage i roterende flasker ved 21% O2. [-] angiver kulturer, der ikke fortsættes på grund af eksperimentelle krav. Klik her for at downloade denne tabel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den kulturprotokol, der præsenteres heri, kan opretholde korrekt og kontinuerlig udvikling af museembryoer ex utero i op til seks dage, fra E5.5 til E11. Tidligere kunne embryoner på disse udviklingsstadier kun udvikle sig normalt i kultur i korte perioder (op til 48 timer)15. Koblingen af gasreguleringsmodulet til rullekulturinkubatoren for præcis kontrol af iltkoncentration og hyperbart gastryk er afgørende for den korrekte museembryokultur, der er beskrevet heri. Forøgelse af gastrykket til 7 psi forbedrer iltdiffusionen, hvilket muliggør embryonudvikling op til E11 i en atmosfære på op til 21% O2/5% CO2 i modsætning til de tidligere anvendte betingelser på 95% O216, som kan være skadelige for embryoet på lang sigt. Endvidere vides iltkoncentrationen at spille en kritisk rolle i embryonal udvikling, da tidlig embryogenese efterimplantation finder sted under hypoxiske forhold17. Følgelig kræver den vellykkede kultur af sen-gastrulerende embryoner en indledende 5% O2-atmosfære med en dynamisk stigning i iltkoncentrationen, når embryoet vokser. Det er bemærkelsesværdigt, at dyrkning af præ-/tidligt gastrulerende embryoner i statisk kultur ved 5% O2 drastisk reducerede effektiviteten af korrekt embryonudvikling sammenlignet med 21% O2, og de kunne ikke udvikle sig yderligere til E9.5. Sidstnævnte kan forklares med den langsommere hastighed af næringsstof- og iltdiffusion gennem det embryonale væv i den statiske kultur sammenlignet med kulturen i roterende flasker1,10.

Desuden giver det høje indhold af serum fra rotter og mennesker i navlesnorsblod mere konsistente resultater for dyrkning af tidlige postimplanterede embryoner end medier suppleret med kun rotteserum13,18. Det er vigtigt, at serumet, der anvendes til embryokultur, fremstilles af frisk ekstraheret blod. Selv om rotteserum af høj kvalitet til helembryokultur er kommercielt tilgængeligt, bør humant serum isoleres internt. Tilskud med humant navlesnorsblodserum kan erstattes af serum isoleret fra humant voksenblod, som er bredt tilgængeligt og stadig giver konsekvent og effektiv embryovækst.

Vellykket og effektiv embryoudvikling ex utero er også meget afhængig af nøjagtig embryoisolering. For det første skal dissektionsproceduren udføres i dissektionsmedium opvarmet ved 37 °C, og de dissekerede embryoner skal overføres til kulturflaskerne/-pladerne inden for 30 minutter. For det andet er præcis embryoisolering fra decidua og fjernelse af Reicherts membran uden at beskadige epiblasten nøglen til at opnå høj effektivitet i embryonudviklingen. For det tredje bør kun embryoner på det rette stadium udvælges til dyrkning, da tidlige/forsinkede embryoner ikke vil vokse ordentligt.

Håndtering af embryoner under overførsel er et andet vigtigt punkt under ex utero-kulturen , hovedsageligt efter udviklingen af den embryonale æggeblommesæk. Embryoner bør overføres omhyggeligt, fordi skader på større æggeblomme sac blodkar kan påvirke korrekt udvikling. Generelt, jo længere embryokulturperioden er, desto lavere er effektiviteten af normal embryonudvikling, dvs. embryoner, der er udplantet ved E7.5, vil udvikle sig med højere effektivitet end dem, der er udplantet ved E6.5 eller E5.5. Desuden er tilstedeværelsen af antibiotika i mediet grundlæggende for at forhindre forurening, hvis et dissektionsmikroskop tildelt inde i en biologisk hætte ikke er tilgængelig.

Det kan ikke udelukkes, at andre platforme, trykniveauer eller forhold kan muliggøre lignende eller forbedrede resultater som de resultater, der opnås med denne protokol. Yderligere optimering af de betingelser, der er beskrevet i denne undersøgelse, er nødvendig for at nå en effektivitet af embryonudvikling svarende til den, der observeres ved intrauterin udvikling. Desuden kan fremtidig udvikling af et defineret serumfrit medium bidrage til at definere de specifikke metaboliske og kemiske krav under udviklingen af pattedyrsembryoner og reducere serumvariabiliteten fra batch til batch. Behovet for konstant blanding af næringsstoffer og gas efter E8.5 ved hjælp af den roterende flaskekultur i de nuværende indstillinger begrænser de langsigtede billeddannelsesmuligheder under organogenesefaser. Fremtidig udvikling af mikrofluidikudstyr, der muliggør gas- og næringsstofblanding i statisk kultur koblet til mikroskopiopsætninger, kan bidrage til at overvinde denne udfordring.

Embryoner dyrket ex utero kan eksperimentelt manipuleres og holdes i kultur op til avancerede organogenesestadier uden for livmoderen. Vi har tidligere demonstreret evnen til at introducere forskellige forstyrrelser i udviklingen af embryoner, såsom genetisk manipulation ved elektroporation eller lentiviral infektion, levende billeddannelse, celletransplantation og teratogene undersøgelser13. I sidste ende kan denne platform hjælpe med at afdække celleskæbnespecifikation og organdannelsesmekanismer hos pattedyr ved at tillade eksperimenter i realtid med levende museembryoner i op til seks dage med tidlig udvikling efterimplantation.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

J.H.H er rådgiver for Biological Industries Ltd og har indsendt en patentansøgning, der dækker de rulle- og statiske dyrkningsbetingelser, der er beskrevet heri (indgivet af J.H.H. og Weizmann Institute of Science). Andre forfattere erklærer ingen konkurrerende interesser.

Acknowledgments

Dette arbejde blev finansieret af Pascal og Ilana Mantoux; Det Europæiske Forskningsråd (EFR-CoG-2016 726497-Cellnaivety); Flight Attendant Medical Research Council (FAMRI); Israel Cancer Research Fund (ICRF) professorat, BSF, Helen og Martin Kimmel Institute for Stem Cell Research, Helen og Martin Kimmel Award for Innovative Investigation; Israel Science Foundation (ISF), Minerva, Sherman Institute for Medicinal Chemistry, Nella og Leon Benoziyo Center for Neurologiske Sygdomme, David og Fela Shapell Family Center for Genetic Disorders Research, Kekst Family Institute for Medical Genetics, Dr. Beth Rom-Rymer Stem Cell Research Fund, Edmond de Rothschild Foundations, Zantker Charitable Foundation, Estate of Zvia Zeroni.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 µm pore size filter (250 mL) JetBiofil FCA-206-250
0.22 µm pore size syringe PVDF filter Millipore SLGV033RS
8-well µ-plates glass bottom/ibiTreat iBidi 80827/80826
Bottle with adaptor cap for gas inlet Arad Technologies
Bungs (Hole) B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering BTC 06 Used to seal the bottles to the drum
Bungs (Solid) B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering BTC 07 Used to seal the rotating drum
Culture bottles B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering BTC 03/BTC 04 Either Glass Bottles (Small) BTC 03 or Glass Bottles (Large) BTC 04
D(+)-glucose Monohydrate J.T. Baker
Diamond knife Fine Science Tools 10100-30/45
Digital Pressure Gauge Shanghai Benxu Electronics Technology co. Ltd BX-DPG80
DMEM GIBCO 11880
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Biological industries 02-020-1A
Fetal Bovine Serum Biological industries 04-013-1A
Gas regulation module Arad Technologies HannaLab1
Glutamax GIBCO 35050061 glutamine
Graefe forceps Fine Science Tools 11052-10
HEPES GIBCO 15630056
Microsurgical forceps (Dumont #5, #55) Fine Science Tools 11255-20
Pasteur pipettes (glass) Hilgenberg 3150102
Pasteur pipettes (plastic) Alexred SO P12201
Penicillin/Streptomycin Biological industries 03-031-1B
Petri Dishes (60 mm and 100 mm) Falcon 351007/351029
Precision incubator system B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering BTC01 BTC01 model with gas bubbler kit
Pro-coagulant sterile test tubes (5 mL) Greiner Bio-One #456005
Rat whole embryo culture serum ENVIGO Bioproducts B-4520
Stereoscopic microscope equipped with heating plate Nikon SMZ18
Sterile syringes (5, 10 ml) for sera filtration Pic Solution
Surgical scissors Fine Science Tools 14094-11

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. New, D. A. Whole-embryo culture and the study of mammalian embryos during organogenesis. Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society. 53 (1), 81-122 (1978).
  2. Tam, P. P., Behringer, R. R. Mouse gastrulation: the formation of a mammalian body plan. Mechanisms of Development. 68 (1-2), 3-25 (1997).
  3. Huang, Q., et al. Intravital imaging of mouse embryos. Science. 368 (6487), 181-186 (2020).
  4. White, M. D., et al. Long-lived binding of Sox2 to DNA predicts cell fate in the four-cell mouse embryo. Cell. 165 (1), 75-87 (2016).
  5. Tam, P. P. Postimplantation mouse development: whole embryo culture and micro-manipulation. International Journal of Developmental Biology. 42 (7), 895-902 (1998).
  6. Nicholas, J. S., Rudnick, D. The development of rat embryos in tissue culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 20 (12), 656-658 (1934).
  7. New, D. A., Stein, K. F. Cultivation of mouse embryos in vitro. Nature. 199, 297-299 (1963).
  8. Rivera-Pérez, J. A., Jones, V., Tam, P. P. L. Culture of whole mouse embryos at early postimplantation to organogenesis stages: developmental staging and methods. Methods in Enzymology. 476, 185-203 (2010).
  9. New, D. A. T., Coppola, P. T., Terry, S. Culture of explanted rat embryos in rotating tubes. Journal of Reproduction and Fertility. 35 (1), 135-138 (1973).
  10. Cockroft, D. L. A comparative and historical review of culture methods for vertebrates. International Journal of Developmental Biology. 41 (12), 127-137 (1997).
  11. Parameswaran, M., Tam, P. P. L. Regionalisation of cell fate and morphogenetic movement of the mesoderm during mouse gastrulation. Developmental Genetics. 17 (1), 16-28 (1995).
  12. Beddington, R. S. Induction of a second neural axis by the mouse node. Development. 120 (3), 613-620 (1994).
  13. Aguilera-Castrejon, A., et al. Ex utero mouse embryogenesis from pre-gastrulation to late organogenesis. Nature. 593 (7857), 119-124 (2021).
  14. Takahashi, M., Makino, S., Kikkawa, T., Osumi, N. Preparation of rat serum suitable for mammalian whole embryo culture. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (90), e51969 (2014).
  15. Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K. V., Nagy, A. Isolation, culture and manipulation of postimplantation embryos. Manipulating the Mouse Embryo: a Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. 149-193 (2014).
  16. Takahashi, M., Nomura, T., Osumi, N. Transferring genes into cultured mammalian embryos by electroporation. Development, Growth and Differentiation. 50 (6), 485-497 (2008).
  17. Mathieu, J., Ruohola-Baker, H. Metabolic remodeling during the loss and acquisition of pluripotency. Development. 144 (4), 541-551 (2017).
  18. Sturm, K., Tam, P. P. L. Isolation and culture of whole postimplantation embryos and germ layer derivatives. Methods in Enzymology. 225, 164-190 (1993).

Tags

Udviklingsbiologi udgave 176 Musee Embryo Ex Utero Culture Gastrulation Organogenese Embryogenese Mammalian Development
<em>Ex Utero</em> Kultur af museembryoner fra prægastrulation til avanceret organogenese
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Aguilera-Castrejon, A., Hanna, J. H. … More

Aguilera-Castrejon, A., Hanna, J. H. Ex Utero Culture of Mouse Embryos from Pregastrulation to Advanced Organogenesis. J. Vis. Exp. (176), e63160, doi:10.3791/63160 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter