Summary
تسمح المنصة المحسنة لزراعة الأجنة بأكملها بالتطور المستمر والقوي خارج الرحم لأجنة الفئران بعد الزرع لمدة تصل إلى ستة أيام ، من مراحل ما قبل المعدة حتى التكوين العضوي المتقدم. في هذا البروتوكول ، نقوم بتفصيل الإجراء القياسي لزراعة الأجنة الناجحة باستخدام لوحات ثابتة وأنظمة زجاجات دوارة.
Abstract
كانت طرق زراعة أجنة الثدييات بعد الزرع غير فعالة بشكل عام وتقتصر على فترات قصيرة بعد تشريح الرحم. تم تطوير منصات مؤخرا لزراعة أجنة الفئران خارج الرحم القوية والمطولة للغاية من مراحل أسطوانة البيض حتى التكوين العضوي المتقدم. تتيح هذه المنصات التطور المناسب والأمين للأجنة قبل المعدة (E5.5) حتى مرحلة تكوين الأطراف الخلفية (E11). تزرع الأجنة المتأخرة في المعدة (E7.5) في زجاجات دوارة في هذه الإعدادات ، في حين أن الثقافة الموسعة من مراحل ما قبل المعدة (E5.5 أو E6.5) تتطلب مزيجا من مزارع الزجاجات الثابتة والدوارة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن التنظيم الحساس لتركيز O2 و CO2 ، وضغط الغاز ، ومستويات الجلوكوز ، واستخدام وسط معين خارج الرحم أمر بالغ الأهمية لنمو الجنين السليم. هنا ، يتم توفير بروتوكول مفصل خطوة بخطوة لزراعة أجنة الفئران خارج الرحم الموسعة. تمثل القدرة على نمو أجنة الفئران الطبيعية خارج الرحم من المعدة إلى التكوين العضوي أداة قيمة لتوصيف تأثير الاضطرابات التجريبية المختلفة أثناء التطور الجنيني.
Introduction
وقد حد التطور داخل الرحم لجنين الثدييات من دراسة المراحل المبكرة من تطور ما بعد الزرع1,2. إن عدم إمكانية الوصول إلى الجنين النامي يعيق فهم العمليات التنموية الرئيسية التي تحدث بعد زرع الجنين في الرحم ، مثل إنشاء خطة جسم الحيوان ، أو مواصفات الطبقات الجرثومية ، أو تكوين الأنسجة والأعضاء. علاوة على ذلك ، فإن الحجم الصغير جدا للجنين المبكر بعد الزرع يجعل من الصعب ملاحظته عن طريق التصوير داخل الجسم في الرحم قبل E103. إن عدم القدرة على مراقبة الأجنة الحية ومعالجتها في هذه المراحل قد حد من دراسة التكوين المبكر للأجنة بعد الزرع إلى لقطات أثناء النمو.
بروتوكولات الاستزراع المختبري لأجنة الثدييات قبل الزرع راسخة وموثوقة وتستخدم بانتظام4. ومع ذلك، فإن محاولات إنشاء أنظمة استزراع خارج الرحم قادرة على دعم نمو جنين الثدييات السليم بعد الزرع حققت نجاحا محدودا5. تم اقتراح مجموعة متنوعة من تقنيات الاستزراع لأكثر من قرن من الزمان ، وذلك أساسا عن طريق زراعة الأجنة في لوحات ثابتة تقليدية 6،7،8 أو زجاجات دوارة (مزارع الأسطوانة) 5،9،10. أثبتت هذه المنصات فائدتها في توسيع المعرفة حول تطور الثدييات بعد الزرع11،12 ، على الرغم من كونها غير فعالة للغاية لبقاء الجنين الطبيعي وتقتصر على فترات قصيرة. بدأت الأجنة في إظهار التخلف التنموي والشذوذ المورفولوجي في وقت مبكر من 24-48 ساعة بعد بدء الثقافة.
تقدم هذه الدراسة وصفا مفصلا لإعداد نظام زراعة الأجنة خارج الرحم الذي يسمح بالتطور المستمر من مرحلة ما قبل المعدة إلى مراحل التكوين العضوي المتقدمة على مدى ما يصل إلى ستة أيام من تطور ما بعد الزرع13. تصف هذه الورقة بروتوكول زراعة الأسطوانة المحسن الذي يدعم نمو أجنة E7.5 (الصفيحة العصبية ومرحلة طي الرأس) حتى مرحلة تكوين الأطراف الخلفية (~ E11) والثقافة الموسعة من E5.5 / E6.5 من خلال الجمع بين الثقافة على لوحات ثابتة ومنصات زراعة الأسطوانة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم إجراء جميع التجارب على الحيوانات وفقا لإرشادات حماية الحيوان الصادرة عن معهد وايزمان للعلوم والمعتمدة من قبل معهد وايزمان ذي الصلة IACUC (# 01390120-1 ، 01330120-2 ، 33520117-2). طلب من النساء الحوامل الأصحاء إعطاء موافقتهن المستنيرة على جمع الدم من الحبل السري، على النحو الذي وافقت عليه لجنة هلسنكي في مركز رامبام الطبي (#RMB-0452-15). طلب من البالغين الأصحاء موافقتهم المستنيرة على جمع الدم وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة هلسنكي التابعة لمعهد وايزمان للعلوم (#1566-3).
1. الإعداد الإعلامي
- تحضير وسط التشريح باستخدام 500 مل من وسط النسر المعدل من دولبيكو (DMEM) بدون الفينول الأحمر والجلوتامين L ، مع استكمال 10٪ مصل البقر الجنيني ، 5 مل من البنسلين / الستربتومايسين ، وتصفية التعقيم باستخدام مرشح 0.22 ميكرومتر.
ملاحظة: حافظ على وسط التشريح عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 1 شهر. - تحضير وسط زراعة الأجنة خارج الرحم (EUCM) طازجا كل يوم زراعة داخل غطاء بيولوجي باستخدام 25٪ من الوسط الجنيني بالإضافة إلى 50٪ من مصل الفئران و 25٪ من مصل دم الحبل السري البشري (HCS) أو مصل دم البالغين البشري (HBS).
- لتحضير الوسط الجنيني ، أضف 5 مل من الجلوتامين ، و 5 مل من HEPES ، و 5 مل من البنسلين / الستربتومايسين في 500 مل من DMEM بدون الفينول الأحمر و L-glutamine. تحضير 10-15 مل aliquots وتخزينها في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهرين.
ملاحظة: ضاعف تركيز المضادات الحيوية إذا تعرضت لأي تلوث. - قم بتعطيل مصل الفئران بالحرارة عند 56 درجة مئوية لمدة 30-45 دقيقة وقم بالتصفية من خلال مرشح ثنائي فلوريد البولي فينيليدين 0.22 ميكرومتر. استخدم المصل للثقافة في نفس يوم التعطيل. قم بإذابة HCS أو HBS واستخدمه على الفور للتجارب.
ملاحظة: يوفر مصل الفئران التجاري نتائج متسقة (تم اختبار ما لا يقل عن 4 لوت دون اختلاف واضح). بدلا من ذلك ، يمكن الحصول على مصل الفئران عالي الجودة في المنزل كما هو موضح سابقا8,14. إذا لم يكن HCS متوفرا ، فاستبدله ب HBS الذي تم جمعه داخليا. يمكن إعادة تجميد مصل الفئران و HCS و HBS مرة واحدة والاحتفاظ بها عند -20 درجة مئوية لاستخدامها في يوم مختلف. قم بإذابة المصل المعاد تجميده ودمجه مع كمية أكبر من المصل المذاب حديثا ولا تقم بإعادة تجميده.
2. جمع مصل دم الحبل السري البشري ومصل دم البالغين البشري
- لعزل HCS ، قم بجمع دم الحبل السري من النساء الحوامل الأصحاء في يوم الولادة القيصرية المقررة.
- قم بتثبيت الحبل السري مرتين على بعد 5-7 سم من السرة وانقلها بين المشابك مباشرة بعد ولادة الرضيع.
- اسحب الدم يدويا باستخدام إبرة كبيرة التجويف 14 جم ومحقنة سعة 50 مل مباشرة من الوريد السري بينما تبقى المشيمة في الموقع لتجنب أي آثار لانحلال الدم.
ملاحظة: جمع الدم بعد إزالة الرضيع من مجال الجراحة، وتم سحب الدم السري للاختبارات السريرية.
- قم بتوزيع الدم الذي تم جمعه على أنابيب اختبار معقمة متخثر سعة 5 مل ونقلها على الفور إلى 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة للسماح بالتخثر الكامل. قم بالطرد المركزي لأنابيب الاختبار المتخثرة عند 2500 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
- تخلص من الأنابيب التي تظهر عليها علامات انحلال الدم (المصل الوردي-الأحمر). جمع المصل (اللون الأصفر) باستخدام ماصة 5 مل وتصفيتها من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر. قم بتسخين المصل على الفور في حمام مائي 56 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة.
- تحضير 1-1.5 مل من الأليكوتات من المصل المعطل وتخزينها في -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى ستة أشهر. إذا لزم الأمر، اشحن على حرارة -70 درجة مئوية باستخدام الثلج الجاف.
- لجمع مصل الدم البشري للبالغين، اسحب الدم من البالغين الأصحاء واعزل المصل على الفور باتباع نفس البروتوكول الموصوف لمصل دم الحبل السري. قم بتخزين HBS كأليكوتات معطلة بالحرارة ومصفاة عند -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى ستة أشهر.
ملاحظة: أعطى مصل الحبل السري البشري والمصل البشري البالغ الذي تم إعداده طازجا في المنزل نتائج متفوقة على المصل المتاح تجاريا. جمع HCS من النساء الأصحاء ، فوق سن 18 وأقل من 40 عاما المقرر للولادة القيصرية. استبعاد النساء اللواتي ولدن مهبليا والنساء المصابات بأي مرض مزمن أو حالات طبية نشطة، بما في ذلك سكري الحمل أو ارتفاع ضغط الدم.
3. زراعة الأسطوانة خارج الرحم للأجنة من E7.5 إلى E11
- إعداد حاضنة زراعة الأسطوانة ومنظم الغاز
- زراعة E7.5 أو أجنة أكثر تقدما باستخدام نظام حاضنة زراعة الأسطوانة. قم بتشغيل الدوار ووحدة التسخين عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة على الأقل قبل تشريح الجنين. أضف الماء المعقم إلى زجاجة مدخل الغاز وأنبوب اختبار المخرج.
ملاحظة: ضع ميزان حرارة بجوار الأسطوانة الدوارة وتحقق بشكل متكرر من استقرار درجة الحرارة داخل الحاضنة. افتح الحاضنة في أسرع وقت ممكن لأن وقت الفتح المطول سيزيد من درجة الحرارة ويؤثر على نمو الجنين. عند الضرورة ، أضف المزيد من المياه المعقمة إلى زجاجة مدخل الغاز وأنبوب اختبار المخرج للحفاظ عليها إلى الحد الأدنى من نصف السعة أثناء الزرع. حماية الأجنة داخل الحاضنة من الضوء عن طريق تغطية الحاضنة بقطعة قماش. - قم بتشغيل وحدة منظم الغاز عن طريق الضغط على المفتاح الرئيسي ثم تشغيل وحدات التحكم في الأكسجين / النيتروجين و CO2 (الشكل 1A). اضبط قيم الأكسجين و CO2 على 5٪ باستخدام وحدات التحكم المعنية. افتح منظم الغاز واضبط ضغط الغاز على ~ 6.5-7 رطل لكل بوصة مربعة (رطل لكل بوصة مربعة) عن طريق تحريك مفتاح الجهد في جهاز إرسال الضغط (الشكل 1B). تأكد من قيمة ضغط الغاز باستخدام مقياس ضغط رقمي.
- راقب تدفق الغاز عن طريق التحقق من معدل الفقاعات التي تم إنشاؤها داخل أنبوب الاختبار المملوء بالماء المخصص داخل الحاضنة الدقيقة. اضبط معدل الفقاعة المناسب عن طريق إغلاق / فتح صمام تدفق الغاز على غطاء زجاجة المياه. تأكد من أن تدفق الغاز يسمح بتكوين فقاعات بمعدل 2-4 فقاعات في الثانية أو اضبط تدفق الفقاعة عند النقطة الأولى حيث تخرج الفقاعات إلى أنبوب المخرج المملوء بالماء.
- املأ زجاجات الاستزراع ب 2 مل من وسط الاستزراع وقم بتوصيلها بالأسطوانة الدوارة المجوفة للتوازن المسبق لمدة 1 ساعة. استخدم بنج السيليكون المجوف لإغلاق الزجاجات على الأسطوانة. حافظ على إغلاق المساحات الفارغة في الأسطوانة الدوارة باستخدام الكتل الصلبة.
ملاحظة: قد يؤثر عدم وجود فقاعات في أنبوب المخرج (لا يوجد غاز قادم عبر النظام) أو تدفق غاز مرتفع بشكل استثنائي على نمو الجنين. في حالة عدم وجود تدفق فقاعة إلى أنبوب اختبار المخرج ، تحقق من وضع جميع بنجات السيليكون بشكل صحيح في الأسطوانة الدوارة وختم النظام ، وتحقق من إغلاق زجاجة المياه بشكل صحيح وتوصيل جميع الأنابيب بشكل صحيح. قد يشير عدم وجود فقاعات قادمة إلى زجاجة المياه إلى وجود خلل في منظم الغاز.
- زراعة E7.5 أو أجنة أكثر تقدما باستخدام نظام حاضنة زراعة الأسطوانة. قم بتشغيل الدوار ووحدة التسخين عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة على الأقل قبل تشريح الجنين. أضف الماء المعقم إلى زجاجة مدخل الغاز وأنبوب اختبار المخرج.
- تشريح أجنة الفئران من الفئران الحامل
- قم بموازنة وسط التشريح داخل الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة لا تقل عن 1 ساعة. اترك الغطاء مفتوحا قليلا للسماح بتبادل الغازات.
- التضحية بالأنثى الحامل عن طريق خلع عنق الرحم ، وتنظيف بطن الأنثى بنسبة 70 ٪ من الإيثانول ، وقطع الجلد وجدار البطن بالمقص. حدد أحد طرفي الرحم وقطعه عند التقاطع بين المبيض والرحم. بعد ذلك ، قم بقطع الرحم حتى الطرف الآخر وانقله إلى طبق بتري 100 مم مملوء بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (DPBS) في درجة حرارة الغرفة من Dulbecco.
ملاحظة: يوصى باستخدام الإناث غير المحضرة للهرمونات والمتزوجة بشكل طبيعي. - اغسل المفاهيم بسرعة في DPBS وقطعها إلى أزواج لتسهيل التعامل مع الأجنة. انقل جميع أزواج المفاهيم إلى وسط تشريح متوازن مسبقا في طبق بتري 60 مم وقطعه إلى مفاهيم فرديةالاستخدامات.
- إزالة جدار الرحم من المفهوميستخدم عن طريق تمزيق أنسجة الرحم باستخدام زوج من الملقط الإجمالي. استخدم ملقط الجراحة المجهرية الدقيقة لقطع طرف الديسيدوا على شكل كمثرى. أدخل الملقط بجوار الجنين الموازي لمحوره الطويل ، وافتح الملقط لتقسيم الديسيدوا إلى نصفين.
- وأخيرا، اترك المخروط المشيمي الخارجي السليم متصلا بأسطوانة البيض عن طريق الإمساك بالجنين من الديسيدوا وتقشير كيس الصفار الجداري من الجنين باستخدام ملقط ناعم.
ملاحظة: لتجنب التأثير على الجنين ، قم بإجراء تشريح على مجهر مجهز بلوحة تسخين عند 37 درجة مئوية في غضون 30-40 دقيقة كحد أقصى. تشريح فضلات واحدة من الأجنة في وقت واحد. - مباشرة بعد التشريح ، انقل الأجنة إلى صفيحة جديدة مليئة بوسط تشريح متوازن باستخدام ماصة باستور الزجاجية لمنع الأجنة من الالتصاق بحطام الأنسجة.
- حدد تلك الأجنة في الصفيحة العصبية / مرحلة طي الرأس المبكرة التي لا تظهر أي ضرر في الأرومة ونقل 5-6 أجنة لكل زجاجة إلى زجاجات الثقافة الزجاجية المتوازنة مسبقا.
ملاحظة: لإعداد ماصة باستور الزجاجية ، قم بقطع فتحة الماصة إلى حجم مناسب لتناسب الأجنة باستخدام قاطع زجاجي ، واحتفظ بها في الإيثانول لتجنب التلوث. اغسل الماصة الزجاجية باستخدام PBS قبل نقل الأجنة. عند نقل الأجنة إلى زجاجة الزرع، تأكد من نقل أقل حجم ممكن من وسط التشريح لتجنب تخفيف EUCM. - ضع الزجاجات في نظام الاستزراع الدوار عند 37 درجة مئوية ، في جو من 5٪ O2 و 5٪ CO2.
- كل يوم من الثقافة، قم بإزالة الزجاجات واحدة تلو الأخرى من الحاضنة لتقييم تطور الجنين تحت المجهر المجسم. تأكد من إغلاق الفتحة الفارغة في الأسطوانة بضربة صلبة عند إزالة زجاجة. قطع طرف ماصة باستور البلاستيكية المعقمة لتناسب حجم الجنين ونقل الأجنة إلى طبق بتري لتسهيل الملاحظة. تأكد من أن الأجنة مغطاة دائما بمتوسط.
ملاحظة: قلل من الوقت الذي تكون فيه الأجنة خارج الحاضنة لتجنب الآثار الضارة في الأجنة بسبب انخفاض درجة حرارة الجسم. تعامل مع الأجنة بعناية لتجنب تمزق الأوعية الدموية في كيس الصفار ، مما يؤثر على بقاء الجنين. - في يوم الاستزراع الأول (أي ما يعادل E8.5) ، قم بنقل مجموعات من 3 أجنة إلى زجاجة جديدة تحتوي على 2 مل من EUCM الطازج والمتوازن مسبقا والذي يحتوي على 3 ملغ / مل إضافية من الجلوكوز D وخليط غاز من 13٪ O2 ، 5٪ CO2.
- بعد 48 ساعة (أي ما يعادل E9.5) ، قم بنقل مجموعات من جنينين إلى زجاجة جديدة مع EUCM طازج مسخن مسبقا بالإضافة إلى 3.5 ملغ / مل من الجلوكوز في جو غازي من 18٪ O2 و 5٪ CO2.
- في 72 ساعة من الزرع (أي ما يعادل E10.5) ، انقل كل جنين إلى زجاجة فردية تحتوي على 1.5-2 مل من الوسط الطازج المكمل ب 4 ملغ / مل من الجلوكوز وإمدادات غاز بنسبة 21٪ O2 و 5٪ CO2.
ملاحظة: تصل الأجنة إلى أقصى نمو لها حوالي منتصف ليل يوم الثقافة 4. - استخدم ملقط ناعم لإزالة كيس الصفار والسلى، وافصل الحبل السري للمراقبة الصحيحة لمورفولوجيا الجنين. قم بإيقاف تشغيل وحدة تنظيم الغاز والحاضنة الدقيقة.
ملاحظة: قم بموازنة وسط المزرعة مسبقا لمدة 1 ساعة عن طريق الحضانة داخل زجاجة زجاجية في مزرعة الأسطوانة مع جو غاز مناسب وفقا لمرحلة الجنين. نظف زجاجات الاستزراع وجميع الأواني الزجاجية الحاضنة بعد كل استخدام عن طريق إجراء ثلاث غسلات بالماء المقطر الجاري يليها غسل ليلي مغمور بالإيثانول بنسبة 70٪. أعد الغسيل ثلاث مرات بالماء المقطر الجاري ، واترك الزجاجات تجف بين عشية وضحاها ، وقم بالتعقيم بواسطة الأوتوكلاف. وبالمثل ، قم بتعقيم مقابس السيليكون بانتظام. نظف جميع أدوات التشريح جيدا باستخدام 70٪ من الإيثانول وقم بتعقيمها جافا.
4. زراعة الأجنة الموسعة من E5.5 / E6.5 إلى E11
- زراعة الأجنة قبل المعدة (E5.5) والمعدة المبكرة (E6.5) حتى مرحلة السوميت المبكرة (E8.5) في لوحات ثابتة.
- قم بالتوازن المسبق لوسط التشريح لمدة 1 ساعة في حاضنة مع 5٪ CO2 عند 37 درجة مئوية.
ملاحظة: للسماح بتبادل الغازات، لا تغلق غطاء الأنبوب تماما. - قم بإعداد أطباق الثقافة عن طريق إضافة 250 ميكرولتر من EUCM الطازج إلى كل بئر. ضع الألواح داخل حاضنة CO2 عند 37 درجة مئوية للتوازن المسبق.
ملاحظة: على الرغم من أن لوحات 8 آبار مناسبة تماما لنمو الجنين ، إلا أنه يمكن إجراء الزراعة في أي صفيحة أخرى عن طريق ضبط حجم الوسط وفقا لحجم اللوحة. - تشريح أجنة أسطوانة البيض خارج الرحم باتباع التقنية الموصوفة ل E7.5. قم بإزالة كيس الصفار الجداري للجنين واترك المخروط المشيمي الخارجي السليم المتصل بأسطوانة البيض.
- انقل الأجنة الفردية إلى كل بئر من الصفيحة المكونة من 8 آبار باستخدام ماصة دقيقة وضع اللوحة داخل الحاضنة مع 5٪ CO2 عند 37 درجة مئوية.
- صور الأجنة تحت المجهر المجسم واختر للزراعة فقط تلك التي لديها تجويف أمنيوسي جيد التكوين ، دون أي ضرر واضح وبدون غشاء رايشرت.
ملاحظة: استخدم أطراف ماصة 20 ميكرولتر لنقل أجنة E5.5 ونصائح 200 ميكرولتر لنقل أجنة E6.5. في حالة الثقافات التي تبدأ من E6.5 ، يمكن استبدال HCS ب HBS التي تم جمعها حديثا. - قم بإزالة نصف الوسط وإضافة 250 ميكرولتر من EUCM الطازج قبل التسخن بعد 24 ساعة من الزرع ، مما يضمن غمر الأجنة دائما في وسط الزرع. في حالة الثقافات التي تبدأ من E5.5 ، بعد يومين من الثقافة (أي ما يعادل E7.5) ، قم بإزالة 200 ميكرولتر وإضافة 250 ميكرولتر من EUCM الجديد.
ملاحظة: أثناء الزراعة الثابتة، قد تلتصق الأجنة بالصفيحة (بشكل رئيسي عند استخدام الألواح البلاستيكية)، مما سيضر بشدة بنمو الجنين. يكون ربط الجنين باللوحة أكثر تواترا في اليوم الأول من زراعة أجنة E5.5. لمنع التعلق، ادفع الأجنة بعناية بعيدا عن سطح الصفيحة باستخدام ملقط ناعم ومعقم. تحقق من أن المخروط المشيمي الخارجي فقط يبقى متصلا بسطح اللوحة. - نقل الأجنة إلى مزرعة الأسطوانة في مرحلة السوميت المبكرة (4-7 سوميت ؛ بعد ثلاثة أيام من الثقافة للأجنة المزروعة في E5.5 ويومين للمزارع بدأت في E6.5) ، بعد نفس المؤشرات الموصوفة سابقا لأجنة المرحلة E8.5.
ملاحظة: يؤدي نقل الأجنة إلى مزرعة الأسطوانة في مراحل سوميت مختلفة عما هو موضح أعلاه إلى فشل المزيد من التطور. على النقيض من مزارع E7.5 خارج الرحم ، من الممكن الحفاظ على الأجنة في جو ثابت من 21٪ من الأكسجين و 5٪ CO2 ، مما يوفر كفاءة أعلى قليلا لتطوير الجنين من الأجواء ذات تركيز الأكسجين الديناميكي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تدعم ظروف زراعة الأسطوانة الموصوفة للأجنة E7.5 (مرحلة أواخر المعدة) نمو الجنين المستمر والطبيعي بمتوسط كفاءة يقترب من 75٪ بعد 4 أيام من الزراعة (الشكل 2 والجدول 1). قد تختلف كفاءة نمو الجنين عبر الخلفيات الوراثية المتنوعة للفئران ولكنها قوية باستمرار (الشكل 2C). المكملات الغذائية مع HBS بدلا من HCS تعطي كفاءة ~ 68 ٪ بعد 4 أيام من ثقافة خارج الرحم ، وهذا يتوقف على الخلفية الوراثية للفئران (الشكل 2D والجدول 2). طورت الأجنة خارج الرحم التطور السليم حتى مرحلة 44-somite تقريبا. بعد ذلك ، تظهر الأجنة تشوهات جنينية بسبب عدم وجود المشيمة الألانتوية ، مما يؤدي إلى عدم كفاية الأوكسجين وإمدادات المغذيات نظرا لزيادة حجم الجسم في هذه المرحلة.
يتم تلخيص تطور أجنة E6.5 (الخط المبكر) في الصفائح الثابتة بشكل صحيح بكفاءة >90٪ حتى مرحلة السوميت المبكرة E8.5 ، باستخدام EUCM مع كل من HCS و HBS (الشكل 3 والجدول 3 والجدول 4) (انظر 8,13 للحصول على وصف مفصل لتدريج الأجنة بين E5.5 و E8.5). إن زراعة خارج الرحم من المعدة إلى التكوين العضوي المتقدم من خلال الجمع بين الثقافات على ألواح ثابتة تليها ثقافة الأسطوانة في جو أكسجين ثابت بنسبة 21٪ يعطي كفاءة تقديرية للتطور السليم بنسبة 55٪ و 26٪ إلى مرحلة 44-somite ، باستخدام HCS و HBS ، على التوالي (الشكل 3A ، الجدول 3 ، والجدول 4). هناك تأخير من 1-2 أزواج السوميت في هذه الأجنة مقارنة مع الأجنة المتقدمة في الرحم. يحدث أكبر انخفاض في الكفاءة عند الانتقال من E8.5 إلى E9.5 بسبب فشل الدوران المحوري وإغلاق الأنبوب العصبي.
تظهر الثقافات التي تبدأ من الأجنة قبل المعدية E5.5 كفاءة التطور السليم إلى مرحلة السوميت المبكرة (E8.5) بنسبة 46٪ تقريبا ، وسيكمل ما يقرب من 17٪ من الأجنة التطور السليم بعد ستة أيام من الزراعة بعد نقلها إلى مزرعة الأسطوانة (الشكل 4 والجدول 5). تطيل زراعة الرحم الممتدة من تأخر النمو في الأجنة ، حيث تظهر الأجنة المزروعة في E5.5 تأخيرا يتراوح بين 2-4 أزواج من السوميت مقارنة بالأجنة في الجسم الحي . ومع ذلك ، فإن التشكل وتطور الأنسجة يمضيان بشكل صحيح حتى مرحلة 42-somite تقريبا.
وتتمثل العيوب الأكثر شيوعا التي شوهدت في الأجنة للمزارع التي بدأت من E7.5 و E6.5 و E5.5 في الشكل 5A-C. في وقت التشريح ، يجب التخلص من الأجنة ذات الأضرار الطفيفة التي لحقت بالأرومة أو المنطقة خارج الجنين ، وكذلك الأجنة التي تحتفظ بغشاء رايشرت. وبالمثل ، لن تنمو الأجنة المبكرة بشكل صحيح (انظر الشكل 5B للأجنة الميتة) أو تظهر تأخيرات شديدة في النمو (انظر الشكل 5B للجنين المتأخر). سيؤثر ربط الأرومة الجنينية بسطح الصفيحة على التطور اعتمادا على موضع ودرجة التعلق. سيؤدي إرفاق جزء من الأرومة أو الجنين بأكمله إلى فشل المزيد من التطور (انظر الشكل 5B للجنين المرفق).
التشوهات الرئيسية التي لوحظت في النسبة المئوية للأجنة المعيبة في E8.5 (مرحلة السوميت المبكرة) هي تطور المنطقة الخلفية خارج كيس الصفار أو عيوب في نمو الطيات العصبية (الشكل 5A ، B). في حالة الثقافات التي بدأت في E5.5 ، فإن العيب التنموي الذي لوحظ بشكل متكرر هو وجود إيبلاست صغير متخلف النمو (الشكل 5C). في الوقت المكافئ ل E9.5 ، تمثل العيوب في إغلاق الطيات العصبية ، أو فشل الدوران المحوري ، أو النقص في نمو الدماغ التشوهات الأكثر شيوعا (الشكل 5). العيوب التنموية الأكثر شيوعا في E10.5 / E11 هي الحالات الشاذة في منطقة الرأس ، واضطراب الدورة الدموية الطبيعية في كيس صفار البيض ، وانصباب التامور (الشكل 5). قد يؤدي تمزق أحد الأوعية الدموية الرئيسية وتدفق الدم إلى موت الجنين لاحقا. والجدير بالذكر أنه يمكن الوصول إلى النمو السليم للجنين نفسه حتى في غياب دوران واضح لكيس الصفار. تظهر الأجنة المحفوظة في الثقافة بعد المرحلة المكافئة ل E11 انكماشا في الجسم والموت بعد بضع ساعات بسبب نقص الأوكسجين المناسب للأنسجة.
الشكل 1: نظام تنظيم الغاز والضغط المتكيف مع حاضنة زراعة الأسطوانة. (أ) المنظر العلوي لوحدة تنظيم الغاز المتصلة بحاضنة زراعة الأسطوانة. يدخل N2 و CO2 منظم الغاز للسماح بالتحكم الدقيق في تركيزات الأكسجين / CO2 وضغط الغاز. يتم توجيه الغازات نحو صندوق الخلط ، حيث يتم خلطها بواسطة منفاخ الطرد المركزي وحقنها في الحاضنة بواسطة مضخة تولد ضغطا إيجابيا. يتدفق الغاز عبر المدخل إلى زجاجة مياه ثم إلى الزجاجات المختومة. (ب) التكوين الداخلي للوحدة الإلكترونية لتنظيم الغاز والضغط. تنظم قيمة الجهد المحددة على جهاز إرسال الضغط الضغط الضغط الناتج عن المضخة داخل صندوق خلط الغاز (5-6 فولت لتحقيق ضغط 6-7 رطل لكل بوصة مربعة في هذا النموذج المحدد). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تدعم منصة زراعة الرحم الخارجي نمو أجنة E7.5 حتى التكوين العضوي المتقدم. (أ) رسم بياني يصور بروتوكول زراعة الأجنة خارج الرحم E7.5. (ب) صور تمثيلية ذات مجال ساطع لمجموعات من الأجنة المستزرعة التي تتطور خارج الرحم على مدى 4 أيام، من أواخر عملية المعدة (E7.5) إلى مرحلة 44-somite (E11). يشار إلى التباين النموذجي في عدد السوميت الذي يتم تقييمه كل 24 ساعة. قضبان المقياس = 500 ميكرومتر (C, D) النسبة المئوية للأجنة المطورة بشكل طبيعي في 1-4 أيام من التكاثر بدءا من E7.5 مقسوما على سلالات الوالدين الفئران ومكملات المصل (C, مصل دم الحبل السري البشري; D ، مصل دم الإنسان البالغ). وقد عدل الفريق ألف من 13 فريقا. الاختصارات: EUCM = وسط زراعة الأجنة خارج الرحم ؛ HCS = مصل دم الحبل السري البشري; HBS = مصل دم الإنسان البالغ. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. بروتوكول زراعة خارج الرحم ممتد لزراعة أجنة الفئران E6.5 المبكرة حتى التكوين العضوي المتأخر. (أ) رسم تخطيطي لبروتوكول الاستزراع خارج الرحم الممتد الذي يجمع بين الألواح الثابتة وأنظمة الزجاجات الدوارة. (ب) صور المجال الساطع للأجنة المستزرعة خارج الرحم لمدة خمسة أيام من E6.5 إلى مرحلة 44 سوميت. يشار إلى التباين النموذجي في عدد السوميت الذي يتم تقييمه كل 24 ساعة. أشرطة المقياس = 500 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: استمرار زراعة الفئران خارج الرحم لأجنة الفئران قبل المعدة من E5.5 حتى مراحل التكوين العضوي المتأخرة. (أ) تصوير تخطيطي لزراعة خارج الرحم وبروتوكول الأجنة E5.5. (ب) صور تمثيلية ذات مجال ساطع للأجنة المستزرعة خارج الرحم لمدة ستة أيام من E5.5 حتى مرحلة 42 سوميت. يشار إلى التباين النموذجي في عدد السوميت الذي يتم تقييمه كل 24 ساعة. أشرطة المقياس = 500 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: عيوب النمو التمثيلية التي لوحظت في الأجنة المستزرعة خارج الرحم. (أ-ج) صور مجهرية ذات مجال ساطع لأجنة الفئران غير الطبيعية التي نمت خارج الرحم بدءا من E7.5 (A) أو E6.5 (B) أو E5.5 (C). يتم توفير وصف عام للعيب على كل صورة. أشرطة المقياس = 500 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الجدول 1: كفاءة التطور السليم للأجنة المعزولة في E7.5 أيام بعد الجماع. تم زرع الأجنة خارج الرحم لمدة 4 أيام في EUCM (25٪ مصل دم الحبل السري البشري). [-] يشير إلى الثقافات التي لم تستمر بسبب المتطلبات التجريبية. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.
الجدول 2: كفاءة التطور السليم للأجنة المعزولة في E7.5 ، المستزرعة خارج الرحم لمدة 4 أيام ، واستبدال مصل دم الحبل السري البشري بمصل دم الإنسان البالغ المعزول حديثا. [-] يشير إلى الثقافات التي لم تستمر بسبب المتطلبات التجريبية. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.
الجدول 3: كفاءة التطور السليم للأجنة (B6D2F1/ICR) المعزولة عند E6.5 والمستزرعة خارج الرحم لمدة 5 أيام باستخدام EUCM (25٪ مصل دم الحبل السري البشري). تم إجراء زراعة خارج الرحم في ثقافة ثابتة لمدة يومين (21٪ O2) تليها ثلاثة أيام في زجاجات دوارة بنسبة 21٪ O2. [-] يشير إلى الثقافات التي لم تستمر بسبب المتطلبات التجريبية. اختصار: NA = غير مكتسبة. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.
الجدول 4: كفاءة التطور السليم للأجنة (B6D2F1/ICR) المعزولة عند E6.5 والمستزرعة خارج الرحم لمدة 5 أيام باستخدام EUCM (استبدال مصل دم الحبل السري البشري بمصل دم الإنسان البالغ المعزول حديثا). تم تطوير الأجنة في ثقافة ثابتة لمدة يومين (21٪ O2) تليها ثلاثة أيام في زجاجات دوارة بنسبة 21٪ O2. [-] يشير إلى الثقافات التي لم تستمر بسبب المتطلبات التجريبية. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.
الجدول 5: كفاءة التطور السليم للأجنة (B6D2F1/ICR) المعزولة عند E5.5 والمستزرعة خارج الرحم لمدة 6 أيام باستخدام EUCM (25٪ مصل دم الحبل السري البشري). تم تطوير الأجنة في ثقافة ثابتة لمدة ثلاثة أيام (21٪ O2) تليها ثلاثة أيام في زجاجات دوارة بنسبة 21٪ O2. [-] يشير إلى الثقافات التي لم تستمر بسبب المتطلبات التجريبية. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يمكن لبروتوكول الاستزراع المقدم هنا الحفاظ على التطور السليم والمستمر لجنين الفئران خارج الرحم لمدة تصل إلى ستة أيام ، من E5.5 إلى E11. في السابق، كانت الأجنة في مراحل النمو هذه تتطور بشكل طبيعي في الثقافة فقط لفترات قصيرة (تصل إلى 48 ساعة)15. يعد اقتران وحدة تنظيم الغاز بحاضنة زراعة الأسطوانة للتحكم الدقيق في تركيز الأكسجين وضغط الغاز عالي الضغط أمرا بالغ الأهمية لزراعة أجنة الفئران المناسبة الموضحة هنا. إن زيادة ضغط الغاز إلى 7 رطل لكل بوصة مربعة يعزز انتشار الأكسجين ، مما يسمح بتطور الجنين حتى E11 في جو يصل إلى 21٪ O2 / 5٪ CO2 ، على عكس الظروف المستخدمة سابقا بنسبة 95٪ O216 ، والتي قد تكون ضارة بالجنين على المدى الطويل. علاوة على ذلك، من المعروف أن تركيز الأكسجين يلعب دورا حاسما في التطور الجنيني، حيث يحدث التكوين المبكر للأجنة بعد الزرع في ظل ظروف نقص الأكسجين17. وبناء على ذلك، فإن الثقافة الناجحة للأجنة المتأخرة تتطلب أجواء أولية O2 بنسبة 5٪، مع زيادة ديناميكية في تركيز الأكسجين مع نمو الجنين. ومن اللافت للنظر أن زراعة الأجنة قبل / في وقت مبكر من التكاثر في الثقافة الثابتة بنسبة 5٪ O2 قللت بشكل كبير من كفاءة نمو الجنين السليم مقارنة ب 21٪ O2 ، ولم يتمكنوا من التطور أكثر إلى E9.5. ويمكن تفسير هذا الأخير بالمعدل البطيء لنشر المغذيات والأكسجين عبر الأنسجة الجنينية في الثقافة الثابتة مقارنة بالثقافة في الزجاجات الدوارة1,10.
علاوة على ذلك، فإن المحتوى العالي من مصل دم الحبل السري للفئران والبشر يوفر نتائج أكثر اتساقا لنمو الأجنة المبكرة بعد الزرع من الوسائط المكملة بمصل الفئران فقط13،18. الأهم من ذلك ، يجب تحضير المصل المستخدم في زراعة الأجنة من الدم المستخرج حديثا. على الرغم من أن مصل الفئران عالي الجودة لزراعة الأجنة بأكملها متاح تجاريا ، إلا أنه يجب عزل المصل البشري في المنزل. يمكن استبدال المكملات الغذائية مع مصل دم الحبل السري البشري بمصل معزول من دم البالغين البشريين ، والذي يمكن الوصول إليه على نطاق واسع ولا يزال يوفر نموا ثابتا وفعالا للأجنة.
كما يعتمد التطور الناجح والفعال للأجنة خارج الرحم بشكل كبير على عزل الجنين بدقة. أولا ، يجب إجراء إجراء التشريح في وسط تشريح يتم تسخينه عند 37 درجة مئوية ، ويجب نقل الأجنة المجزأة إلى زجاجات / ألواح الاستزراع في غضون 30 دقيقة. ثانيا، يعد عزل الجنين الدقيق عن الديسيدوا وإزالة غشاء الرايشرت دون الإضرار بالأرومة أمرا أساسيا للحصول على كفاءة عالية في نمو الجنين. ثالثا ، يجب اختيار الأجنة فقط في المرحلة المناسبة للزراعة ، لأن الأجنة المبكرة / المتأخرة لن تنمو بشكل صحيح.
يعد التعامل مع الأجنة أثناء النقل نقطة أساسية أخرى خلال زراعة خارج الرحم ، خاصة بعد تطور كيس صفار البيض الجنيني. يجب نقل الأجنة بعناية لأن تلف الأوعية الدموية الرئيسية في كيس الصفار يمكن أن يؤثر على التطور السليم. بشكل عام ، كلما طالت فترة زراعة الأجنة ، انخفضت كفاءة نمو الجنين الطبيعي ، أي أن الأجنة المزروعة في E7.5 ستتطور بكفاءة أعلى من تلك المزروعة في E6.5 أو E5.5. علاوة على ذلك ، فإن وجود المضادات الحيوية في الوسط أمر أساسي لمنع التلوث إذا لم يكن مجهر التشريح المخصص داخل غطاء بيولوجي متاحا.
لا يمكن استبعاد أن المنصات الأخرى أو مستويات الضغط أو الظروف قد تمكن من تحقيق نتائج مماثلة أو معززة للنتائج التي تم الحصول عليها باستخدام هذا البروتوكول. هناك حاجة إلى مزيد من التحسين للظروف الموصوفة في هذه الدراسة للوصول إلى كفاءة نمو الجنين مساوية لتلك التي لاحظها التطور داخل الرحم. وعلاوة على ذلك، فإن التطوير المستقبلي لوسط محدد خال من المصل يمكن أن يساعد في تحديد المتطلبات الأيضية والكيميائية المحددة أثناء تطور أجنة الثدييات وتقليل تباين المصل من دفعة إلى أخرى. إن الحاجة إلى الخلط المستمر بين المغذيات والغاز بعد E8.5 باستخدام ثقافة الزجاجات الدوارة في الإعدادات الحالية تحد من قدرات التصوير على المدى الطويل خلال مراحل التكوين العضوي. ويمكن أن يساعد التطوير المستقبلي لأجهزة الموائع الدقيقة التي تمكن من مزج الغاز والمغذيات في الثقافة الثابتة إلى جانب إعدادات الفحص المجهري في التغلب على هذا التحدي.
يمكن التلاعب بالأجنة المستزرعة خارج الرحم تجريبيا والاحتفاظ بها في الثقافة حتى مراحل التكوين العضوي المتقدمة خارج الرحم . لقد أظهرنا سابقا القدرة على إدخال اضطرابات متنوعة في الأجنة النامية ، مثل التلاعب الجيني عن طريق المعالجة الكهربائية أو العدوى الفيروسية ، والتصوير الحي ، وتطعيم الخلايا ، والدراسات المسخية 13. في نهاية المطاف، قد تساعد هذه المنصة في الكشف عن مواصفات مصير الخلية وآليات تكوين الأعضاء في الثدييات من خلال السماح بإجراء تجارب في الوقت الفعلي على أجنة الفئران الحية لمدة تصل إلى ستة أيام من التطور المبكر بعد الزرع.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
J.H.H هو مستشار لشركة Biological Industries Ltd وقدم طلب براءة اختراع يغطي ظروف الثقافة الدوارة والثابتة الموضحة هنا (قدمها J.H.H. ومعهد وايزمان للعلوم). مؤلفون آخرون يعلنون عدم وجود مصالح متنافسة.
Acknowledgments
تم تمويل هذا العمل من قبل باسكال وإيلانا مانتو. مجلس البحوث الأوروبي (ERC-CoG-2016 726497-Cellnaivety) ؛ مجلس البحوث الطبية لمضيفات الطيران (FAMRI) ؛ أستاذية الصندوق الإسرائيلي لأبحاث السرطان (ICRF) ، BSF ، معهد هيلين ومارتن كيميل لأبحاث الخلايا الجذعية ، جائزة هيلين ومارتن كيميل للتحقيق المبتكر ؛ مؤسسة العلوم الإسرائيلية (ISF)، مينيرفا، معهد شيرمان للكيمياء الطبية، مركز نيلا وليون بينوزيو للأمراض العصبية، مركز عائلة ديفيد وفيلا شيبيل لأبحاث الاضطرابات الوراثية، معهد كيكست العائلي لعلم الوراثة الطبية، صندوق أبحاث الخلايا الجذعية للدكتور بيث روم-رايمر، مؤسسات إدموند دي روتشيلد، مؤسسة زانتكر الخيرية، مزرعة زفيا زيروني.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm pore size filter (250 mL) | JetBiofil | FCA-206-250 | |
| 0.22 µm pore size syringe PVDF filter | Millipore | SLGV033RS | |
| 8-well µ-plates glass bottom/ibiTreat | iBidi | 80827/80826 | |
| Bottle with adaptor cap for gas inlet | Arad Technologies | ||
| Bungs (Hole) | B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering | BTC 06 | Used to seal the bottles to the drum |
| Bungs (Solid) | B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering | BTC 07 | Used to seal the rotating drum |
| Culture bottles | B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering | BTC 03/BTC 04 | Either Glass Bottles (Small) BTC 03 or Glass Bottles (Large) BTC 04 |
| D(+)-glucose Monohydrate | J.T. Baker | ||
| Diamond knife | Fine Science Tools | 10100-30/45 | |
| Digital Pressure Gauge | Shanghai Benxu Electronics Technology co. Ltd | BX-DPG80 | |
| DMEM | GIBCO | 11880 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Biological industries | 02-020-1A | |
| Fetal Bovine Serum | Biological industries | 04-013-1A | |
| Gas regulation module | Arad Technologies | HannaLab1 | |
| Glutamax | GIBCO | 35050061 | glutamine |
| Graefe forceps | Fine Science Tools | 11052-10 | |
| HEPES | GIBCO | 15630056 | |
| Microsurgical forceps (Dumont #5, #55) | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Pasteur pipettes (glass) | Hilgenberg | 3150102 | |
| Pasteur pipettes (plastic) | Alexred | SO P12201 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biological industries | 03-031-1B | |
| Petri Dishes (60 mm and 100 mm) | Falcon | 351007/351029 | |
| Precision incubator system | B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering | BTC01 | BTC01 model with gas bubbler kit |
| Pro-coagulant sterile test tubes (5 mL) | Greiner Bio-One | #456005 | |
| Rat whole embryo culture serum | ENVIGO Bioproducts | B-4520 | |
| Stereoscopic microscope equipped with heating plate | Nikon | SMZ18 | |
| Sterile syringes (5, 10 ml) for sera filtration | Pic Solution | ||
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 14094-11 |
References
- New, D. A. Whole-embryo culture and the study of mammalian embryos during organogenesis. Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society. 53 (1), 81-122 (1978).
- Tam, P. P., Behringer, R. R. Mouse gastrulation: the formation of a mammalian body plan. Mechanisms of Development. 68 (1-2), 3-25 (1997).
- Huang, Q., et al. Intravital imaging of mouse embryos. Science. 368 (6487), 181-186 (2020).
- White, M. D., et al. Long-lived binding of Sox2 to DNA predicts cell fate in the four-cell mouse embryo. Cell. 165 (1), 75-87 (2016).
- Tam, P. P. Postimplantation mouse development: whole embryo culture and micro-manipulation. International Journal of Developmental Biology. 42 (7), 895-902 (1998).
- Nicholas, J. S., Rudnick, D. The development of rat embryos in tissue culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 20 (12), 656-658 (1934).
- New, D. A., Stein, K. F. Cultivation of mouse embryos in vitro. Nature. 199, 297-299 (1963).
- Rivera-Pérez, J. A., Jones, V., Tam, P. P. L. Culture of whole mouse embryos at early postimplantation to organogenesis stages: developmental staging and methods. Methods in Enzymology. 476, 185-203 (2010).
- New, D. A. T., Coppola, P. T., Terry, S. Culture of explanted rat embryos in rotating tubes. Journal of Reproduction and Fertility. 35 (1), 135-138 (1973).
- Cockroft, D. L. A comparative and historical review of culture methods for vertebrates. International Journal of Developmental Biology. 41 (12), 127-137 (1997).
- Parameswaran, M., Tam, P. P. L. Regionalisation of cell fate and morphogenetic movement of the mesoderm during mouse gastrulation. Developmental Genetics. 17 (1), 16-28 (1995).
- Beddington, R. S. Induction of a second neural axis by the mouse node. Development. 120 (3), 613-620 (1994).
- Aguilera-Castrejon, A., et al. Ex utero mouse embryogenesis from pre-gastrulation to late organogenesis. Nature. 593 (7857), 119-124 (2021).
- Takahashi, M., Makino, S., Kikkawa, T., Osumi, N. Preparation of rat serum suitable for mammalian whole embryo culture. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (90), e51969 (2014).
- Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K. V., Nagy, A. Isolation, culture and manipulation of postimplantation embryos. Manipulating the Mouse Embryo: a Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. 149-193 (2014).
- Takahashi, M., Nomura, T., Osumi, N. Transferring genes into cultured mammalian embryos by electroporation. Development, Growth and Differentiation. 50 (6), 485-497 (2008).
- Mathieu, J., Ruohola-Baker, H. Metabolic remodeling during the loss and acquisition of pluripotency. Development. 144 (4), 541-551 (2017).
- Sturm, K., Tam, P. P. L. Isolation and culture of whole postimplantation embryos and germ layer derivatives. Methods in Enzymology. 225, 164-190 (1993).
