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Behavior

果蝇 被动回避行为作为研究联想性厌恶学习的新范式

Published: October 15, 2021 doi: 10.3791/63163
Automatic Translation
1, 1
1Department of Physiology, East Carolina University

ERRATUM NOTICE

Summary

这项工作描述了一个简单的行为范式，可以分析成年果蝇的厌恶联想学习。该方法基于抑制由于特定环境环境与电击之间形成的关联而导致的先天负地理出租车行为。

Abstract

该协议描述了一种分析成年果蝇（Drosophila melanogaster）中厌恶性联想学习的新范例。这种范式类似于实验室啮齿动物的被动回避行为，其中动物学会避开以前接受过电击的隔间。该测定利用了苍蝇中的负地理出租车，这表现为当它们被放置在垂直表面上时爬上去的冲动。该设置由垂直方向的上部和下部隔间组成。在第一次试验中，一只苍蝇被放置在较低的隔间中，通常从那里在3-15秒内离开，然后进入上层隔间，在那里它受到电击。在第二次试验期间，24小时后，潜伏期显着增加。同时，与第一次试验相比，电击次数减少，表明苍蝇形成了关于上部隔室的长期记忆。延迟和冲击次数的记录可以使用计数计数器和秒表或基于Arduino的简单设备执行。为了说明如何使用该测定，本文表征了 D. melanogaster 和 D. simulans 男性和女性的被动回避行为。对潜伏期和冲击次数的比较表明， D. melanogaster 和 D. simulans 苍蝇都有效地学习了被动回避行为。雄性和雌性苍蝇之间没有观察到统计学差异。然而，在第一次试验中，男性进入上部隔间时速度稍快，而女性在每次保留试验中接受的电击次数略高。西方饮食（WD）显着损害了雄性苍蝇的学习和记忆，而飞行运动抵消了这种效果。综上所述，苍蝇的被动回避行为提供了一种简单且可重复的测定，可用于研究学习和记忆的基本机制。

Introduction

学习和记忆是一种进化上古老的环境适应机制，从果蝇（D.）到人类1。果蝇是一种强大的模型生物，用于研究学习和记忆的基本原理，因为它提供了广泛的强大遗传工具来剖析内在的分子机制2。开创性的基因筛查研究确定了对学习和记忆至关重要的rutabaga3，amnesiac4和dunce5基因2，利用了嗅觉调节，因为果蝇依靠其敏锐的嗅觉来寻找食物，潜在的配偶并避开捕食者6。

嗅觉调节已成为研究学习和记忆机制的流行范式，这要归功于Tully和Quinn7，8引入嗅觉T迷宫。随后，已经提出了其他测量各种类型的学习和记忆的方法，包括视觉条件9，求偶条件10，厌恶光速抑制测定11和黄蜂暴露条件反射12。然而，大多数这些检测方法都有一个复杂的设置，必须在大学车间定制或通过供应商购买。这里描述的范式基于一个简单的行为测定，用于研究苍蝇的厌恶联想学习，这些学习可以很容易地与一些可用的用品组装在一起。

所描述的范式相当于实验室小鼠和大鼠的被动（或抑制）回避行为，其中动物学会避开以前接受过电脚电击的隔间13。在Murids中，该程序基于他们对强光的天生回避和对较暗区域的偏好14。在第一次试验中，动物被放入明亮的隔间，从那里动物迅速离开，踏入一个黑暗的隔间，在那里发出电脚电击。通常，一次试验足以形成坚实的长期记忆，导致24小时后的潜伏期显着增加。然后，潜伏期被用作动物记住厌恶刺激与特定环境之间关联的能力的指标15。

这项工作描述了使用 D. 作为模型系统的类似程序，与啮齿动物模型相比，它具有几个优点，包括成本效益，更大的样本量，缺乏监管监督以及获得强大的遗传工具16，17。该过程基于负面的地理出租车行为，这表现在苍蝇被放置在垂直表面上时爬上去的冲动18。该装置由两个垂直腔室组成。在第一次试验中，将果蝇放入较低的隔间。从那里，它通常在3-15秒内离开，进入上层隔间，在那里它受到电击。在1分钟的试验中，一些苍蝇可能偶尔会重新进入上层隔间，从而导致额外的电击。在测试阶段，24小时后，延迟显着增加。同时，与第一天相比，电击次数减少，表明苍蝇在上部隔间形成了厌恶的联想记忆。然后使用延迟，电击次数以及梳理发作的持续时间和频率来分析动物行为以及形成和记住厌恶刺激与特定环境之间关联的能力。具有代表性的结果表明，暴露于西方饮食（WD）会显着损害雄性苍蝇的被动回避行为，这表明WD会深刻影响苍蝇的行为和认知。相反，飞行锻炼减轻了WD的负面影响，改善了被动回避行为。

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Protocol

1. 被动回避装置的制备

  1. 钻一个垂直于14 mL聚丙烯培养管壁面的4 mm孔，距离管底部8 mm。
    注：使用电钻和5/32钻头以获得最佳效果。
  2. 使用钢美工刀，切掉14 mL聚丙烯培养管的上部，形成45毫米长的管底部碎片。底部碎片用作下部隔间。
  3. 使用单刃剃须刀片切断1，000 μL蓝色移液器吸头的尖端，使开口足够宽，以便单个苍蝇通过。切掉蓝色尖端的变窄部分，形成一个12毫米的碎片。将此碎片牢固地插入下部隔间的4毫米孔中。这被用作转移苍蝇的装卸月台。
  4. 切割一块 15 mm 的透明乙烯基管，内径为 5/8"（参见 材料表）以创建联轴器。从两端将上部和下部隔间插入联轴器，将下部隔间牢固地连接到上部隔间。
  5. 使用 2 爪可调节夹具，将组件连接到垂直支架上。将组件垂直定向，将减震管作为上部隔间。
  6. 将冲击管导线连接到电刺激器（见 材料表）以提供电击。训练时间为1分钟。
    注意：为了便于观察，请将一张白纸放在减震管后面，作为设备的白色背景。将带有75 W等效软灯泡的灯放在防震室上方。在设置前面放置一个可调节的臂放大灯。被动回避装置的表示 如图1所示。

2. 为被动回避程序准备苍蝇

  1. 使用冰冷块固定3-4天大 的D. melanogaster 或 D. simulans 苍蝇，并在实验前24小时将它们转移到带有食物的单个小瓶中（每瓶1只苍蝇），按照前面描述的程序19。
    注意：这里描述的实验比较了3-4天大的男性 与。雌性苍蝇在 D. melanogaster 和 D. simulans。
  2. 在行为实验之前，对所有小瓶进行编码。为此，为每个组分配一个字母，例如"A"，"B"，"C"等，每个组飞行一个数字。只有在记录和分析了所有数据之后，才显示此代码。每种基因型或治疗方法至少使用20只苍蝇来对抗个体变异。
    注意：执行实验和分析"盲目"允许在评估苍蝇和数据分析的性能时排除偏差。

3. 执行第一次试验

  1. 使用前面描述的飞嘴吸气器（见材料表）20，通过装卸月台将苍蝇从单个小瓶轻轻转移到下部隔间。通过吸气轻轻地将一只苍蝇吸进口中吸气器。通过轻轻吹入装卸月台来存放苍蝇。
    注意：避免在捕捉和装载过程中给动物施加压力。
  2. 在苍蝇被装入下部隔间后，立即启动1分钟计时器和秒表。
    注：秒表用于测量延迟，并用于计数震动次数的计数计数器。
  3. 按下秒表，通过将所有爪子放在网格上，记录苍蝇进入冲击管时的第一个延迟。打开刺激器，对苍蝇进行电击。刺激参数为120伏，持续时间为1000 ms，脉冲/秒（PPS），列车持续时间为2000 ms。
  4. 如果苍蝇重新进入冲击管，则提供额外的冲击。使用计数计数器或基于Arduino的计数器记录1分钟试验期间接受的电击次数（参见 材料表）。如果使用基于Arduino的计数器，请按照以下步骤操作。
    注意：可选的基于Arduino的设备AKM-007（参见 材料表）可用于测量时间，延迟，冲击次数以及通过按下并释放设备上相应按钮来训练每只动物的梳理频率和持续时间。设备上的按钮用于测量延迟，管理和记录电击次数，以及测量梳理比赛的频率和持续时间。
    1. 在步骤 3.2 中 按"开始 "按钮，在步骤 3.3 中按" 震撼 "按钮。
    2. 要记录梳理比赛的持续时间，请在设备上按下 美容 比赛开始时的美容按钮，然后在美容比赛结束时释放此按钮。
      注意：在整个1分钟的试验中测量了梳理发作。广泛的梳理可能表明动物压力21，22。基于Arduino的设备将所有数据作为CSV文件保存到存储卡中。
  5. 在1分钟的试验结束时，轻轻地将苍蝇转移回单个小瓶。记下延迟、收到的冲击次数以及行为中任何显著的变化。
  6. 用70%乙醇清洁下部和冲击室，用不起毛的清洁纸巾擦拭（ 见材料表），然后用吹风机擦干。用下一只苍蝇重复试验。
  7. 行为实验后，用水和无味洗涤剂清洁下部隔间。用70%乙醇擦拭下部隔间和减震室，并风干过夜。

4. 执行第二次试验

  1. 通过在24小时后重复上述程序（步骤3）来执行第二次试验。以与前一天相同的顺序测试苍蝇。

5. 结果分析

  1. 计算试验1和试验2中每组动物的平均潜伏期、平均休克次数和梳理时间。使用 Tukey 检验执行学生 t 检验进行两组比较，或使用 Tukey 检验进行方差分析进行多重比较23。

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Representative Results

被动回避在 D. melanogaster （Canton-S）和 D中进行了研究。 模拟。实验比较了连续试验之间的潜伏期和接受冲击的数量。最初，实验是用3-4天大的雄性 D. melanogaster 苍蝇进行的。在24°C的气候受控环境中，在12小时的光暗循环，70%湿度和受控的种群密度下，将苍蝇保持在标准布卢明顿配方饮食中。通过保持所有组的繁殖条件恒定来控制密度。将15只雄性和15只雌性在24°C，70%湿度和12小时光周期的瓶中繁殖48小时以产生后代。在四个2分钟的试验中研究了果蝇的被动回避行为，间隔24小时。试验是在一天中的同一时间进行的。在试验期间，从单个小瓶中轻轻地吸出一只苍蝇， 并通过 装卸月台转移到下部隔间（图1）。实验表明， D. melanogaster 可以成功地学习和记忆被动回避行为。在第一次试验中，幼小的苍蝇平均会在16秒（16.15±2.64秒）内进入上层舱室，并且经常会重新进入它，平均受到2次冲击（2.18±0.19）。在连续试验期间，潜伏期将显着增加，而冲击次数将减少，这表明苍蝇学会了上舱室与电击之间的关联（表1， 图2 A，B）。对频率分布的分析表明，负地理出租车是一个强大的动机。在第一次试验中，大多数幼稚的苍蝇会在5-15秒内进入上层舱室（bin 10， 图2C）并接受1-3次冲击（图2D）。相比之下，在第四次试验中，大多数苍蝇不会进入上部隔间，相应地不会受到任何冲击（图2E，F）。

为了验证被动回避测定在其他果蝇物种中有效，在 D.simulans 雄性和雌性蝇中重复实验，这些果蝇保持在与上述 黑色素食 蝇相同的外壳条件下。试验持续时间缩短至1分钟。延迟的频率分布清楚地表明，如果苍蝇在第一次试验中在60秒内没有进入上部隔间，它通常根本不进入（图3C）。试验数量减少到三个，因为上述实验可靠地证明，即使是一个试验也足以让苍蝇形成厌恶的关联。 D.模拟 雄性和雌性苍蝇在学习被动回避行为方面都有效，从图表和表格中的数据中可以明显看出（图3， 图4;和 表2，表3）。

男性和女性之间的潜伏期和休克次数的比较没有发现任何统计学上的显着差异（图5 A，B）。然而，在第一次试验中，雄性苍蝇进入上层隔间的速度稍快，而雌性苍蝇在每次试验中受到的电击次数略高（图4A，B）。差异在说明频率分布的图表中尤为明显（图4C-F）。第三次试验中潜伏期的频率分布表明，大多数苍蝇在7.5-12.5秒内进入上舱（图4E）。第三次试验中电击次数的频率分布显示，在上一次试验中，雌性苍蝇平均受到1-2次电击（图4F）。

在试验期间还记录了梳理行为的总持续时间。苍蝇美容行为包括前腿和后腿的重复协调运动，扫过翅膀，头部和身体24。自我修饰，也称为自动美容，以前与苍蝇24，实验室啮齿动物25和人类的行为压力有关22。因此，对自我修饰行为的研究可以为焦虑相关行为提供见解26。对被动回避试验期间梳理发作总持续时间的分析显示，在第二项和第三项试验中，雌性果蝇的自我修饰显著增加（图5C， 表4）。

越来越多的证据表明，高热量 WD 与认知能力受损之间存在关联27。实验表明，WD对线粒体脑功能，神经发生和突触可塑性产生不利影响28，29，30。最近的一项研究记录了WD增加甘油三酯并缩短D.的寿命，而飞行运动抵消了WD31的不利影响。为了开始探索WD和飞行运动对被动回避行为的影响， D. simulans雄性 苍蝇根据前面描述的协议进行了5天的WD，飞行运动或WD和飞行运动的组合31。WD含有15%Nutiva USDA认证的有机，非转基因，红棕榈油，15%蔗糖和0.1M NaCl，如其他地方所述31。飞行演习是在六十只雄蝇的组中进行的，这些雄蝇装在1加仑的透明塑料桶中，绑在连接到电动机的水平平台上，并由计时器操作。该运动每天进行7小时，持续5天，如前所述31。在5天的饮食和运动方案结束时，在冷麻醉下将苍蝇分类到单独的小瓶中，并进行两次被动回避行为试验。实验表明，WD增加了试验一和试验二中接受的电击次数，并降低了试验二中的潜伏期，表明WD显着损害了果蝇的厌恶联想学习（图6， 表5）。在WD和运动组合组中，试验二的电击次数也呈下降趋势，这表明运动可以减轻热量超负荷的影响。

Figure 1
图1：示意图显示了被动回避测定。 下部隔间尺寸为长 45 mm，外径为 17 mm。上部隔间尺寸为长 80 mm，外径为 18 mm。 请点击此处查看此图的放大版本。

Figure 2
图2： D. 黑色素体 雄性的被动回避行为。 （A） 每次试验的平均延迟。该图显示，延迟随试验次数的增加而显著增加。每个条形上都标明了苍蝇的数量。（B） 每次试验接受电击的平均次数。该图显示，冲击次数随试验次数的增加而显著减少。（C）频率分布，显示第一次试验中延迟箱内的苍蝇数量。x 轴上的数字是条柱中心。箱子是间隔（0-5秒，5-15秒，15-25秒等）。该图表明，大多数苍蝇在5-15秒内进入上舱室（D）频率分布，显示第一次试验中电击箱内的苍蝇数量。x 轴上的数字是条柱中心。该图显示，大多数苍蝇在第一次试验中受到1-3次冲击。在第一次试验中，很少有苍蝇没有进入震动室，并且受到零震动。他们被排除在随后的试验之外。（E）频率分布显示第四次试验中延迟箱内的苍蝇数量。该图表明大多数苍蝇不会进入上部隔间。（F）频率分布显示第四次试验中电击箱内的苍蝇数量。该图显示，大多数苍蝇在上一次试验中受到0次冲击。缩写： ns- 不显著， *- P<0.05， **- P<0.01， ***-P<0.001， ****- P<0.0001.单因素方差分析与 Tukey 的多重比较检验。 请点击此处查看此图的放大版本。

Figure 3
图3： D.模拟 男性的被动回避行为。 （A） 每次试验的平均延迟。该图显示，延迟随试验次数的增加而显著增加。（B） 每次试验接受电击的平均次数。该图显示，冲击次数随试验次数的增加而显著减少。（C）频率分布，显示第一次试验中延迟箱内的苍蝇数量。该图显示，大多数苍蝇在2.5-12.5秒内进入上舱。x 轴上的数字是库位中心。（D）频率分布，显示第一次试验中电击箱内的苍蝇数量。该图显示，大多数苍蝇在第一次试验中受到1-3次冲击。（E）频率分布显示第三次试验中延迟箱内的苍蝇数量。该图表明大多数苍蝇不会进入上部隔间。（F）频率分布显示第三次试验中电击箱内的苍蝇数量。该图显示，大多数苍蝇在上一次试验中受到0次冲击。缩写： *- P<0.05， ****- P<0.0001.单因素方差分析与 Tukey 的多重比较检验。 请点击此处查看此图的放大版本。

Figure 4
图4： D.模拟 女性的被动回避行为。 （A） 每次试验的平均延迟。该图显示，延迟随试验次数的增加而显著增加。（B） 每次试验接受电击的平均次数。该图显示，冲击次数随试验次数的增加而显著减少。（C）频率分布，显示第一次试验中延迟箱内的苍蝇数量。该图显示，大多数苍蝇在2.5-12.5秒内进入上舱。x 轴上的数字是库位中心。（D）频率分布，显示第一次试验中电击箱内的苍蝇数量。该图显示，大多数苍蝇在第一次试验中受到2次冲击。（E）频率分布显示第三次试验中延迟箱内的苍蝇数量。该图显示，大多数苍蝇在7.5-12.5秒内进入上舱室（F）频率分布，显示第三次试验中电击箱内的苍蝇数量。该图显示，在上一次试验中，大多数雌性苍蝇接受了1-2次电击。缩写： **- P<0.01， ***-P<0.001， ****- P<0.0001.单因素方差分析与 Tukey 的多重比较检验。 请点击此处查看此图的放大版本。

Figure 5
图5： D.模拟 男性和女性的被动回避和梳理行为的比较。 （A） 每次试验的平均延迟。该图显示男性和女性在潜伏期方面没有统计学上的显着差异。（B） 每次试验接受电击的平均次数。该图显示，男性和女性在接受的电击数量方面没有统计学上的显着差异。（C）试验1-3中梳理比赛的总持续时间。虽然雄性和雌性之间没有统计学上的显着差异，但与试验1相比，雌性苍蝇在试验2和试验3期间的梳理行为显着降低。缩写： *- P<0.05.单因素方差分析与 Tukey 的多重比较检验。 请点击此处查看此图的放大版本。

Figure 6
图6：WD对 D的影响，模拟 了男性的被动回避行为。 （A） 每次试验的平均延迟。该图显示 WD 显著增加了 WD 和 WDE 组中的延迟。（B） 每次试验接受电击的平均次数。该图显示，在试验1和2中，苍蝇在WD上接受的冲击数量在统计学上显着增加。有趣的是，根据学生t检验，飞行练习显着否定了WD的影响。缩写：CD-控制饮食，CDE-控制饮食与运动，WD-西方饮食，WDE-西方饮食与运动。*- P<0.05， **- P<0.01。单因素方差分析与 Tukey 的多重比较检验。#- P<0.05，学生t-test。 请点击此处查看此图的放大版本。

试验 试用版 1 试用版 2 试用版 3 试用 4
延迟（秒） 16.15±2.64 49.08±6.2 64.72±6.8 102.1±12.1
冲击 2.18±0.19 1.41±0.29 0.76±0.25 0.33±0.22
延迟 Tukey 试验之间的多重比较 总结 调整后的 P 值
1 与 2 **** <0.0001
1 与 3 **** <0.0001
1 与 4 **** <0.0001
2 与 3 ns 0.2043
2 对 4 **** <0.0001
3 与. 4 ** 0.0099
震惊了Tukey在试验之间的多重比较 总结 调整后的 P 值
1 与 2 ns 0.0646
1 与 3 *** 0.0004
1 与 4 **** <0.0001
2 与 3 ns 0.2569
2 对 4 * 0.0253
3 与. 4 ns 0.694

表1：训练对 D. melanogaster 雄性 避免触电的影响。延迟和接收冲击的数据作为均值表示±SEM.单因素方差分析与Tukey的多重比较检验。

试验 试用版 1 试用版 2 试用版 3
延迟（秒） 10.16±0.78 22.64±2.1 30.63±2.69
冲击 2.36±0.13 1.84±0.17 1.24±0.14
延迟 Tukey 试验之间的多重比较 总结 调整后的 P 值
1 与 2 **** <0.0001
1 与 3 **** <0.0001
2 与 3 * 0.0229
震惊了Tukey在试验之间的多重比较 总结 调整后的 P 值
1 与 2 * 0.0166
1 与 3 **** <0.0001
2 与 3 * 0.0172

表2：训练对 D.模拟 男性 避免触电的影响。延迟和接收冲击的数据作为均值表示±SEM.单因素方差分析与Tukey的多重比较检验。

试验 试用版 1 试用版 2 试用版 3
延迟（秒） 12.07±0.89 20.98±2.63 23.20±2.16
冲击 2.65±0.12 1.98±0.12 1.49±0.11
延迟 Tukey 试验之间的多重比较 总结 调整后的 P 值
1 与 2 ** 0.0023
1 与 3 **** <0.0001
2 与 3 ** 0.0028
震惊了Tukey在试验之间的多重比较 总结 调整后的 P 值
1 与 2 **** <0.0001
1 与 3 **** <0.0001
2 与 3 *** 0.0003

表3：训练对避免 D.模拟女性电击的影响。 延迟和接收冲击的数据作为均值表示±SEM.单因素方差分析与Tukey的多重比较检验。

试验 试用版 1 试用版 2 试用版 3
男性的修饰（s） 14.42±1.02 18.47±2.82 18.23±2.75
女性的修饰（s） 9.15±1.39 14.03±2.26 15.50±2.38
Tukey对男性试验的多重比较 总结 调整后的 P 值
1 与 2 ns 0.4384
1 与 3 ns 0.4873
2 与 3 ns 0.9971
Tukey对女性试验的多重比较 总结 调整后的 P 值
1 与 2 * 0.0299
1 与 3 * 0.0426
2 对 3 ns 0.8481

表4：被动回避对 D.模拟 梳理行为的影响。 数据以均值的形式呈现±SEM.单因素方差分析与Tukey的多重比较检验。

潜伏期 试用版 1 试用版 2
光盘 16.26±2.28 45.85±4.09
断续器 15.28±2.75 33.59±5.19
白矮星 13.49±1.58 28.33±3.7
断续器 13.00±1.95 30.23±3.79
延迟 Tukey 组间的多重比较 试验 1 总结 调整后的 P 值
光盘与光盘 ns 0.9916
CD 与 WD ns 0.7369
CD vs. WDE ns 0.6475
CDE 与 WD ns 0.9523
CDE vs. WDE ns 0.9122
WD vs. WDE ns 0.9981
延迟 Tukey 组间的多重比较 试验 2 总结 调整后的 P 值
光盘与光盘 ns 0.2785
CD 与 WD ** 0.0082
CD vs. WDE * 0.0283
CDE 与 WD ns 0.8578
CDE vs. WDE ns 0.9594
WD vs. WDE ns 0.9844
冲击 试用版 1 试用版 2
光盘 1.95±0.21 0.94±0.4
断续器 2.0±0.28 1.0±0.23
白矮星 3.05±0.26 2.36±0.41
断续器 2.49±0.24 1.36±0.23
震撼了Tukey在组间的多重比较 试验1 总结 调整后的 P 值
光盘与光盘 ns 0.9992
CD 与 WD ** 0.005
CD vs. WDE ns 0.3765
CDE 与 WD ns 0.0523
CDE vs. WDE ns 0.6446
WD vs. WDE ns 0.3268
震撼了图基在组间的多重比较 试验2 总结 调整后的 P 值
光盘与光盘 ns 0.9996
CD 与 WD * 0.0194
CD vs. WDE ns 0.8246
CDE 与 WD * 0.0122
CDE vs. WDE ns 0.9306
WD vs. WDE ns 0.1508

表5：WD和运动对 避免男性D.模拟电击的影响。延迟和接收冲击的数据作为均值表示±SEM.单因素方差分析与Tukey的多重比较检验。缩写：CD-控制饮食，CDE-控制饮食与运动，WD-西方饮食，WDE-西方饮食与运动。

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Discussion

避免威胁性刺激是各种物种从优雅到人类的适应性行为的关键特征32。回避学习程序通常需要逃避厌恶事件，是自1970年代以来常用的行为任务，用于研究实验室啮齿动物的学习和记忆过程133。在主动回避程序中，冷漠的刺激或条件信号（CS）之后是厌恶事件或无条件信号（US），动物通过执行特定的行为任务来学习避免。在被动回避程序中，动物需要通过将先前受到惩罚的行为与特定的环境背景相关联来避免厌恶的美国33。更长的保留测试潜伏期表明更好的记忆力表明动物对训练经验进行了详细的表示13。被动回避训练包括一次试验;然而，获取这项任务的大脑机制是复杂的，因为动物学会将各种信息联系起来，包括环境，空间位置和厌恶刺激13。改变这些刺激可以研究记忆的情节和上下文类型13。

这里描述的范式采用啮齿动物的被动回避行为作为成年苍蝇的模型系统。虽然已经开发了几种程序来研究苍蝇的学习和记忆，包括嗅觉7，8，visual9和求偶条件10，但这些测定相当耗时，需要复杂的设置。这里描述的协议是一种简单的行为测定，用于研究果蝇中的关联厌恶学习，包括1分钟的试验，并且可以使用一些可用的耗材轻松设置。该协议可能允许对环境线索进行额外的操纵，通过添加嗅觉，视觉和其他上下文刺激，通过改变下部隔室的颜色或几何图案或将嗅觉线索添加到上腔的盖子中。此外，该测定可以很容易地用于研究短期记忆，中期记忆和麻醉抵抗记忆，方法是操纵试验之间的间隔和使苍蝇接受麻醉。

该测定在 D. melanogaster 和 D.模拟 雄性和雌性苍蝇中同样有效，表明该范式可以适应不同的 D. 物种。在第二次试验中，以潜伏期增加和冲击次数减少为特征的苍蝇行为变化具有统计学意义，并且在随后的试验中会加强。有趣的是，如果天真的苍蝇习惯于在没有电击的情况下使用这种装置，那么在第二次和第三次试验中，它们会更快地进入上层隔间。然而，延迟的减少在统计学上并不显著（数据未显示）。两性之间没有观察到统计学上的显着差异，尽管雌性苍蝇的潜伏期稍长，受到的冲击略多。这种差异可能是由于多种因素的综合作用，包括雌性未能将休克与上部隔室联系起来，地理压力更强，或者可能是因为雌性比雄性略大和慢。在雌性苍蝇的第二次和第三次试验中，梳理发作的总持续时间显着降低，这与 D. 和啮齿动物焦虑样行为相似26。

有趣的是，如图 3E 和 图4E所示，第三次试验中的延迟分为两个极端（小于30秒和60秒）。然而，在第4次 试验中没有观察到这些差异，这表明大多数苍蝇最终获得了任务（图2E）。虽然在发展被动回避任务时个体差异的确切原因尚不清楚，但自然群体可能包含影响学习和记忆的多态性和突变3，5，34，35。最近的一项研究表明，编码cGMP依赖性蛋白激酶（PKG）的 觅食 （for）位点的多态性可能介导学习觅食行为的替代策略34。具有"漫游者"等位基因和较高活性的苍蝇具有更好的短期记忆，而具有"坐者"等位基因和久坐行为的苍蝇表现出更好的长期记忆34。

该测定显示，WD显着损害了苍蝇的学习和记忆，这在第二次试验中通过较短的潜伏期和接受更多的冲击来证明。在WD之后的第一次试验中，电击次数的增加可能表明短期记忆缺陷以及未能在特定环境环境和电击之间建立联系。有趣的是，飞行演习部分减轻了WD的负面影响，因为WDE苍蝇在第二次试验中受到的冲击明显减少。这表明飞行运动可以逆转代谢超负荷的影响，提高认知能力。这些数据得到了我们之前对飞行运动对飞行生理、繁殖和行为有益影响的观察31的支持。

所描述的方案中的关键步骤之一是将苍蝇从单个小瓶转移到下腔室。受压的苍蝇要么太快进入上层隔间，要么根本不会进入。在第一次试验中没有进入上部隔间的苍蝇在被转移回单个小瓶并给予5分钟的休息时间后仍然可以进入上部隔室。但是，最好将这些苍蝇排除在实验之外。苍蝇年龄是另一个关键因素，因为在30天大的苍蝇中，负地理出租车明显减弱（数据未显示）。因此，在第一次试验中，更多的苍蝇不会进入上腔室，并将被排除在实验之外。

所描述的测定的优点是它是一个简单的行为任务，在 D. melanogaster 和 D. simulans 雄性和雌性苍蝇中产生可重复的数据。该测定可以帮助研究由各种遗传，药理和饮食操作引起的学习和记忆障碍的基本机制。此外，由于保留试验可以在初始训练后的不同时间进行，因此短期，中期和长期记忆可能会被单独询问。

这项单项试验任务也存在潜在的局限性，包括受试者间变异性和年龄差异（如上所述）。学习和记忆也可能受到各种因素的影响，包括学习时的行为状态，实验操作和对压力的反应36。由于美国被放置在带有铜网格的隔间中，因此有时很难评估动物的进入情况，除非将来可以安装光束和红外摄像机进行视频跟踪。

综上所述，这里介绍的测定是一种简单，可靠且可重复的程序，可以研究记忆机制。它可能会为详细分析果蝇的记忆巩固开辟新的途径，包括基因 - 药物相互作用，无论是在记忆的上下文还是情节方面。

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Disclosures

作者声明没有利益冲突。

Acknowledgments

这项研究得到了NIH R15ES029673（AKM）的部分支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bloomington Formulation diet Nutri-Fly  66-112 Available from Genesee Scientific Inc., San Diego, CA
1000 µL Blue tip Fisher NC9546243
17 x 100 mm 14 mL polypropylene culture tube VWR  60818-689
Aduino-based Automatic Kontrol Module In-house AKM-007 This unit is optional. Complete description, schematics, wiring diagram and a code are provided at the ECU Digital Market - https://digitalmarket.ecu.edu/akmmodule
Dual-Display 2-Channel  Digital Clock/Timer Digi-Sense AO-94440-10 https://www.amazon.com/Cole-Parmer-AO-94440-10-Dual-Display-2-Channel-Jumbo-Digit/dp/B00PR0809G/ref=sr_1_5?dchild=1&keywords=Dual-Display+timer+jumbo&qid=1627660660&sr=
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Electronic Finger Counter N/A N/A https://www.amazon.com/gp/product/B01M8IRK6F/ref=ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8&psc=1
Fisherbrand Sparkleen 1 Detergent Fisher Scientific 04-320-4
Fly mouth aspirator In-house Prepared as described in reference 19.
Grass S88 stimulator N/A N/A Could be replaced with any stimulator which can provide described parameters
Kim-wipes Fisher Scientific 06-666 Kimberly-Clark Professional 34120
Metal block for fly immobilization In-house 4 x 13 x 23.5cm aluminum block
Nutiva USDA Certified Organic, non-GMO, Red Palm Oil Nutiva N/A https://www.amazon.com/Nutiva-Certified-Cold-Filtered-Unrefined-Ecuadorian/dp/B00JJ1E83G/ref=sxts_rp_s1_0?cv_ct_cx=Nutiva+USDA+Certified+Organic%2C+non-GMO%2C+Red+Palm+Oil&dchild=1&keywords=Nutiva+USDA+Certified+Organic%2C+non-GMO%2C+Red+Palm+Oil&pd_rd_i=B00JJ1E83G&pd_
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Shock tube CelExplorer TMA-201 https://www.celexplorer.com/product_detail.asp?id=217&MainType=110&SubType=8
Stopwatch Accusplit A601XLN https://www.amazon.com/gp/product/B0007ZGZYI/ref=ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8&psc=1
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Tags

行为，问题176，被动回避，厌恶学习，联想学习，记忆， 果蝇，西方饮食，飞行锻炼

Erratum

Formal Correction: Erratum: Drosophila Passive Avoidance Behavior as a New Paradigm to Study Associative Aversive Learning
Posted by JoVE Editors on 02/23/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Drosophila Passive Avoidance Behavior as a New Paradigm to Study Associative Aversive Learning. The Representative Results and Discussion sections were updated.

In the Representative Results, the legend for Figure 5 was updated from:

Figure 5: Comparison of passive avoidance and grooming behavior in D. simulans males and females. (A) Average latency (s) per trial. The graph shows no statistically significant differences between males and females in the latencies. (B) An average number of received shocks per trial. The graph shows no statistically significant differences between males and females in the number of received shocks. (C) The total duration of grooming bouts in trials 1-3. While there were no statistically significant differences between males and females, the female flies showed a considerable increase in grooming behavior during trials 2 and 3 compared to trial 1. Abbreviations: *- P<0.05. One-way ANOVA with Tukey's multiple comparisons test.

to:

Figure 5: Comparison of passive avoidance and grooming behavior in D. simulans males and females. (A) Average latency (s) per trial. The graph shows no statistically significant differences between males and females in the latencies. (B) An average number of received shocks per trial. The graph shows no statistically significant differences between males and females in the number of received shocks. (C) The total duration of grooming bouts in trials 1-3. While there were no statistically significant differences between males and females, the female flies showed a considerable decrease in grooming behavior during trials 2 and 3 compared to trial 1. Abbreviations: *- P<0.05. One-way ANOVA with Tukey's multiple comparisons test.

In the Discussion, the third paragraph was updated from:

The assay worked equally well in D. melanogaster and D. simulans male and female flies, demonstrating that the paradigm could be adapted to different D. species. The changes in fly behavior characterized by increased latencies and decreased number of shocks were statistically significant in the second trial and would strengthen with subsequent trials. Interestingly, if naïve flies were habituated to the apparatus without electric shock, they would enter the upper compartment a little faster on the second and the third trials. However, the decrease in latencies was not statistically significant (data not shown). No statistically significant differences were observed between sexes, although female flies had somewhat longer latencies and received slightly more shocks. This difference could be due to a combination of factors, including females' failure to associate the shock with the upper compartment, a stronger geotaxis, or possibly because females are slightly larger and slower than males. The total duration of grooming bouts was significantly higher in the second and third trials in female flies, which draws a parallel between D. and rodent anxiety-like behaviors26.

to:

The assay worked equally well in D. melanogaster and D. simulans male and female flies, demonstrating that the paradigm could be adapted to different D. species. The changes in fly behavior characterized by increased latencies and decreased number of shocks were statistically significant in the second trial and would strengthen with subsequent trials. Interestingly, if naïve flies were habituated to the apparatus without electric shock, they would enter the upper compartment a little faster on the second and the third trials. However, the decrease in latencies was not statistically significant (data not shown). No statistically significant differences were observed between sexes, although female flies had somewhat longer latencies and received slightly more shocks. This difference could be due to a combination of factors, including females' failure to associate the shock with the upper compartment, a stronger geotaxis, or possibly because females are slightly larger and slower than males. The total duration of grooming bouts was significantly lower in the second and third trials in female flies, which draws a parallel between D. and rodent anxiety-like behaviors26.

<em>果蝇</em> 被动回避行为作为研究联想性厌恶学习的新范式
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Pak, E. S., Murashov, A. K.… More

Pak, E. S., Murashov, A. K. Drosophila Passive Avoidance Behavior as a New Paradigm to Study Associative Aversive Learning. J. Vis. Exp. (176), e63163, doi:10.3791/63163 (2021).

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