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Summary
이 작품은 성인 과일 파리에서 역경 연관 학습의 분석을 허용하는 간단한 행동 패러다임을 설명합니다. 이 방법은 특정 환경 적 맥락과 감전 사이에 형성된 협회로 인해 타고난 음극식 행동을 억제하는 데 기반을 두고 있습니다.
Abstract
이 프로토콜은 성인 파리의 회선 적 연관 학습을 분석하기위한 새로운 패러다임을 설명합니다 (Drosophila melanogaster). 패러다임은 동물이 이전에 감전을 받은 구획을 피하는 법을 배우는 실험실 설치류의 수동 회피 행동과 유사합니다. 분석법은 파리의 부정적인 지질세를 이용하며, 이는 수직 표면에 배치될 때 올라가려는 충동으로 나타납니다. 설정은 수직 지향 상부 및 하부 구획으로 구성됩니다. 첫 번째 시험에서 비행은 보통 3-15 s 이내에 나가는 낮은 구획에 배치되고 전기 충격을 받는 상부 구획으로 단계입니다. 두 번째 시험 동안, 24 시간 후, 대기 시간이 크게 증가한다. 동시에, 충격의 수는 상부 구획에 관하여 연장 기억을 형성했다는 것을 나타내는 첫번째 예심에 비해 감소됩니다. 집계 카운터와 스톱워치 또는 Arduino 기반의 간단한 장치로 대기 시간 및 충격 횟수를 기록할 수 있습니다. 분석법을 어떻게 사용할 수 있는지 설명하기 위해 , D. 멜라노가스터 와 D. 시뮬란스의 수동 회피 행동은 여기에서 특징지어졌습니다. 늦은 시간과 충격의 수를 비교하는 것은 D. 멜라노가스터 와 D. 시뮬란 모두 수동 회피 행동을 효율적으로 배운 것으로 나타났습니다. 남성과 여성 파리 사이에 통계적 차이가 관찰되지 않았습니다. 그러나, 남성은 첫 번째 재판에 상부 구획을 입력 하는 동안 조금 더 빨랐다, 여성 모든 보존 재판에서 충격의 약간 높은 수를 받은 동안. 서양 식단 (WD)은 비행 운동이이 효과를 균형 조정하는 동안 남성 파리의 학습과 기억을 크게 손상시켰습니다. 함께 촬영, 파리의 수동 회피 행동은 학습과 기억의 기본 메커니즘을 공부하는 데 사용할 수있는 간단하고 재현 가능한 분석법을 제공합니다.
Introduction
학습과 기억은 드로소필라(D.)에서 인간1에 이르는 환경에 대한 진화적으로 고대의 적응 메커니즘입니다. 과일 비행은 본질적인 분자 기계장치를 해부하기 위하여 강력한 유전 공구의 넓은 범위를 제공하기 때문에 학습과 기억의 근본적인 원리를 공부하는 강력한 모형 유기체입니다2. rutabaga3, 기억 상실4 및 기억에 중요한 dunce5 유전자를 확인한 선구적인 유전자 선별 연구는 과일 파리가 음식, 잠재적 인 동료를 찾고 육식 동물을 피하기 위해 예리한 냄새 감각에 의존함에 따라 후각 컨디셔닝을 이용했습니다.
후각 컨디셔닝은 툴리와 퀸7,8에 의해 후각 T-미로의 도입 덕분에 학습과 기억의 메커니즘을 연구하는 인기있는 패러다임이되었다. 그 후, 시각적 컨디셔닝9, 구애 컨디셔닝10, 역경 광탁 억제 분석 분석11, 말살 노출 컨디셔닝 등 다양한 유형의 학습 및 메모리를 측정하는 다른 방법이 제안되었습니다. 그러나 이러한 애서의 대부분은 대학 워크샵에서 사용자 정의 구축하거나 공급 업체를 통해 구입해야하는 복잡한 설정이 있습니다. 여기에 설명된 패러다임은 몇 가지 사용 가능한 소모품으로 쉽게 조립할 수 있는 파리의 역경 적 연관 학습을 연구하는 간단한 행동 적 분석법을 기반으로합니다.
설명된 패러다임은 동물이 이전에 전기 발 shock13을 받은 구획을 피하는 법을 배우는 실험실 마우스 및 쥐의 수동 (또는 억제) 회피 행동과 동일합니다. murids에서, 절차는 밝은 빛의 타고난 회피와 어두운 영역에 대한 선호에 기초한다14. 첫 번째 시험에서 동물은 동물이 빠르게 빠져 나가는 밝은 구획에 배치되어 전기 발 충격이 전달되는 어두운 칸으로 들어갑니다. 일반적으로 단일 평가판은 고체 장기 메모리를 형성하기에 충분하므로 대기 시간이 24시간 후에 크게 증가합니다. 대기 시간은 다음 역경 자극과 특정 환경 사이의 연관성을 기억하는 동물의 능력의 인덱스로 사용된다15.
이 작품은 비용 효율성, 더 큰 샘플 크기, 규제 감독의 부재 및 강력한 유전 도구에 대한 액세스를 포함하여 설치류 모델에 비해 몇 가지 이점을 제공하는 모델 시스템으로 D.를 사용하는 유사한 절차를 설명합니다16,17. 절차는 부정적인 지질 택시 행동을 기반으로, 이는 그들이 수직 표면에 배치 될 때 상승 파리의 충동에 명시18. 설정은 두 개의 수직 챔버로 구성됩니다. 첫 번째 시험에서는 과일 파리를 하부 구획에 배치합니다. 거기에서, 그것은 일반적으로 3-15 s 이내에 종료, 그것은 감전을 수신 하는 상부 구획에 스테핑. 1분 시험 중에 일부 파리는 때때로 상부 구획에 다시 들어갈 수 있으며, 이로 인해 추가적인 감전이 발생할 수 있습니다. 테스트 단계 동안, 24 시간 후, 대기 시간이 크게 증가된다. 동시에, 충격의 수는 파리가 상부 구획에 대한 역경 연관 메모리를 형성것을 나타내는 첫날에 비해 감소된다. 대기 시간, 충격 수 및 그루밍 시합의 지속 시간 및 빈도는 동물 행동과 역경 자극과 특정 환경 사이의 연관성을 형성하고 기억하는 능력을 분석하는 데 사용됩니다. 대표적인 결과는 서양 규정식 (WD)에 노출이 크게 수컷 파리의 수동 회피 행동을 손상한다는 것을 보여줍니다, WD가 심오하게 비행의 행동과 인식에 영향을 미친다는 것을 건의합니다. 반대로, 비행 운동은 WD의 부정적인 효과를 완화하여 수동 회피 행동을 개선했습니다.
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Protocol
1. 수동 회피 장치의 준비
- 14mL 폴리프로필렌 배양튜브의 벽면에 수직으로 4mm 구멍을 뚫고 튜브 바닥에서 8mm 떨어진 곳에 드릴한다.
참고: 최상의 결과를 위해 전기 드릴과 5/32 드릴 비트를 사용합니다. - 강철 유틸리티 나이프를 사용하여 14mL 폴리프로필렌 배양 튜브의 상부를 잘라 45mm 길이의 튜브 바닥 조각을 생성합니다. 아래쪽 조각은 하부 구획역할을 합니다.
- 단일 가장자리 면도날을 사용하여 1,000 μL 블루 파이펫 팁의 끝을 잘라 하나의 비행의 통과를 위해 충분히 넓은 개방을 합니다. 파란색 팁의 좁히는 부분을 잘라 12mm 조각을 만듭니다. 이 조각을 하부 구획의 4mm 구멍에 단단히 삽입합니다. 이 는 파리 전송을 위한 로딩 도크로 사용됩니다.
- 투명 비닐 튜브 5/8" ID( 재료 표 참조)의 15mm 조각을 잘라 커플링을 만듭니다. 상하 구획을 반대쪽 끝에서 커플링에 삽입하여 아래 칸을 상부 구획에 단단히 부착합니다.
- 2-갈래 조절 식 클램프를 사용하여 어셈블리를 수직 스탠드에 부착합니다. 상부 구획으로 충격 튜브와 수직으로 조립을 방향을 지정합니다.
- 충격 튜브 와이어를 전기 자극기( 재료 표 참조)에 연결하여 감전을 전달합니다. 훈련 기간은 1분입니다.
참고: 관찰을 용이하게 하기 위해 충격관 뒤에 백서를 배치하여 장치의 흰색 배경역할을 한다. 충격 구획 위에 75W와 동등한 부드러운 전구가 있는 램프를 놓습니다. 설정 앞에 조절 가능한 암 돋보기 램프를 놓습니다. 수동 회피 장치의 표현은 도 1에 도시된다.
2. 수동 회피 절차에 대한 파리의 준비
- 3-4일 된 D. 멜라노가스터 또는 D. 시뮬란스는 얼음-차가운 블록을 사용하여 비행하여 이전에 설명한 절차에 따라 실험(유리병 당 1플라이)을 하기 전에 24시간 동안 음식으로 개별 바이알로 이송합니다.
참고 : 여기에 설명 된 실험은 3-4 일 된 남성 대 비교했습니다. 암컷은 D. 멜라노가스터 와 디 시뮬란에서 날아간다. - 행동 실험 전에 모든 바이알을 코딩합니다. 이를 위해 각 그룹에 "A", "B", "C" 등과 같은 문자를 할당하고 각 그룹은 숫자를 비행합니다. 모든 데이터가 기록되고 분석된 후에만 이 코드를 표시합니다. 유전자형 또는 치료당 적어도 20파리를 사용하여 개별적인 변이에 대응하십시오.
참고: 실험 및 분석 "블라인드"를 수행하면 플라이 및 데이터 분석의 성능을 평가하는 데 편향을 제외할 수 있습니다.
3. 첫 번째 시험 수행
- 이전에 설명한 플라이 입 흡자(재료 표 참조)를 사용하여 개별 바이알에서 하중 도크를 통해 하부 구획으로 부드럽게 이송합니다. 공기를 빨아 입 흡입기로 부드럽게 한 비행을 빨아. 로딩 도크에 가볍게 불어 비행을 입금합니다.
참고: 잡기 및 적재 중에 동물을 강조하지 마십시오. - 비행이 하부 구획에 적재된 직후 1분 타이머와 스톱워치를 시작합니다.
참고: 스톱워치는 충격 수를 계산하기 위해 대기 시간 및 집계 카운터를 측정하는 데 사용됩니다. - 스톱워치를 눌러 플라이가 충격 튜브에 들어갈 때 모든 발을 격자에 배치하여 첫 번째 대기 시간을 기록합니다. 자극기를 켜서 즉석에서 감전을 전달합니다. 자극 매개 변수는 120 볼트, 1000 ms 지속 시간, 1 펄스 / s (PPS), 기차 기간 2000 ms입니다.
- 비행이 충격 튜브에 다시 들어가면 추가 충격을 전달합니다. 탈리 카운터 또는 Arduino 기반 카운터로 1분 간의 시험 에서 받은 충격 수를 기록 합니다(재료 표 참조). 아두이노 기반 카운터를 사용하는 경우 아래 단계를 따르십시오.
참고: 옵션 Arduino 기반 장치 AKM-007( 재료 표 참조)을 사용하여 장치의 해당 버튼을 누르고 해제하여 각 동물에 대한 시간, 대기 시간, 충격 수 및 그루밍 시합의 빈도 및 지속 시간을 측정할 수 있습니다. 장치의 단추는 대기 시간을 측정하고, 충격 수를 관리하고 기록하고, 그루밍 시합의 빈도와 지속 시간을 측정하도록 할당됩니다.- 3.2단계에서 시작 버튼을 누르고 3.3단계에서 충격 버튼을 누릅니다.
- 그루밍 시합의 지속 시간을 기록하려면 장치에서 그루밍 시합이 시작될 때 그루 밍 버튼을 누르고 그루밍 시합이 끝날 때이 버튼을 놓습니다.
참고 : 그루밍 시합은 1 분 시험 내내 측정되었습니다. 광범위한 그루밍은 동물 스트레스를 나타낼 수 있습니다21,22. Arduino 기반 장치는 모든 데이터를 CSV 파일로 메모리 카드에 저장합니다.
- 1분 시험이 끝나면 플라이를 개별 바이알로 부드럽게 옮기십시오. 대기 시간, 수신된 충격 수 및 동작의 주목할 만한 변경 사항을 적어 둡니다.
- 70% 에탄올로 하부 및 충격 구획을 청소하고, 보풀이 없는 청소 조직( 재료 표 참조)으로 닦고, 헤어드라이어로 건조시킵니다. 다음 비행으로 재판을 반복합니다.
- 행동 실험 후, 물과 무취 세제로 하부 구획을 청소하십시오. 낮은 구획과 충격 구획을 70% 에탄올로 닦고 밤새 공기 건조를 합니다.
4. 두 번째 시험 수행
- 상기(3단계) 24시간 후에 설명한 절차를 반복하여 두 번째 시험을 수행한다. 전날과 동일한 순서로 파리를 테스트합니다.
5. 결과 분석
- 실험 1 및 실험 용 실험 1 및 예심 2의 평균 대기 시간, 평균 충격 수 및 그루밍 시합 의 기간을 계산합니다. Tukey의 test23을 사용하여 후hoc 분석과 여러 비교를 위해 2그룹 비교 또는 ANOVA에 대한 학생 t-테스트를 수행합니다.
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Representative Results
수동적 회피는 D. 멜라노가스터 (캔톤-S)와 D에서 연구되었다. 시뮬란. 실험은 연속적인 시험 사이 수신된 충격의 대기 시간 및 수를 비교했습니다. 처음에, 실험은 3-4 일 오래된 남성 D. 멜라노가스터 파리로 수행되었다. 파리는 12h 의 밝은 어두운 주기, 70 % 습도 및 통제 된 인구 밀도하에서 24 °C에서 기후 조절 환경에서 표준 블루밍턴 제형 식단에서 유지되었습니다. 밀도는 모든 그룹에 대해 사육 조건을 일정하게 유지함으로써 제어되었다. 15명의 수컷과 15명의 암컷은 24°C에서 병에서 48시간, 습도 70%, 자손을 생성하는 12h 광주기로 사육하였다. 과일 비행에서 수동 회피 행동은 24 시간 간격 4 2 분 시험에서 연구되었다. 시련은 하루 중 동시에 수행되었다. 시험 중에 개별 바이알에서 비행이 부드럽게 흡인되어 적재 도크를 통해 하부 구획으로 옮겨졌습니다(그림 1). 실험은 D. 멜라노가스터 가 성공적으로 배우고 수동 회피 행동을 암기 할 수 있음을 밝혔다. 첫 번째 시험에서 순진한 비행은 평균 16 s (16.15±2.64) 이내에 상부 구획에 들어가고 종종 평균 2 충격 (2.18±0.19)을 받으면 다시 입력합니다. 연속 시험 중에 지연 시간이 크게 증가하면서 충격 횟수가 감소하여 파리가 상부 구획과 감전 사이의 연관성을 배웠습니다(표 1, 그림 2 A, B). 주파수 분포의 분석은 부정적인 지질택시가 강력한 동기 부여임을 보여주었습니다. 첫 번째 시험 에서 대부분의 순진한 파리는 5-15 s (빈 10, 그림 2C) 내의 상부 구획에 들어가 1-3 충격을받습니다 (그림 2D). 대조적으로, 대부분의 파리는 네 번째 시험에서 상부 구획에 들어가지 않으며 그에 상응하는 충격을받지 않습니다 (그림 2E, F).
수동 회피 분석이 다른 과일 비행 종에서 작동하는지 확인하기 위해, 실험은 위에서 설명 한 멜라노가스터 파리와 동일한 하우징 조건하에서 유지 D.simulans 남성과 여성 파리에서 반복되었다. 평가판 기간이 1분으로 단축되었습니다. 대기 시간에 대한 주파수 분포는 플라이가 첫 번째 시험에서 60 s 이내에 상부 구획에 들어가지 않으면 일반적으로 전혀 입력되지 않는 것으로 나타났습니다 (그림 3C). 전술한 실험이 단 하나의 시험조차도 비버협회를 형성하기에 충분하다는 것을 안정적으로 입증함에 따라 시험 횟수가 3개로 감소하였다. D. simulans 남성과 여성은 그래프와 테이블의 데이터에서 알 수 있듯이 수동 회피 행동을 배우는 데 모두 효과적이었다(그림 3, 그림 4; 표 2, 표 3).
남성과 여성 사이의 대기 시간 및 충격의 수를 비교하는 것은 어떤 통계적으로 유의한 차이를 밝히지 않았다 (그림 5 A, B). 그러나, 남성 파리는 첫 번째 재판에서 상부 구획에 조금 더 빨리 입력했다, 여성은 모든 재판에서 충격의 약간 높은 수를받은 동안 (그림 4A, B). 그 차이는 주파수 분포를 보여주는 그래프에서 특히 분명하게 드러났습니다(그림 4C-F). 세 번째 시험에서 대기 시간 분포는 대부분의 파리가 7.5-12.5 s (그림 4E) 내의 상부 구획에 들어갔다는 것을 나타냈다. 세 번째 시험에서 충격의 수에 대한 주파수 분포는 마지막 재판에서 평균 1-2 충격을 받은 여성 파리를 보여줍니다 (그림 4F).
그루밍 동작의 총 지속 시간도 시험 중에 기록되었습니다. 플라이 그루밍 동작은 날개, 머리 및 바디24를 휩쓸고 있는 앞다리와 뒷다리의 반복적인 조정 된 움직임으로 구성됩니다. 자동 그루밍이라고도 하는 셀프 그루밍은 이전에 flies24, 실험실 설치류 25 및 humans22의 행동 스트레스와 관련이 있습니다. 따라서 자기 그루밍 행동에 대한 연구는 불안 관련 행동에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다26. 수동 회피 시험 도중 그루밍 시합의 총 기간의 분석은 자기 손질이 시험 2와 3에서 여자 파리에서 현저하게 증가했다는 것을 밝혔습니다 (그림 5C, 표 4).
성장 증거는 고칼로리 WD와 장애인인지 성능 사이의 연관성을 시사27. 실험적으로, WD는 미토콘드리아 뇌 기능, 신경 발생, 시냅스 가소성에 악영향을 미칩니다28,29,30. 최근 연구에 따르면 WD는 트리글리세라이드를 증가시키고 D.의 수명을 단축하는 반면 비행 운동은 WD31의 해로운 효과의 균형을 맞추고 있습니다. WD와 비행 운동이 수동 회피 행동에 미치는 영향을 탐구하기 시작하기 위해 D. simulans 남성 파리는 이전에 설명한 프로토콜에 따라 5 일 WD, 비행 운동 또는 WD 및 비행 운동의 조합을 받았습니다. 15% 누티바 USDA 인증 유기농, 비GMO, 레드 팜 오일, 15% 수크로오스, 0.1M NaCl을 포함하는 WD는 다른 곳에서 출판된 바와 같이 제조되었다31. 비행 운동은 전기 모터에 부착 된 수평 플랫폼에 묶여 타이머에 의해 작동 1 갤런 투명 플라스틱 드럼에 보관 60 남성 파리의 그룹에 수행되었다. 운동은 이전에 출판 된 대로 5 일 동안 매일 7 시간 동안 수행되었다31. 5 일 간의 식이 요법과 운동 요법의 끝에서, 파리는 감기 마취하에 개별 유리병으로 분류되고 수동 회피 행동의 2개의 예심을 복종했습니다. 실험결과, WD는 시험 1회와 2회에서 받은 충격의 수를 증가시키고 2심에서 대기시간을 감소시키는 것으로 나타났으며, 이는 WD가 파리의 역경 연관 학습을 크게 손상시킨다는 것을 나타낸다(그림 6, 표 5). 또한 WD와 운동 조합을 가진 그룹에서 시험 2의 충격 의 수에 있는 하향 추세가 있었습니다, 운동이 열량 과부하의 충격을 완화할 수 있다는 것을 건의합니다.
그림 1: 수동 회피 분석서를 설명하는 회로도. 낮은 구획 치수는 길이 45mm, 외부 직경 17mm입니다. 상부 구획 치수는 길이 80mm, 외경 18mm입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: D. 멜라노가스터 남성의 수동 회피 행동. (A) 평가판당 평균 대기 시간(들). 그래프는 시험 횟수와 함께 대기 가 크게 증가한다는 것을 보여줍니다. 각 막대에 파리 수가 표시됩니다. (B) 재판당 평균 받은 충격 수입니다. 그래프는 시험 횟수와 함께 충격 횟수가 크게 감소한다는 것을 보여줍니다. (C) 첫 번째 시험에서 대기 시간 의 빈 내에서 파리의 수를 표시하는 주파수 분포. x축의 숫자는 빈 중심입니다. 쓰레기통은 간격(0-5s, 5-15s, 15-25 s 등)입니다. 그래프는 대부분의 파리가 5-15 s. (D) 주파수 분포 내에서 상부 구획에 들어가 첫 번째 시험에서 충격 의 빈 내에서 파리의 수를 표시한다는 것을 나타냅니다. x축의 숫자는 빈 중심입니다. 그래프는 대부분의 파리가 첫 번째 시험에서 1-3 충격을 받는다는 것을 나타냅니다. 첫 번째 시험에서 충격 구획에 들어가지 않은 파리는 거의 없었고 충격이 없었습니다. 그들은 후속 재판에서 제외되었다. (E) 네 번째 시험에서 대기 시간 의 빈 내에서 파리의 수를 표시하는 주파수 분포. 그래프는 대부분의 파리가 상부 구획에 들어가지 않음을 나타냅니다. (F) 네 번째 시험에서 충격의 빈 내에서 파리의 수를 표시하는 주파수 분포. 그래프는 대부분의 파리가 마지막 시험에서 0충격을 받는다는 것을 보여줍니다. 약어: ns-중요하지 않은, *-P<0.05, **-P<0.01, ***-P<0.001, ****-P<0.0001. 투키의 다중 비교 테스트를 통해 단방향 ANOVA. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: D. simulans 남성의 수동 회피 행동. (A) 평가판당 평균 대기 시간(들). 그래프는 시험 횟수와 함께 대기 가 크게 증가한다는 것을 보여줍니다. (B) 재판당 평균 받은 충격 수입니다. 그래프는 시험 횟수와 함께 충격 횟수가 크게 감소한다는 것을 보여줍니다. (C) 첫 번째 시험에서 대기 시간 의 빈 내에서 파리의 수를 표시하는 주파수 분포. 그래프는 대부분의 파리가 2.5-12.5 s 이내에 상부 구획으로 들어가는 것을 나타냅니다. x축의 숫자는 빈 중심입니다. (D) 첫 번째 시험에서 충격의 빈 내에서 파리의 수를 표시하는 주파수 분포. 그래프는 대부분의 파리가 첫 번째 시험에서 1-3 충격을 받는다는 것을 나타냅니다. (E) 세 번째 시험에서 대기 시간 의 빈 내에서 파리의 수를 표시하는 주파수 분포. 그래프는 대부분의 파리가 상부 구획에 들어가지 않음을 나타냅니다. (F) 세 번째 시험에서 충격의 빈 내에서 파리의 수를 표시하는 주파수 분포. 그래프는 대부분의 파리가 마지막 시험에서 0충격을 받는다는 것을 보여줍니다. 약어: *- P<0.05, ****- P<0.0001. 투키의 다중 비교 테스트를 통해 단방향 ANOVA. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: D. 시뮬란여성의 수동 회피 행동. (A) 평가판당 평균 대기 시간(들). 그래프는 시험 횟수와 함께 대기 가 크게 증가한다는 것을 보여줍니다. (B) 재판당 평균 받은 충격 수입니다. 그래프는 시험 횟수와 함께 충격 횟수가 크게 감소한다는 것을 보여줍니다. (C) 첫 번째 시험에서 대기 시간 의 빈 내에서 파리의 수를 표시하는 주파수 분포. 그래프는 대부분의 파리가 2.5-12.5 s 이내에 상부 구획으로 들어가는 것을 나타냅니다. x축의 숫자는 빈 중심입니다. (D) 첫 번째 시험에서 충격의 빈 내에서 파리의 수를 표시하는 주파수 분포. 그래프는 대부분의 파리가 첫 번째 시험에서 2개의 충격을 받는다는 것을 나타냅니다. (E) 세 번째 시험에서 대기 시간 의 빈 내에서 파리의 수를 표시하는 주파수 분포. 그래프는 대부분의 파리가 7.5-12.5(F) 주파수 분포 내에서 상부 구획에 들어가 세 번째 시험에서 충격 의 빈 내에서 파리수를 표시한다는 것을 나타냅니다. 그래프는 대부분의 여성 파리가 마지막 재판에서 1-2 충격을 받았다는 것을 보여줍니다. 약어: **- P<0.01, ***-P<0.001, ****- P<0.0001. 투키의 다중 비교 테스트를 통해 단방향 ANOVA. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: D. simulans 남성과 여성의 수동 회피 및 그루밍 행동의 비교. (A) 평가판당 평균 대기 시간(들). 그래프는 늦은 때 남성과 여성 사이의 통계적으로 유의한 차이를 보여줍니다. (B) 재판당 평균 받은 충격 수입니다. 그래프는 수신된 충격의 수에 있는 남성과 여성 사이 통계적으로 유의한 다름을 보여주지 않습니다. (C) 시험 1-3에서 그루밍 시합의 총 기간. 남성과 여성 사이에 통계적으로 유의한 차이는 없었지만, 여성 파리는 시험 1에 비해 시험 2와 3 동안 그루밍 행동에 상당한 감소를 보였다. 약어: *- P<0.05. 투키의 다중 비교 테스트를 통해 단방향 ANOVA. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: D. simulans 남성의 수동 회피 행동에 대한 WD의 효과. (A) 평가판당 평균 대기 시간(들). 그래프는 WD와 WDE 그룹의 대기 시간이 크게 증가함을 보여줍니다. (B) 재판당 평균 받은 충격 수입니다. 그래프는 시험 1과 2에서 WD에 파리에 의해 수신된 충격의 수에 있는 통계적으로 유의한 증가를 보여줍니다. 흥미롭게도, 비행 운동은 학생 t-시험에 따라 WD의 효과를 크게 부정했습니다. 약어: CD-제어 다이어트, 운동을 가진 CDE-제어 다이어트, WD-서양 다이어트, WDE-서부 다이어트 운동. *- P<0.05, **- P<0.01. 투키의 다중 비교 테스트를 통해 단방향 ANOVA. #- P<0.05, 학생 t 테스트. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 재판 | 평가판 1 | 평가판 2 | 평가판 3 | 평가판 4 |
| 대기 시간(들) | 16.15±2.64 | 49.08±6.2 | 64.72±6.8 | 102.1±12.1 |
| 충격 | 2.18±0.19 | 1.41±0.29 | 0.76±0.25 | 0.33±0.22 |
| 평가판 간의 대기 시간 Tukey의 여러 비교 | 요약 | 조정된 P 값 | ||
| 1 대 2 | **** | <0.0001 | ||
| 1 대 3 | **** | <0.0001 | ||
| 1 대 4 | **** | <0.0001 | ||
| 2 대 3 | ns | 0.2043 | ||
| 2 대 4 | **** | <0.0001 | ||
| 3 대 4 | ** | 0.0099 | ||
| 투키가 시련을 여러 번 비교한 충격에 휩년대 | 요약 | 조정된 P 값 | ||
| 1 대 2 | ns | 0.0646 | ||
| 1 대 3 | *** | 0.0004 | ||
| 1 대 4 | **** | <0.0001 | ||
| 2 대 3 | ns | 0.2569 | ||
| 2 대 4 | * | 0.0253 | ||
| 3 대 4 | ns | 0.694 | ||
표 1: D. 멜라노가스터 남성의 감전 방지에 대한 훈련효과. 대기 시간 및 수신 된 충격에 대한 데이터는 Tukey의 여러 비교 테스트를 통해 SEM. 편도 ANOVA를 ± 수단으로 제시됩니다.
| 재판 | 평가판 1 | 평가판 2 | 평가판 3 |
| 대기 시간(들) | 10.16±0.78 | 22.64±2.1 | 30.63±2.69 |
| 충격 | 2.36±0.13 | 1.84±0.17 | 1.24±0.14 |
| 평가판 간의 대기 시간 Tukey의 여러 비교 | 요약 | 조정된 P 값 | |
| 1 대 2 | **** | <0.0001 | |
| 1 대 3 | **** | <0.0001 | |
| 2 대 3 | * | 0.0229 | |
| 투키가 시련을 여러 번 비교한 충격에 휩년대 | 요약 | 조정된 P 값 | |
| 1 대 2 | * | 0.0166 | |
| 1 대 3 | **** | <0.0001 | |
| 2 대 3 | * | 0.0172 | |
표 2: D. simulans 남성의 감전 방지에 대한 교육의 효과. 대기 시간 및 수신 된 충격에 대한 데이터는 Tukey의 여러 비교 테스트를 통해 SEM. 편도 ANOVA를 ± 수단으로 제시됩니다.
| 재판 | 평가판 1 | 평가판 2 | 평가판 3 |
| 대기 시간(들) | 12.07±0.89 | 20.98±2.63 | 23.20±2.16 |
| 충격 | 2.65±0.12 | 1.98±0.12 | 1.49±0.11 |
| 평가판 간의 대기 시간 Tukey의 여러 비교 | 요약 | 조정된 P 값 | |
| 1 대 2 | ** | 0.0023 | |
| 1 대 3 | **** | <0.0001 | |
| 2 대 3 | ** | 0.0028 | |
| 투키가 시련을 여러 번 비교한 충격에 휩년대 | 요약 | 조정된 P 값 | |
| 1 대 2 | **** | <0.0001 | |
| 1 대 3 | **** | <0.0001 | |
| 2 대 3 | *** | 0.0003 | |
표 3: D. 시뮬란스 여성의 감전 방지에 대한 교육의 효과 . 대기 시간 및 수신 된 충격에 대한 데이터는 Tukey의 여러 비교 테스트를 통해 SEM. 편도 ANOVA를 ± 수단으로 제시됩니다.
| 재판 | 평가판 1 | 평가판 2 | 평가판 3 |
| 남성 그루밍 (들) | 14.42±1.02 | 18.47±2.82 | 18.23±2.75 |
| 여성의 그루밍 (들) | 9.15±1.39 | 14.03±2.26 | 15.50±2.38 |
| 투키의 시험 남성 사이의 여러 비교 | 요약 | 조정된 P 값 | |
| 1 대 2 | ns | 0.4384 | |
| 1 대 3 | ns | 0.4873 | |
| 2 대 3 | ns | 0.9971 | |
| 투키의 임상 시험 여성 사이의 여러 비교 | 요약 | 조정된 P 값 | |
| 1 대 2 | * | 0.0299 | |
| 1 대 3 | * | 0.0426 | |
| 2 대 3 | ns | 0.8481 | |
표 4: D. 시뮬란스 그루밍 동작 에 수동 회피의 효과. 데이터는 Tukey의 여러 비교 테스트를 통해 SEM. 편도 ANOVA를 ± 수단으로 제시됩니다.
| 대기 시간이 | 평가판 1 | 평가판 2 |
| 시디 | 16.26±2.28 | 45.85±4.09 |
| CDE | 15.28±2.75 | 33.59±5.19 |
| 백색 왜성 | 13.49±1.58 | 28.33±3.7 |
| WDE | 13.00±1.95 | 30.23±3.79 |
| 대기 시간 Tukey의 그룹 평가판 1 간의 여러 비교 | 요약 | 조정된 P 값 |
| CD vs. CDE | ns | 0.9916 |
| CD vs. WD | ns | 0.7369 |
| CD vs. WDE | ns | 0.6475 |
| CDE vs. WD | ns | 0.9523 |
| CDE vs. WDE | ns | 0.9122 |
| WD vs. WDE | ns | 0.9981 |
| 대기 시간 Tukey의 그룹 평가판 2 간의 여러 비교 | 요약 | 조정된 P 값 |
| CD vs. CDE | ns | 0.2785 |
| CD vs. WD | ** | 0.0082 |
| CD vs. WDE | * | 0.0283 |
| CDE vs. WD | ns | 0.8578 |
| CDE vs. WDE | ns | 0.9594 |
| WD vs. WDE | ns | 0.9844 |
| 충격 | 평가판 1 | 평가판 2 |
| 시디 | 1.95±0.21 | 0.94±0.4 |
| CDE | 2.0±0.28 | 1.0±0.23 |
| 백색 왜성 | 3.05±0.26 | 2.36±0.41 |
| WDE | 2.49±0.24 | 1.36±0.23 |
| 쇼크 투키의 그룹 평가판 1 사이의 여러 비교 | 요약 | 조정된 P 값 |
| CD vs. CDE | ns | 0.9992 |
| CD vs. WD | ** | 0.005 |
| CD vs. WDE | ns | 0.3765 |
| CDE vs. WD | ns | 0.0523 |
| CDE vs. WDE | ns | 0.6446 |
| WD vs. WDE | ns | 0.3268 |
| 쇼크 투키의 그룹 평가판 2 사이의 여러 비교 | 요약 | 조정된 P 값 |
| CD vs. CDE | ns | 0.9996 |
| CD vs. WD | * | 0.0194 |
| CD vs. WDE | ns | 0.8246 |
| CDE vs. WD | * | 0.0122 |
| CDE vs. WDE | ns | 0.9306 |
| WD vs. WDE | ns | 0.1508 |
표 5: D. simulans 남성의 감전 방지에 대한 WD 및 운동의 효과. 대기 시간 및 수신 된 충격에 대한 데이터는 Tukey의 여러 비교 테스트를 통해 SEM. 편도 ANOVA를 ± 수단으로 제시됩니다. 약어: CD-제어 다이어트, 운동을 가진 CDE-제어 다이어트, WD-서양 다이어트, WDE-서부 다이어트 운동.
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Discussion
위협적인 자극의 회피는 C. 우아함 에서 인간32에 이르기까지 다양한 종의 적응 행동의 중요한 특성입니다. 일반적으로 역경 이벤트의 탈출을 수반 회피 학습 절차는 일반적으로 1970 년대 이후 실험실 설치류13 에서 학습 및 메모리 프로세스를 조사하기 위해 동작 작업을 사용한다32. 활성 회피 절차에서, 무관심 자극 또는 조건된 신호 (CS)는 동물이 특정 행동 작업을 수행하여 피하는 법을 배우는 역경 이벤트 또는 무조건 신호 (미국)가 뒤따릅니다. 수동 회피 절차에서 동물은 이전에 처벌 된 행동을 특정 환경 컨텍스트33과 연결하여 역경을 피해야합니다. 더 나은 메모리를 나타내는 더 긴 보존 테스트 대기 시간 제안 동물 훈련 경험의 자세한 표현을 개발 13. 수동 회피 교육은 단일 시험으로 구성됩니다. 그러나, 동물이 환경, 공간 위치, 그리고 역경 자극13을 포함하여 정보의 다양한 조각을 연결하는 법을 배워야으로이 작업의 인수의 기초 뇌 메커니즘은 복잡하다. 이러한 자극을 변경하면 에피소드및 문맥 유형의 메모리13을 공부할 수 있습니다.
여기에 설명된 패러다임은 성인 플라이에 대한 설치류의 수동 회피 행동을 모델 시스템으로 채택했습니다. 후각7,8, visual9 및 구애 컨디셔닝10을 포함하여 파리의 학습과 기억을 연구하기 위해 여러 가지 절차가 개발되었지만,이 애법은 다소 시간이 많이 걸리며 복잡한 설정이 필요합니다. 여기에 설명된 프로토콜은 1분 시험으로 구성되며 사용 가능한 몇 가지 소모품으로 쉽게 설정할 수 있는 파리의 연관 적 역경 학습을 연구하는 간단한 행동 분석입니다. 이 프로토콜은 잠재적으로 후각, 시각 및 기타 상황성 자극을 추가하여 낮은 구획의 색상 이나 기하학적 패턴을 변경하거나 상부 챔버의 캡에 후각 큐를 추가하여 환경 단서를 추가 할 수 있습니다. 또한, 이 분석법은 시험과 마취에 파리를 복종하는 사이 간격을 조작하여 단기 기억, 중간 기간 기억 및 마취 저항하는 기억을 공부하기 위하여 쉽게 적응될 수 있습니다.
분석은 D. 멜라노가스터 와 D. 시뮬란스 남성과 여성 파리에서 똑같이 잘 작동하여 패러다임이 다른 D. 종에 적응할 수 있음을 보여줍니다. 증가 된 대기 시간 및 충격의 감소 수를 특징으로 하는 비행 행동의 변화는 두 번째 재판에서 통계적으로 유의하고 후속 시험으로 강화 될 것입니다. 흥미롭게도, 순진한 파리가 감전없이 장치에 습관화 된 경우, 그들은 두 번째와 세 번째 시험에서 조금 더 빨리 상부 구획에 들어갈 것입니다. 그러나, 대기 의 감소는 통계적으로 유의하지 않았다 (데이터는 표시되지 않음). 여성 파리는 다소 더 긴 대기 시간을 가지고 약간 더 충격을 받았지만, 남녀 사이에 통계적으로 유의한 차이는 관찰되지 않았다. 이 차이는 여성의 충격을 상부 구획, 더 강한 지질과 연관짓지 않거나 여성이 남성보다 약간 크고 느리기 때문에 요인의 조합때문일 수 있습니다. 그루밍 시합의 총 기간은 D. 와 설치류 불안 같이 행동 26 사이 평행을 그리는 여성 파리의 두 번째 및 세 번째 예심에서 현저하게 낮았습니다26.
흥미롭게도, 그림 3E 및 그림 4E에 도시된 바와 같이, 세 번째 시험의 대기는 두 개의 극단으로 분할되었다 (미만 30 s와 60 s). 그러나 이러한 차이는 4심에서 관찰되지 않았으며, 이는 파리의 대부분이 결국 작업을 인수했음을 나타내는 것이다(그림 2E). 수동 회피 작업 개발에 있는 개별적인 다름을 위한 정확한 이유는 불분명한 동안, 자연 인구는 학습및 기억에 영향을 미치는 다형성 과 돌연변이를 포함할 수 있습니다3,5,34,35. 최근 연구에 따르면 cGMP 의존성 단백질 키나아제(PKG)를 코딩하는 메뚜기(for) 메뚜기의 다형성은 행동을 위한 학습에 대한 대체 전략을 중재할 수 있음을 보여주었다34. "로버" 알렐과 더 높은 활동으로 파리는 단기 기억력이 더 뛰어나고, "시터" 골반과 앉아있는 행동으로 파리는 더 나은 장기 기억을 보여줍니다34.
분석 결과 WD는 파리의 학습과 기억을 크게 손상시켰으며, 이는 짧은 대기 시간및 두 번째 재판에서 더 많은 충격을 받는 것으로 나타났습니다. WD 이후 첫 번째 재판에서 더 많은 충격이 단기 메모리의 적자와 특정 환경 맥락과 감전 사이의 연관성을 만들지 못하는 것을 나타낼 수 있습니다. 흥미롭게도, 비행 훈련은 WDE 파리가 두 번째 시험에서 훨씬 적은 충격을 받았기 때문에 WD의 부정적인 영향을 부분적으로 완화시켰습니다. 이것은 비행 운동이 신진 대사 과부하의 충격을 반전하고 인지 성능을 향상시킬 수 있음을 시사한다. 이러한 데이터는 비행 생리학, 생식 및 행동에 비행 운동의 유익한 효과에 대한 이전의 관찰에 의해 지원됩니다31.
기술된 프로토콜의 중요한 단계 중 하나는 개별 바이알에서 하부 챔버로 파리를 전송하는 것입니다. 응력 파리는 너무 빨리 상부 구획에 들어가거나 전혀 들어가지 않습니다. 첫 번째 시험에서 상부 구획에 들어가지 않은 파리는 개별 바이알로 다시 옮겨져 5분 간 휴식을 취한 후에도 상부 구획에 들어갈 수 있었습니다. 그러나 실험에서 이러한 파리를 제외하는 것이 좋습니다. 비행 연령은 30일 된 파리(표시되지 않은 데이터)에서 부정적인 지질세가 현저히 약해지면서 또 다른 중요한 요소입니다. 따라서 더 많은 파리는 첫 번째 시험에서 상부 챔버에 들어가지 않을 것이고 실험에서 제외될 것입니다.
설명된 분석의 장점은 D. 멜라노가스터 와 D. 시뮬란 스 남성과 여성 파리 모두에서 재현 가능한 데이터를 생성하는 간단한 행동 작업이라는 것입니다. 분석은 각종 유전, 약리학 및 규정식 조작에서 유래된 기본적인 기계장치 기초 학습 및 기억 손상의 연구 결과 도움이 될 수 있었습니다. 더욱이, 보존 시험은 초기 훈련 후에 다른 시간에 수행될 수 있기 때문에, 단기, 중간 및 장기 기억은 잠재적으로 별도로 심문될 수 있었습니다.
또한 주제 간 변동성 및 연령 차이를 포함하여 이 1심 과제에 대한 잠재적 인 제한 (위에서 설명)이 있습니다. 학습과 기억은 또한 학습, 실험 조작 및 stress36에 대한 응답을 배우는 시의 행동 상태를 포함하여 다양한 요인에 의해 영향을 받을 수 있습니다. 미국은 구리 그리드가 있는 구획에 주어지기 때문에, 향후 비디오 추적을 위해 사진 빔과 적외선 카메라를 설치하지 않는 한 동물의 진입은 때때로 평가하기가 어렵습니다.
함께 촬영, 여기에 제시 된 분석은 메모리 메커니즘을 공부 할 수 있습니다 간단하고 신뢰할 수 있으며 재현 할 수있는 절차입니다. 그것은 잠재적으로 파리의 메모리 통합의 상세한 분석을 위한 새로운 길을 열 수 있습니다., 유전자 약물 상호 작용을 포함 하 여, 문맥과 에피소드 같은 측면 메모리의.
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Disclosures
저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 연구는 NIH R15ES029673 (AKM)에 의해 부분에서 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bloomington Formulation diet | Nutri-Fly | 66-112 | Available from Genesee Scientific Inc., San Diego, CA |
| 1000 µL Blue tip | Fisher | NC9546243 | |
| 17 x 100 mm 14 mL polypropylene culture tube | VWR | 60818-689 | |
| Aduino-based Automatic Kontrol Module | In-house | AKM-007 | This unit is optional. Complete description, schematics, wiring diagram and a code are provided at the ECU Digital Market - https://digitalmarket.ecu.edu/akmmodule |
| Dual-Display 2-Channel Digital Clock/Timer | Digi-Sense | AO-94440-10 | https://www.amazon.com/Cole-Parmer-AO-94440-10-Dual-Display-2-Channel-Jumbo-Digit/dp/B00PR0809G/ref=sr_1_5?dchild=1&keywords=Dual-Display+timer+jumbo&qid=1627660660&sr= 8-5#customerReviews |
| Electronic Finger Counter | N/A | N/A | https://www.amazon.com/gp/product/B01M8IRK6F/ref=ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8&psc=1 |
| Fisherbrand Sparkleen 1 Detergent | Fisher Scientific | 04-320-4 | |
| Fly mouth aspirator | In-house | Prepared as described in reference 19. | |
| Grass S88 stimulator | N/A | N/A | Could be replaced with any stimulator which can provide described parameters |
| Kim-wipes | Fisher Scientific | 06-666 | Kimberly-Clark Professional 34120 |
| Metal block for fly immobilization | In-house | 4 x 13 x 23.5cm aluminum block | |
| Nutiva USDA Certified Organic, non-GMO, Red Palm Oil | Nutiva | N/A | https://www.amazon.com/Nutiva-Certified-Cold-Filtered-Unrefined-Ecuadorian/dp/B00JJ1E83G/ref=sxts_rp_s1_0?cv_ct_cx=Nutiva+USDA+Certified+Organic%2C+non-GMO%2C+Red+Palm+Oil&dchild=1&keywords=Nutiva+USDA+Certified+Organic%2C+non-GMO%2C+Red+Palm+Oil&pd_rd_i=B00JJ1E83G&pd_ rd_r=f35e9d2f-afe4-44b6-afc2-1c9cd705be18&pd_rd_w= R3Zb4&pd_rd_wg=eUv1m&pf_rd_ p=c6bde456-f877-4246-800f-44405f638777&pf _rd_r=M94N11RC7NH333EMJ66Y &psc=1&qid=1627661533&sr=1-1-f0029781-b79b-4b60-9cb0-eeda4dea34d6 |
| Shock tube | CelExplorer | TMA-201 | https://www.celexplorer.com/product_detail.asp?id=217&MainType=110&SubType=8 |
| Stopwatch | Accusplit | A601XLN | https://www.amazon.com/gp/product/B0007ZGZYI/ref=ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8&psc=1 |
| Transparent vinyl tubing (3/4” OD, 5/8” ID) | Lowes | Avaiable from Lowes |
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행동 문제 176 수동 회피 역경 학습 연관 학습 기억 드로소필라 서양 식단 비행 운동Erratum
Formal Correction: Erratum: Drosophila Passive Avoidance Behavior as a New Paradigm to Study Associative Aversive Learning
Posted by JoVE Editors on 02/23/2022.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Drosophila Passive Avoidance Behavior as a New Paradigm to Study Associative Aversive Learning. The Representative Results and Discussion sections were updated.
In the Representative Results, the legend for Figure 5 was updated from:
Figure 5: Comparison of passive avoidance and grooming behavior in D. simulans males and females. (A) Average latency (s) per trial. The graph shows no statistically significant differences between males and females in the latencies. (B) An average number of received shocks per trial. The graph shows no statistically significant differences between males and females in the number of received shocks. (C) The total duration of grooming bouts in trials 1-3. While there were no statistically significant differences between males and females, the female flies showed a considerable increase in grooming behavior during trials 2 and 3 compared to trial 1. Abbreviations: *- P<0.05. One-way ANOVA with Tukey's multiple comparisons test.
to:
Figure 5: Comparison of passive avoidance and grooming behavior in D. simulans males and females. (A) Average latency (s) per trial. The graph shows no statistically significant differences between males and females in the latencies. (B) An average number of received shocks per trial. The graph shows no statistically significant differences between males and females in the number of received shocks. (C) The total duration of grooming bouts in trials 1-3. While there were no statistically significant differences between males and females, the female flies showed a considerable decrease in grooming behavior during trials 2 and 3 compared to trial 1. Abbreviations: *- P<0.05. One-way ANOVA with Tukey's multiple comparisons test.
In the Discussion, the third paragraph was updated from:
The assay worked equally well in D. melanogaster and D. simulans male and female flies, demonstrating that the paradigm could be adapted to different D. species. The changes in fly behavior characterized by increased latencies and decreased number of shocks were statistically significant in the second trial and would strengthen with subsequent trials. Interestingly, if naïve flies were habituated to the apparatus without electric shock, they would enter the upper compartment a little faster on the second and the third trials. However, the decrease in latencies was not statistically significant (data not shown). No statistically significant differences were observed between sexes, although female flies had somewhat longer latencies and received slightly more shocks. This difference could be due to a combination of factors, including females' failure to associate the shock with the upper compartment, a stronger geotaxis, or possibly because females are slightly larger and slower than males. The total duration of grooming bouts was significantly higher in the second and third trials in female flies, which draws a parallel between D. and rodent anxiety-like behaviors26.
to:
The assay worked equally well in D. melanogaster and D. simulans male and female flies, demonstrating that the paradigm could be adapted to different D. species. The changes in fly behavior characterized by increased latencies and decreased number of shocks were statistically significant in the second trial and would strengthen with subsequent trials. Interestingly, if naïve flies were habituated to the apparatus without electric shock, they would enter the upper compartment a little faster on the second and the third trials. However, the decrease in latencies was not statistically significant (data not shown). No statistically significant differences were observed between sexes, although female flies had somewhat longer latencies and received slightly more shocks. This difference could be due to a combination of factors, including females' failure to associate the shock with the upper compartment, a stronger geotaxis, or possibly because females are slightly larger and slower than males. The total duration of grooming bouts was significantly lower in the second and third trials in female flies, which draws a parallel between D. and rodent anxiety-like behaviors26.
