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Behavior

Drosofila Comportamento di evitamento passivo come nuovo paradigma per studiare l'apprendimento avversivo associativo

Published: October 15, 2021 doi: 10.3791/63163
Automatic Translation
1, 1
1Department of Physiology, East Carolina University

ERRATUM NOTICE

Summary

Questo lavoro descrive un semplice paradigma comportamentale che consente l'analisi dell'apprendimento associativo avversivo nei moscerini della frutta adulti. Il metodo si basa sulla soppressione del comportamento innato della geotaxi negativa a causa dell'associazione formata tra uno specifico contesto ambientale e una scossa elettrica.

Abstract

Questo protocollo descrive un nuovo paradigma per l'analisi dell'apprendimento associativo avversivo nelle mosche adulte (Drosophila melanogaster). Il paradigma è analogo al comportamento di evitamento passivo nei roditori di laboratorio in cui gli animali imparano a evitare un compartimento in cui hanno precedentemente ricevuto una scossa elettrica. Il test sfrutta la geotassi negativa nelle mosche, che si manifesta come un impulso a salire quando sono posizionate su una superficie verticale. La configurazione è costituita da scomparti superiori e inferiori orientati verticalmente. Nella prima prova, una mosca viene posizionata in un compartimento inferiore da dove di solito esce entro 3-15 s e entra nel compartimento superiore dove riceve una scossa elettrica. Durante la seconda prova, 24 ore dopo, la latenza è significativamente aumentata. Allo stesso tempo, il numero di shock è diminuito rispetto al primo studio, indicando che le mosche hanno formato una memoria a lungo termine sul compartimento superiore. Le registrazioni delle latenze e del numero di shock potrebbero essere eseguite con un contatore di conteggi e un cronometro o con un semplice dispositivo basato su Arduino. Per illustrare come il test può essere utilizzato, il comportamento passivo di evitamento di D. melanogaster e D. simulans maschio e femmina sono stati caratterizzati qui. Il confronto tra latenze e numero di shock ha rivelato che sia D. melanogaster che D. simulans vola in modo efficiente hanno imparato il comportamento di evitamento passivo. Non sono state osservate differenze statistiche tra mosche maschili e femminili. Tuttavia, i maschi erano un po 'più veloci mentre entravano nel compartimento superiore al primo studio, mentre le femmine ricevevano un numero leggermente più alto di shock in ogni prova di ritenzione. La dieta occidentale (WD) ha significativamente compromesso l'apprendimento e la memoria nelle mosche maschio durante l'esercizio di volo controbilanciato questo effetto. Nel complesso, il comportamento passivo di evitamento nelle mosche offre un test semplice e riproducibile che potrebbe essere utilizzato per studiare i meccanismi di base dell'apprendimento e della memoria.

Introduction

L'apprendimento e la memoria sono un meccanismo di adattamento evolutivamente antico all'ambiente, conservato dalla Drosophila (D.) all'uomo1. Il moscerino della frutta è un robusto organismo modello per studiare i principi fondamentali dell'apprendimento e della memoria in quanto offre una vasta gamma di potenti strumenti genetici per sezionare i meccanismi molecolari intrinseci2. I pionieristici studi di screening genetico, che hanno identificato i geni rutabaga3, amnesia4 e dunce5 fondamentali per l'apprendimento e la memoria2, hanno approfittato del condizionamento olfattivo poiché i moscerini della frutta si affidano al loro acuto senso dell'olfatto per trovare cibo, potenziali compagni ed evitare i predatori6.

Il condizionamento olfattivo è diventato un paradigma popolare per studiare il meccanismo dell'apprendimento e della memoria, grazie all'introduzione del labirinto a T olfattivo di Tully e Quinn7,8. Successivamente, sono stati proposti altri metodi per misurare vari tipi di apprendimento e memoria, tra cui il condizionamento visivo9, il condizionamento del corteggiamento10, il saggio di soppressione della fototassi avversiva11 e il condizionamento dell'esposizione alle vespe12. Tuttavia, la maggior parte di questi test ha una configurazione complessa che deve essere costruita su misura in un laboratorio universitario o acquistata tramite un fornitore. Il paradigma qui descritto si basa su un semplice test comportamentale per studiare l'apprendimento associativo avversivo nelle mosche che può essere facilmente assemblato con poche forniture disponibili.

Il paradigma descritto è equivalente al comportamento passivo (o inibitorio) di evitamento nei topi e nei ratti di laboratorio in cui gli animali imparano a evitare un compartimento in cui hanno precedentemente ricevuto scosse elettriche del piede13. Nei muridi, la procedura si basa sulla loro innata evitamento della luce intensa e sulla preferenza per le aree più scure14. Nella prima prova, l'animale viene collocato nel compartimento luminoso, da dove l'animale esce rapidamente, entrando in un compartimento buio, dove viene erogata una scossa elettrica del piede. Di solito, una singola prova è sufficiente per formare una solida memoria a lungo termine, con conseguente aumento significativo della latenza 24 ore dopo. La latenza viene quindi utilizzata come indice della capacità dell'animale di ricordare l'associazione tra lo stimolo avversivo e l'ambiente specifico15.

Questo lavoro descrive una procedura analoga che utilizza D. come sistema modello che offre diversi vantaggi rispetto ai modelli di roditori, tra cui l'economicità, dimensioni del campione più grandi, l'assenza di supervisione normativa e l'accesso a potenti strumenti genetici16,17. La procedura si basa sul comportamento negativo della geotaxi, che si manifesta nell'impulso delle mosche di arrampicarsi quando sono posizionate su una superficie verticale18. La configurazione è composta da due camere verticali. Nella prima prova, un moscerino della frutta viene posizionato in un compartimento inferiore. Da lì, di solito esce entro 3-15 s, entrando nel compartimento superiore dove riceve una scossa elettrica. Durante una prova di 1 minuto, alcune mosche possono occasionalmente rientrare nel compartimento superiore, il che si traduce in un'ulteriore scossa elettrica. Durante la fase di test, 24 ore dopo, la latenza è notevolmente aumentata. Allo stesso tempo, il numero di shock è diminuito rispetto al primo giorno indicando che le mosche hanno formato una memoria associativa avversa sul compartimento superiore. La latenza, il numero di shock e la durata e la frequenza degli attacchi di toelettatura vengono quindi utilizzati per analizzare il comportamento animale e la capacità di formare e ricordare l'associazione tra lo stimolo avversivo e l'ambiente specifico. I risultati rappresentativi rivelano che l'esposizione alla dieta occidentale (WD) compromette significativamente il comportamento di evitamento passivo nelle mosche maschili, suggerendo che il WD influisce profondamente sul comportamento e sulla cognizione della mosca. Al contrario, l'esercizio di volo ha alleviato l'effetto negativo del WD, migliorando il comportamento di evitamento passivo.

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Protocol

1. Preparazione di apparecchi passivi di evitamento

  1. Praticare un foro di 4 mm perpendicolare alla superficie della parete del tubo di coltura in polipropilene da 14 mL e a 8 mm di distanza dal fondo del tubo.
    NOTA: utilizzare un trapano elettrico e una punta da trapano 5/32 per ottenere i migliori risultati.
  2. Utilizzando un coltello da utilità in acciaio, tagliare la parte superiore del tubo di coltura in polipropilene da 14 ml per creare un frammento inferiore del tubo lungo 45 mm. Il frammento inferiore funge da compartimento inferiore.
  3. Tagliare la punta della punta della pipetta blu da 1.000 μL usando una lama di rasoio a bordo singolo per rendere l'apertura abbastanza ampia per un passaggio di una singola mosca. Tagliare la parte restringente della punta blu per creare un frammento di 12 mm. Inserire saldamente questo frammento in un foro di 4 mm del compartimento inferiore. Questo è usato come banchina di carico per il trasferimento delle mosche.
  4. Tagliare un pezzo di tubo in vinile trasparente da 15 mm ID 5/8" (vedi Tabella dei materiali) per creare un accoppiamento. Inserire lo scomparto superiore e inferiore nell'accoppiamento da estremità opposte per fissare saldamente lo scomparto inferiore al compartimento superiore.
  5. Utilizzando un morsetto regolabile a 2 poli, collegare l'assieme a un supporto verticale. Orientate verticalmente il gruppo con il tubo ammortizzatore come scomparto superiore.
  6. Collegare i fili del tubo d'urto a uno stimolatore elettrico (vedere Tabella dei materiali) per erogare scosse elettriche. La durata del periodo di formazione è di 1 min.
    NOTA: per facilitare l'osservazione, posizionare un pezzo di carta bianca dietro il tubo d'urto per fungere da sfondo bianco dell'apparecchio. Metti una lampada con una lampadina morbida equivalente a 75 W sopra il vano ammortizzatore. Posizionare una lampada a lente d'ingrandimento a braccio regolabile davanti alla configurazione. Una rappresentazione dell'apparato passivo di evitamento è mostrata nella Figura 1.

2. Preparazione delle mosche per la procedura di evitamento passivo

  1. Immobilizzare le mosche D. melanogaster o D. simulans di 3-4 giorni usando un blocco ghiacciato e trasferirle in singole fiale con cibo 24 ore prima dell'esperimento (1 mosca per fiala) seguendo la procedura descritta in precedenza19.
    NOTA: Gli esperimenti qui descritti hanno confrontato maschi di 3-4 giorni rispetto a mosche femminili in D. melanogaster e D. simulans.
  2. Prima degli esperimenti comportamentali, codificare tutte le fiale. Per questo, assegna a ciascun gruppo una lettera, ad esempio "A", "B", "C", ecc., E ogni mosca un numero. Rivela questo codice solo dopo che tutti i dati sono stati registrati e analizzati. Utilizzare almeno 20 mosche per genotipo o trattamento per contrastare le variazioni individuali.
    NOTA: Eseguire gli esperimenti e le analisi "alla cieca" consente di escludere un pregiudizio nella valutazione delle prestazioni della mosca e l'analisi dei dati.

3. Esecuzione della prima prova

  1. Utilizzando un aspiratore a bocca mosca (vedere Tabella dei materiali) descritto in precedenza20, trasferire delicatamente una mosca dal singolo flaconcino nel compartimento inferiore attraverso la banchina di carico. Aspirare delicatamente una mosca nell'aspiratore della bocca aspirando l'aria. Deposita la mosca soffiando leggermente nella banchina di carico.
    NOTA: Evitare di stressare l'animale durante la cattura e il carico.
  2. Subito dopo che la mosca è stata caricata nello scompartimento inferiore, avviare un timer e un cronometro di 1 minuto.
    NOTA: il cronometro viene utilizzato per misurare le latenze e il contatore di conteggio per contare il numero di scosse.
  3. Premere il cronometro per registrare la prima latenza quando la mosca entra nel tubo d'urto posizionando tutte le zampe sulla griglia. Accendi lo stimolatore per fornire una scossa elettrica al volo. I parametri di stimolazione sono 120 volt, 1000 ms di durata, 1 impulso/s (PPS), durata del treno 2000 ms.
  4. Fornire ulteriori urti se la mosca rientra nel tubo d'urto. Registrare il numero di shock ricevuti durante una prova di 1 minuto con un contatore di conteggio o un contatore basato su Arduino (vedere Tabella dei materiali). Se si utilizza il contatore basato su Arduino, attenersi alla seguente procedura.
    NOTA: Un dispositivo opzionale basato su Arduino AKM-007 (vedi Tabella dei materiali) può essere utilizzato per misurare il tempo, la latenza, il numero di shock e la frequenza e la durata degli attacchi di toelettatura per ciascun animale premendo e rilasciando i pulsanti corrispondenti sul dispositivo. I pulsanti sul dispositivo sono assegnati per misurare la latenza, amministrare e registrare il numero di shock e misurare la frequenza e la durata degli attacchi di toelettatura.
    1. Premere il pulsante Start al passaggio 3.2. e premere il pulsante Shock al passaggio 3.3.
    2. Per registrare la durata di un incontro di toelettatura, premere il pulsante Toelettatura all'inizio di un incontro di toelettatura sul dispositivo e rilasciare questo pulsante alla fine dell'incontro di toelettatura.
      NOTA: Gli attacchi di toelettatura sono stati misurati durante 1 minuto di prova. Una toelettatura estensiva potrebbe essere indicativa di stress animale21,22. Il dispositivo basato su Arduino salva tutti i dati come file CSV su una scheda di memoria.
  5. Al termine di una prova di 1 minuto, trasferire delicatamente la mosca su un singolo flaconcino. Annota la latenza, il numero di shock ricevuti e qualsiasi cambiamento notevole nel comportamento.
  6. Pulire il compartimento inferiore e antiurto con etanolo al 70%, pulire con un fazzoletto per la pulizia privo di lanugine (vedere Tabella dei materiali) e asciugare con l'asciugacapelli. Ripeti la prova con la mosca successiva.
  7. Dopo gli esperimenti comportamentali, pulire il compartimento inferiore con acqua e detergente inodore. Pulire il compartimento inferiore e il compartimento degli ammortizzatori con etanolo al 70% e asciugare all'aria durante la notte.

4. Esecuzione della seconda prova

  1. Eseguire la seconda prova ripetendo la procedura sopra descritta (passaggio 3) 24 ore dopo. Prova le mosche nella stessa sequenza del giorno precedente.

5. Analisi dei risultati

  1. Calcola la latenza media, il numero medio di shock e la durata degli attacchi di toelettatura per la prova 1 e la prova 2 per ciascun gruppo sperimentale di animali. Esegui il t-test degli studenti per il confronto a due gruppi o ANOVA per confronti multipli con analisi post-hoc utilizzando il test di Tukey23.

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Representative Results

L'evitamento passivo è stato studiato in D. melanogaster (Canton-S) e D. simulani. Gli esperimenti hanno confrontato le latenze e il numero di shock ricevuti tra prove consecutive. Inizialmente, gli esperimenti sono stati eseguiti con mosche D. melanogaster maschio di 3-4 giorni. Le mosche sono state mantenute con la dieta standard Bloomington Formulation in un ambiente climatizzato a 24 ° C in un ciclo luce-buio di 12 ore, umidità del 70% e densità di popolazione controllata. La densità è stata controllata mantenendo costanti le condizioni di riproduzione per tutti i gruppi. 15 maschi e 15 femmine sono stati allevati per 48 ore in una bottiglia a 24 °C, 70% di umidità e un ciclo di luce di 12 ore per generare la prole. Il comportamento passivo di evitamento in un moscerino della frutta è stato studiato in quattro prove di 2 minuti distanziate di 24 ore l'una dall'altra. Le prove sono state eseguite alla stessa ora del giorno. Una mosca è stata aspirata delicatamente da una singola fiala durante una prova e trasferita nel compartimento inferiore tramite una banchina di carico (Figura 1). Gli esperimenti hanno rivelato che D. melanogaster poteva imparare e memorizzare con successo il comportamento di evitamento passivo. Nel primo processo, la mosca ingenua entrava nel compartimento superiore in media entro 16 s (16.15±2.64) e spesso rientrava in esso, ricevendo in media 2 shock (2.18±0.19). Durante le prove consecutive, la latenza aumenterebbe significativamente mentre il numero di scosse diminuirebbe, indicando che le mosche hanno imparato l'associazione tra il compartimento superiore e una scossa elettrica (Tabella 1, Figura 2 A, B). L'analisi della distribuzione delle frequenze ha mostrato che la geotaxi negativa è una motivazione potente. Durante la prima prova, la maggior parte delle mosche ingenue entrava nel compartimento superiore entro 5-15 s (bidone 10, Figura 2C) e riceveva 1-3 shock (Figura 2D). Al contrario, la maggior parte delle mosche non entrerebbe nel compartimento superiore nel quarto studio e di conseguenza non riceverebbe alcuna scossa (Figura 2E, F).

Per verificare che il test di evitamento passivo funzioni in altre specie di moscerini della frutta, gli esperimenti sono stati ripetuti in mosche maschio e femmina D.simulans mantenute nelle stesse condizioni abitative delle mosche melanogaster sopra descritte. La durata della prova è stata ridotta a 1 min. La distribuzione della frequenza per le latenze ha mostrato chiaramente che se la mosca non entra nel compartimento superiore entro 60 s nel primo studio, di solito non entra affatto (Figura 3C). Il numero di studi è stato ridotto a tre poiché gli esperimenti sopra descritti hanno dimostrato in modo affidabile che anche un singolo studio era sufficiente per una mosca per formare associazioni avverse. D. simulans maschi e femmine di mosche erano entrambi efficaci nell'apprendere il comportamento di evitamento passivo, come evidente dai dati nei grafici e nelle tabelle (Figura 3, Figura 4; e Tabella 2, Tabella 3).

Il confronto tra latenze e numero di shock tra maschi e femmine non ha rivelato differenze statisticamente significative (Figura 5 A,B). Tuttavia, le mosche maschio sono state un po 'più veloci nell'entrare nel compartimento superiore nel primo studio, mentre le femmine hanno ricevuto un numero leggermente più alto di shock in ogni prova (Figura 4A, B). La differenza era particolarmente evidente nei grafici che illustravano le distribuzioni di frequenza (Figura 4C-F). La distribuzione in frequenza delle latenze nel terzo studio ha indicato che la maggior parte delle mosche è entrata nel compartimento superiore entro 7,5-12,5 s (Figura 4E). La distribuzione della frequenza per il numero di shock nel terzo studio mostra che le mosche femmine hanno ricevuto in media 1-2 shock nell'ultimo studio (Figura 4F).

La durata totale del comportamento di toelettatura è stata registrata anche durante le prove. Il comportamento di toelettatura della mosca consiste in ripetuti movimenti coordinati di zampe anteriori e zampe posteriori che spazzano le ali, la testa e il corpo24. L'auto-toelettatura, nota anche come auto-toelettatura, è stata precedentemente collegata allo stress comportamentale nelle mosche24, nei roditori di laboratorio25 e negli esseri umani22. Pertanto, gli studi sul comportamento di auto-toelettatura possono fornire approfondimenti sui comportamenti legati all'ansia26. L'analisi della durata totale degli attacchi di toelettatura durante gli studi di evitamento passivo ha rivelato che l'auto-toelettatura era significativamente aumentata nelle mosche femmine negli studi due e tre (Figura 5C, Tabella 4).

Prove crescenti suggeriscono un'associazione tra WD ipercalorico e prestazioni cognitive compromesse27. Sperimentalmente, il WD produce effetti avversi sulla funzione cerebrale mitocondriale, sulla neurogenesi e sulla plasticità sinaptica28,29,30. Un recente studio ha documentato che il WD aumenta i trigliceridi e accorcia la durata della vita in D., mentre l'esercizio di volo controbilancia l'effetto dannoso del WD31. Per iniziare a esplorare gli effetti del WD e dell'esercizio di volo sul comportamento di evitamento passivo, le mosche maschio di D. simulans sono state sottoposte a 5 giorni di WD, esercizio di volo o una combinazione di WD ed esercizio di volo secondo i protocolli descritti in precedenza31. Il WD, contenente il 15% di Nutiva USDA Certified Organic, non-OGM, olio di palma rosso, 15% di saccarosio e 0,1 milioni di NaCl, è stato preparato come pubblicato altrove31. L'esercitazione di volo è stata eseguita su gruppi di sessanta mosche maschi alloggiate in fusti di plastica trasparente da 1 gallone legati a una piattaforma orizzontale collegata a un motore elettrico e azionati da un timer. L'esercizio è stato eseguito quotidianamente per 7 ore per 5 giorni come pubblicato in precedenza31. Alla fine della dieta di 5 giorni e del regime di esercizio fisico, le mosche sono state ordinate in singole fiale in anestesia fredda e sottoposte a due prove di comportamento passivo di evitamento. Gli esperimenti hanno dimostrato che il WD aumenta il numero di shock ricevuti negli studi uno e due e diminuisce la latenza nello studio due, indicando che il WD compromette significativamente l'apprendimento associativo avversivo nelle mosche (Figura 6, Tabella 5). C'è stata anche una tendenza al ribasso nel numero di shock nello studio due in un gruppo con la combinazione WD ed esercizio, suggerendo che l'esercizio fisico può mitigare l'impatto del sovraccarico calorico.

Figure 1
Figura 1: Schema che illustra il saggio di evitamento passivo. Le dimensioni inferiori del compartimento sono di 45 mm di lunghezza e 17 mm di diametro esterno. Le dimensioni del vano superiore sono di 80 mm di lunghezza e 18 mm di diametro esterno. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Comportamento passivo di evitamento nei maschi di D. melanogaster . (A) Latenza media (s) per prova. Il grafico mostra che le latenze aumentano significativamente con il numero di prove. Il numero di mosche è indicato su ogni barra. (B) Un numero medio di shock ricevuti per processo. Il grafico mostra che il numero di shock diminuisce significativamente con il numero di prove. (C) Distribuzione della frequenza che mostra il numero di mosche all'interno di un contenitore di latenze nel primo processo. I numeri sull'asse x sono centri contenitore. I contenitori sono intervalli (0-5 s, 5-15 s, 15-25 s, ecc.). Il grafico indica che la maggior parte delle mosche entra nel compartimento superiore entro 5-15 s. (D) Distribuzione della frequenza che mostra il numero di mosche all'interno di un bidone di shock nel primo studio. I numeri sull'asse x sono centri contenitore. Il grafico indica che la maggior parte delle mosche riceve 1-3 shock nel primo processo. Poche mosche non sono entrate nel compartimento d'urto durante la prima prova e hanno ricevuto zero scosse. Sono stati esclusi dalle prove successive. (E) Distribuzione della frequenza che mostra il numero di mosche all'interno di un contenitore di latenze nel quarto processo. Il grafico indica che la maggior parte delle mosche non entra nel compartimento superiore. (F) Distribuzione della frequenza che mostra il numero di mosche all'interno di un bidone di shock nel quarto processo. Il grafico mostra che la maggior parte delle mosche riceve 0 shock nell'ultima prova. Abbreviazioni: ns- non significativo, *- P<0.05, **- P<0.01, ***-P<0.001, ****- P<0.0001. ANOVA unidirezionale con il test di confronti multipli di Tukey. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Comportamento passivo di evitamento nei maschi di D. simulans . (A) Latenza media (s) per prova. Il grafico mostra che le latenze aumentano significativamente con il numero di prove. (B) Un numero medio di shock ricevuti per processo. Il grafico mostra che il numero di shock diminuisce significativamente con il numero di prove. (C) Distribuzione della frequenza che mostra il numero di mosche all'interno di un contenitore di latenze nel primo processo. Il grafico indica che la maggior parte delle mosche entra nel compartimento superiore entro 2,5-12,5 s. I numeri sull'asse x sono i centri del cestino. (D) Distribuzione della frequenza che mostra il numero di mosche all'interno di un bidone di shock nel primo processo. Il grafico indica che la maggior parte delle mosche riceve 1-3 shock nel primo processo. (E) Distribuzione della frequenza che mostra il numero di mosche all'interno di un bidone di latenze nel terzo processo. Il grafico indica che la maggior parte delle mosche non entra nel compartimento superiore. (F) Distribuzione della frequenza che mostra il numero di mosche all'interno di un bidone di shock nel terzo processo. Il grafico mostra che la maggior parte delle mosche riceve 0 shock nell'ultima prova. Abbreviazioni: *- P<0.05, ****- P<0.0001. ANOVA unidirezionale con il test di confronti multipli di Tukey. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Comportamento passivo di evitamento nelle femmine di D. simulans . (A) Latenza media (s) per prova. Il grafico mostra che le latenze aumentano significativamente con il numero di prove. (B) Un numero medio di shock ricevuti per processo. Il grafico mostra che il numero di shock diminuisce significativamente con il numero di prove. (C) Distribuzione della frequenza che mostra il numero di mosche all'interno di un contenitore di latenze nel primo processo. Il grafico indica che la maggior parte delle mosche entra nel compartimento superiore entro 2,5-12,5 s. I numeri sull'asse x sono i centri del cestino. (D) Distribuzione della frequenza che mostra il numero di mosche all'interno di un bidone di shock nel primo processo. Il grafico indica che la maggior parte delle mosche riceve 2 shock nella prima prova. (E) Distribuzione della frequenza che mostra il numero di mosche all'interno di un bidone di latenze nel terzo processo. Il grafico indica che la maggior parte delle mosche entra nel compartimento superiore entro 7,5-12,5 s. (F) Distribuzione della frequenza che mostra il numero di mosche all'interno di un contenitore di shock nel terzo studio. Il grafico mostra che la maggior parte delle mosche femmine ha ricevuto 1-2 shock nell'ultimo processo. Abbreviazioni: **- P<0.01, ***-P<0.001, ****- P<0.0001. ANOVA unidirezionale con il test di confronti multipli di Tukey. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Confronto tra l'evitamento passivo e il comportamento di toelettatura nei maschi e nelle femmine di D. simulans . (A) Latenza media (s) per prova. Il grafico non mostra differenze statisticamente significative tra maschi e femmine nelle latenze. (B) Un numero medio di shock ricevuti per processo. Il grafico non mostra differenze statisticamente significative tra maschi e femmine nel numero di shock ricevuti. (C) La durata totale degli attacchi di toelettatura nelle prove 1-3. Mentre non c'erano differenze statisticamente significative tra maschi e femmine, le mosche femmine hanno mostrato una notevole diminuzione del comportamento di toelettatura durante gli studi 2 e 3 rispetto allo studio 1. Abbreviazioni: *- P<0.05. ANOVA unidirezionale con il test di confronti multipli di Tukey. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6: Effetto del WD sul comportamento passivo di evitamento del maschio D. simulans . (A) Latenza media (s) per prova. Il grafico mostra che WD ha aumentato significativamente la latenza nei gruppi WD e WDE. (B) Un numero medio di shock ricevuti per processo. Il grafico mostra un aumento statisticamente significativo del numero di shock ricevuti dalle mosche sul WD nelle prove 1 e 2. È interessante notare che l'esercizio di volo ha negato in modo significativo l'effetto del WD secondo il t-test dello studente. Abbreviazioni: CD- dieta di controllo, CDE- dieta di controllo con esercizio fisico, WD- dieta occidentale, WDE- dieta occidentale con esercizio fisico. *- P<0.05, **- P<0.01. ANOVA unidirezionale con il test di confronti multipli di Tukey. #- P<0.05, Student t-test. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Prove Prova 1 Prova 2 Prova 3 Prova 4
Latenza (s) 16.15±2.64 49.08±6.2 64,72±6,8 102,1±12,1
Shock 18±0.02.19 1.41±0.29 0.76±0.25 0.33±0.22
Latenza Confronti multipli di Tukey tra le prove Sommario Valore P rettificato
1 contro 2 **** <0,0001
1 contro 3 **** <0,0001
1 contro 4 **** <0,0001
2 contro 3 Ns 0.2043
2 contro 4 **** <0,0001
3 contro 4 ** 0.0099
Sconvolge i molteplici confronti di Tukey tra le prove Sommario Valore P rettificato
1 contro 2 Ns 0.0646
1 contro 3 *** 0.0004
1 contro 4 **** <0,0001
2 contro 3 Ns 0.2569
2 contro 4 * 0.0253
3 contro 4 Ns 0.694

Tabella 1: Effetto dell'allenamento sull'evitamento di scosse elettriche nei maschi di D. melanogaster. I dati per le latenze e gli shock ricevuti sono presentati come mezzi ± SEM. ANOVA unidirezionale con il test di confronti multipli di Tukey.

Prove Prova 1 Prova 2 Prova 3
Latenza (s) 10.16±0.78 22.64±2.1 30.63±2.69
Shock 2.36±0.13 1.84±0.17 1.24±0.14
Latenza Confronti multipli di Tukey tra le prove Sommario Valore P rettificato
1 contro 2 **** <0,0001
1 contro 3 **** <0,0001
2 contro 3 * 0.0229
Sconvolge i molteplici confronti di Tukey tra le prove Sommario Valore P rettificato
1 contro 2 * 0.0166
1 contro 3 **** <0,0001
2 contro 3 * 0.0172

Tabella 2: Effetto dell'allenamento sull'evitamento di scosse elettriche nei maschi D. simulans. I dati per le latenze e gli shock ricevuti sono presentati come mezzi ± SEM. ANOVA unidirezionale con il test di confronti multipli di Tukey.

Prove Prova 1 Prova 2 Prova 3
Latenza (s) 07.12±0.89 20.98±2.63 23.20±2.16
Shock 2.65±0.12 1.98±0.12 1.49±0.11
Latenza Confronti multipli di Tukey tra le prove Sommario Valore P rettificato
1 contro 2 ** 0.0023
1 contro 3 **** <0,0001
2 contro 3 ** 0.0028
Sconvolge i molteplici confronti di Tukey tra le prove Sommario Valore P rettificato
1 contro 2 **** <0,0001
1 contro 3 **** <0,0001
2 contro 3 *** 0.0003

Tabella 3: Effetto dell'allenamento sull'evitamento di scosse elettriche nelle femmine di D. simulans. I dati per le latenze e gli shock ricevuti sono presentati come mezzi ± SEM. ANOVA unidirezionale con il test di confronti multipli di Tukey.

Prove Prova 1 Prova 2 Prova 3
Toelettatura maschile (s) 14.42±1.02 18.47±2.82 18.23±2.75
Toelettatura femminile (s) 15±1.09.09 14.03±2.26 15.50±2.38
Confronti multipli di Tukey tra i maschi delle prove Sommario Valore P rettificato
1 contro 2 Ns 0.4384
1 contro 3 Ns 0.4873
2 contro 3 Ns 0.9971
Confronti multipli di Tukey tra le femmine di prova Sommario Valore P rettificato
1 contro 2 * 0.0299
1 contro 3 * 0.0426
2 contro 3 Ns 0.8481

Tabella 4: Effetto dell'evitamento passivo sul comportamento di toelettatura di D. simulans. I dati sono presentati come mezzi ± SEM. ANOVA unidirezionale con i test di confronto multipli di Tukey.

Latenze Prova 1 Prova 2
CD 16.26±2.28 45.85±4.09
CDE · 15.28±2.75 33.59±5.19
NANA BIANCA 13.49±1.58 28.33±3.7
WDE · 13.00±1.95 30.23±3.79
Latenza Confronti multipli di Tukey tra gruppi Trial 1 Sommario Valore P rettificato
CD vs CDE Ns 0.9916
CD vs. WD Ns 0.7369
CD vs WDE Ns 0.6475
Confronto tra CDE e WD Ns 0.9523
Confronto tra CDE e WDE Ns 0.9122
Confronto tra WD e WDE Ns 0.9981
Latenza Confronti multipli di Tukey tra gruppi Trial 2 Sommario Valore P rettificato
CD vs CDE Ns 0.2785
CD vs. WD ** 0.0082
CD vs WDE * 0.0283
Confronto tra CDE e WD Ns 0.8578
Confronto tra CDE e WDE Ns 0.9594
Confronto tra WD e WDE Ns 0.9844
Shock Prova 1 Prova 2
CD 1.95±0.21 0,94±0,4
CDE · 2.0±0.28 1.0±0.23
NANA BIANCA 3.05±0.26 2.36±0.41
WDE · 2.49±0.24 1.36±0.23
Shock I confronti multipli di Tukey tra i gruppi Trial 1 Sommario Valore P rettificato
CD vs CDE Ns 0.9992
CD vs. WD ** 0.005
CD vs WDE Ns 0.3765
Confronto tra CDE e WD Ns 0.0523
Confronto tra CDE e WDE Ns 0.6446
Confronto tra WD e WDE Ns 0.3268
Shock I confronti multipli di Tukey tra i gruppi Trial 2 Sommario Valore P rettificato
CD vs CDE Ns 0.9996
CD vs. WD * 0.0194
CD vs WDE Ns 0.8246
Confronto tra CDE e WD * 0.0122
Confronto tra CDE e WDE Ns 0.9306
Confronto tra WD e WDE Ns 0.1508

Tabella 5: Effetto della WD e dell'esercizio sull'evitamento di scosse elettriche nei maschi di D. simulans. I dati per le latenze e gli shock ricevuti sono presentati come mezzi ± SEM. ANOVA unidirezionale con il test di confronti multipli di Tukey. Abbreviazioni: CD- dieta di controllo, CDE- dieta di controllo con esercizio fisico, WD- dieta occidentale, WDE- dieta occidentale con esercizio fisico.

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Discussion

Evitare stimoli minacciosi è una caratteristica cruciale del comportamento adattivo in varie specie, da C. eleganza a umano32. Le procedure di apprendimento evitamento che in genere comportano la fuga di un evento avversivo, sono compiti comportamentali comunemente usati per indagare i processi di apprendimento e memoria nei roditori di laboratorio13 dal 197032. Nelle procedure di evitamento attivo, uno stimolo indifferente o un segnale condizionato (CS) è seguito da un evento avversivo o da un segnale incondizionato (US), che gli animali imparano a evitare eseguendo uno specifico compito comportamentale. Nelle procedure di evitamento passivo, un animale deve evitare gli Stati Uniti avversi associando un comportamento precedentemente punito a uno specifico contesto ambientale33. Latenze più lunghe dei test di ritenzione che indicano una migliore memoria suggeriscono che l'animale ha sviluppato una rappresentazione dettagliata dell'esperienza di addestramento13. L'allenamento passivo per evitare consiste in un'unica prova; tuttavia, i meccanismi cerebrali alla base dell'acquisizione di questo compito sono complessi in quanto l'animale impara ad associare varie informazioni, tra cui stimoli ambientali, spaziali-posizionali e avversivi13. L'alterazione di questi stimoli consente lo studio di tipi di memoria episodica e contestuale13.

Il paradigma qui descritto ha adottato il comportamento di evitamento passivo nei roditori per volare adulti come sistema modello. Mentre sono state sviluppate diverse procedure per studiare l'apprendimento e la memoria nelle mosche, tra cui olfattivo7,8, visual9 e condizionamento del corteggiamento10, questi test richiedono piuttosto tempo e richiedono una configurazione complessa. Il protocollo qui descritto è un semplice test comportamentale per studiare l'apprendimento avversivo associativo nelle mosche, che consiste in prove di 1 minuto e può essere facilmente impostato con alcune forniture disponibili. Il protocollo consente potenzialmente un'ulteriore manipolazione dei segnali ambientali, con l'aggiunta di stimoli olfattivi, visivi e altri stimoli contestuali, cambiando colori o motivi geometrici per il compartimento inferiore o aggiungendo segnali olfattivi nel cappuccio della camera superiore. Inoltre, questo test può essere facilmente adattato per studiare la memoria a breve termine, la memoria a medio termine e la memoria resistente all'anestesia manipolando gli intervalli tra le prove e sottoponendo le mosche all'anestesia.

Il test ha funzionato altrettanto bene nelle mosche maschili e femminili di D. melanogaster e D. simulans , dimostrando che il paradigma potrebbe essere adattato a diverse specie di D. I cambiamenti nel comportamento delle mosche caratterizzati da un aumento delle latenze e da una diminuzione del numero di shock erano statisticamente significativi nel secondo studio e si sarebbero rafforzati con gli studi successivi. È interessante notare che, se le mosche ingenue fossero abituate all'apparato senza scosse elettriche, entrerebbero nel compartimento superiore un po 'più velocemente nella seconda e nella terza prova. Tuttavia, la diminuzione delle latenze non è stata statisticamente significativa (dati non mostrati). Non sono state osservate differenze statisticamente significative tra i sessi, anche se le mosche femminili hanno avuto latenze un po 'più lunghe e hanno ricevuto leggermente più shock. Questa differenza potrebbe essere dovuta a una combinazione di fattori, tra cui l'incapacità delle femmine di associare lo shock al compartimento superiore, una geotaxi più forte, o forse perché le femmine sono leggermente più grandi e più lente dei maschi. La durata totale degli attacchi di toelettatura è stata significativamente inferiore nella seconda e nella terza prova nelle mosche femmine, il che traccia un parallelo tra D. e i comportamenti ansiosi dei roditori26.

È interessante notare che, come mostrato nelle figure 3E e 4E, le latenze nel terzo studio sono state divise in due estremi (meno di 30 s e 60 s). Queste differenze, tuttavia, non sono state osservate nel 4 ° studio indicando che la maggior parte delle mosche alla fine ha acquisito il compito (Figura 2E). Mentre le ragioni esatte delle differenze individuali nello sviluppo di compiti di evitamento passivo non sono chiare, le popolazioni naturali possono contenere polimorfismo e mutazioni che influenzano l'apprendimento e la memoria3,5,34,35. Uno studio recente ha dimostrato che il polimorfismo nel locus foraggiamento (per) che codifica una proteina chinasi cGMP-dipendente (PKG) potrebbe mediare strategie alternative nell'apprendimento del comportamento di foraggiamento34. Le mosche con l'allele "rover" e un'attività più elevata hanno una migliore memoria a breve termine, mentre le mosche con l'allele "sitter" e il comportamento sedentario mostrano una migliore memoria a lungo termine34.

Il test ha rivelato che il WD ha significativamente compromesso l'apprendimento e la memoria nelle mosche, il che era evidente da latenze più brevi e ricevendo più shock nel secondo studio. Il maggior numero di shock nel primo studio dopo il WD potrebbe indicare deficit nella memoria a breve termine e un fallimento nel fare associazioni tra specifico contesto ambientale e una scossa elettrica. È interessante notare che le esercitazioni di volo hanno parzialmente mitigato l'effetto negativo del WD poiché le mosche WDE avevano ricevuto significativamente meno shock nella seconda prova. Ciò suggerisce che l'esercizio di volo potrebbe invertire l'impatto del sovraccarico metabolico e migliorare le prestazioni cognitive. Questi dati sono supportati dalla nostra precedente osservazione sugli effetti benefici dell'esercizio di volo sulla fisiologia, la riproduzione e il comportamento della mosca31.

Uno dei passaggi critici nel protocollo descritto è il trasferimento delle mosche dalla singola fiala nella camera inferiore. Le mosche stressate entrerebbero nel compartimento superiore troppo rapidamente o non entrerebbero affatto. Le mosche che non sono entrate nel compartimento superiore nella prima prova potevano ancora entrare nel compartimento superiore dopo essere state trasferite di nuovo in una fiala individuale e aver dato una pausa di 5 minuti. Tuttavia, è meglio escludere queste mosche dall'esperimento. L'età della mosca è un altro fattore cruciale in quanto la geotassi negativa è diventata significativamente più debole nelle mosche di 30 giorni (dati non mostrati). Così più mosche non entrerebbero nella camera superiore alla prima prova e sarebbero escluse dall'esperimento.

Il vantaggio del test descritto è che si tratta di un semplice compito comportamentale che produce dati riproducibili sia in D. melanogaster che in D. simulans mosche maschili e femminili. Il test potrebbe aiutare lo studio dei meccanismi di base alla base dell'apprendimento e dei disturbi della memoria derivanti da varie manipolazioni genetiche, farmacologiche e dietetiche. Inoltre, poiché le prove di ritenzione possono essere eseguite in momenti diversi dopo l'allenamento iniziale, la memoria a breve termine, intermedia e a lungo termine potrebbe essere potenzialmente interrogata separatamente.

Ci sono anche potenziali limitazioni con questo compito di prova unica, tra cui la variabilità tra soggetti e le differenze di età (discusse sopra). L'apprendimento e la memoria potrebbero anche essere influenzati da vari fattori, tra cui lo stato comportamentale al momento dell'apprendimento, le manipolazioni sperimentali e le risposte allo stress36. Poiché gli Stati Uniti sono dati nel compartimento con una griglia di rame, l'ingresso degli animali è talvolta difficile da valutare a meno che i fasci fotografici e le telecamere a infrarossi non possano essere installati per il monitoraggio video in futuro.

Nel complesso, il test qui presentato è una procedura semplice, affidabile e riproducibile che consente di studiare i meccanismi della memoria. Potrebbe potenzialmente aprire nuove strade per un'analisi dettagliata del consolidamento della memoria nelle mosche, comprese le interazioni gene-farmaco, sia negli aspetti contestuali che episodici della memoria.

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Disclosures

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

Acknowledgments

Questo studio è stato supportato in parti da NIH R15ES029673 (AKM).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bloomington Formulation diet Nutri-Fly  66-112 Available from Genesee Scientific Inc., San Diego, CA
1000 µL Blue tip Fisher NC9546243
17 x 100 mm 14 mL polypropylene culture tube VWR  60818-689
Aduino-based Automatic Kontrol Module In-house AKM-007 This unit is optional. Complete description, schematics, wiring diagram and a code are provided at the ECU Digital Market - https://digitalmarket.ecu.edu/akmmodule
Dual-Display 2-Channel  Digital Clock/Timer Digi-Sense AO-94440-10 https://www.amazon.com/Cole-Parmer-AO-94440-10-Dual-Display-2-Channel-Jumbo-Digit/dp/B00PR0809G/ref=sr_1_5?dchild=1&keywords=Dual-Display+timer+jumbo&qid=1627660660&sr=
8-5#customerReviews
Electronic Finger Counter N/A N/A https://www.amazon.com/gp/product/B01M8IRK6F/ref=ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8&psc=1
Fisherbrand Sparkleen 1 Detergent Fisher Scientific 04-320-4
Fly mouth aspirator In-house Prepared as described in reference 19.
Grass S88 stimulator N/A N/A Could be replaced with any stimulator which can provide described parameters
Kim-wipes Fisher Scientific 06-666 Kimberly-Clark Professional 34120
Metal block for fly immobilization In-house 4 x 13 x 23.5cm aluminum block
Nutiva USDA Certified Organic, non-GMO, Red Palm Oil Nutiva N/A https://www.amazon.com/Nutiva-Certified-Cold-Filtered-Unrefined-Ecuadorian/dp/B00JJ1E83G/ref=sxts_rp_s1_0?cv_ct_cx=Nutiva+USDA+Certified+Organic%2C+non-GMO%2C+Red+Palm+Oil&dchild=1&keywords=Nutiva+USDA+Certified+Organic%2C+non-GMO%2C+Red+Palm+Oil&pd_rd_i=B00JJ1E83G&pd_
rd_r=f35e9d2f-afe4-44b6-afc2-1c9cd705be18&pd_rd_w=
R3Zb4&pd_rd_wg=eUv1m&pf_rd_
p=c6bde456-f877-4246-800f-44405f638777&pf
_rd_r=M94N11RC7NH333EMJ66Y
&psc=1&qid=1627661533&sr=1-1-f0029781-b79b-4b60-9cb0-eeda4dea34d6
Shock tube CelExplorer TMA-201 https://www.celexplorer.com/product_detail.asp?id=217&MainType=110&SubType=8
Stopwatch Accusplit A601XLN https://www.amazon.com/gp/product/B0007ZGZYI/ref=ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8&psc=1
Transparent vinyl tubing (3/4” OD, 5/8” ID) Lowes Avaiable from Lowes

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Comportamento Problema 176 Evitamento passivo apprendimento avversivo apprendimento associativo memoria Drosophila dieta occidentale esercizio di volo

Erratum

Formal Correction: Erratum: Drosophila Passive Avoidance Behavior as a New Paradigm to Study Associative Aversive Learning
Posted by JoVE Editors on 02/23/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Drosophila Passive Avoidance Behavior as a New Paradigm to Study Associative Aversive Learning. The Representative Results and Discussion sections were updated.

In the Representative Results, the legend for Figure 5 was updated from:

Figure 5: Comparison of passive avoidance and grooming behavior in D. simulans males and females. (A) Average latency (s) per trial. The graph shows no statistically significant differences between males and females in the latencies. (B) An average number of received shocks per trial. The graph shows no statistically significant differences between males and females in the number of received shocks. (C) The total duration of grooming bouts in trials 1-3. While there were no statistically significant differences between males and females, the female flies showed a considerable increase in grooming behavior during trials 2 and 3 compared to trial 1. Abbreviations: *- P<0.05. One-way ANOVA with Tukey's multiple comparisons test.

to:

Figure 5: Comparison of passive avoidance and grooming behavior in D. simulans males and females. (A) Average latency (s) per trial. The graph shows no statistically significant differences between males and females in the latencies. (B) An average number of received shocks per trial. The graph shows no statistically significant differences between males and females in the number of received shocks. (C) The total duration of grooming bouts in trials 1-3. While there were no statistically significant differences between males and females, the female flies showed a considerable decrease in grooming behavior during trials 2 and 3 compared to trial 1. Abbreviations: *- P<0.05. One-way ANOVA with Tukey's multiple comparisons test.

In the Discussion, the third paragraph was updated from:

The assay worked equally well in D. melanogaster and D. simulans male and female flies, demonstrating that the paradigm could be adapted to different D. species. The changes in fly behavior characterized by increased latencies and decreased number of shocks were statistically significant in the second trial and would strengthen with subsequent trials. Interestingly, if naïve flies were habituated to the apparatus without electric shock, they would enter the upper compartment a little faster on the second and the third trials. However, the decrease in latencies was not statistically significant (data not shown). No statistically significant differences were observed between sexes, although female flies had somewhat longer latencies and received slightly more shocks. This difference could be due to a combination of factors, including females' failure to associate the shock with the upper compartment, a stronger geotaxis, or possibly because females are slightly larger and slower than males. The total duration of grooming bouts was significantly higher in the second and third trials in female flies, which draws a parallel between D. and rodent anxiety-like behaviors26.

to:

The assay worked equally well in D. melanogaster and D. simulans male and female flies, demonstrating that the paradigm could be adapted to different D. species. The changes in fly behavior characterized by increased latencies and decreased number of shocks were statistically significant in the second trial and would strengthen with subsequent trials. Interestingly, if naïve flies were habituated to the apparatus without electric shock, they would enter the upper compartment a little faster on the second and the third trials. However, the decrease in latencies was not statistically significant (data not shown). No statistically significant differences were observed between sexes, although female flies had somewhat longer latencies and received slightly more shocks. This difference could be due to a combination of factors, including females' failure to associate the shock with the upper compartment, a stronger geotaxis, or possibly because females are slightly larger and slower than males. The total duration of grooming bouts was significantly lower in the second and third trials in female flies, which draws a parallel between D. and rodent anxiety-like behaviors26.

<em>Drosofila</em> Comportamento di evitamento passivo come nuovo paradigma per studiare l'apprendimento avversivo associativo
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Pak, E. S., Murashov, A. K.… More

Pak, E. S., Murashov, A. K. Drosophila Passive Avoidance Behavior as a New Paradigm to Study Associative Aversive Learning. J. Vis. Exp. (176), e63163, doi:10.3791/63163 (2021).

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