Summary
פרוטוקול זה מתאר מודל של בעלי חיים מורכבים עם חשיפה לחומר חלקיקי (PM) המחמיר איסכמיה שריר הלב עם טרשת עורקים.
Abstract
הבעיות הבריאותיות הנגרמות על ידי זיהום אוויר (במיוחד זיהום חלקיקי) מקבלות יותר ויותר תשומת לב, במיוחד בקרב חולים במחלות לב וכלי דם, מה שמחמיר הפרעות מסובכות וגורם לפרוגנוזה גרועה. מודל החשיפה הפשוט לאיסכמיה שריר הלב (MI) או לחומר חלקיקי (PM) אינו מתאים למחקרים כאלה על מחלות מרובות סיבות. כאן תוארה שיטה לבניית מודל מרוכב המשלב חשיפה ל-PM, טרשת עורקים ואיסכמיה שריר הלב. עכברי ApoE−/− הוזנו בתזונה עתירת שומן במשך 16 שבועות כדי לפתח טרשת עורקים, החדרת קנה הנשימה של מתלים סטנדרטיים של PM בוצעה כדי לדמות את החשיפה הריאתית של PM, והעורק הכלילי הקדמי השמאלי היורד נקשר שבוע לאחר החשיפה האחרונה. החדרת קנה הנשימה של PM יכולה לדמות חשיפה חריפה לריאות תוך הפחתה משמעותית של עלות הניסוי; קשירת העורק הקדמי הקדמי השמאלי הקלאסי עם אינטובציה לא פולשנית של קנה הנשימה ומכשיר הרחבה עזר חדש יכולים להבטיח את שיעור ההישרדות של החיה ולהפחית את הקושי של הניתוח. מודל בעלי חיים זה יכול לדמות באופן סביר את השינויים הפתולוגיים של המטופל של אוטם שריר הלב מחמיר על ידי זיהום אוויר ולספק התייחסות לבניית מודלים של בעלי חיים הקשורים למחקרים המערבים מחלות עם סיבות מרובות.
Introduction
זיהום אוויר נקשר לתמותה גבוהה מכל הסיבות ותרם נטל תחלואה משמעותי יותר מסכום זיהום המים, זיהום הקרקע והחשיפה התעסוקתית1. דו"ח של ארגון הבריאות העולמי גילה כי זיהום אוויר חיצוני גרם ל -4.2 מיליון מקרי מוות בטרם עת בערים ובאזורים כפריים ברחבי העולם בשנת 20162. 91% מהאנשים ברחבי העולם גרים במקומות שבהם איכות האוויר חורגת ממגבלות ההנחיות של ארגון הבריאות העולמי2. יתר על כן, החומר החלקיקי העדין (PM) (קוטר ≤2.5 מיקרומטר, PM2.5) מוכר כאיום זיהום האוויר המשמעותי ביותר לבריאות הציבור העולמית3, במיוחד לאנשים החיים בערים של מדינות בעלות הכנסה נמוכה ובינונית.
ההשפעות השליליות של זיהום אוויר על מחלות לב וכלי דם ראויות לתשומת לב רבה יותר. מחקרים קודמים הראו כי PM מוביל לסיכון מוגבר למחלות לב וכלי דם (CVDs)4. חשיפה לריכוזים גבוהים של חלקיקים זעירים במשך מספר שעות עלולה להוביל לתמותה מוגברת של אוטם שריר הלב. עבור אנשים עם היסטוריה של אוטם שריר הלב, חשיפה לחלקיקים זעירים יכולה להגדיל באופן משמעותי את הסיכון להישנות5. יתר על כן, מקובל כי חשיפה PM מאיצה את ההתקדמות של טרשת עורקים6.
לצורך מחקר רפואי, חיוני לבחור מודל מתאים של בעלי חיים. מודלים פשוטים של בעלי חיים טרשת עורקים7, מודלים של בעלי חיים של איסכמיה שריר הלב8, ומודלים של בעלי חיים עם חשיפה ל-PM9 כבר קיימים. עכבר ApoE−/− (אפוליפופרוטאין E נוקאאוט) הוא מודל עכבר מסורתי המשמש במחקרי טרשת עורקים. היכולת לנקות ליפופרוטאינים בפלזמה בעכברי ApoE−/− נפגעת קשות. האכלה בתזונה עתירת שומן תגרום לטרשת עורקים קשה, בדומה לתלות בתזונה של מחלת לב טרשת עורקים שנצפתה בבני אדם7. קשירת העורק הכלילי היורד הקדמי השמאלי (LAD) היא שיטה קלאסית להשראת האירוע האיסכמי 8,10. עירוי קנה הנשימה שימש במחקרים רבים ובולט ממודלים של חשיפה11,12 בגלל הסימולציה הטובה יותר והעלות הנמוכה יותר שלו.
עם זאת, למודלים חייתיים של מחלה בודדת יש מגבלות משמעותיות במחקר המדעי. איסכמיה שריר הלב המושרה רק על ידי קשירת LAD אינה מדומה במצב בפועל. במצב הטבעי, איסכמיה שריר הלב נגרמת בדרך כלל על ידי קרע פלאק ועורקים כליליים חסומים13. חולים עם קרדיומיופתיה איסכמית בדרך כלל יש נגעים בסיסיים טרשת עורקים13. יש גם חילוף חומרים לא תקין של שומנים ותגובות דלקתיות בגוף14. לכן, איסכמיה הנגרמת על ידי גורמים פיזיים או בתנאים טבעיים יש ביטויים פתולוגיים שונים. מחקרים קיימים הראו כי אוטם ודלקת במודלים של איסכמיה שריר הלב עם טרשת עורקים חמורים יותר15,16. חשיפה ל-PM עלולה להחמיר עוד יותר טרשת עורקים ואיסכמיה שריר הלב על ידי גרימת דלקת ועקה חמצונית1. שלושה גורמים מתקיימים בדרך כלל יחד במצב הטבעי, כך שניתן לדמות את המצב בפועל בצורה טובה יותר על ידי שימוש במודל מורכב.
פרוטוקול זה מתאר פיתוח מודל חייתי של איסכמיה שריר הלב (MI) המשלב טרשת עורקים (AS) וחשיפה חריפה של PM. עכברי ApoE−/− הוזנו בתזונה עתירת שומן כדי לגרום לטרשת עורקים. חשיפה ריאתית של PM הייתה חיקוי על ידי טפטוף תרחיף PM דרך קנה הנשימה. קשירת ה-LAD בעכברים שימשה להשראת איסכמיה שריר הלב. שיטות אלה שולבו והותאמו כדי לדמות את מצב המחלה טוב יותר ולשפר את שיעור ההישרדות של בעלי חיים. אין צורך ביחידת חשיפה גדולה או במכונת הרדמת גז, מה שהופך את הניסוי לקל לביצוע. מודל זה יכול לשמש כדי לחקור את ההשפעה של חשיפה PM בזיהום אוויר על טרשת עורקים וקרדיומיופתיה איסכמית ולערוך מחקר על תרופות חדשות שפותחו לטיפול במחלות עם גורמים מורכבים כאלה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל פעילויות בעלי החיים המתוארות כאן אושרו על ידי ועדת האתיקה של בעלי חיים של המכון הסיני Materia Medica, האקדמיה הסינית למדעי הרפואה הסינית. עכברי ApoE−/− זכרים (רקע C57BL/6) בני 6-8 שבועות שימשו למחקר.
1. הכנה ניסיונית
- הכינו חומרי הרדמה של טריברומואתנול (15 מ"ג/מ"ל): המיסו 0.75 גרם של טריברומואתנול ב-1 מ"ל של אלכוהול טרט-אמיל (ראו טבלת חומרים). לאחר פירוק מלא, לדלל אותו ל 50 מ"ל עם מלוחים סטריליים. יש לאחסן את התמיסה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס במיכל סטרילי ולהימנע מחשיפה לאור.
הערה: בפרוטוקול זה נעשה שימוש בטריברומואתנול עקב זמן התאוששות אופטימלי מהרדמה ושיעור הישרדות של בעלי חיים. עקוב אחר המלצות ועדת האתיקה המקומית לבעלי חיים בעת בחירת משטר ההרדמה. - הכן מתלי PM: מדוד 5 מ"ג של DPM (חומר חלקיקי דיזל, ראה טבלת חומרים) בצינורות צנטריפוגה של 10 מ"ל. מוסיפים 5 מ"ל של מלח רגיל והופכים את הצינור הפוך כדי לערבב היטב. השתמש בסרט פרפין כדי לאטום את הצינור ולאחר מכן לשים אותו לתוך מנקה קולי במשך 2-3 שעות (40KHz, 80w) עבור שבירה קולית.
הערה: ההשעיה צריכה להיות הומוגנית ונטולת חלקיקים אגרגלומרטים. יש לנער היטב לפני השימוש.
2. אינדוקציה של טרשת עורקים בעכברים
- האכילו את העכברים בתזונה עתירת שומן (אבקת חלמון ביצה 10%, שומן 10%, סטרול 1%, הזנת תחזוקה 79%, ראו טבלת חומרים) במשך 12 שבועות.
- כדי להעריך את התקדמות טרשת העורקים, בחר 2-3 עכברים באופן אקראי ובדוק אם יש רובד בקשת אבי העורקים על ידי הדמיית אולטרסאונד או תצפית אנטומית ישירה17.
הערה: לתצפית אנטומית, בעלי חיים נבחרו באמצעות דגימה אקראית והומתו לאחר הרדמה. לאחר מכן, חלל החזה שלהם נפתח, וכלי הדם היו דמיינו ישירות. תצפית אנטומית היא בדרך כלל אמינה יותר מכיוון שהדמיית אולטרסאונד עשויה שלא לזהות את כל הפלאקים. - לאחר שנוצרה טרשת עורקים, הכינו את העכברים לשלב הבא.
3. אינטובציה אורוטרכאלית וחומר חלקיקי חשיפה חריפה
הערה: PM ייחשף פעם בשבוע למשך 4 שבועות לאחר 12 שבועות של האכלה עתירת שומן וימשיך לתת דיאטה עתירת שומן.
- הכינו לוח נתיחה (ראו טבלת חומרים) עם גומייה המגיעה לגובה של 1.5 ס"מ מהקצה העליון. תקן את לוח הנתיחה בזווית של 60° ממישור השולחן.
- הרדמת העכבר באמצעות הרדמה tribromoethanol על ידי הזרקה intraperitoneal (0.1 מ"ל עבור כל 10 גרם של משקל הגוף). לאחר 2-3 דקות, הפוך את העכבר כדי לבדוק אם יש רפלקס ימין. בצע צביטה בבוהן כדי לאשר טשטוש. טיפה סיכה סטרילית על העיניים.
- יש לחטא את לוח הניתוחים באמצעות מגבוני אלכוהול.
- הניחו את העכבר המרדים במצב שכיבה על הלוח וחברו את החותכות העליונות לגומי.
- השתמשו בזרקור LED קטן (ראו טבלת חומרים) עם צינור גמיש. מקד את האור על קנה הנשימה, שנמצא בערך בנקודת האמצע של קו בית השחי.
- שים צמר גפן סטרילי קטן לתוך הפה של העכבר, ולאחר מכן לגלגל את המטוש כדי לדחוף את הלשון החוצה.
- החזיקו את הלשון ומשכו אותה בעדינות כלפי מעלה כדי להפוך את חלל הפה, הלוע וקנה הנשימה לאותו כיוון אורכי. הגלוטיס, שהוא הכניסה לקנה הנשימה, יוצג כנקודת אור, שנפתחת ונסגרת עם כל נשימה.
- המשיכו להחזיק את הלשון בעדינות. הכנס את הצינורית (22 גרם) לקנה הנשימה של העכבר על ידי כיוונון הגלוטיס, משיכת ליבת המחט לאחר החדרת הצינורית לקנה הנשימה.
- השתמש אקדח פיפטה עם כמות קטנה של מלח רגיל כדי לבדוק אם הצינור הוא כראוי weasand. אם הצינור נמצא במיקום הנכון, עמוד הנוזל באקדח הפיפטה יקפוץ עם כל נשימה.
- שחרר 50 μL של השעיה DPM (מוכן בשלב 1.2) לתוך הצינור עם אקדח פיפטה. המתלים ישאפו באופן טבעי לריאות העכבר כשהוא נושם.
הערה: כדי להבטיח נשימה חלקה, עדיף להעניק לעכבר פי שניים מתלי DPM (25 μL פעם אחת), בהפרש של 10 שניות זה מזה. - יש להסיר את מחט השכינה של חיית המחמד לאחר חשיפה ל-PM. המתן עד שהעכבר יישאר על כריות החימום עד שהם יחזרו להכרה (10-20 דקות) ואז החזירו לכלוב הביתי.
4. קשירת עורקים כליליים
הערה: ניתוח מידול איסכמיה שריר הלב (קשירת עורקים כליליים) מבוצע בשבועה - 16.
- הכינו כלי ניתוח. לאחר autoclaving, לאחסן את כל כלי הניתוח בקופסת מכשירים אטומה. השרו אותם ב-75% אלכוהול למשך 20-30 דקות לפני הניתוח.
- בניית פלטפורמת הניתוח. כדי להשיג את שיפוע הפלטפורמה הנכון, השתמש בכיסוי צלחת תרבית תאים (150 מ"מ x 25 מ"מ). מקפלים 0-0 משי (10-15 ס"מ אורך) לשניים ומחברים את קצות החוט לחלק העליון של הפלטפורמה המשופעת באמצעות סרט הדבקה ליצירת לולאת תלייה.
- הרדימו את העכברים בעקבות ההליך המתואר בשלב 3.2.
הערה: יש להבטיח מרווח של שבוע אחד בין כל מתן טריברומואתנול. - לחטא את הפלטפורמה עם מגבונים אלכוהול.
- הנח את העכבר במצב שכיבה על פלטפורמת האינטובציה וחבר את החותכות העליונות בלולאת המתלים המתוארת בשלב 4.2. הדביקו את הזנב, הגפיים והשפם.
- הסר את השיער של החזה השמאלי וחלק מהחזה הימני הסמוך עם קרם להסרת שיער לפני הניתוח.
- בצע אינטובציה אורוטרכאלית בעכברים בעקבות ההליך המתואר בשלבים 3.4-3.8.
- קשרו את מחט השכינה של חיית המחמד עם מכונת הנשמה של בעלי חיים (ראו טבלת חומרים). הגדרת מכונת הנשמה: קצב נשימה - 120 פעמים לדקה; יחס שאיפה/נשימה - 1:1.1; נפח גאות - 1.7 מ"ל.
- נגב את העור עם יודופור ואלכוהול לחיטוי.
- חשוף את הלב. לעשות חתך עור עבור 0.5-1 ס"מ על ידי מספריים עיניים ו brace את השרירים (שריר החזה superficialis ו serratus שריר קדמי) כדי לחשוף את הצלעות. מהדקים את הצלע בפינצטה אופתלמית (עם ווים) ואז עושים חתך קטן בחלל הבין-קוסטלי השלישי (ראו טבלת חומרים). הכינו חלון ניתוח עם כלים ביתיים לפתיחת החזה.
הערה: חתך העור ממוקם בכשליש מתהליך ה-xiphoid וקו בית השחי. - לקרוע את קרום הלב. לאחר מכן ניתן לבצע LAD על ידי ביצוע השלבים 4.11-4.14.
הערה: אם האונות הריאתיות חוסמות את הנוף, דחפו אותו מאחורי הלב באמצעות צמר גפן סטרילי קטן. - בהתחלה, אתר את LAD.
- החזיקו את תפר המשי הסטרילי 6-0 עם מחט באמצעות מלקחיים המוסטטיים מיקרו-וסקולריים (ראו טבלת חומרים). מעבירים את המשי דרך רוחב 2 מ"מ של שריר הלב באזור שבו נמצא העורק הכלילי.
הערה: אל תנסה לשפוך את ה- LAD בלבד, מה שעלול לגרום לדימום תוך ניתוחי משמעותי. - מניחים חתיכת משי סטרילית 5-0 קצרה בין הליגטורה לרקמות שריר הלב כדי למנוע שבירת רקמות.
- קושרים את ה-LAD ואת הצרור הקטן של שריר הלב סביבו בחוזקה. הקשירה נחשבת מוצלחת כאשר הדופן הקדמית של החדר השמאלי (LV) הופכת חיוורת; ניתן לצפות בגובה מקטע ST בו זמנית אם מחוברת מכונת אלקטרוקרדיוגרמה.
- סחטו בעדינות את האוויר מהחזה. תפרים אינטרקוסטליים שרירים ועור ברצף עם משי סטרילי 5-0.
הערה: כדי לסחוט את האוויר מהחזה, סגור את החזה ברגע הרחבת הריאה והשתמש באצבעות המורות והאמצעיות כדי לסחוט בעדינות את הצלעות באמצע ולאפשר לאוויר לברוח מעבר לתפר האחרון. מזרקים יכולים לשמש גם כדי לחלץ גז החזה.
הערה: תפר פשוט מופרע מומלץ, שכן העכברים עשויים לכרסם את המשי כאשר הם ערים.
5. התאוששות
- נקה את כל כתם הדם לאחר הניתוח, או שהעכבר יותקף על ידי אחרים.
- הניחו את העכבר על כרית חימום בתנוחת משענת צידית. נטר ברציפות את סימני העכבר למשך 5-20 דקות עד שהם מתאוששים מההרדמה. זמן הניטור תלוי במצב הגוף.
הערה: עכברים נושמים ביתר קלות בתנוחת משענת צידית. - לאחר שחזור רפלקס התיקון, העבירו את העכברים לכלובי התאוששות נקיים על כרית חימום עם בקבוק מזון ומים. המשך לפקח במשך 15-30 דקות כדי להבטיח את הישרדותו של העכבר. הרחק את העכבר מאחרים לפני שיוכל לנוע באופן אוטונומי לחלוטין.
- כדי למנוע זיהום פצע, להזריק נתרן פניצילין תוך שרירית על פי המינון הרצוי (1,00,000-1,50,000 U/kg). לקבלת פרטים, עיין בהתוויית התרופה להמרת המינון.
- החזירו את העכבר לכלוב הביתי. המשך לנטר במשך 24 השעות הבאות לפני איסוף הדגימות. ניהול משככי כאבים לניסויים ארוכי טווח.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
העכברים הומתו 24 שעות לאחר קשירת העורק הכלילי, והדם נאסף לאחר ההרדמה. עכברים הורדמו על ידי טריברומואתנול (לפי שלב 3.2), ודגימת הדם נאספה מהסינוס הרטרואורביטלי. הלב נקטף, ומידת האיכמיה נבדקה על ידי צביעה של 2,3,5-Triphenyltetrazolium כלוריד (TTC) (איור 1). רקמות נורמליות הופכות אדומות כאשר TTC מגיב עם סוקסינט דהידרוגנאז, בעוד הרקמות האיסכמיות נשארות חיוורות עקב ירידה בפעילות דהידרוגנאז18. ללב של קבוצת MI+PM יש שטח אוטם גדול יותר מזה של קבוצת MI.
איור 2 מראה לוחות באבי העורקים על ידי O אדום שמן שמכתים17,19. שמן אדום O יכול לצבוע במדויק את השומנים הנייטרליים כגון טריגליצרידים ברקמות17. הכתמים האדומים בתמונה מציינים לוחות. באבי העורקים של קבוצת AS+PM היו יותר לוחות מאשר של קבוצת AS. איור 3 מראה את כלי פתיחת החזה הביתיים שהוזכרו ואת השימוש בהם.
איור 1: בדיקת צביעת TTC ברקמת הלב של העכבר. אזור האוטם מראה לבן. חשיפת PM החמירה את איסכמיה שריר הלב. שאם: לא סבל מניתוח MI או מחשיפה ל-PM; MI: סבל מניתוח MI אך ללא חשיפה ל- PM; MI+PM: סבל הן מניתוח MI והן מחשיפה ל-PM. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: דוגמאות מייצגות להכתמת O אדום שמן של אבי העורקים של עכברי ApoE−/− . הלוח באבי העורקים היה מוכתם באדום. האכלה עתירת שומן הובילה לטרשת עורקים בעכברי ApoE-/- וחשיפה ל-PM החמירה את טרשת העורקים. שאם: עכברים מסוג בר עם תזונה רגילה; AS: עכברי ApoE-/- עם תזונה עתירת שומן; AS+PM: עכברי ApoE-/- עם תזונה עתירת שומן, סבלו מחשיפה ל-PM . אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: כלים ביתיים לפתיחת חזה. יש להניח את כלי פתיחת החזה כדי לפתוח חלון ניתוח בעת השימוש. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הקמת מודל בעלי חיים מורכב שונה במקצת ממודל MI יחיד. שמירה על שיעור הישרדות גבוה היא מאתגרת בפיתוח המודל המורכב. חומרת טרשת העורקים בעכברי ApoE−/− תהיה חמורה יותר עם הארכת זמן ההאכלה עתיר השומן7, וחולשת העכברים מובילה לתמותה מוגברת. לכן, יש צורך לעקוב אחר מצב העכברים במהלך הניסוי באופן רציף ולהתאים את הזמן לגרימת טרשת עורקים בהתאם לצרכי הניסוי.
לחשיפה ל-PM עשויה להיות השפעה מועטה על שיעור ההישרדות של העכברים. אבל אינטובציה חוזרת של קנה הנשימה תגרום לדימום תוך אוראלי ובצקת בעכברים20, מה שיגביר את הקושי של הניסויים הבאים. לכן, יש צורך לתרגל את תהליך אינטובציה בחריצות. נסו למצוא את המיקום הנכון בכמה שפחות ניסיונות. מכיוון שנדרשת תקופה ארוכה בניסוי זה, יש צורך בקיצור החותכות הארוכות של העכבר. גיזום החותכות הארוכות של העכבר צריך להימנע במהלך הניתוחים, כולל אינטובציה אנדוטרכאלית; אחרת, החותכות החדות עלולות לשרוט את לשון העכבר ולגרום לדימום.
ניתוח קשירת LAD משפיע על שיעור ההישרדות של העכברים. קשירה תוך-תאית קלאסית ושמרנית של העורק הכלילי LAD נבחרה בקפידה ולא ב'מודל היעיל'10 (שיטה שדוחקת את הלב החוצה מהחזה) כדי להשיג הישרדות טובה יותר לטווח ארוך לאחר ניתוח עם עלויות אימון נמוכות יותר.
הדברים החיוניים ביותר בפעולה הם הרדמה, שמירה על נשימת העכבר ומניעת דימום. בהשוואה לפנטוברביטל, טריברומואתנול יכול לשפר באופן משמעותי את שיעור ההישרדות של עכברים. העכבר יהיה מחוסר הכרה 2-5 דקות לאחר ההרדמה, ומצב זה נמשך בדרך כלל עד סוף הניתוח. אם העכבר מתעורר, זריקה נוספת של 0.05 מ"ל הרדמה ניתנת.
לאחר פתיחת חלל החזה, יש לחבר את מכונת ההנשמה עד הסוף. אם אינטובציה קנה הנשימה נופל באמצע, חלל החזה צריך להיות אטום מיד עם מלקחיים hemostatic, ואת הניסוי ניתן להמשיך לאחר חיבור מחדש של מכונת ההנשמה. יש להימנע מדימום במהלך הניתוח. תהליך הדימום נוטה להתרחש בחזה הפתוח, קרום הלב הוסר, LAD ligated. אם הדימום מתרחש, להסיר את הדם עם צמר גפן. פליטה צריכה להיות סחוטה לחלוטין בעת סגירת חלל החזה, או להשתמש צינור החזה8 כאשר החזה סגור.
שיטת החשיפה PM בעכברים כוללת בעיקר מגדל חשיפה21, הזרקת וריד זנב22, וטפטוף קנה הנשימה23. למגדלי חשיפה יש עלויות עצומות (בגלל ציוד יקר וצריכת PM עצומה), בעוד שהזרקת וריד הזנב שונה לגמרי מהתבנית הטבעית של חשיפת PM. טפטוף קנה הנשימה הוא דרך פשרה. בהשוואה לנשימה בחשיפה ל-PM, טפטוף קנה הנשימה הוא תהליך חשיפה פסיבי. התפלגות PM בקנה הנשימה והריאות עשויה להיות שונה מהמצב הטבעי. אבל כשיטה קלאסית, טפטוף קנה הנשימה הוא מדויק מבחינה כמותית וקל ליישום9. למרות שההחדרה לאף פחות מזיקה, עם החדרת האף, חלק מהתרחיף עשוי להיכנס לריאות, חלקו עשוי להיכנס למערכת העיכול, וחלקו יישאר בחלל האף. מכיוון שמתלי PM לא ייכנסו כולם לריאות, החדרה לאף אינה יכולה לדמות חשיפה לזיהום אוויר. לעומת זאת, הזרקת החומר החלקיקי לקנה הנשימה מבטיחה שכל החומר החלקיקי ייכנס ישירות לריאות. בנוסף, חלל האף קטן יותר ודורש ריכוז גבוה יותר של ההשעיה כדי להשיג את המינון הרצוי, מה שמקשה על השליטה במינון הממוצע הניתן.
הפרוטוקול הנוכחי סובל ממגבלות מסוימות. חומרי הגלם של השעיית PM המשמשים בהחדרת קנה הנשימה הם חומר חלקיקי סטנדרטי ממנועי דיזל. הוא מכיל בעיקר פחמימנים ארומטיים פוליציקליים, שהוא אחד המרכיבים העיקריים של PM. המרכיבים הכימיים של PM מהאטמוספרה כוללים חנקות, סולפטים, יסודות, פחמן אורגני, תרכובות אורגניות (למשל, פחמימנים ארומטיים פוליציקליים), תרכובות ביולוגיות (למשל, אנדוטוקסין, שברי תאים) ומתכות (למשל, ברזל, נחושת, ניקל, אבץ וונדיום)24. תקן החומר החלקיקי עשוי להיות שונה מהחומר החלקיקי שבאוויר, שגם הוא אינו בחירה מושלמת. הרכב החומר החלקיקי משתנה לפי אזור, אקלים ועונה. לכן, ראש הממשלה שנאסף מהאוויר אינו ודאי, מה שגורם לניסויים להיות מאתגרים לחזור על עצמם עם אותן תוצאות. שימוש בתקני PM יכול לתת למחקר יכולת חזרה טובה יותר.
בסך הכל, תואר מודל של איסכמיה שריר הלב המתרחשת על בסיס טרשת עורקים בעקבות חשיפה לחומר חלקיקי. מודל זה יכול לשמש כדי לחקור את ההשפעה של זיהום אוויר על מחלות לב וכלי דם ולספק התייחסות להקמת מודל בעלי חיים של מחלות מורכבות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין אינטרסים כלכליים מתחרים להצהיר.
Acknowledgments
מודל זה פותח בתמיכת הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מס' 81673640, 81841001 ו-81803814) והתוכנית הלאומית הגדולה למדע וטכנולוגיה של סין לתרופות חדשניות (2017ZX09301012002 ו-2017ZX09101002001-001-3).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,2,2-Tribromoethanol | Sigma-Aldrich | T48402 | |
| 75% alcohol disinfectant | |||
| Animal ventilator | Shanghai Alcott Biotech | ALC-V8S | |
| Cotton swabs | Sterile | ||
| Cotton swabs for babies | Sterile , Approximately 3 mm in diameter | ||
| Culture Dish | Corning | 430597 | 150 mm x 25 mm |
| Diesel Particulate Matter | National Institute of Standards Technology | 1650b | |
| Dissection board | About 25 x 17 cm. The dissecting board can be replaced with a wooden board of the same size | ||
| High-fat diet for mice | Prescription: egg yolk powder 10%, lard 10%, sterol 1%, maintenance feed 79% | ||
| Iodophor disinfectant | |||
| LED spotlight | 5 V, 3 W,with hoses and clamps | ||
| Medical silk yarn ball | Shanghai Medical Suture Needle Factory Co., Ltd. | - | 0-0 |
| Medical tape | 3M | 1527C-0 | |
| Micro Vascular Hemostatic Forceps | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. Surgical Instruments Factory | W40350 | |
| Needle Holders | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. Surgical Instruments Factory | JC32010 | |
| Normal saline | |||
| Ophthalmic Scissors | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. Surgical Instruments Factory | Y00040 | |
| Ophthalmic tweezer, 10cm, curved, with hooks | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. Surgical Instruments Factory | JD1080 | |
| Ophthalmic tweezer, 10cm, curved, with teeth | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. Surgical Instruments Factory | JD1060 | |
| Pipet Tips | Axygen | T-200-Y-R-S | 0-200 μL |
| Pipette | eppendorf | 3121000074 | 100 uL |
| Safety pin | Approximately 4.5 cm in length , for making chest opening tools | ||
| Small Animal I.V. Cannulas | Baayen healthcare suzhou | BAAN-322025 | I.V CATHETER 22FG x 25 MM |
| Suture needle with thread | Shanghai Medical Suture Needle Factory Co., Ltd. | - | 6-0,Nylon line |
| Suture needle with thread | JinHuan Medical | F503 | 5-0 |
| Syringe | 1 mL | ||
| Tert-amyl alcohol | |||
| Zoom-stereo microscope | Mshot | MZ62 |
References
- Al-Kindi, S. G., Brook, R. D., Biswal, S., Rajagopalan, S. Environmental determinants of cardiovascular disease: lessons learned from air pollution. Nature Reviews: Cardiology. 17 (10), 656-672 (2020).
- WHO. Ambient (outdoor) Air Pollution. WHO. , Available from: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/ambient-(outdoor)-air-quality-and-health (2021).
- Kim, K. H., Kabir, E., Kabir, S. A review on the human health impact of airborne particulate matter. Environment International. 74, 136-143 (2015).
- Rajagopalan, S., Al-Kindi, S. G., Brook, R. D. Air pollution and cardiovascular disease: JACC State-of-the-Art Review. Journal of the American College of Cardiology. 72 (17), 2054-2070 (2018).
- Wolf, K., et al. Associations between short-term exposure to particulate matter and ultrafine particles and myocardial infarction in Augsburg, Germany. International Journal of Hygiene and Environmental Health. 218 (6), 535-542 (2015).
- Sun, Q., Hong, X., Wold, L. E. Cardiovascular effects of ambient particulate air pollution exposure. Circulation. 121 (25), 2755-2765 (2010).
- Emini Veseli, B., et al.
- Reichert, K., et al. Murine Left anterior descending (LAD) coronary artery ligation: An improved and simplified model for myocardial infarction. Journal of Visualized Experiments. (122), e55353 (2017).
- Lei, J., et al. The acute effect of diesel exhaust particles and different fractions exposure on blood coagulation function in mice. International Journal of Environmental Research and Public Health. 18 (8), 4136 (2021).
- Gao, E., et al. A novel and efficient model of coronary artery ligation and myocardial infarction in the mouse. Circulation Research. 107 (12), 1445-1453 (2010).
- Pei, Y. H., et al. LncRNA PEAMIR inhibits apoptosis and inflammatory response in PM2.5 exposure aggravated myocardial ischemia/reperfusion injury as a competing endogenous RNA of miR-29b-3p. Nanotoxicology. 14 (5), 638-653 (2020).
- Jia, H., et al. PM2.5-induced pulmonary inflammation via activating of the NLRP3/caspase-1 signaling pathway. Environmental Toxicology. 36 (3), 298-307 (2021).
- Vogel, B., et al.
- Libby, P.
- Zhou, Z., et al. Excessive neutrophil extracellular trap formation aggravates acute myocardial infarction injury in Apolipoprotein E deficiency mice via the ROS-dependent pathway. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2019, 1209307 (2019).
- Pluijmert, N. J., Bart, C. I., Bax, W. H., Quax, P. H. A., Atsma, D. E. Effects on cardiac function, remodeling and inflammation following myocardial ischemia-reperfusion injury or unreperfused myocardial infarction in hypercholesterolemic APOE*3-Leiden mice. Scientific Reports. 10 (1), 16601 (2020).
- Centa, M., Ketelhuth, D. F. J., Malin, S., Gistera, A.
- Benedek, A., et al. Use of TTC staining for the evaluation of tissue injury in the early phases of reperfusion after focal cerebral ischemia in rats. Brain Research. 1116 (1), 159-165 (2006).
- Mehlem, A., Hagberg, C. E., Muhl, L., Eriksson, U., Falkevall, A. Imaging of neutral lipids by oil red O for analyzing the metabolic status in health and disease. Nature Protocols. 8 (6), 1149-1154 (2013).
- Nelson, A. M., Nolan, K. E., Davis, I. C.
- Zheng, Z., et al. Exposure to fine airborne particulate matters induces hepatic fibrosis in murine models. Journal of Hepatology. 63 (6), 1397-1404 (2015).
- Bai, N., van Eeden, S. F. Systemic and vascular effects of circulating diesel exhaust particulate matter. Inhalation Toxicology. 25 (13), 725-734 (2013).
- Furuyama, A., Kanno, S., Kobayashi, T., Hirano, S. Extrapulmonary translocation of intratracheally instilled fine and ultrafine particles via direct and alveolar macrophage-associated routes. Archives of Toxicology. 83 (5), 429-437 (2009).
- Brunekreef, B., Holgate, S. T.
