Summary
De hier beschreven methoden schetsen een procedure die wordt gebruikt om cocaïne-geïnduceerde plasticiteit in een gedragsrelevant circuit bij ratten op optogenetisch om te keren. Aanhoudende laagfrequente optische stimulatie van thalamo-amygdala synapsen induceert langdurige depressie (LTD). In vivo optogenetisch geïnduceerde LTD bij cocaïne-ervaren ratten resulteerde in de daaropvolgende verzwakking van cue-gemotiveerde drug seeking.
Abstract
Dit protocol demonstreert de stappen die nodig zijn om optogenetische hulpmiddelen te gebruiken om cocaïne-geïnduceerde plasticiteit in thalamo-amygdala-circuits om te keren om het daaropvolgende cocaïnezoekgedrag bij de rat te verminderen. In ons onderzoek hadden we ontdekt dat wanneer ratten zelf intraveneuze cocaïne toedienen in combinatie met een audiovisuele cue, synapsen gevormd bij inputs van de mediale geniculate kern van de thalamus (MGN) op de belangrijkste neuronen van de laterale amygdala (LA) sterker worden naarmate de cue-cocaïne associatie wordt geleerd. We veronderstelden dat het omkeren van de door cocaïne geïnduceerde plasticiteit bij deze synapsen cue-gemotiveerde cocaïnezoekgedrag zou verminderen. Om dit type neuromodulatie in vivo te bereiken, wilden we synaptische langdurige depressie (LTD) induceren, die de sterkte van MGN-LA-synapsen vermindert. Hiervoor gebruikten we optogenetica, die neuromodulatie van hersencircuits met behulp van licht mogelijk maakt. De exciterende opsine oChiEF werd uitgedrukt op presynaptische MGN-terminals in de LA door een AAV met oChiEF in de MGN te injecteren. Optische vezels werden vervolgens geïmplanteerd in de LA en 473 nm laserlicht werd gedurende 15 minuten gepulseerd met een frequentie van 1 Hz om LTD te induceren en cocaïne-geïnduceerde plasticiteit om te keren. Deze manipulatie produceert een langdurige vermindering van het vermogen van signalen geassocieerd met cocaïne om drugszoekende acties te induceren.
Introduction
Middelenmisbruik is een zeer ernstig probleem voor de volksgezondheid in de VS en wereldwijd. Ondanks tientallen jaren van intensief onderzoek zijn er zeer weinig effectieve therapeutische opties 1,2. Een grote tegenslag voor de behandeling is het feit dat chronisch drugsgebruik langdurige associatieve herinneringen genereert tussen omgevingssignalen en het medicijn zelf. Herblootstelling aan drugsgerelateerde signalen stimuleert fysiologische en gedragsmatige reacties die aanhoudend drugsgebruik en terugval motiveren3. Een nieuwe therapeutische strategie is om op geheugen gebaseerde behandelingen uit te voeren die gericht zijn op het manipuleren van de circuits die betrokken zijn bij het reguleren van drug-cue-associaties. Onlangs werd waargenomen dat synapsen in de laterale amygdala (LA), met name die welke voortkomen uit de mediale geniculate nucleus (MGN) van de thalamus, worden versterkt door herhaalde cue-geassocieerde cocaïne zelftoediening, en dat deze potentiëring cocaïnezoekgedrag kan ondersteunen 4,5. Daarom werd voorgesteld dat cue-geïnduceerde re-integratie kon worden verzwakt door plasticiteit bij MGN-LA synapsen om te keren.
Het vermogen om de synaptische plasticiteit van een specifiek hersencircuit nauwkeurig te richten, is een grote uitdaging voor het veld geweest. Traditionele farmacologische hulpmiddelen hebben enig succes gehad bij het verminderen van terugvalgedrag, maar worden beperkt door het onvermogen om individuele synapsen te manipuleren. De recente ontwikkeling van in vivo optogenetica heeft echter de tools opgeleverd die nodig zijn om deze beperkingen te overwinnen en neurale paden te beheersen met temporele en ruimtelijke precisie 6,7,8. Door lichtgevoelige opsins in een specifiek hersencircuit tot expressie te brengen, kan laserlicht vervolgens worden gebruikt om het circuit te activeren of te remmen. Frequentieafhankelijke optische stimulatie kan worden gebruikt om specifiek de synaptische plasticiteit van het circuit in een zich gedragend dier te manipuleren.
Dit manuscript schetst de procedure die is gevolgd om het gedragsrelevante MGN-LA-circuit te manipuleren met behulp van in vivo optogenetica. Eerst werd de exciterende opsine oChIEF uitgedrukt in de MGN en werden optische vezels bilateraal geïmplanteerd in de LA. Dieren werden vervolgens getraind om zelf cocaïne toe te dienen op een cue-afhankelijke manier, wat de MGN-LA-route versterkt. Vervolgens werd aanhoudende, laagfrequente stimulatie met 473 nm laserlicht gebruikt om circuitspecifieke LTD te produceren. Het omkeren van de plasticiteit geïnduceerd door cocaïnegebruik genereerde een langdurige vermindering van het vermogen van signalen om acties te activeren die geassocieerd zijn met drugszoekgedrag.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De experimenten die in dit protocol worden beschreven, waren in overeenstemming met de richtlijnen van de National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals en werden goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee van de University of Pittsburgh. Alle procedures werden uitgevoerd met volwassen, naïeve Sprague-Dawley-ratten die bij aankomst 275-325 g wogen.
1. Bouw van optische vezelimplantaten en patchkabels
- Bereid optische vezelimplantaten voor volgens eerder gepubliceerde protocollen9. Experimenten beschreven in dit protocol gebruikten 200 μm kernvezel (0,5 NA) en Ø1,25 mm Multimode LC / PC Keramische ferrule, Ø230 μm gatgrootte.
- Gebruik een Dremel-gereedschap om het onderste derde deel van een ferrule te scoren (het dichtst bij het platte uiteinde van de ferrule). Het scoren van de ferrules helpt hen gehecht te blijven aan tandcement, waardoor de kans toeneemt dat ze veilig blijven gedurende de hele duur van het experimenteren.
- Gebruik draadsnijders om ~35 mm vezel te snijden. Gebruik fiber stripping tool om ~25 mm vezel te strippen, waardoor 10 mm onbelicht blijft.
- Bereid warmte-uithardende epoxy volgens de instructies van de fabrikant. Los 1 g harspoeder op in 100 mg verharderverbinding. Bevestig een stompe naald van 25 gauge aan een spuit van 1 ml. Vul de spuit met epoxy en bevestig een stompe naaldpunt van 25 gauge.
- Gebruik een bankschroef of klem om de ferrule stevig vast te houden met de platte kant naar boven en de bolle kant naar beneden. Voeg met de met epoxy gevulde spuit één druppel epoxy toe aan de platte kant van de ferrule en wees voorzichtig om overtollige epoxy van de zijkanten van de ferrule af te vegen.
- Steek het gestripte deel van de vezel door de ferrule waardoor een extra 5 mm gestripte vezel wordt blootgesteld. In het geval van LA-implantaten wordt de vezel 7,9 mm ventraal geïmplanteerd tot bregma, dus de blootgestelde lengte van niet-gespannen vezels moet ~ 13 mm zijn.
- Hard de epoxy uit met een warmtepistool gedurende ongeveer 30-40 s totdat deze zwart / amber van kleur wordt.
- Scoor de vezel direct op het grensvlak van het bolle uiteinde van de ferrule met een diamantmes en gebruik een vinger om de vezel voorzichtig af te tikken.
- Poets het bolle uiteinde van de ferrule door vast te houden met een hemostat, zorg ervoor dat u gelijkmatige druk uitoefent en maak 20 cirkelvormige rotaties elk op een reeks polijstpapier (van hoge kwaliteit tot lage kwaliteit; 5, 3, 1, 0,3 μm).
- Bevestig de niet-gespannen vezel aan de tafel met behulp van tape en score gestripte vezels, waardoor een extra 2 mm voorbij de ventrale coördinaat overblijft (voor LA-implantaten is de uiteindelijke lengte van de vezel ~ 10 mm). Gebruik een hemostat om aan de ferrule te trekken en de vezel gelijkmatig te breken waar deze is gescoord. Pas op dat u vezels niet volledig snijdt tijdens het scoren, anders wordt de kern van de vezel beschadigd.
- Bouw patchkabels die compatibel zijn met optische vezelimplantaten. Op maat ontworpen patchkabels werden aangeschaft (zie materiaaltabel). Als alternatief kunnen patchkabels worden gebouwd volgens eerder gepubliceerde protocollen9.
OPMERKING: De diameter en NA van de ferrulevezel en patchkabelvezel moeten overeenkomen op de koppelingsverbinding om overmatig verlies van licht te voorkomen, wat kan resulteren in het niet voldoende stimuleren van neurale activiteit. - Meet de lichtopbrengst via de patchkabel en optische vezelimplantaten door patchkabel/optische vezel aan een geschikte laserlichtbron (473 nm, 1 mW output) te bevestigen en de output te meten met een lichtsensor. Een succesvol geconstrueerde vezel zendt een concentrische lichtcirkel uit en heeft niet meer dan 30% lichtverlies.
2. Intraveneuze katheterisatie van knaagdieren, virusafgifte en implantatie van optische vezels
- Bereid het dier voor op een operatie.
- Verdoof ratten volledig met verdoving naar keuze op basis van institutionele richtlijnen. Een optie is ketaminehydrochloride (87,5-100 mg / kg, i.m.) en xylazinehydrochloride (5 mg / kg, i.m.). Zorg ervoor dat de rat volledig verdoofd is door te controleren op het ontbreken van een teenknijpreflex.
LET OP: Ketamine is een gereguleerde stof die moet worden behandeld volgens institutionele richtlijnen.
OPMERKING: Intramusculaire injectie van anesthetica wordt in deze studie gebruikt omdat het een snellere en betrouwbaardere anesthesie-inductie produceerde dan intraperitoneale injectie. Controleer continu de ademhaling en het reactievermogen van de rat en bied thermische ondersteuning tijdens de operatie. - Scheer een groot deel van de rug van de rat (bovenrug van net boven de schouderbladen tot het midden van de rug), evenals het gebied van de nek onder de rechtervoorpoot en de hoofdhuid.
- Plaats de rat in het operatiegebied en breng puralube (kunstmatige tranen) aan op de ogen. Injecteer een lichaamsgewichtvolume carprofen (analgeticum) subcutaan (s.c.) door de huid van de bovenrug en injecteer vervolgens 5 ml Lactated Ringer's oplossing s.c. door de huid van de onderrug.
- Ontsmet alle chirurgische plaatsen door een stuk steriel gaas met betadine te bevochtigen en het met een cirkelvormige beweging over het geschoren chirurgische gebied af te vegen. Herhaal vervolgens het proces met 70% ethanol. Herhaal deze afwisselende cyclus drie keer.
- Verdoof ratten volledig met verdoving naar keuze op basis van institutionele richtlijnen. Een optie is ketaminehydrochloride (87,5-100 mg / kg, i.m.) en xylazinehydrochloride (5 mg / kg, i.m.). Zorg ervoor dat de rat volledig verdoofd is door te controleren op het ontbreken van een teenknijpreflex.
- Voer intraveneuze katheterimplantatie uit volgens eerder gepubliceerde protocollen 4,10.
OPMERKING: Een chirurgisch gordijn wordt tijdens deze operatie niet gebruikt om irritatie tijdens katheterimplantatie te voorkomen. Steriliseer alle instrumenten en apparatuur voor gebruik. Gebruik steriele handschoenen en vervang de handschoenen als er contact wordt gemaakt met een niet-steriel oppervlak. - Onmiddellijk na katheterimplantaties moet u de rat in een stereotaxisch frame vastzetten om AAV-injecties uit te voeren.
- Lever een subcutane (s.c) injectie van 2% lidocaïne (0,2-0,3 ml) op de hoofdhuid als een lokaal verdovingsmiddel.
OPMERKING: Lokale verdoving wordt niet gebruikt tijdens de intraveneuze katheterimplantatie om wijzigingen in de chirurgische uitkomsten te voorkomen. - Sluit een 26-gauge roestvrijstalen injectiecanule aan op een Hamilton-spuit gevuld met 1 μL geconcentreerde AAV-oplossing: AAV5-hSyn-tdTomato of AAV5-hSyn-oChIEF-tdTomato
OPMERKING: oChIEF is een variant van de blauwlichtgevoelige opsinekanaalrhodopsine (ChR2), die kan reageren op een breed frequentiebereik 8,11, en daarom nut heeft voor de laagfrequente LTD-experimenten die in dit protocol worden besproken, maar ook voor hoogfrequente LTP-experimenten (hier niet besproken). De oChIEF-constructie werd geschonken door Dr. Roger Tsien en verwerkt voor verpakking en zuivering door de Duke Viral Vector Core. Er is ten minste 3-4 weken nodig tussen de injectiedag en de dag van LTD-inductie om optimale virusexpressie in MGN-axonterminals mogelijk te maken.
LET OP: Over het algemeen wordt AAV beschouwd als een bioveiligheidsniveau 1 (BSL-1) organisme, met een laag risico op zelfinfectie, tenzij een helpervirus wordt gebruikt bij de productie ervan. Het gebruik ervan vereist IACUC-goedkeuring en de juiste PBM moeten te allen tijde worden gebruikt in overeenstemming met institutionele richtlijnen om onnodige blootstelling te beperken. - Maak met behulp van een scalpel een incisie van 0,5 mm van de voorkant naar de achterkant van de schedel en verwijder bovenliggend weefsel om het oppervlak van de schedel bloot te leggen.
- Egaliseer de kop van de rat in de voorste/achterste as en nul stereotaxische coördinaten naar bregma.
- Boor drie kleine gaatjes door de schedel met behulp van een Dremel-gereedschap uitgerust met een kleine boor. Gebruik de schroevendraaier om roestvrijstalen schroeven (M2x4 965-A2) stevig op hun plaats te monteren.
OPMERKING: Schroeven zijn nodig voor een goede binding van tandcement en het creëren van stevige, duurzame kopkappen. De positie van de schroeven moet worden verspreid over de voorste-achterste as van de schedel en weg van de AAV-injectieplaats. - Boor bilaterale gaten voor injectie van AAV op basis van de coördinaten van de Rattenhersenatlas (Watson en Paxinos)12 voor het mediale deel van de mediale geniculate nucleus (MGN); in mm van bregma, AP: -5,4; ML: ±3,0; DV: -6,6. Verlaag langzaam de injectiecanulee (4 mm/min) totdat deze in de MGN is geplaatst. Injecteer geconcentreerde AAV-oplossing met een snelheid van 0,1 μL/min.
- Laat de injectiecanule 5 minuten op zijn plaats nadat de infusies zijn voltooid om diffusie weg van de canule mogelijk te maken en trek vervolgens de canule langzaam uit de hersenen terug.
- Lever een subcutane (s.c) injectie van 2% lidocaïne (0,2-0,3 ml) op de hoofdhuid als een lokaal verdovingsmiddel.
- Onmiddellijk na virusinjecties, doorgaan met het implanteren van optische vezels 4,9 gericht op MGN-LA terminals.
- Gebruik een Dremel-gereedschap om bilaterale gaten te boren voor optische vezelimplantaten gericht op de laterale amygdala (in mm van bregma, AP: -3.0; ML ±5.1).
- Gebruik een tang om de ferrule van het optische vezelimplantaat te pakken en bevestig deze aan de stereotaxische adapters, zodat ze veilig op hun plaats worden gehouden.
- Verlaag langzaam de vezels met een snelheid van 2 mm / min, totdat de punt van de vezel in het dorsale gedeelte van de LA zit (DV: -7,9 mm).
- Bevestig ferrules eerst aan de schedel met behulp van een dunne laag Loctite instant lijm gevolgd door tandcement en bedek ferrules met ferrule sleeves met een diameter van 1,25 mm en stofdeksels.
OPMERKING: De keuze van de lijm voor het bevestigen van de ferrules aan de schedel moet worden goedgekeurd door de lokale of institutionele commissie voor dierenverzorging en -gebruik. Loctite wordt voor dit onderzoek gebruikt om de ferrules na vallen en opstaan betrouwbaar aan de schedel te bevestigen met meerdere lijmen; er kunnen echter beschikbare alternatieven worden overwogen.
- Na chirurgische ingrepen huisvest u ratten individueel en biedt u gratis toegang tot voedsel en water. Bied postoperatieve zorg in overeenstemming met institutionele richtlijnen. Spoel katheters dagelijks met zoutoplossing die gentamicine (5 mg / ml) en heparine (30 USP / ml) bevat om de doorgankelijkheid te behouden. Ten minste 5 dagen na de operatie en 24 uur voor het begin van gedragsexperimenten, beperkt voedsel ratten tot ~ 90% van hun vrije voedende gewicht.
3. Zelftoediening van knaagdiercocaïne en instrumentele hefboomuitsterving
OPMERKING: Alle gedragsprocedures worden uitgevoerd in standaard operante conditioneringskamers, uitgerust met twee intrekbare hendels aan één muur, een stimuluslicht boven elke hendel, een toongenerator, een huislamp en een infusiepomp.
- Onderwier ratten aan dagelijkse 1-h cocaïne (2 mg / ml) zelftoedieningstrainingen volgens een FR1-schema van versterking.
- Plaats ratten elke dag in een operante kamer en laat ratten met een hefboom drukken. Een druk op de aangewezen 'actieve hefboom' (tegenwicht over linker- en rechterhendels) resulteert in een cocaïne-infusie (1,0 mg/kg/infusie) en een presentatie van 10 s van een samengestelde licht- en toonkeu. Een druk op de aangewezen 'inactieve hefboom' heeft geen geprogrammeerde effecten.
- Ga door met zelftoedieningsexperimenten gedurende ten minste 10 d en totdat ratten met succes ten minste 8 infusies / dag verdienen gedurende 3 opeenvolgende dagen. Het niet bereiken van acquisitiecriteria op dag 20 resulteert in uitsluiting van het onderzoek.
- Nadat met succes aan de acquisitiecriteria is voldaan, onderwerpen ratten aan 1 uur instrumentele uitstervingssessies gedurende 6-10 d.
- Plaats ratten in operante kamers en laat ratten vrijelijk drukken. Reacties op zowel de actieve als de inactieve hefboom hebben echter geen geprogrammeerde gevolgen.
- Laat ratten dagelijks doorgaan met het uitsterven van instrumenten totdat er gemiddeld < 25 hefboomdrukken gedurende twee opeenvolgende dagen plaatsvindt.
4. In vivo optogenetische inductie van LTD
OPMERKING: Optogenetische remmingsexperimenten vinden plaats 24 uur na de laatste dag van instrumentele extinctie.
- Sluit patchkabels aan op een blauwe laserdiode van 473 nm via een roterende verbinding die boven een schone, standaard knaagdierhuiskooi hangt met de afdekking verwijderd. Met deze opstelling kunnen knaagdieren vrij door de kooi bewegen tijdens de optogenetische stimulatie.
- Schakel de laserdiode in volgens de gebruiksaanwijzing en sluit deze aan op een pulsgenerator. Pas de instellingen aan, zodat de rat bij het inschakelen 900 2-ms lichtpulsen bij 1 Hz ontvangt.
LET OP: De juiste oogbescherming moet te allen tijde worden gebruikt tijdens het gebruik van de laser. - Meet de lichtintensiteit via het patchsnoer met behulp van een lichtsensor. Pas de intensiteit van de laser aan zodat de lichtopbrengst via de patchkabel ~5-7 mW is.
- Plaats ratten in een schone kooi. Verwijder stofdeksels en ferrule sleeves, waardoor de ferrules bloot komen te liggen. Sluit patchkabels bilateraal aan op de optische vezelimplantaten. Laat ratten de omgeving gedurende 3 minuten verkennen voorafgaand aan ltd-inductie.
- Schakel de pulsgenerator in om optogenetische stimulatie te starten.
OPMERKING: Hoewel onwaarschijnlijk, als rat bijwerkingen op stimulatie ervaart, wordt het experiment onmiddellijk beëindigd en worden ratten op de juiste manier geëuthanaseerd op basis van institutionele richtlijnen. - Houd ratten na LTD-inductie 3 minuten in de kooi en plaats ze vervolgens terug in hun thuiskooien.
- Gebruik voor controle-experimenten dezelfde stimulatieprocedure bij ratten die het AAV5-tdTomato-controlevirus tot expressie brengen. Voor schijnexperimenten bevestigt u een patchkabel aan de optische vezel van ratten die het AAV5-oChIEF-virus tot expressie brengen, maar er wordt geen stimulatie geleverd tijdens een sessie van 15 minuten.
5. Test het effect van optogenetische stimulatie op cue-geïnduceerde cocaïne zoeken
- Plaats ratten 24 uur na in vivo optogenetische stimulaties terug in operante conditioneringskamers. Ratten worden onderworpen aan een 1-h standaard cue-geïnduceerde herplaatsingssessie om cocaïnezoekgedrag te beoordelen.
OPMERKING: Tijdens cue-geïnduceerde re-integratie levert een respons op de actieve hefboom een 10-s presentatie van de cocaïne-geassocieerde cue op, maar geen cocaïne-infusies. - Geef een tweede herplaatsingstest ten minste 1 week na de eerste test om te bepalen of optogenetische LTD-inductie resulteert in een langdurige onderdrukking van cocaïne zoeken
6. Kleuring, fluorescentie en beeldvorming voor histologische verificatie van virale expressie en plaatsing van optische vezels
- Maak 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en 4% paraformaldehyde (PFA). Bewaar beide oplossingen op ijs. Het totale volume zal afhangen van het aantal ratten in het onderzoek (~100 ml PBS en 200 ml PFA zal per rat worden gebruikt).
LET OP: PFA is een giftige chemische stof en bekend carcinogeen. Wees goed voorzichtig om inademing en contact met de huid te voorkomen. Het gebruik en de verwijdering ervan moeten in overeenstemming zijn met de institutionele richtsnoeren, met inbegrip van het gebruik van de juiste PBM en een chemische stromingskap. - Installatie peristaltische pomp bij een debiet van 20 ml/min. Vul slang van pomp met 1x PBS. Bevestig een stompe naald van 20 gauge aan het uiteinde van de buis.
- Verdoof ratten diep met natriumpentobarbital (100 mg/kg, i.p.). Bevestig de diepte van de anesthesie door een gebrek aan reactie op teenknijpen voordat u verder gaat.
OPMERKING: Natriumpentobarbital wordt gebruikt omdat de perfusie een terminale procedure is. - Gebruik een chirurgische schaar om de buikholte van de rat onder het middenrif open te snijden. Snijd de ribbenkast rostrale langs de zijranden om het hart van de rat bloot te leggen. Gebruik hemostat om het rostrale deel van de ribbenkast weg te klemmen van het hart. Snijd al het bovenliggende vetweefsel dat het hart omringt weg.
- Steek de stompe naald door de linker ventrikel en omhoog in de aorta. Snijd een klein gaatje in het rechter atrium om de oplossing af te voeren terwijl deze terugkeert naar het hart.
- Perfuseer elke rat met 1x PBS gedurende 5 minuten gevolgd door 4% PFA, pH 7,4 gedurende 10 min.
- Onthoofd de rat, haal de hersenen eruit en postfixeer het in 4% PFA gedurende 24 uur. Breng vervolgens de hersenen over naar 30% sucrose-oplossing gedurende 2-3 d.
- Sectie hersenen op 50 μm met behulp van een cryostaat.
- Monteer alle plakjes met de LA of MGN op glazen dia's en coverslip.
- Beeldsegmenten met behulp van een epifluorescente microscoop om de AAV-oChIEF-tdTomato-expressie in de MGN en de projecties naar de LA te verifiëren, evenals de plaatsing van de optische vezel boven de LA.
7. Perfusie en acute hersenschijfvoorbereiding voor elektrofysiologische experimenten
OPMERKING: Elektrofysiologische experimenten worden uitgevoerd op een subset van dieren om het succes van in vivo LTD te valideren.
- Bereid elektrofysiologische oplossingen met behulp van de in de tabellen 1-3 4,13 vermelde reagentia. Stel de pH van alle oplossingen in op 7,4 met HCl en stel de osmolariteit in op 300-310 mOsm/kg H2O. Maak oplossingen vers voorafgaand aan experimenten en bewaar ze maximaal 1 week bij 4 °C. Verzadig alle oplossingen met carbogen (95% O2/5% CO2) te allen tijde tijdens gebruik.
- Gebruik isofluraan volgens de lokale of institutionele dierverzorging en gebruiksrichtlijnen, verdoof de rat diep in een afgesloten euthanasiekamer. Controleer of het dier volledig verdoofd is via de teen-knijpreflex.
- Vul een klein bekerglas met 50 ml ijskoude snijoplossing. Vul de slang van de peristaltische pomp met een oplossing en pas het debiet aan op 20 ml / min. Bevestig een stompe naald van 20 gauge aan het uiteinde van de buis.
- Open de buikholte (zie stappen 6.4 en 6.5) en perfuseer rat kort met snijoplossing (maximaal 1-2 min).
- Na perfusie, onthoofd rat onmiddellijk. Verwijder de hersenen en plaats deze in een klein bekerglas gevuld met 4 °C snijoplossing gedurende 30 s-1 min.
- Breng hersenen over met een spatel en bevestig ze snel naar de kamer van een vibratoom. Verwijder de pia met een fijne tang. Vul de kamer met een snijoplossing van 4 °C en bereid acute coronale plakjes (250 μm dik) van de amygdala met een snelheid van 0,37 mm/sec en een frequentie van 70 Hz.
- Als plakjes worden verkregen, plaatst u ze allemaal in een met snijoplossing gevulde bewaarkamer en incubeert u ze gedurende 10-12 minuten bij 37 °C. Ongeveer 5-7 plakjes met de LA kunnen per dier worden verkregen.
- Breng plakjes over naar een bekerglas met kamertemperatuur (RT) holdingoplossing en laat >30 minuten herstellen voordat u experimenteert.
OPMERKING: Plakjes blijven over het algemeen gezond terwijl ze 4-6 uur in de bewaaroplossing worden bewaard. Vanwege het fluorescerende karakter van de AAV worden plakjes bewaard bij weinig licht.
8. Ex vivo elektrofysiologische opnames
- Bereid intracellulaire oplossingen met behulp van de in de tabellen 4-5 vermelde reagentia.
OPMERKING: Intracellulaire oplossingen moeten voorafgaand aan experimenten worden gemaakt en kunnen langdurig (3-12 maanden) worden bewaard bij -80 °C of op korte termijn (1-2 maanden) bij -20 °C. Oplossingen worden pH aangepast tot 7,3 (met CsOH voor Cs-gebaseerde intracellulaire oplossing en met KOH voor K-gebaseerde intracellulaire oplossing). Stel in op een uiteindelijke osmolariteit van 290-300 mOsm/kg H2O. - Bereid 500 mM picrotoxine stockoplossing opgelost in dimethylsulfoxide (DMSO).
OPMERKING: Picrotoxinevoorraden worden gealiquoteerd en opgeslagen bij -20 °C. Op de dag van gebruik worden aliquots ontdooid en toegevoegd aan de registratieoplossing tot een eindconcentratie van 100 μM.
LET OP: Picrotoxine is een niet-competitieve antagonist van GABAA-receptoren , dus infusie van picrotoxine heeft een stimulerend effect. Het is ernstig giftig door orale inname of huidabsorptie. De juiste PBM's moeten te allen tijde worden gebruikt bij het werken met picrotoxine. - Breng plakjes over naar een rechtopstaande microscoop die is ontworpen voor elektrofysiologische experimenten.
- Tijdens experimenten worden plakjes continu geperfuseerd met een opnameoplossing die wordt verwarmd tot 31-33 °C.
- Vergroot de LA met behulp van een 4x-doelstelling. Identificeer de belangrijkste neuronen door morfologie met een 40x water onderdompeling lens.
- Gebruik een glazen pipet (3-5 MΩ) gevuld met een op Cs gebaseerde intracellulaire oplossing (voor spanningsklemexperimenten) of een op K gebaseerde intracellulaire oplossing (voor stroomklemexperimenten) om patchklemopnamen voor hele cellen te verkrijgen.
- Identificeer AAV-geïnfecteerde MGN axonale projecties onder fluorescentie (met behulp van een RFP-filter). Stimuleer projecties met behulp van een dpss-laser met blauw licht (473 nm) die is aangesloten op een pulsgenerator.
LET OP: Om de laserblootstelling te beperken, wordt gecollimeerd laserlicht gekoppeld aan een fluorescerende poort op de microscoop en gericht op het segment door het doel.
OPMERKING: In de spanningsklemmodus worden exciterende postsynaptische stromen (EPSC's) optisch opgeroepen bij 0,1 Hz. Neuronen die input ontvangen van AAV-geïnfecteerde MGN-neuronen zullen betrouwbare EPSC's vertonen. - Om ex vivo LTD te induceren, registreert u in de huidige klemmodus een stabiele basislijn van exciterende postsynaptische potentialen (EPSP's) gedurende ten minste 10 minuten. Lever vervolgens 900 2-ms pulsen van 473-nm licht met een frequentie van 1 Hz (totale tijd = 15 min). Neem vervolgens continu EPSP's op 0,1 Hz op gedurende ≥60 min.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een tijdlijn met de volgorde van experimenten is weergegeven in figuur 1. Gedurende gedragsexperimenten dient het aantal cocaïne-infusies en het aantal reacties op de actieve hefboom als een maat voor de intensiteit van cocaïnezoekgedrag. Tijdens de eerste dagen van zelftoediening van cocaïne moet het aantal actieve reacties geleidelijk toenemen gedurende elke acquisitiedag, voordat het in de tweede week stabiliseert. Omgekeerd moeten inactieve hefboomresponsen gedurende het gehele experiment laag blijven (figuur 2A). Op de eerste dag van instrumentele uitsterving is er meestal een toename van het aantal actieve hefboomreacties, omdat de onverwachte afwezigheid van cocaïne resulteert in de escalatie van cocaïnezoekgedrag. Deze respons zal echter geleidelijk afnemen met volgende sessies naarmate ratten de nieuwe contingentie leren, wat resulteert in een laag en stabiel aantal actieve hefboomresponsen binnen 6-10 d (figuur 2B). Ratten die de gespecificeerde verwervingscriteria niet bereiken in de zelftoedienings- of instrumentele extinctiefase van het experiment, worden uit het onderzoek verwijderd en gegevens worden niet opgenomen in de uiteindelijke analyse.
Na instrumentele uitsterving herstelt hernieuwde blootstelling aan cocaïne-geassocieerde signalen het cocaïnezoekgedrag, wat resulteert in een toename van het aantal actieve hefboomreacties. Deze toename wordt waargenomen in beide groepen controle-experimenten: ratten die werden geïnjecteerd met een virus zonder oChIEF (AAV-controle) en ratten die geen laserstimulatie ontvingen (SHAM-controle; Figuur 3A) Echter, in vivo optogenetische LTD van MGN-LA terminals veroorzaakte een vermindering van de daaropvolgende cue-geïnduceerde cocaïne-zoeken. 24 uur na inductie van optogenetische LTD was het aantal actieve hefboompersen significant verminderd ten opzichte van zowel AAV-controles als SHAM-controles (figuur 3A). Dit lage niveau van respons werd gehandhaafd tijdens een daaropvolgende herplaatsingstest 7 dagen later (uitgevoerd in een subgroep van ratten) (figuur 3B), wat wijst op een aanhoudende vermindering van cue-gemotiveerde cocaïnezoekopdrachten in meerdere herplaatsingstests.
Ex vivo elektrofysiologische opnamen van dieren die aan optische stimulatie werden blootgesteld, bevestigden dat de verzwakking bij het herstel inderdaad ten minste gedeeltelijk te wijten was aan een modulatie van MGN-LA synaptische plasticiteit. Dit werd aangetoond door een afname van de optisch opgeroepen EPSC-amplitude in LA-neuronen na blootstelling aan optische LTD (figuur 4A). Deze verzwakking in EPSC-amplitude was specifiek voor neuronen die optische stimulatie ontvingen, omdat epsc-amplitude onveranderd bleef in SHAM-controles. Bovendien was LTD niet in staat om te worden gegenereerd in plakjes van ratten die al in vivo optische stimulatie hadden ontvangen, maar werd het betrouwbaar opgeroepen in neuronen van ratten die SHAM-stimulatie ondergingen, zoals blijkt uit een aanhoudende vermindering van epsp-stijging (figuur 4B). In vivo optische stimulatie lijkt dus verdere LTD-inductie in plak te voorkomen. Tijdens het opnemen is het belangrijk om de serieweerstand gedurende de duur van de opname te meten om de gezondheid van de pleister te behouden. Cellen met een verandering in serieweerstand van meer dan 20% worden niet geaccepteerd voor data-analyse. Dit is vooral belangrijk voor LTD-experimenten die >60 min duren, omdat veranderingen in serieresistentie de receptor- en kanaaldynamiek kunnen beïnvloeden. Om ervoor te zorgen dat de afferente stoffen die tijdens elektrofysiologische opnames worden gestimuleerd, afkomstig zijn uit het MGN, is het belangrijk om plakjes te verzamelen door de omvang van de thalamus. Dit dient als validatie dat de cellichamen van de MGN inderdaad fluorescerend AAV tot expressie brengen. Naast visuele bevestiging is ook functionele validatie noodzakelijk. Onder huidige klemomstandigheden vuren AAV-oChIEF-geïnfecteerde MGN-neuronen actiepotentialen af als reactie op zowel hoge als lage frequenties van 473-nm-lichtstimulatie (figuur 4C).
Alle gedragsresultaten werden als voorlopig beschouwd totdat virale expressie en optische vezelimplantaten histologisch werden geverifieerd en de juiste plaatsing werd bevestigd (figuur 5). Gebrek aan AAV-expressie in de MGN of LA en / of die waarin de optische vezels niet correct in de dorsale LA waren gepositioneerd, werden uitgesloten van experimentele analyse, maar in sommige gevallen kunnen worden opgenomen als een negatieve anatomische controle.
Figuur 1: Tijdlijn van de experimentele procedure. Een overzicht van de kritieke stappen van het protocol, inclusief het opeenvolgende tijdsverloop en de duur van elke experimentele fase. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Verwerving en uitroeiing van zelftoediening van cocaïne. (A) Dieren vertonen een toenemend aantal cocaïne-infusies en actieve hefboomresponsen tijdens de verwerving, en een laag niveau van inactieve hefboomresponsen. (B) Na een eerste boost in het indrukken van de hefboom op dag 1 van het uitsterven, reageren dieren op zowel actieve als inactieve hefbomen tot een laag, stabiel niveau. Foutbalken, gemiddelde ±SEM. Dit cijfer is aangepast van Rich et al. 20194. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: In vivo optogenetische LTD verzwakt cue-geïnduceerde herplaatsing. (A) Optical LTD veroorzaakt een significante vermindering van actieve hefboomdrukken tijdens het herstel ten opzichte van dieren die controlevirus- of SHAM-controlestimulatie hebben ontvangen. Tweeweg ANOVA, hoofdeffect van groep (F(2,27) = 7,04, P = .004) en een dag x groepsinteractie (F(2,27) = 8,08, P = .002); Bonferroni's post hoc analyse: ***p < .001. (B) 7 dagen later ondergingen ratten een tweede herplaatsingstest, waaruit een significante vermindering van het actieve hefboompersen bleek bij dieren die eerder MGN-LA LTD ondergingen ten opzichte van SHAM-controles. Tweeweg ANOVA, hoofdeffect van de groep (F(1,32) = 5,04, P = .032), significante interactie (F(1,32) = 7,69, P = .009); Bonferroni's post hoc analyse, **p < .01. Foutbalken, gemiddelde ±SEM, n in staven, aantal ratten. Dit cijfer is aangepast van Rich et al. 20194. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Functionele validatie van in vivo laagfrequente optogenetische stimulatie (A) In vivo dual hemisphere LTD van MGN-LA synapsen verzwakt epsc-amplitude ten opzichte van SHAM-controles (Unpaired t-test, t(10) = 2,73, *P = .021). Inzet: Monstergemiddelde EPSC-sporen opgeroepen bij E rev-70 mV. Schaalstaven: 50 ms, 200 pA, n in staven, aantal ratten (neuronen). (B) In vivo optische LTD-inductie occludes ex vivo LTD. 24 uur na in vivo LTD-inductie werden amygdala-plakjes bereid en hetzelfde stimulatieprotocol toegepast. EPSP-stijgingshelling bij MGN-LA-terminals werd verminderd door ex vivo optische stimulatie in neuronen van dieren die in vivo SHAM-stimulatie hadden ontvangen, maar niet in neuronen van dieren die in vivo optische LTD hadden ontvangen. n cursief, aantal neuronen. (C) Sample current clamp opnames van AAV-oChIEF-geïnfecteerde MGN neuronen. Actiepotentialen werden opgewekt door stimulatie van blauw licht (5-100 Hz). Schaalbalken: 100 ms, 40 mV. Foutbalken, gemiddelde ±SEM. Dit cijfer is aangepast van Rich et al. 20194. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Histologische verificatie van virale expressie en optische vezelplaatsingen. (A) Representatieve microscopische beelden met DAPI- en AAV-oChIEF-tdTomato-expressie in LA (links) en MGN (rechts). Schaalbalk: 2 mm. (B) Schematische weergave van injectie van AAV-oChIEF-tdTomato en gedurende de anterieur-posterieure omvang van de LA (links) en MGN (rechts), en optische vezelplaatsingen in de LA. Donkerrode schaduw toont de weergave van de kleinste aanvaardbare virusverspreiding en lichtroze schaduw toont de weergave van de grootste aanvaardbare verspreiding. Blauwe cirkels komen overeen met succesvolle plaatsing van optische vezels in beide hemisferen. Zwarte cirkels komen overeen met succesvolle plaatsing van optische vezels in slechts één halfrond. Zwarte "X" komt overeen met mislukte vezelplaatsing. Om in de uiteindelijke analyse te worden opgenomen, hadden ratten virale duale hemisfeerexpressie in de LA nodig, evenals een succesvolle plaatsing van vezels. Coördinaten zijn in mm, achterste van bregma. Dit cijfer is aangepast van Rich et al. 20194. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Chemisch | Mm | MW | g/1000 ml |
| N-methyl-D-glucamine | 92 | 195.215 | 17.96 |
| Kaliumchloride | 2.5 | 74.551 | 0.19 |
| Natriumfosfaat Monobasisch | 1.25 | 119.98 | 0.15 |
| Natriumbicarbonaat | 30 | 84.01 | 2.52 |
| Hepes | 20 | 238.301 | 4.77 |
| D-glucose | 25 | 180.16 | 4.5 |
| Natriumascorbaat | 5 | 198.11 | 0.99 |
| Thioureum | 2 | 76.12 | 0.15 |
| Natriumpyruvaat | 3 | 110 | 0.33 |
| Magnesiumsulfaat | 10 | Gebruik 5,0 ml bouillon van 2,0 m | |
| Calciumchloride | 0.5 | Gebruik 250 μL van 2,0 M bouillon | |
| 1. Voeg voor 1 l oplossing zouten in de aangegeven volgorde toe aan 850 ml ddH2O | |||
| 2. pH met geconcentreerd hcl tot 7,3-7,4 (NMDG maakt een basisoplossing) | |||
| 3. Oxygenaat gedurende 5-10 minuten en voeg vervolgens MgSO4 en CaCl2 toe | |||
| 4. Breng de uiteindelijke volutme op 1 L met ddH2O en controleer de uiteindelijke pH | |||
| 5. Controleer de osmolariteit met osmometer en stel in op 300-310 mOsm / kg H2O | |||
Tabel 1: Lijst van ingrediënten voor extracellulaire snijoplossing. Ingrediënten en instructies die worden gebruikt voor de bereiding van de op NMDG gebaseerde extracellulaire snijoplossing.
| Chemisch | Mm | MW | g/1000 ml |
| N-methyl-D-glucamine | 86 | 195.215 | 5.03 |
| Kaliumchloride | 2.5 | 74.551 | 0.19 |
| Natriumfosfaat Monobasisch | 1.25 | 119.98 | 0.15 |
| Natriumbicarbonaat | 35 | 84.01 | 2.94 |
| Hepes | 20 | 238.301 | 4.77 |
| D-glucose | 25 | 180.16 | 4.5 |
| Natriumascorbaat | 5 | 198.11 | 0.99 |
| Thioureum | 2 | 76.12 | 0.15 |
| Natriumpyruvaat | 3 | 110 | 0.33 |
| Magnesiumsulfaat | 1 | Gebruik 500 μL van 2,0 M bouillon | |
| Calciumchloride | 2 | Gebruik 1000 μL van 2,0 M bouillon | |
| 1. Voeg voor 1 l oplossing zouten in de aangegeven volgorde toe aan 850 ml ddH2O | |||
| 2. pH met 1 N HCl of KOH tot 7,3-7,4 | |||
| 3. Oxygenaat gedurende 5-10 minuten en voeg vervolgens MgSO4 en CaCl2 toe | |||
| 4. Breng de uiteindelijke volutme op 1 L met ddH2O en controleer de uiteindelijke pH | |||
| 5. Controleer de osmolariteit met osmometer en stel in op 300-310 mOsm / kg H2O | |||
Tabel 2: Lijst van ingrediënten voor extracellulaire holdingoplossing. Ingrediënten en instructies die worden gebruikt voor de bereiding van de extracellulaire holdingoplossing.
| Chemisch | Mm | MW | g/1000 ml |
| N-methyl-D-glucamine | 119 | 195.215 | 6.95 |
| Kaliumchloride | 2.5 | 74.551 | 0.19 |
| Natriumfosfaat Monobasisch | 1.25 | 119.98 | 0.15 |
| Natriumbicarbonaat | 26 | 84.01 | 2.18 |
| Hepes | 5 | 238.301 | 1.19 |
| D-glucose | 12.5 | 180.16 | 2.25 |
| Magnesiumsulfaat | 1 | Gebruik 500 μL van 2,0 M bouillon | |
| Calciumchloride | 2 | Gebruik 1000 μL van 2,0 M bouillon | |
| 1. Voeg voor 1 l oplossing zouten in de aangegeven volgorde toe aan 850 ml ddH2O | |||
| 2. pH met 1 N HCl of KOH tot 7,3-7,4 | |||
| 3. Oxygenaat gedurende 5-10 minuten en voeg vervolgens MgSO4 en CaCl2 toe | |||
| 4. Breng de uiteindelijke volutme op 1 L met ddH2O en controleer de uiteindelijke pH | |||
| 5. Controleer de osmolariteit met osmometer en stel in op 300-310 mOsm / kg H2O | |||
Tabel 3: Lijst met ingrediënten voor extracellulaire opnameoplossing. Ingrediënten en instructies die worden gebruikt voor de bereiding van de extracellulaire opnameoplossing.
| Chemisch | Mm | MW | mg/50 ml |
| Cesium methaansulfonaat | 108 | 227.997 | 1231.3 |
| Cesiumchloride | 15 | 168.36 | 126.3 |
| Cesium-EGTA | 0.4 | Voeg 80 μL van 250 mM Cs-EGTA toe | |
| THEEchloride | 5 | 165.705 | 41.4 |
| Hepes | 20 | 238.301 | 238.3 |
| QX-314-Br | 1 | 343.31 | 17.2 |
| L-glutathion | 1 | 307.323 | 15.4 |
| Natriumfosfocreatine | 7.5 | 255.1 | 95.7 |
| Mg-ATP | 2.5 | 507.18 | 63.4 |
| Na-GTP | 0.25 | 523.18 | 6.5 |
| 1. Begin met 40-45 ml HPLC-grade H2O | |||
| 2. Houd fosfocreatine, ATP en GTP te allen tijde op ijs. | |||
| 3. Voeg ingrediënten toe in de volgorde die in de tabel wordt vermeld | |||
| 4. pH tot 7,3 met CsOH (ongeveer 200 μL van 2 M CsOH) | |||
| 5. Gebruik de osmometer om de osmolariteit te controleren. | |||
| 6. Voeg HPLC-grade H2O toe aan een uiteindelijke osmolariteit van ongeveer 285-290 mOsm / kg H2O | |||
| 7. Bereid 500-1000 μL aliquots en bewaar bij -80 °C of -20 °C | |||
Tabel 4: Lijst van ingrediënten voor Cesium methanesulfonate intracellular electrophysiology solution. Ingrediënten en instructies die worden gebruikt voor de bereiding van cesium methaansulfonaat intracellulaire oplossing.
| Chemisch | Mm | MW | mg/50 ml |
| Kaliumgluconaat | 145 | 234.246 | 1698.2 |
| Kaliumchloride | 2.5 | 74.56 | 9.3 |
| Tafelzout | 2.5 | 58.44 | 7.3 |
| K-BAPTA | 0.1 | Voeg 80 μL K-BAPTA toe | |
| Hepes | 10 | 238.301 | 119.2 |
| L-glutathion | 1 | 307.323 | 15.4 |
| Natriumfosfocreatine | 7.5 | 255.1 | 95.7 |
| Mg-ATP | 2 | 507.18 | 63.4 |
| Tris-GTP | 0.25 | 886.59 | 11.1 |
| 1. Begin met 40-45 ml HPLC-grade H2O | |||
| 2. Houd fosfocreatine, ATP en GTP te allen tijde op ijs. | |||
| 3. Voeg ingrediënten toe in de volgorde die in de tabel wordt vermeld | |||
| 4. pH tot 7,3 met KOH (ongeveer 200 μL van 2 M KOH) | |||
| 5. Gebruik de osmometer om de osmolariteit te controleren. | |||
| 6. Voeg HPLC-grade H2O toe aan een uiteindelijke osmolariteit van ongeveer 285-290 mOsm / kg H2O | |||
| 7. Bereid 500-1000 μL aliquots en bewaar bij -80 °C of -20 °C | |||
Tabel 5: Lijst van ingrediënten voor kaliumgluconaat intracellulaire elektrofysiologische oplossing. Ingrediënten en instructies die worden gebruikt voor de bereiding van kaliumgluconaat intracellulaire oplossing.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Zoals hierboven beschreven, zijn er verschillende kritieke stappen die belangrijk zijn voor het bereiken van de juiste experimentele resultaten. Het protocol zal waarschijnlijk alleen effectief zijn bij dieren die op de juiste manier cocaïne zelftoediening krijgen, en tot op heden is het alleen getest met behulp van de hierboven beschreven parameters. Het is mogelijk dat de cocaïnedosis, het schema van versterking en cue-parameters kunnen worden gewijzigd met waarschijnlijk weinig effect op gedragsuitkomsten, met uitzondering van het feit dat een tweede-orde schema van versterking kan leiden tot amygdala-onafhankelijke cocaïnezoektocht die de werkzaamheid van de procedure zou kunnen verminderen, hoewel dit niet direct is getest14 . Er zijn verschillende punten in het protocol waar het valideren van de juiste constructie en werking van optische vezels zal helpen zorgen voor succesvolle optische stimulatie. Het is noodzakelijk om ferrules goed te scoren om verlies van de hoofdkap te voorkomen en optische vezels te polijsten, en om te testen of het verlies van lichtopbrengst door de implantaten niet hoger is dan 30% 9. Daarnaast zijn de laserstimulatieparameters belangrijke overwegingen. De laser moet worden gebruikt met een relatief laag vermogen (5-7 mW). Aanhoudende, laagfrequente stimulatie wordt gebruikt om LTD te induceren, en dit kan functioneel worden gevalideerd door mgn-la synaptische sterkte te meten met elektrofysiologische opnames. Ten slotte wezen de resultaten op een significante vermindering van cue-geïnduceerde herplaatsing met een laatste n van 10 dieren per groep, maar experimentatoren moeten verwachten te beginnen met een grotere n, omdat het waarschijnlijk is dat sommige dieren moeten worden uitgesloten van de eindanalyse. Het is cruciaal om de juiste anatomische plaatsing en expressie van virus en optische vezels te verifiëren en alleen gegevens te gebruiken van dieren waarbij histologie is geverifieerd.
Ondanks het robuuste gedragseffect op cocaïnezoeken dat met dit protocol wordt waargenomen, zijn er verschillende beperkingen waarmee rekening moet worden gehouden. Ten eerste is de methode alleen getest bij ratten die werden getraind met een enkele audiovisuele cue in combinatie met cocaïne. Het is niet duidelijk wat er zou gebeuren in een scenario waarin meerdere verschillende signalen werden geconditioneerd, wat een nauwkeurigere weergave zou zijn van menselijke verslaving, waarbij meerdere omgevingsprikkels sterk geassocieerd worden met drugsgebruik 15,16,17. Bewijs uit ons laboratorium geeft aan dat het vermogen van optogenetische LTD om het zoeken naar geneesmiddelen te verminderen te wijten is aan een afname van de synaptische sterkte die geneesmiddel-cue-geassocieerde herinneringen verzwakt. Het is echter niet duidelijk in hoeverre neutraal, of herinneringen die niet geassocieerd zijn met zelftoediening van cocaïne, door dit protocol kunnen worden beïnvloed. Bovendien, terwijl de methode alleen de synaptische sterkte op één circuit beïnvloedt, kunnen andere circuits ook belangrijk zijn voor het coderen van geheugen en / of het besturen van cocaïnezoekgedrag 18,19,20. Ten slotte moet worden opgemerkt dat LTD alleen kan worden geïnduceerd bij synapsen waar het virus voldoende tot expressie komt, waardoor sommige synaptische verbindingen waarschijnlijk niet worden beïnvloed door het stimulatieprotocol, wat mogelijk de gedragsimpact beperkt. Bovendien suggereert bewijs dat slechts kleine ensembles van neuronen en synapsen betrokken zijn bij de codering van een bepaald geheugen, wat geloofwaardigheid geeft aan het idee dat LTD-inductie binnen een heel hersengebied niet de beste strategie is voor het bewerkstelligen van gedragsverandering, terwijl er andere benaderingen bestaan om zich specifiek te richten op cue- of contextueel actieve populaties van neuronen21, 22. Desondanks is het protocol effectief in het dempen van cue-gemotiveerde drugszoeken, waarschijnlijk omdat de laagfrequente optische stimulatie de LTD-inductie beperkt tot synapsen die eerder zijn versterkt door herhaalde cocaïne-cue-paringen4.
Dit protocol biedt een aanzienlijke vooruitgang in meer algemeen gebruikte optogenetische gedragsstudies waarbij de activiteit van neuronen wordt geactiveerd of geremd terwijl het dier het gedrag in realtime uitvoert19,23. In plaats daarvan wordt optogenetica hier gebruikt als een neuromodulerend hulpmiddel om door cocaïne geïnduceerde plasticiteit om te keren. Een voordeel van deze methode is dat de optogenetische manipulatie onafhankelijk is van de gedragstest, zodanig dat potentiële verstorende effecten van optogenetica (bijv. Lokale circuiteffecten, refractaire periode na lichtstimulatie, antidromale stimulatie-effecten, enz. 24 mag de resultaten niet beïnvloeden, waardoor het vertrouwen toeneemt dat het veronderstelde neurale mechanisme gedragsveranderingen bemiddelt. Deze methode kan daarom worden gebruikt in een aantal toepassingen die onderzoeken hoe synaptische plasticiteit, met name een toename van synaptische sterkte zoals optreedt bij LTP, zich verhoudt tot gedragsveranderingen. Vergelijkbare benaderingen kunnen ook relevant zijn voor klinische toepassing van neurale stimulatietechnologieën waarbij abnormale verbindingen in de hersenen die disfunctioneel gedrag veroorzaken, kunnen worden gedownreguleerd. Evenzo, omdat het oChIEF-virale construct reageert op zowel laag- als hoogfrequente stimulaties, zijn er potentiële toepassingen voor deze methoden buiten het bereik van de beschreven experimenten. Optogenetisch geïnduceerde LTP kan bijvoorbeeld gunstig zijn voor het omkeren van tekorten in plasticiteit die worden aangetroffen in een breed scala aan neurodegeneratieve en neurologische ontwikkelingsstoornissen25. Bovendien is bidirectionele plasticiteit bij MGN-LA synapsen ook direct gekoppeld aan de regulatie van gedrag dat relevant is voor angstgerelateerde stoornissen8.
Het moduleren van de specifieke neurale circuits die drugsgemotiveerd gedrag ondersteunen, is essentieel voor het vaststellen van onthouding op lange termijn van drugsgebruik. Dit protocol maakt gebruik van nieuwe ontwikkelingen in in vivo optogenetica om plasticiteit van een nauwkeurig neuraal circuit om te keren dat wordt versterkt door herhaalde zelftoediening van cocaïne in aanwezigheid van omgevingssignalen. Het resultaat van deze specifieke neuromodulatie is een verminderde kans dat latere cue-herblootstellingen een cocaïnezoekende reactie veroorzaken, wat belangrijke implicaties kan hebben voor de ontwikkeling van toekomstige therapieën voor stoornissen in het gebruik van middelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs willen de steun erkennen van USPHS-subsidies K01DA031745 (MMT), R01DA042029 (MMT), DA035805 (YHH), F31DA039646 (MTR), T32031111 (MTR) en het Pennsylvania Department of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Saline | Fisher Scientific | NC0291799 | |
| A.M.P.I. Stimulus Isolator | Iso-Flex | ||
| AAV5.hSyn.oChIEF.tdTomato | Duke Viral Vector Core (via Roger Tsien) | #268 | See Lin et al., 2009; Nabavi et al., 2014 |
| AAV5.hSyn.tdTomato (Control) | Duke Viral Vector Core Control | See Lin et al., 2009; Nabavi et al., 2014 | |
| Artificial Tears (Opthalmic Ointment) | Covetrus | 70349 | |
| ATP Magnesium Salt | Fisher Scientific | A9187 | |
| Betadine | Butler Schein | 38250 | |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | C1016 | |
| Cesium chloride | Fisher Scientific | 289329 | |
| Cesium hydroxide | Fisher Scientific | 516988 | |
| Cesium methanesulfonate | Fisher Scientific | C1426 | |
| Cocaine HCl | NIDA Drug Supply Center | 9041-001 | |
| Cryostat | Leica | CM1950 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| DMSO | Fisher Scientific | BP231-1 | |
| Dual-Channel Temperature Controller | Warner Instruments | TC-344C | |
| EGTA | Fisher Scientific | E3889 | |
| Ethanol | University of Pittsburgh Chemistry Stockroom | 200C5000 | |
| Ferrule Dust Caps | Thor Labs | CAPL | White plastic dust caps for 1.25 mm Ferrules |
| Ferrule Mating Sleeves | Doric Lenses | F210-3011 | Sleeve_BR_1.25, Bronze, 1.25 mm ID |
| Ferrules | Precision Fiber Products | MM-FER2007C-2300 | Ø1.25 mm Multimode LC/PC Ceramic ferrule, Ø230 μm hole size |
| Fiber Optic | Thor Labs | FP200URT | 200 μm core multimode fiber (0.5 NA) |
| Fiber Optic Rotary Joint | Prizmatix | (Ordered from Amazon) | 18 mm diameter, FC-FC connector for fiber |
| Fiber Stripping Tool | Thor Labs | T12S21 | |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma-Aldrich | F6057 | |
| Gentamicin | Henry Schein | 6913 | |
| GTP Sodium Salt | Fisher Scientific | G8877 | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 80085 | 10 μL volume, 26 gauge, 2 inch, point style 3 |
| Heat Gun | Allied Electronics | 972-6966 | 250 V, 750-800 °F |
| Heat-Curable Epoxy | Precision Fiber Products | PFP-353ND-8OZ | |
| Heparin | Henry Schein | 55737 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | 219405490 | |
| Isoflurane | Henry Schein | 29405 | |
| Ketamine HCl | Henry Schein | 55853 | Ketamine is a controlled substance and should be handled according to institutional guidelines |
| Lactated Ringer’s | Henry Schein | 9846 | |
| Laser, driver, and laser-to-fiber coupler | OEM Laser Systems | BL-473-00100-CWM-SD-xx-LED-0 | 100 mW, 473-nm, diode-pumped solid-state laser (One option) |
| L-glutathione | Fisher Scientific | G4251 | |
| Lidocaine | Butler Schein | 14583 | |
| Light Sensor | Thor Labs | PM100D | Compact energy meter console with digital display |
| Loctite instant adhesive | Grainger | 5E207 | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | 203726 | |
| Microelectrode Amplifier/Data Acquisition | Molecular Devices | MULTICLAMP700B / Digidata 1440A | |
| Microinjector pump | Harvard Apparatus | 70-4501 | Dual syringe |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-200/ROE-200 | |
| Microscope | Olympus | BX51WI | Upright microscope for electrophysiology |
| Microscope | Olympus | BX61VS | Epifluorescent slide-scanning microscope |
| N-methyl-D-glucamine | Sigma-Aldrich | M2004 | |
| Orthojet dental cement, liquid | Lang Dental | 1504BLK | black |
| Orthojet dental cement, powder | Lang Dental | 1530BLK | Contemporary powder, black |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Patch Cables | Thor Labs | FP200ERT | Multimode, FT030 Tubing |
| Picrotoxin | Fisher Scientific | AC131210010 | |
| Polishing Disc | Thor Labs | D50FC | |
| Polishing Pad | Thor Labs | NRS913 | 9" x 13" |
| Polishing Paper | Thor Labs | LFG5P | 5 μm grit |
| Polishing Paper | Thor Labs | LFG3P | 3 μm grit |
| Polishing Paper | Thor Labs | LFG1P | 1 μm grit |
| Polishing Paper | Thor Labs | LFG03P | 0.3 μm grit |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Potassium hydroxide | Fisher Scientific | P5958 | |
| Potassium methanesulfonate | Fisher Scientific | 83000 | |
| QX-314-Cl | Alomone Labs | Q-150 | |
| Rimadyl (Carprofen) | Henry Schein | 24751 | |
| Self-Administration Chambers/Software | Med Associates | MED-NP5L-D1 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 1064980500 | |
| Sodium L-Ascorbate | Sigma-Aldrich | A7631 | |
| Sodium Pentobarbital | Henry Schein | 24352 | |
| Sodium phosphate | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| Sodium phosphocreatine | Fisher Scientific | P7936 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Stainless steel machine screws | WW Grainger | 6GB25 | M2-0.40mm Machine Screw, Pan, Phillips, A2 Stainless Steel, Plain, 3 mm Length |
| Stereotaxic adapter for ferrules | Thor Labs | XCL | |
| Stereotaxic Frame | Stoelting | 51603 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | |
| Suture Thread | Fine Science Tools | 18020-50 | Silk thread; Size: 5/0, Diameter: 0.12 mm |
| TEA-Chloride | Fisher Scientific | T2265 | |
| Thiourea | Sigma-Aldrich | T8656 | |
| Vetbond Tissue Adhesive | Covetrus | 001505 | |
| Vibratome | Leica | VT1200S | |
| Xylazine | Butler Schein | 33198 |
References
- Connors, N. J., Hoffman, R. S. Experimental treatments for cocaine toxicity: A difficult transition to the bedside. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 347 (2), 251-257 (2013).
- Makani, R., Pradhan, B., Shah, U., Parikh, T. Role of repetitive transcranial magnetic stimulation (rTMS) in treatment of addiction and related disorders: A systematic review. Current Drug Abuse Reviews. 10 (1), 31-43 (2017).
- Shaham, Y., Shalev, U., Lu, L., De Wit, H., Stewart, J. The reinstatement model of drug relapse: History, methodology and major findings. Psychopharmacology. 168 (1-2), 3-20 (2003).
- Rich, M. T., Huang, Y. H., Torregrossa, M. M. Plasticity at Thalamo-amygdala Synapses Regulates Cocaine-Cue Memory Formation and Extinction. Cell Reports. 26 (4), 1010-1020 (2019).
- Rich, M. T., Huang, Y. H., Torregrossa, M. M. Calcineurin promotes neuroplastic changes in the amygdala associated with weakened cocaine-cue memories. Journal of Neuroscience. 40 (6), 1344-1354 (2020).
- Deisseroth, K. Optogenetics 10 years of microbial opsins in neuroscience. Nature Neuroscience. 18 (9), 1213-1225 (2015).
- Gradinaru, V., et al. Molecular and cellular approaches for diversifying and extending optogenetics. Cell. 141 (1), 154-165 (2010).
- Nabavi, S., Fox, R., Proulx, C. D., Lin, J. Y., Tsien, R. Y., Malinow, R. Engineering a memory with LTD and LTP. Nature. 511 (7509), 348-352 (2014).
- Sparta, D. R., Stamatakis, A. M., Phillips, J. L., Hovelsø, N., Van Zessen, R., Stuber, G. D. Construction of implantable optical fibers for long-term optogenetic manipulation of neural circuits. Nature Protocols. 7 (1), 12-23 (2012).
- Stripling, J. S. A simple intravenous catheter for use with a cranial pedestal in the rat. Pharmacology, Biochemistry and Behavior. 15 (5), 823-825 (1981).
- Lin, J. Y., Lin, M. Z., Steinbach, P., Tsien, R. Y. Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics. Biophysical Journal. 96 (5), 1803-1814 (2009).
- Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates Hard Cover Edition. , 466 (2013).
- Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute brain slice methods for adult and aging animals: Application of targeted patch clamp analysis and optogenetics. Methods in Molecular Biology. 1183, 221-242 (2014).
- Bender, B. N., Torregrossa, M. M. Dorsolateral striatum dopamine-dependent cocaine seeking is resistant to pavlovian cue extinction in male and female rats. Neuropharmacology. 182, (2021).
- Milton, A. L., Everitt, B. J. The persistence of maladaptive memory: Addiction, drug memories and anti-relapse treatments. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 36 (4), 1119-1139 (2012).
- Torregrossa, M. M., Taylor, J. R. Learning to forget: Manipulating extinction and reconsolidation processes to treat addiction. Psychopharmacology. 226 (4), 659-672 (2013).
- Kalivas, P. W., Volkow, N. D. The Neural Basis of Addiciton: A Pathology of Motivation and Choice. American Journal of Psychiatry. 162 (8), 1403-1413 (2005).
- Stefanik, M. T., et al. Optogenetic inhibition of cocaine seeking in rats. Addiction Biology. 18 (1), 50-53 (2013).
- Arguello, A. A., et al. Role of a Lateral Orbital Frontal Cortex-Basolateral Amygdala Circuit in Cue-Induced Cocaine-Seeking Behavior. Neuropsychopharmacology. 42 (3), 727-735 (2017).
- Cruz, A. M., Spencer, H. F., Kim, T. H., Jhou, T. C., Smith, R. J. Prelimbic cortical projections to rostromedial tegmental nucleus play a suppressive role in cue-induced reinstatement of cocaine seeking. Neuropsychopharmacology. 46 (8), 1399-1406 (2021).
- Cruz, F. C., Javier Rubio, F., Hope, B. T. Using c-fos to study neuronal ensembles in corticostriatal circuitry of addiction. Brain Research. 1628, 157-173 (2015).
- Rubio, F. J., et al. Context-Induced Reinstatement of Methamphetamine Seeking Is Associated with Unique Molecular Alterations in Fos-Expressing Dorsolateral Striatum Neurons. Journal of Neuroscience. 35 (14), 5625-5639 (2015).
- Siuda, E. R., et al. Spatiotemporal Control of Opioid Signaling and Behavior. Neuron. 86 (4), 923-935 (2015).
- McCracken, C. B., Grace, A. A. High-frequency deep brain stimulation of the nucleus accumbens region suppresses neuronal activity and selectively modulates afferent drive in rat orbitofrontal cortex in vivo. Journal of Neuroscience. 27 (46), 12601-12610 (2007).
- Zhang, H., Bramham, C. R. Bidirectional Dysregulation of AMPA Receptor-Mediated Synaptic Transmission and Plasticity in Brain Disorders. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 12 (26), (2020).
