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Neuroscience

न्यूरोप्लास्टी को उलटने और चूहों में कोकीन की मांग को रोकने के लिए ऑप्टोजेनेटिक्स का उपयोग करना

Published: October 5, 2021 doi: 10.3791/63185
Automatic Translation
1,2, 1, 1
1Department of Psychiatry, University of Pittsburgh, 2Department of Psychiatry, Rutgers University

Summary

यहां वर्णित विधियां चूहों में व्यवहारिक रूप से प्रासंगिक सर्किट में कोकेन-प्रेरित प्लास्टिसिटी को ऑप्टोजेनेटिक रूप से रिवर्स करने के लिए उपयोग की जाने वाली प्रक्रिया को रेखांकित करती हैं। थैलेमो-एमिग्डाला सिनैप्स की निरंतर कम आवृत्ति ऑप्टिकल उत्तेजना दीर्घकालिक अवसाद (लिमिटेड) को प्रेरित करती है। कोकेन-अनुभवी चूहों में विवो ऑप्टोजेनेटिकली-प्रेरित लिमिटेड में क्यू-प्रेरित दवा की मांग के बाद क्षीणन हुआ।

Abstract

यह प्रोटोकॉल चूहे में बाद में कोकीन की मांग के व्यवहार को कम करने के लिए थैलेमो-एमिग्डाला सर्किट पर कोकीन-प्रेरित प्लास्टिसिटी को उलटने के लिए ऑप्टोजेनेटिक टूल का उपयोग करने के लिए आवश्यक कदमों को प्रदर्शित करता है। हमारे शोध में, हमने पाया था कि जब चूहे एक ऑडियोविज़ुअल क्यू के साथ जोड़े गए अंतःशिरा कोकीन को स्व-प्रशासित करते हैं, तो थैलेमस (एमजीएन) के मेडियल जेनिकुलेट न्यूक्लियस से लेटरल एमिग्डाला (एलए) के प्रमुख न्यूरॉन्स पर इनपुट पर बनने वाले सिनैप्स मजबूत हो जाते हैं क्योंकि क्यू-कोकीन एसोसिएशन सीखा जाता है। हमने अनुमान लगाया कि इन सिनैप्स में कोकीन-प्रेरित प्लास्टिसिटी के उलट से क्यू-प्रेरित कोकीन की मांग करने वाले व्यवहार में कमी आएगी। विवो में इस प्रकार के न्यूरोमॉड्यूलेशन को पूरा करने के लिए, हम सिनैप्टिक दीर्घकालिक अवसाद (LTD) को प्रेरित करना चाहते थे, जो MGN-LA सिनैप्स की ताकत को कम करता है। इसके लिए, हमने ऑप्टोजेनेटिक्स का उपयोग किया, जो प्रकाश का उपयोग करके मस्तिष्क सर्किट के न्यूरोमॉड्यूलेशन की अनुमति देता है। उत्तेजक ऑप्सिन ओसीएचईएफ को एलए में प्रीसिनेप्टिक एमजीएन टर्मिनलों पर एमजीएन में ओसीएचईएफ युक्त एएवी को शामिल करके व्यक्त किया गया था। ऑप्टिकल फाइबर को तब एलए में प्रत्यारोपित किया गया था और 473 एनएम लेजर प्रकाश को लिमिटेड और रिवर्स कोकीन प्रेरित प्लास्टिसिटी को प्रेरित करने के लिए 15 मिनट के लिए 1 हर्ट्ज की आवृत्ति पर स्पंदित किया गया था। यह हेरफेर नशीली दवाओं की मांग करने वाले कार्यों को प्रेरित करने के लिए कोकीन से जुड़े संकेतों की क्षमता में लंबे समय तक चलने वाली कमी पैदा करता है।

Introduction

मादक द्रव्यों का सेवन अमेरिका और दुनिया भर में एक बहुत ही गंभीर सार्वजनिक स्वास्थ्य मुद्दा है। दशकों के गहन शोध के बावजूद, बहुत कम प्रभावी चिकित्सीय विकल्प हैं 1,2. उपचार के लिए एक बड़ा झटका यह तथ्य है कि पुरानी दवा का उपयोग पर्यावरणीय संकेतों और दवा के बीच दीर्घकालिक सहयोगी यादें उत्पन्न करता है। दवा से संबंधित संकेतों के पुन: संपर्क में आने से शारीरिक और व्यवहारिक प्रतिक्रियाएं होती हैं जो निरंतर दवा के उपयोग और रिलैप्स को प्रेरित करतीहैं। एक नई चिकित्सीय रणनीति स्मृति-आधारित उपचारों को लागू करना है जिसका उद्देश्य दवा-क्यू संघों को विनियमित करने में शामिल सर्किट में हेरफेर करना है। हाल ही में, यह देखा गया कि पार्श्व एमिग्डाला (एलए) में सिनैप्स, विशेष रूप से थैलेमस के मेडियल जेनिकुलेट न्यूक्लियस (एमजीएन) से उत्पन्न होते हैं, बार-बार क्यू-जुड़े कोकीन स्व-प्रशासन द्वारा मजबूत होते हैं, और यह प्रवर्धन कोकीन की मांग करने वाले व्यवहार 4,5 का समर्थन कर सकता है। इसलिए, यह प्रस्तावित किया गया था कि एमजीएन-एलए सिनैप्स पर प्लास्टिसिटी को उलटकर क्यू-प्रेरित बहाली को क्षीण किया जा सकता है।

एक विशिष्ट मस्तिष्क सर्किट की सिनैप्टिक प्लास्टिसिटी को ठीक से लक्षित करने की क्षमता क्षेत्र के लिए एक बड़ी चुनौती रही है। पारंपरिक औषधीय उपकरणों को रिलैप्स व्यवहार को कम करने में कुछ सफलता मिली है, लेकिन व्यक्तिगत सिनैप्स में हेरफेर करने में असमर्थता से सीमित हैं। हालांकि, विवो ऑप्टोजेनेटिक्स के हालिया विकास ने इन सीमाओं को दूर करने और अस्थायी और स्थानिक परिशुद्धता 6,7,8 के साथ तंत्रिका मार्गोंको नियंत्रित करने के लिए आवश्यक उपकरण प्रदान किए हैं। एक विशिष्ट मस्तिष्क सर्किट में प्रकाश-संवेदनशील ऑप्सिन व्यक्त करके, लेजर प्रकाश का उपयोग सर्किट को सक्रिय या बाधित करने के लिए किया जा सकता है। आवृत्ति-निर्भर ऑप्टिकल उत्तेजना का उपयोग विशेष रूप से व्यवहार करने वाले जानवर में सर्किट की सिनैप्टिक प्लास्टिसिटी में हेरफेर करने के लिए किया जा सकता है।

यह पांडुलिपि विवो ऑप्टोजेनेटिक्स में उपयोग करके व्यवहारिक रूप से प्रासंगिक एमजीएन-एलए सर्किट में हेरफेर करने के लिए ली गई प्रक्रिया को रेखांकित करती है। सबसे पहले, उत्तेजक ऑप्सिन ओसीएचईईएफ को एमजीएन में व्यक्त किया गया था और ऑप्टिकल फाइबर को एलए में द्विपक्षीय रूप से प्रत्यारोपित किया गया था। जानवरों को तब क्यू-निर्भर फैशन में कोकीन को स्व-प्रशासित करने के लिए प्रशिक्षित किया गया था, जो एमजीएन-एलए मार्ग को शक्तिशाली बनाता है। इसके बाद, 473 एनएम लेजर लाइट के साथ निरंतर, कम आवृत्ति उत्तेजना का उपयोग सर्किट-विशिष्ट लिमिटेड का उत्पादन करने के लिए किया गया था। कोकीन के उपयोग से प्रेरित प्लास्टिसिटी को उलटने से उन कार्यों को ट्रिगर करने के लिए संकेतों की क्षमता में दीर्घकालिक कमी उत्पन्न हुई जो दवा की मांग व्यवहार से जुड़े हैं।

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Protocol

इस प्रोटोकॉल में वर्णित प्रयोग प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ गाइड द्वारा निर्धारित दिशानिर्देशों के अनुरूप थे और पिट्सबर्ग विश्वविद्यालय की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित थे। सभी प्रक्रियाओं को वयस्क, भोले स्प्राग-डॉवले चूहों का उपयोग करके किया गया था जिनका वजन आगमन पर 275-325 ग्राम था।

1. ऑप्टिक फाइबर प्रत्यारोपण और पैच केबल का निर्माण

  1. पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल9 का पालन करते हुए ऑप्टिक फाइबर प्रत्यारोपण तैयार करें। इस प्रोटोकॉल में वर्णित प्रयोगों में 200 μm कोर फाइबर (0.5 NA) और Ø1.25 mm मल्टीमोड एलसी / पीसी सिरेमिक फेरूल, Ø230 μm छेद आकार का उपयोग किया गया।
    1. फेरूल के निचले तीसरे हिस्से (फेरूल के सपाट छोर के सबसे करीब) को स्कोर करने के लिए एक ड्रेमेल टूल का उपयोग करें। फेरूल्स को स्कोर करने से उन्हें दंत सीमेंट से जुड़े रहने में मदद मिलती है, जिससे संभावना बढ़ जाती है कि वे प्रयोग की पूरी सीमा में सुरक्षित रहेंगे।
    2. ~ 35 मिमी फाइबर काटने के लिए तार कटर का उपयोग करें। ~ 25 मिमी फाइबर को स्ट्रिप करने के लिए फाइबर स्ट्रिपिंग टूल का उपयोग करें, जिससे 10 मिमी अनएक्सपोज़्ड हो जाए।
    3. निर्माता के निर्देशों के अनुसार गर्मी-इलाज योग्य एपॉक्सी तैयार करें। 100 मिलीग्राम हार्डनर यौगिक में 1 ग्राम राल पाउडर घोलें। एक 1 एमएल सिरिंज के साथ एक कुंद 25-गेज सुई संलग्न करें। सिरिंज को एपॉक्सी से भरें और एक कुंद 25-गेज सुई टिप संलग्न करें।
    4. फेरूल को सुरक्षित रूप से पकड़ने के लिए एक वाइस या क्लैंप का उपयोग करें, जिसमें सपाट पक्ष ऊपर की ओर और उत्तल पक्ष नीचे की ओर हो। एपॉक्सी से भरे सिरिंज के साथ, फेरूल के किनारों से अतिरिक्त एपॉक्सी को पोंछने के लिए सावधानी बरतते हुए, फेरूल के सपाट पक्ष में एपॉक्सी की एक बूंद जोड़ें।
    5. फेरूल के माध्यम से फाइबर के छीने गए हिस्से को डालें जिससे अतिरिक्त 5 मिमी स्ट्रिप्ड फाइबर उजागर हो सके। एलए प्रत्यारोपण के मामले में, फाइबर को ब्रेग्मा में 7.9 मिमी वेंट्रल प्रत्यारोपित किया जाएगा, इसलिए अनव्सक्रेटेड फाइबर की उजागर लंबाई ~ 13 मिमी होनी चाहिए।
    6. लगभग 30-40 सेकंड के लिए हीट गन के साथ एपॉक्सी का इलाज करें जब तक कि यह काले / एम्बर रंग में न हो जाए।
    7. हीरे के चाकू के साथ फेरूल के उत्तल छोर के इंटरफ़ेस पर सीधे फाइबर स्कोर करें और फाइबर को धीरे से टैप करने के लिए एक उंगली का उपयोग करें।
    8. फेरूल के उत्तल छोर को हेमोस्टैट के साथ पकड़कर, समान दबाव लागू करना सुनिश्चित करके, और पॉलिशिंग पेपर की एक श्रृंखला पर 20 गोलाकार रोटेशन करना (उच्च ग्रेड से निम्न ग्रेड तक; 5, 3, 1, 0.3 μm)।
    9. टेप का उपयोग करके तालिका में अनवलैंड फाइबर को सुरक्षित करें और फाइबर को स्कोर करें, जिससे वेंट्रल कोऑर्डिनेट से परे एक अतिरिक्त 2 मिमी छोड़ दिया जाए (एलए प्रत्यारोपण के लिए, फाइबर की अंतिम लंबाई ~ 10 मिमी है)। फेरूल को खींचने के लिए हेमोस्टैट का उपयोग करें और समान रूप से फाइबर को तोड़ दें जहां इसे स्कोर किया गया है। स्कोरिंग करते समय फाइबर को पूरी तरह से काटने के लिए सावधान रहें, अन्यथा फाइबर का कोर क्षतिग्रस्त हो जाएगा।
  2. पैच केबल बनाएं जो ऑप्टिक फाइबर प्रत्यारोपण के साथ संगत हैं। कस्टम डिज़ाइन किए गए पैच केबल खरीदे गए थे ( सामग्री की तालिका देखें)। वैकल्पिक रूप से, पैच केबल का निर्माण पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल 9 के बाद किया जा सकताहै।
    नोट: फेरूल फाइबर और पैच केबल फाइबर के व्यास और एनए को प्रकाश के अतिरिक्त नुकसान को रोकने के लिए युग्मन जंक्शन पर मेल खाना चाहिए, जिसके परिणामस्वरूप तंत्रिका गतिविधि को पर्याप्त रूप से उत्तेजित करने में विफलता हो सकती है।
  3. ऑप्टिक फाइबर को एक उपयुक्त लेजर प्रकाश स्रोत (473 एनएम, 1 मेगावाट आउटपुट) से जोड़कर और प्रकाश सेंसर के साथ आउटपुट को मापकर पैच केबल और ऑप्टिक फाइबर प्रत्यारोपण के माध्यम से प्रकाश उत्पादन को मापें। एक सफलतापूर्वक निर्मित फाइबर प्रकाश के एक संकेंद्रित चक्र का उत्सर्जन करेगा और इसमें 30% से अधिक प्रकाश हानि नहीं होगी।

2. कृंतक अंतःशिरा कैथीटेराइजेशन, वायरस डिलीवरी, और ऑप्टिक फाइबर प्रत्यारोपण

  1. सर्जरी के लिए जानवर तैयार करें।
    1. संस्थागत दिशानिर्देशों के आधार पर पसंद के एनेस्थेटिक के साथ चूहों को पूरी तरह से एनेस्थेटाइज करें। एक विकल्प केटामाइन हाइड्रोक्लोराइड (87.5-100 मिलीग्राम / किग्रा, यानी) और ज़ाइलाज़िन हाइड्रोक्लोराइड (5 मिलीग्राम / किग्रा, यानी) है। सुनिश्चित करें कि पैर की अंगुली पिंच रिफ्लेक्स की कमी की जांच करके चूहे को पूरी तरह से एनेस्थेटाइज्ड किया गया है।
      चेतावनी: केटामाइन एक नियंत्रित पदार्थ है जिसे संस्थागत दिशानिर्देशों के अनुसार संभाला जाना चाहिए।
      नोट: एनेस्थेटिक्स के इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन का उपयोग इस अध्ययन में किया जाता है क्योंकि यह इंट्रापरिटोनियल इंजेक्शन की तुलना में अधिक तेजी से और विश्वसनीय संज्ञाहरण प्रेरण का उत्पादन करता है। लगातार चूहे के श्वसन और प्रतिक्रिया की निगरानी करें और सर्जरी के दौरान थर्मल सहायता प्रदान करें।
    2. चूहे की पीठ का एक बड़ा क्षेत्र (कंधे के ब्लेड के ठीक ऊपर से पीठ के बीच तक) के साथ-साथ दाहिने अग्रभाग के नीचे गर्दन का क्षेत्र और खोपड़ी रखें।
    3. चूहे को सर्जिकल क्षेत्र में रखें और आंखों पर प्यूरलूब (कृत्रिम आँसू) लगाएं। ऊपरी पीठ की त्वचा के माध्यम से चमड़े के नीचे (एससी) कारप्रोफेन (एनाल्जेसिक) के शरीर के वजन की मात्रा इंजेक्ट करें, फिर पीठ के निचले हिस्से की त्वचा के माध्यम से लैक्टेटेड रिंगर के घोल के 5 एमएल इंजेक्ट करें।
    4. बीटाडाइन के साथ बाँझ धुंध के एक टुकड़े को गीला करके सभी सर्जिकल साइटों को साफ करें और इसे गोलाकार गति का उपयोग करके मुंडा सर्जिकल क्षेत्र को पोंछें। फिर 70% इथेनॉल के साथ प्रक्रिया को दोहराएं। इस वैकल्पिक चक्र को तीन बार दोहराएं।
  2. पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल 4,10 के अनुसार अंतःशिरा कैथेटर आरोपण करें।
    नोट: कैथेटर आरोपण के दौरान जलन से बचने के लिए इस सर्जरी के दौरान एक सर्जिकल ड्रेप का उपयोग नहीं किया जाता है। उपयोग से पहले सभी उपकरणों और उपकरणों को निष्फल करें। बाँझ दस्ताने का उपयोग करें और किसी भी गैर-बाँझ सतह से संपर्क होने पर दस्ताने बदलें।
  3. कैथेटर प्रत्यारोपण के तुरंत बाद, एएवी इंजेक्शन करने के लिए चूहे को स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम में सुरक्षित करें।
    1. स्थानीय एनेस्थेटिक के रूप में खोपड़ी पर 2% लिडोकेन (0.2-0.3 एमएल) का चमड़े के नीचे (एससी) इंजेक्शन वितरित करें।
      नोट: सर्जिकल परिणामों में परिवर्तन से बचने के लिए अंतःशिरा कैथेटर प्रत्यारोपण के दौरान स्थानीय एनेस्थेटिक का उपयोग नहीं किया जाता है।
    2. एक 26-गेज स्टेनलेस स्टील इंजेक्शन कैनुला को हैमिल्टन सिरिंज से कनेक्ट करें जो 1 μL केंद्रित AAV समाधान से भरा है: या तो AAV5-hSyn-tdTomato या AAV5-hSyn-oChIEF-tdTomato
      नोट: oChIEF ब्लू-लाइट संवेदनशील ऑप्सिन चैनलरोडोप्सिन (CHR2) का एक संस्करण है, जोआवृत्तियों 8,11 की एक विस्तृत श्रृंखला का जवाब दे सकता है, और इसलिए इस प्रोटोकॉल में चर्चा किए गए कम आवृत्ति LTD प्रयोगों के लिए उपयोगिता है, लेकिन उच्च आवृत्ति LTP प्रयोगों के लिए भी (यहां चर्चा नहीं की गई है)। ओसीएचआईएफ निर्माण डॉ रोजर त्सिएन द्वारा दान किया गया था और ड्यूक वायरल वेक्टर कोर द्वारा पैकेजिंग और शुद्धिकरण के लिए संसाधित किया गया था। एमजीएन एक्सॉन टर्मिनलों में इष्टतम वायरस अभिव्यक्ति की अनुमति देने के लिए इंजेक्शन दिवस और लिमिटेड प्रेरण के दिन के बीच कम से कम 3-4 सप्ताह की आवश्यकता होती है।
      चेतावनी: आम तौर पर, एएवी को जैव सुरक्षा स्तर 1 (बीएसएल -1) जीव के रूप में माना जाता है, जिसमें आत्म-संक्रमण का कम जोखिम होता है जब तक कि इसके उत्पादन में एक सहायक वायरस का उपयोग नहीं किया जाता है। इसके उपयोग के लिए आईएसीयूसी अनुमोदन की आवश्यकता होती है और अनावश्यक जोखिम को सीमित करने के लिए संस्थागत दिशानिर्देशों के अनुसार हर समय उचित पीपीई का उपयोग किया जाना चाहिए।
    3. स्केलपेल का उपयोग करके, खोपड़ी के सामने से पीछे तक 0.5 मिमी चीरा लगाएं, और खोपड़ी की सतह को उजागर करने के लिए ऊपरी ऊतक को हटा दें।
    4. चूहे के सिर को पूर्ववर्ती/पीछे की धुरी में समतल करें और ब्रेग्मा के लिए शून्य स्टीरियोटैक्सिक निर्देशांक।
    5. एक छोटे ड्रिल बिट से लैस ड्रेमेल टूल का उपयोग करके खोपड़ी के माध्यम से तीन छोटे छेद ड्रिल करें। जगह में स्टेनलेस स्टील स्क्रू (एम 2 एक्स 4 965-ए 2) को मजबूती से माउंट करने के लिए स्क्रूड्राइवर का उपयोग करें।
      नोट: दंत सीमेंट के उचित बंधन और मजबूत, लंबे समय तक चलने वाले हेडकैप के निर्माण के लिए स्क्रू आवश्यक हैं। स्क्रू की स्थिति खोपड़ी के पूर्ववर्ती-पीछे की धुरी में फैली होनी चाहिए, और एएवी इंजेक्शन साइट से दूर होनी चाहिए।
    6. औसत दर्जे के जेनुलेट न्यूक्लियस (एमजीएन) के मध्यवर्ती भाग के लिए रैट ब्रेन एटलस (वाटसन और पैक्सिनोस) 12 से निर्देशांक के आधार पर एएवी के इंजेक्शन के लिए द्विपक्षीय छेद ड्रिल करें; ब्रेग्मा, एपी से मिमी में: -5.4; एमएल: ±3.0; डीवी: -6.6। एमजीएन में स्थित होने तक धीरे-धीरे इंजेक्शन कैनुला (4 मिमी / मिनट) को कम करें। 0.1 μL/ min की दर से केंद्रित AAV समाधान इंजेक्ट करें।
    7. इंजेक्शन कैनुला को 5 मिनट के लिए छोड़ दें ताकि प्रवेशनी से दूर प्रसार की अनुमति मिल सके और फिर धीरे-धीरे मस्तिष्क से प्रवेशनी वापस ले सकें।
  4. वायरस इंजेक्शन के तुरंत बाद, एमजीएन-एलए टर्मिनलों को लक्षित करने वाले ऑप्टिक फाइबर 4,9 को प्रत्यारोपित करना जारी रखें।
    1. पार्श्व एमिग्डाला को लक्षित करने वाले ऑप्टिक फाइबर प्रत्यारोपण के लिए द्विपक्षीय छेद ड्रिल करने के लिए एक ड्रेमेल उपकरण का उपयोग करें (ब्रेग्मा, एपी: -3.0 से मिमी में; एमएल ±5.1)।
    2. ऑप्टिक फाइबर इम्प्लांट के फेरूल को पकड़ने के लिए फोर्स का उपयोग करें और इसे स्टीरियोटैक्सिक एडाप्टर में ठीक करें ताकि वे सुरक्षित रूप से जगह पर रखे जा सकें।
    3. धीरे-धीरे 2 मिमी / मिनट की दर से फाइबर को कम करें, जब तक कि फाइबर की नोक एलए (डीवी: -7.9 मिमी) के पृष्ठीय भाग में नहीं बैठती है।
    4. पहले लोक्टिट इंस्टेंट चिपकने वाले की एक पतली परत का उपयोग करके खोपड़ी को सुरक्षित करें, इसके बाद दंत सीमेंट और 1.25 मिमी व्यास के फेरूल आस्तीन और धूल कवर के साथ फेरूल को कवर करें।
      नोट: खोपड़ी के फेरूल को सुरक्षित करने के लिए चिपकने वाला विकल्प स्थानीय या संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया जाना चाहिए। इस अध्ययन के लिए लोकटाइट का उपयोग कई चिपकने वाले पदार्थों के साथ परीक्षण और त्रुटि के बाद खोपड़ी में फेरूल को मज़बूती से सुरक्षित करने के लिए किया जाता है; हालांकि, उपलब्ध विकल्पों पर विचार किया जा सकता है।
  5. शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं के बाद, चूहों को व्यक्तिगत रूप से घर दें, और भोजन और पानी तक मुफ्त पहुंच प्रदान करें। संस्थागत दिशानिर्देशों के अनुरूप पोस्टऑपरेटिव देखभाल प्रदान करें। पेटेंसी बनाए रखने के लिए जेंटामाइसिन (5 मिलीग्राम / एमएल) और हेपरिन (30 यूएसपी / एमएल) युक्त खारा युक्त खारा के साथ रोजाना कैथेटर फ्लश करें। सर्जरी के कम से कम 5 दिन बाद और व्यवहार प्रयोगों की शुरुआत से 24 घंटे पहले, भोजन चूहों को उनके फ्री-फीडिंग वजन के ~ 90% तक सीमित करता है।

3. कृंतक कोकीन स्व-प्रशासन और वाद्य लीवर विलुप्त होने

नोट: सभी व्यवहार प्रक्रियाएं मानक ऑपरेटिंग कंडीशनिंग कक्षों में आयोजित की जाती हैं, जो एक दीवार पर दो वापस लेने योग्य लीवर, प्रत्येक लीवर के ऊपर एक उत्तेजना प्रकाश, एक टोन जनरेटर, एक हाउस लाइट और एक जलसेक पंप से लैस होती हैं।

  1. सुदृढीकरण के एफआर 1 अनुसूची के तहत चूहों को दैनिक 1-एच कोकीन (2 मिलीग्राम / एमएल) स्व-प्रशासन प्रशिक्षण सत्रों के अधीन करें।
    1. प्रत्येक दिन संचालित कक्ष में चूहों को रखें और चूहों को लीवर प्रेस करने की अनुमति दें। नामित 'सक्रिय लीवर' (बाएं और दाएं लीवर में संतुलित) पर एक प्रेस के परिणामस्वरूप कोकीन जलसेक (1.0 मिलीग्राम / किग्रा / जलसेक) और एक यौगिक प्रकाश और टोन क्यू की 10 सेकंड की प्रस्तुति होती है। निर्दिष्ट 'निष्क्रिय लीवर' पर एक प्रेस का कोई प्रोग्राम ्ड प्रभाव नहीं है।
    2. कम से कम 10 डी के लिए स्व-प्रशासन प्रयोगों को जारी रखें और जब तक चूहे लगातार 3 दिनों में कम से कम 8 इन्फ्यूजन / दिन सफलतापूर्वक अर्जित न करें। दिन 20 तक अधिग्रहण मानदंडों तक पहुंचने में विफलता के परिणामस्वरूप अध्ययन से बहिष्करण होता है।
  2. अधिग्रहण मानदंडों को सफलतापूर्वक पूरा करने के बाद, चूहों को 6-10 डी के लिए 1 घंटे के वाद्य विलोपन सत्रों के अधीन करें।
    1. चूहों को ऑपरेटिंग कक्षों में रखें और चूहों को स्वतंत्र रूप से लीवर प्रेस करने की अनुमति दें। हालांकि, सक्रिय और निष्क्रिय लीवर दोनों पर प्रतिक्रियाओं का कोई क्रमादेशित परिणाम नहीं है।
    2. क्या चूहों ने रोजाना वाद्य विलुप्त होना जारी रखा है जब तक कि लगातार दो दिनों में औसतन 25 लीवर प्रेस < न हो।

4. विवो ऑप्टोजेनेटिक इंडक्शन ऑफ लिमिटेड

नोट: ऑप्टोजेनेटिक निषेध प्रयोग वाद्य विलुप्त होने के अंतिम दिन के 24 घंटे बाद होते हैं।

  1. पैच कॉर्ड को 473-एनएम ब्लू लेजर डायोड से कनेक्ट करें, जो कवर को हटाने के साथ एक स्वच्छ, मानक कृंतक आवास पिंजरे के ऊपर निलंबित रोटरी जोड़ के माध्यम से होता है। यह सेटअप कृन्तकों को ऑप्टोजेनेटिक उत्तेजना के दौरान पिंजरे के चारों ओर स्वतंत्र रूप से घूमने की अनुमति देता है।
  2. ऑपरेटिंग निर्देशों के अनुसार लेजर डायोड चालू करें और पल्स जनरेटर से कनेक्ट करें। सेटिंग्स समायोजित करें, ताकि चालू होने पर चूहे को 1 हर्ट्ज पर प्रकाश की 900 2-एमएस दालें प्राप्त हों।
    सावधानी: लेजर संचालित करते समय हर समय उचित आंखों की सुरक्षा का उपयोग किया जाना चाहिए।
  3. प्रकाश सेंसर का उपयोग करके पैच कॉर्ड के माध्यम से प्रकाश की तीव्रता को मापें। लेजर की तीव्रता को समायोजित करें ताकि पैच केबल के माध्यम से प्रकाश उत्पादन ~ 5-7 किलोवाट हो।
  4. चूहों को एक साफ आवास पिंजरे में रखें। धूल के आवरण को हटा दें और फेरूल आस्तीन को हटा दें, जिससे फेरूल ्स उजागर हो जाएं। ऑप्टिक फाइबर प्रत्यारोपण के लिए पैच कॉर्ड को द्विपक्षीय रूप से कनेक्ट करें। चूहों को लिमिटेड प्रेरण से पहले 3 मिनट के लिए पर्यावरण का पता लगाने की अनुमति दें।
  5. ऑप्टोजेनेटिक उत्तेजना शुरू करने के लिए पल्स जनरेटर चालू करें।
    नोट: हालांकि संभावना नहीं है, अगर चूहे उत्तेजना के लिए किसी भी प्रतिकूल प्रतिक्रिया का अनुभव करते हैं, तो प्रयोग तुरंत समाप्त हो जाता है, और संस्थागत दिशानिर्देशों के आधार पर चूहों को ठीक से इच्छामृत्यु दी जाती है।
  6. लिमिटेड प्रेरण के बाद, चूहों को 3 मिनट के लिए पिंजरे में रखें, और फिर अपने घर के पिंजरों में वापस रखें।
  7. नियंत्रण प्रयोगों के लिए, चूहों पर एक ही उत्तेजना प्रक्रिया का उपयोग करें जो एएवी 5-टीडीटोमेटो नियंत्रण वायरस को व्यक्त करते हैं। दिखावटी प्रयोगों के लिए, चूहों के ऑप्टिक फाइबर में एक पैच कॉर्ड संलग्न करें जो एएवी 5-ओसीआईईएफ वायरस को व्यक्त करता है, लेकिन 15 मिनट के सत्र के दौरान कोई उत्तेजना नहीं दी जाती है।

5. क्यू-प्रेरित कोकीन की मांग पर ऑप्टोजेनेटिक उत्तेजना के प्रभाव का परीक्षण करें

  1. विवो ऑप्टोजेनेटिक उत्तेजनाओं में 24 घंटे बाद, चूहों को ऑपरेटिंग कंडीशनिंग कक्षों में वापस रखें। चूहों को कोकीन की मांग के व्यवहार का आकलन करने के लिए 1-एच मानक क्यू-प्रेरित बहाली सत्र के अधीन किया जाता है।
    नोट: क्यू-प्रेरित बहाली के दौरान, सक्रिय लीवर पर एक प्रतिक्रिया कोकीन से जुड़े क्यू की 10-एस प्रस्तुति देती है, लेकिन कोई कोकीन इन्फ्यूजन नहीं।
  2. पहले परीक्षण के कम से कम 1 सप्ताह बाद दूसरा बहाली परीक्षण दें ताकि यह निर्धारित किया जा सके कि क्या ऑप्टोजेनेटिक लिमिटेड प्रेरण के परिणामस्वरूप कोकीन की मांग का दीर्घकालिक दमन होता है

6. वायरल अभिव्यक्ति और ऑप्टिक फाइबर प्लेसमेंट के हिस्टोलॉजिकल सत्यापन के लिए धुंधला, प्रतिदीप्ति और इमेजिंग

  1. 1x फॉस्फेट बफर्ड सेलाइन (PBS) और 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (PFA) बनाएं। बर्फ पर दोनों समाधान स्टोर करें। कुल मात्रा अध्ययन में चूहों की संख्या पर निर्भर करेगी (पीबीएस के ~ 100 एमएल और पीएफए के 200 एमएल का उपयोग प्रति चूहे किया जाएगा)।
    सावधानी: पीएफए एक विषाक्त रसायन और ज्ञात कार्सिनोजेन है। साँस लेने के साथ-साथ त्वचा के संपर्क से बचने के लिए उचित देखभाल करें। इसका उपयोग और निपटान संस्थागत दिशानिर्देशों के अनुसार होना चाहिए, जिसमें उचित पीपीई और एक रासायनिक प्रवाह हुड का उपयोग शामिल है।
  2. 20 एमएल / मिनट की प्रवाह दर पर पेरिस्टालिक पंप सेट करें। 1x PBS के साथ पंप की टयूबिंग भरें। टयूबिंग के अंत में एक कुंद 20-गेज सुई संलग्न करें।
  3. सोडियम पेंटोबार्बिटल (100 मिलीग्राम / किग्रा, यानी) के साथ चूहों को गहराई से एनेस्थेटाइज करें। आगे बढ़ने से पहले पैर की अंगुली की प्रतिक्रिया की कमी से संज्ञाहरण की गहराई की पुष्टि करें।
    नोट: सोडियम पेंटोबार्बिटल का उपयोग किया जाता है क्योंकि छिड़काव एक टर्मिनल प्रक्रिया है।
  4. डायाफ्राम के नीचे चूहे के पेट की गुहा को काटने के लिए सर्जिकल कैंची का उपयोग करें। चूहे के दिल को उजागर करने के लिए पार्श्व किनारों के साथ पसली के पिंजरे को काटें। रिब पिंजरे के रोस्ट्रल हिस्से को दिल से दूर रखने के लिए हेमोस्टैट का उपयोग करें। दिल को घेरने वाले किसी भी वसा ऊतक को काट दें।
  5. कुंद सुई को बाएं वेंट्रिकल के माध्यम से और महाधमनी में डालें। समाधान निकालने के लिए दाहिने आलिंद में एक छोटा छेद काटें क्योंकि यह दिल में लौटता है।
  6. प्रत्येक चूहे को 5 मिनट के लिए 1x PBS के साथ खिलाएं, इसके बाद 4% PFA, pH 7.4 10 मिनट के लिए।
  7. चूहे का सिर काट दें, मस्तिष्क को निकालें, और इसे 24 घंटे के लिए 4% पीएफए में पोस्टफिक्स करें। फिर मस्तिष्क को 2-3 डी के लिए 30% सुक्रोज समाधान में स्थानांतरित करें।
  8. क्रायोस्टेट का उपयोग करके 50 μm पर अनुभाग दिमाग।
  9. ग्लास स्लाइड और कवरस्लिप पर एलए या एमजीएन युक्त सभी स्लाइस माउंट करें।
  10. एमजीएन में एएवी-ओसीआईईएफ-टीडीटोमेटो अभिव्यक्ति को सत्यापित करने के लिए एक एपिफ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग करके छवि स्लाइस और एलए के लिए इसके अनुमान, साथ ही एलए के ऊपर ऑप्टिक फाइबर का प्लेसमेंट।

7. इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी प्रयोगों के लिए छिड़काव और तीव्र मस्तिष्क स्लाइस तैयारी

नोट: विवो लिमिटेड की सफलता को मान्य करने के लिए जानवरों के उप-समूह पर इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल प्रयोग किए जाते हैं।

  1. तालिका 1-3 4,13 में सूचीबद्ध अभिकर्मकों का उपयोग करके इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी समाधान तैयार करें। सभी समाधानों के पीएच को एचसीएल के साथ 7.4 में समायोजित करें और ऑस्मोलरिटी को 300-310 mOsm / kg H2O में समायोजित करें। प्रयोगों से पहले समाधान ताजा बनाएं और 1 सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। उपयोग के दौरान हर समय कार्बोजेन (95% ओ2/5% सीओ2) के साथ सभी समाधानों को संतृप्त करें।
  2. स्थानीय या संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग दिशानिर्देशों के अनुसार आइसोफ्लुरेन का उपयोग करके, एक संलग्न इच्छामृत्यु कक्ष में चूहे को गहराई से एनेस्थेटाइज करें।  पुष्टि करें कि जानवर को पैर की अंगुली-चुटकी रिफ्लेक्स के माध्यम से पूरी तरह से एनेस्थेटाइज्ड किया गया है।
  3. एक छोटे बीकर को 50 मिलीलीटर बर्फ-ठंडा काटने के घोल के साथ भरें। समाधान के साथ पेरिस्टाल्टिक पंप की ट्यूबिंग भरें और प्रवाह दर को 20 एमएल / मिनट तक समायोजित करें। टयूबिंग के अंत में एक कुंद 20-गेज सुई संलग्न करें।
  4. पेट की गुहा खोलें (चरण 6.4 और 6.5 देखें) और संक्षेप में काटने के घोल (अधिकतम 1-2 मिनट) के साथ चूहे को भरें।
  5. छिड़काव के बाद, तुरंत चूहे का सिर काट दें। मस्तिष्क को हटा दें और इसे 30 एस -1 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस काटने के घोल से भरे एक छोटे बीकर में रखें।
  6. एक स्पैटुला के साथ दिमाग स्थानांतरित करें और जल्दी से उन्हें एक विब्राटोम के कक्ष में ठीक करें। बारीक बल का उपयोग करके पिया को हटा दें। कक्ष को 4 डिग्री सेल्सियस काटने के घोल से भरें और 0.37 मिमी / सेकंड के वेग और 70 हर्ट्ज की आवृत्ति पर एमिग्डाला के तीव्र कोरोनल स्लाइस (250 μm मोटी) तैयार करें।
  7. जैसे ही स्लाइस प्राप्त किए जाते हैं, प्रत्येक को काटने के घोल से भरे होल्डिंग चैंबर में रखें और 10-12 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। एलए युक्त लगभग 5-7 स्लाइस प्रति जानवर प्राप्त किए जा सकते हैं।
  8. स्लाइस को कमरे के तापमान (आरटी) होल्डिंग समाधान के बीकर में स्थानांतरित करें और प्रयोग से पहले >30 मिनट के लिए ठीक होने की अनुमति दें।
    नोट: स्लाइस आमतौर पर स्वस्थ रहते हैं जबकि 4-6 घंटे के लिए घोल को पकड़कर रखा जाता है। एएवी की फ्लोरोसेंट प्रकृति के कारण, स्लाइस को कम रोशनी की स्थिति में रखा जाता है।

8. पूर्व विवो इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग

  1. तालिका 4-5 में सूचीबद्ध अभिकर्मकों का उपयोग करके इंट्रासेल्युलर समाधान तैयार करें।
    नोट: इंट्रासेल्युलर समाधान प्रयोगों से पहले किए जाने चाहिए और -80 डिग्री सेल्सियस पर दीर्घकालिक (3-12 महीने) या -20 डिग्री सेल्सियस पर अल्पकालिक (1-2 महीने) संग्रहीत किए जा सकते हैं। समाधान को पीएच को 7.3 में समायोजित किया जाता है (सीएस-आधारित इंट्रासेल्युलर समाधान के लिए सीएसओएच के साथ और के-आधारित इंट्रासेल्युलर समाधान के लिए केओएच के साथ)। 290-300 mOsm / kg H2O की अंतिम परासरणता में समायोजित करें।
  2. डाइमिथाइलसल्फोक्साइड (डीएमएसओ) में घुलने वाले 500 एमएम पिकोटॉक्सिन स्टॉक समाधान तैयार करें।
    नोट: पिकोटॉक्सिन स्टॉक को -20 डिग्री सेल्सियस पर अलिकोट और संग्रहीत किया जाता है। उपयोग के दिन, एलिकोट को पिघलाया जाता है और 100 μM की अंतिम एकाग्रता के लिए रिकॉर्डिंग समाधान में जोड़ा जाता है।
    सावधानी: पिक्रोटॉक्सिन जीएबीएए रिसेप्टर्स का एक गैर-प्रतिस्पर्धी विरोधी है, इसलिए पिकरोटॉक्सिन के जलसेक का एक उत्तेजक प्रभाव है। यह मौखिक अंतर्ग्रहण या त्वचा अवशोषण से गंभीर रूप से विषाक्त है। पिकरोटॉक्सिन के साथ काम करते समय उचित पीपीई का उपयोग हर समय किया जाना चाहिए।
  3. इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी प्रयोगों के लिए डिज़ाइन किए गए एक सीधे माइक्रोस्कोप में स्लाइस स्थानांतरित करें।
  4. प्रयोगों के दौरान, लगातार स्नान रिकॉर्डिंग समाधान के साथ स्लाइस को प्रभावित करता है जिसे 31-33 डिग्री सेल्सियस तक गर्म किया जाता है।
  5. 4x उद्देश्य का उपयोग करके LA को बड़ा करें। 40x जल विसर्जन लेंस के साथ आकृति विज्ञान द्वारा प्रमुख न्यूरॉन्स की पहचान करें।
  6. पूरे सेल पैच क्लैंप रिकॉर्डिंग प्राप्त करने के लिए या तो सीएस-आधारित इंट्रासेल्युलर समाधान (वोल्टेज क्लैंप प्रयोगों के लिए) या के-आधारित इंट्रासेल्युलर समाधान (वर्तमान क्लैंप प्रयोगों के लिए) से भरे ग्लास पिपेट (3-5 एम) का उपयोग करें।
  7. फ्लोरेसेंस (आरएफपी फिल्टर का उपयोग करके) के तहत एएवी-संक्रमित एमजीएन अक्षीय अनुमानों की पहचान करें। पल्स जनरेटर से जुड़े नीली रोशनी (473 एनएम) डीपीएसएस लेजर का उपयोग करके अनुमानों को उत्तेजित करें।
    चेतावनी: लेजर एक्सपोजर को सीमित करने के लिए, कोलिमेटेड लेजर लाइट को माइक्रोस्कोप पर एक फ्लोरोसेंट पोर्ट के साथ जोड़ा जाता है और उद्देश्य के माध्यम से स्लाइस पर केंद्रित किया जाता है।
    नोट: वोल्टेज क्लैंप मोड में, उत्तेजक पोस्टसिनेप्टिक धाराओं (ईपीएससी) को 0.1 हर्ट्ज पर ऑप्टिकल रूप से उत्पन्न किया जाता है।
  8. वर्तमान क्लैंप मोड में एक्स विवो लिमिटेड को प्रेरित करने के लिए, कम से कम 10 मिनट के लिए उत्तेजक पोस्टसिनेप्टिक पोटेंशियल (ईपीएसपी) की एक स्थिर आधार रेखा रिकॉर्ड करें। इसके बाद, 1 हर्ट्ज (कुल समय = 15 मिनट) की आवृत्ति पर 473-एनएम प्रकाश के 900 2-एमएस दालें वितरित करें। फिर ≥60 मिनट के लिए 0.1 हर्ट्ज पर ईपीएसपी को लगातार रिकॉर्ड करें।

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Representative Results

प्रयोगों के क्रम को रेखांकित करने वाली एक समयरेखा चित्रा 1 में दिखाई गई है। व्यवहार संबंधी प्रयोगों के दौरान, कोकीन जलसेक की संख्या के साथ-साथ सक्रिय लीवर पर की गई प्रतिक्रियाओं की संख्या कोकीन की मांग करने वाले व्यवहार की तीव्रता के माप के रूप में कार्य करती है। कोकीन स्व-प्रशासन के शुरुआती दिनों के दौरान, सक्रिय प्रतिक्रियाओं की संख्या धीरे-धीरे प्रत्येक अधिग्रहण दिन में बढ़नी चाहिए, दूसरे सप्ताह के दौरान स्थिर होने से पहले। इसके विपरीत, निष्क्रिय लीवर प्रतिक्रियाओं को प्रयोग की संपूर्णता में कम रहना चाहिए (चित्रा 2 ए)। वाद्य विलुप्त होने के पहले दिन, आमतौर पर सक्रिय लीवर प्रतिक्रियाओं की संख्या में वृद्धि होती है, क्योंकि कोकीन की अप्रत्याशित अनुपस्थिति के परिणामस्वरूप कोकीन की मांग करने वाले व्यवहार में वृद्धि होती है। हालांकि, यह प्रतिक्रिया धीरे-धीरे बाद के सत्रों के साथ कम हो जाएगी क्योंकि चूहे नई आकस्मिकता सीखते हैं, जिसके परिणामस्वरूप 6-10 डी (चित्रा 2 बी) के भीतर सक्रिय लीवर प्रतिक्रियाओं की कम और स्थिर संख्या होती है। चूहे जो प्रयोग के स्व-प्रशासन या वाद्य विलुप्त होने के चरणों में निर्दिष्ट अधिग्रहण मानदंडों तक पहुंचने में विफल रहते हैं, उन्हें अध्ययन से हटा दिया जाता है, और डेटा को अंतिम विश्लेषण में शामिल नहीं किया जाता है।

वाद्य विलुप्त होने के बाद, कोकीन से जुड़े संकेतों के पुन: संपर्क में आने से कोकीन की मांग करने वाले व्यवहार को बहाल किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप सक्रिय लीवर प्रतिक्रियाओं की संख्या में वृद्धि होती है। यह वृद्धि नियंत्रण प्रयोगों के दोनों समूहों में देखी जाती है: जिन चूहों को ओसीएचआईईएफ (एएवी नियंत्रण) की कमी वाले वायरस के साथ इंजेक्ट किया गया था और जिन चूहों को लेजर उत्तेजना (एसएचएएम नियंत्रण) प्राप्त नहीं हुआ था; चित्र 3A) हालांकि, एमजीएन-एलए टर्मिनलों केविवो ऑप्टोजेनेटिक लिमिटेड ने बाद में क्यू-प्रेरित कोकीन-मांग में कमी का कारण बना। ऑप्टोजेनेटिक लिमिटेड प्रेरण के 24 घंटे बाद, एएवी नियंत्रण और एसएचएएम नियंत्रण (चित्रा 3 ए) दोनों के सापेक्ष सक्रिय लीवर प्रेस की संख्या काफी कम हो गई थी। प्रतिक्रिया का यह निम्न स्तर 7 दिन बाद (चूहों के उप-समूह में आयोजित) बाद के बहाली परीक्षण के दौरान बनाए रखा गया था (चित्रा 3 बी), जो कई बहाली परीक्षणों में क्यू-प्रेरित कोकीन की मांग में लगातार कमी का संकेत देता है।

ऑप्टिकल उत्तेजना के संपर्क में आने वाले जानवरों से पूर्व विवो इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग ने पुष्टि की कि बहाली में क्षीणन वास्तव में कम से कम एमजीएन-एलए सिनैप्टिक प्लास्टिसिटी के मॉड्यूलेशन के कारण था। यह ऑप्टिकल लिमिटेड (चित्रा 4 ए) के संपर्क में आने के बाद एलए न्यूरॉन्स में ऑप्टिकल रूप से उत्पन्न ईपीएससी आयाम में कमी से स्पष्ट था। ईपीएससी आयाम में यह क्षीणन ऑप्टिक उत्तेजना प्राप्त करने वाले न्यूरॉन्स के लिए विशिष्ट था, क्योंकि ईपीएससी आयाम एसएचएएम-नियंत्रण में अपरिवर्तित रहा। इसके अतिरिक्त, लिमिटेड उन चूहों से स्लाइस में उत्पन्न होने में असमर्थ था जो पहले से ही विवो ऑप्टिकल उत्तेजना में प्राप्त हुए थे, लेकिन एसएचएएम उत्तेजना से गुजरने वाले चूहों से न्यूरॉन्स में मज़बूती से उत्पन्न हुआ था, जैसा कि ईपीएसपी वृद्धि ढलान (चित्रा 4 बी) में निरंतर कमी से स्पष्ट है। इस प्रकार, विवो ऑप्टिकल उत्तेजना में स्लाइस में आगे लिमिटेड प्रेरण होता है। रिकॉर्डिंग करते समय, पैच के बनाए गए स्वास्थ्य को सुनिश्चित करने के लिए रिकॉर्डिंग की अवधि के माध्यम से श्रृंखला प्रतिरोध को मापना महत्वपूर्ण है। 20% से अधिक श्रृंखला प्रतिरोध में परिवर्तन वाले कोशिकाओं को डेटा विश्लेषण के लिए स्वीकार नहीं किया जाता है। यह लिमिटेड प्रयोगों के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है जो >60 मिनट तक चलते हैं, क्योंकि श्रृंखला प्रतिरोध में परिवर्तन रिसेप्टर और चैनल गतिशीलता को प्रभावित कर सकते हैं। यह सुनिश्चित करने के लिए कि इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग के दौरान उत्तेजित होने वाले अभिवाही एमजीएन में उत्पन्न होते हैं, थैलेमस की सीमा के माध्यम से स्लाइस एकत्र करना महत्वपूर्ण है। यह सत्यापन के रूप में कार्य करता है कि एमजीएन के सेल निकाय वास्तव में फ्लोरोसेंटली एएवी व्यक्त करते हैं। दृश्य पुष्टि के अलावा, कार्यात्मक सत्यापन भी आवश्यक है। वर्तमान-क्लैंप स्थितियों के तहत, एएवी-ओसीआईईएफ-संक्रमित एमजीएन न्यूरॉन्स 473-एनएम-प्रकाश उत्तेजना (चित्रा 4 सी) की उच्च और निम्न आवृत्तियों दोनों के जवाब में कार्रवाई क्षमता को आग लगाते हैं।

सभी व्यवहार परिणामों को अनंतिम माना जाता था जब तक कि वायरल अभिव्यक्ति और ऑप्टिक फाइबर प्रत्यारोपण को हिस्टोलॉजिकल रूप से सत्यापित नहीं किया गया था और उचित प्लेसमेंट की पुष्टि की गई थी (चित्रा 5)। एमजीएन या एलए में एएवी अभिव्यक्ति की कमी और / या जिनमें ऑप्टिक फाइबर पृष्ठीय एलए के भीतर सही ढंग से तैनात नहीं थे, उन्हें प्रयोगात्मक विश्लेषण से बाहर रखा गया था, लेकिन कुछ उदाहरणों में इसे नकारात्मक शारीरिक नियंत्रण के रूप में शामिल किया जा सकता है।

Figure 1
चित्रा 1: प्रयोगात्मक प्रक्रिया की समयरेखा। प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण चरणों की एक रूपरेखा, जिसमें अनुक्रमिक समय पाठ्यक्रम और प्रत्येक प्रयोगात्मक चरण की अवधि शामिल है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: कोकीन स्व-प्रशासन का अधिग्रहण और विलुप्त होना। (ए) पशु अधिग्रहण में कोकीन इन्फ्यूजन और सक्रिय लीवर प्रतिक्रियाओं की बढ़ती संख्या और निष्क्रिय लीवर प्रतिक्रियाओं के निम्न स्तर का प्रदर्शन करते हैं। (बी) विलुप्त होने के पहले दिन लीवर दबाने में प्रारंभिक वृद्धि के बाद, जानवर सक्रिय और निष्क्रिय लीवर दोनों पर कम, स्थिर स्तर तक प्रतिक्रिया करना कम कर देते हैं। त्रुटि पट्टियाँ, मतलब ±SEM. इस आंकड़े को रिच एट अल 2019 4 से संशोधित किया गयाहै। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: विवो ऑप्टोजेनेटिक लिमिटेड में क्यू-प्रेरित बहाली को कम करता है। (ए) ऑप्टिकल लिमिटेड नियंत्रण वायरस या एसएचएएम नियंत्रण उत्तेजना प्राप्त करने वाले जानवरों के सापेक्ष बहाली के दौरान सक्रिय लीवर प्रेस में महत्वपूर्ण कमी का कारण बनता है। दो-तरफ़ा एनोवा, समूह का मुख्य प्रभाव (F(2,27) = 7.04, P = .004) और एक दिन x समूह इंटरैक्शन (F(2,27) = 8.08, P = .002); बोनफेरोनी का पोस्ट हॉक विश्लेषण: ***पी < .001. (बी) 7 दिन बाद, चूहों ने एक दूसरा बहाली परीक्षण किया, जिससे उन जानवरों में सक्रिय लीवर दबाने में महत्वपूर्ण कमी का पता चला जो पहले एसएचएएम नियंत्रणों के सापेक्ष एमजीएन-एलए लिमिटेड से गुजरे थे। दो-तरफ़ा एनोवा, समूह का मुख्य प्रभाव (F(1,32) = 5.04, P = .032), महत्वपूर्ण अंतःक्रिया (F(1,32) = 7.69, P = .009); बोनफेरोनी का पोस्ट हॉक विश्लेषण, ** पी < .01। त्रुटि पट्टियाँ, माध्य ±SEM, सलाखों में n, चूहों की संख्या. इस आंकड़े को रिच एट अल 2019 4 से संशोधित किया गयाहै। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: विवो कम आवृत्ति ऑप्टोजेनेटिक उत्तेजना (ए) में कार्यात्मक सत्यापन एमजीएन-एलए सिनैप्स के विवो दोहरे गोलार्ध लिमिटेड में एसएचएएम-नियंत्रण (अप्रकाशित टी-टेस्ट, टी (10) = 2.73, * पी = .021) के सापेक्ष ईपीएससी आयाम को क्षीण करता है। इनसेट: नमूना औसत ईपीएससी निशान ईरेव -70 एमवी पर उत्पन्न हुए। स्केल बार: 50 एमएस, 200 पीए, सलाखों में एन, चूहों (न्यूरॉन्स) की संख्या। (ख) विवो ऑप्टिकल लिमिटेड इंडक्शन में विवो लिमिटेड इंडक्शन में 24 घंटे बाद एमिग्डाला स्लाइस तैयार किए गए थे और वही उत्तेजना प्रोटोकॉल लागू किया गया था। एमजीएन-एलए टर्मिनलों पर ईपीएसपी वृद्धि ढलान को विवो एसएचएएम उत्तेजना में प्राप्त जानवरों से न्यूरॉन्स में एक्स विवो ऑप्टिकल उत्तेजना द्वारा कम किया गया था, लेकिन जानवरों के न्यूरॉन्स में नहीं जो विवो ऑप्टिकल लिमिटेड में प्राप्त हुए थे। (सी) एएवी-ओसीआईईएफ संक्रमित एमजीएन न्यूरॉन्स से नमूना वर्तमान क्लैंप रिकॉर्डिंग। एक्शन पोटेंशिअल ब्लू लाइट उत्तेजना (5-100 हर्ट्ज) द्वारा प्राप्त किए गए थे। स्केल सलाखों: 100 एमएस, 40 एमवी। त्रुटि पट्टियाँ, मतलब ±SEM. इस आंकड़े को रिच एट अल 2019 4 से संशोधित किया गयाहै। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: वायरल अभिव्यक्ति और ऑप्टिक फाइबर प्लेसमेंट का हिस्टोलॉजिकल सत्यापन। (ए) एलए (बाएं) और एमजीएन (दाएं) में डीएपीआई और एएवी-ओसीआईईएफ-टीडीटोमेटो अभिव्यक्ति दिखाने वाले प्रतिनिधि सूक्ष्म चित्र। स्केल बार: 2 मिमी (बी) एएवी-ओसीआईईएफ-टीडीटोमेटो के इंजेक्शन और एलए (बाएं) और एमजीएन (दाएं) के पूर्ववर्ती-पीछे की सीमा में, और एलए में ऑप्टिक फाइबर प्लेसमेंट को दिखाने वाला योजनाबद्ध। गहरे लाल छायांकन सबसे छोटे स्वीकार्य वायरस प्रसार का प्रतिनिधित्व दिखाता है, और हल्के गुलाबी छायांकन सबसे बड़े स्वीकार्य प्रसार का प्रतिनिधित्व दिखाता है। नीले घेरे दोनों गोलार्धों में सफल ऑप्टिक फाइबर प्लेसमेंट के अनुरूप हैं। काले घेरे केवल एक गोलार्ध में सफल ऑप्टिक फाइबर प्लेसमेंट के अनुरूप हैं। ब्लैक "एक्स" असफल फाइबर प्लेसमेंट से मेल खाती है। अंतिम विश्लेषण में शामिल होने के लिए, चूहों को एलए में वायरल दोहरे गोलार्ध अभिव्यक्ति के साथ-साथ फाइबर के सफल प्लेसमेंट की आवश्यकता होती है। निर्देशांक मिमी में होते हैं, ब्रेग्मा से पीछे। इस आंकड़े को रिच एट अल 2019 4 से संशोधित किया गयाहै। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

रासायनिक मिलीमीटर मेगावाट g/1000 mL
एन-मिथाइल-डी-ग्लूकोमाइन 92 195.215 17.96
पोटेशियम क्लोराइड 2.5 74.551 0.19
सोडियम फॉस्फेट मोनोबेसिक 1.25 119.98 0.15
सोडियम बाइकार्बोनेट 30 84.01 2.52
HEPES 20 238.301 4.77
डी-ग्लूकोज 25 180.16 4.5
सोडियम एस्कॉर्बेट 5 198.11 0.99
थिओरिया 2 76.12 0.15
सोडियम पाइरूवेट 3 110 0.33
मैग्नीशियम सल्फेट 10 2.0 M स्टॉक के 5.0 mL का उपयोग करें
कैल्शियम क्लोराइड 0.5 2.0 M स्टॉक के 250 μL का उपयोग करें
1. 1 लीटर घोल के लिए, 850 एमएल डीडीएच2ओ पर सूचीबद्ध क्रम में लवण जोड़ें
2. केंद्रित एचसीएल के साथ पीएच 7.3-7.4 (एनएमडीजी एक बुनियादी समाधान बनाता है)
3. 5-10 मिनट के लिए ऑक्सीजन लें फिर एमजीएसओ4 और सीएसीएल2 जोड़ें
4. डीडीएच2ओ के साथ अंतिम वॉल्यूम को 1 एल तक लाएं और अंतिम पीएच की दोहरी जांच करें
5. ऑस्मोमीटर के साथ ऑस्मोलरिटी की जांच करें और 300-310 mOsm / kg H2O पर समायोजित करें

तालिका 1: एक्स्ट्रासेल्युलर कटिंग सॉल्यूशन के लिए सामग्री की सूची। एनएमडीजी-आधारित बाह्य कटिंग समाधान की तैयारी के लिए उपयोग की जाने वाली सामग्री और निर्देश।

रासायनिक मिलीमीटर मेगावाट g/1000 mL
एन-मिथाइल-डी-ग्लूकोमाइन 86 195.215 5.03
पोटेशियम क्लोराइड 2.5 74.551 0.19
सोडियम फॉस्फेट मोनोबेसिक 1.25 119.98 0.15
सोडियम बाइकार्बोनेट 35 84.01 2.94
HEPES 20 238.301 4.77
डी-ग्लूकोज 25 180.16 4.5
सोडियम एस्कॉर्बेट 5 198.11 0.99
थिओरिया 2 76.12 0.15
सोडियम पाइरूवेट 3 110 0.33
मैग्नीशियम सल्फेट 1 2.0 M स्टॉक के 500 μL का उपयोग करें
कैल्शियम क्लोराइड 2 2.0 M स्टॉक के 1000 μL का उपयोग करें
1. 1 लीटर घोल के लिए, 850 एमएल डीडीएच2ओ पर सूचीबद्ध क्रम में लवण जोड़ें
2. 1 N HCl या KOH के साथ pH से 7.3-7.4
3. 5-10 मिनट के लिए ऑक्सीजन लें फिर एमजीएसओ4 और सीएसीएल2 जोड़ें
4. डीडीएच2ओ के साथ अंतिम वॉल्यूम को 1 एल तक लाएं और अंतिम पीएच की दोहरी जांच करें
5. ऑस्मोमीटर के साथ ऑस्मोलरिटी की जांच करें और 300-310 mOsm / kg H2O पर समायोजित करें

तालिका 2: एक्स्ट्रासेल्युलर होल्डिंग समाधान के लिए सामग्री की सूची। बाह्य होल्डिंग समाधान की तैयारी के लिए उपयोग की जाने वाली सामग्री और निर्देश।

रासायनिक मिलीमीटर मेगावाट g/1000 mL
एन-मिथाइल-डी-ग्लूकोमाइन 119 195.215 6.95
पोटेशियम क्लोराइड 2.5 74.551 0.19
सोडियम फॉस्फेट मोनोबेसिक 1.25 119.98 0.15
सोडियम बाइकार्बोनेट 26 84.01 2.18
HEPES 5 238.301 1.19
डी-ग्लूकोज 12.5 180.16 2.25
मैग्नीशियम सल्फेट 1 2.0 M स्टॉक के 500 μL का उपयोग करें
कैल्शियम क्लोराइड 2 2.0 M स्टॉक के 1000 μL का उपयोग करें
1. 1 लीटर घोल के लिए, 850 एमएल डीडीएच2ओ पर सूचीबद्ध क्रम में लवण जोड़ें
2. 1 N HCl या KOH के साथ pH से 7.3-7.4
3. 5-10 मिनट के लिए ऑक्सीजन लें फिर एमजीएसओ4 और सीएसीएल2 जोड़ें
4. डीडीएच2ओ के साथ अंतिम वॉल्यूम को 1 एल तक लाएं और अंतिम पीएच की दोहरी जांच करें
5. ऑस्मोमीटर के साथ ऑस्मोलरिटी की जांच करें और 300-310 mOsm / kg H2O पर समायोजित करें

तालिका 3: एक्स्ट्रासेल्युलर रिकॉर्डिंग समाधान के लिए सामग्री की सूची। बाह्य रिकॉर्डिंग समाधान की तैयारी के लिए उपयोग की जाने वाली सामग्री और निर्देश।

रासायनिक मिलीमीटर मेगावाट mg/50 mL
सीज़ियम मीथेनसल्फोनेट 108 227.997 1231.3
सीज़ियम क्लोराइड 15 168.36 126.3
सीज़ियम-ईजीटीए 0.4 250 mM Cs-EGTA का 80 μL जोड़ें
टीईए-क्लोराइड 5 165.705 41.4
HEPES 20 238.301 238.3
QX-314-Br 1 343.31 17.2
एल-ग्लूटाथियोन 1 307.323 15.4
सोडियम फॉस्फोक्रिएटिन 7.5 255.1 95.7
Mg-ATP 2.5 507.18 63.4
Na-GTP 0.25 523.18 6.5
1. 40-45 एमएल एचपीएलसी-ग्रेड एच2ओ के साथ शुरू करें
2. फॉस्फोक्रिएटिन, एटीपी और जीटीपी को हर समय बर्फ पर रखें।
3. तालिका में सूचीबद्ध क्रम में सामग्री जोड़ें
4. CSOH के साथ pH से 7.3 (2 M CSOH का लगभग 200 μL)
5. ऑस्मोलरिटी की जांच करने के लिए ऑस्मोमीटर का उपयोग करें।
6. एचपीएलसी-ग्रेड एच 2 ओ को लगभग 285-290 mOsm / kg H2O की अंतिम परासरण में जोड़ें
7. 500-1000 μL एलिकोट तैयार करें और -80 डिग्री सेल्सियस या -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें

तालिका 4: सीज़ियम मीथेनसल्फोनेट इंट्रासेल्युलर इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी समाधान के लिए सामग्री की सूची। सीज़ियम मीथेनसल्फोनेट इंट्रासेल्युलर समाधान की तैयारी के लिए उपयोग की जाने वाली सामग्री और निर्देश।

रासायनिक मिलीमीटर मेगावाट mg/50 mL
पोटेशियम ग्लूकोनेट 145 234.246 1698.2
पोटेशियम क्लोराइड 2.5 74.56 9.3
सोडियम क्लोराइड 2.5 58.44 7.3
K-BAPTA 0.1 K-BAPTA के 80 μL जोड़ें
HEPES 10 238.301 119.2
एल-ग्लूटाथियोन 1 307.323 15.4
सोडियम फॉस्फोक्रिएटिन 7.5 255.1 95.7
Mg-ATP 2 507.18 63.4
Tris-GTP 0.25 886.59 11.1
1. 40-45 एमएल एचपीएलसी-ग्रेड एच2ओ के साथ शुरू करें
2. फॉस्फोक्रिएटिन, एटीपी और जीटीपी को हर समय बर्फ पर रखें।
3. तालिका में सूचीबद्ध क्रम में सामग्री जोड़ें
4. कोह के साथ पीएच से 7.3 तक (2 एम कोह का लगभग 200 μL)
5. ऑस्मोलरिटी की जांच करने के लिए ऑस्मोमीटर का उपयोग करें।
6. एचपीएलसी-ग्रेड एच 2 ओ को लगभग 285-290 mOsm / kg H2O की अंतिम परासरण में जोड़ें
7. 500-1000 μL एलिकोट तैयार करें और -80 डिग्री सेल्सियस या -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें

तालिका 5: पोटेशियम ग्लूकोनेट इंट्रासेल्युलर इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी समाधान के लिए सामग्री की सूची। पोटेशियम ग्लूकोनेट इंट्रासेल्युलर समाधान की तैयारी के लिए उपयोग की जाने वाली सामग्री और निर्देश।

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Discussion

जैसा कि ऊपर वर्णित है, कई महत्वपूर्ण कदम हैं जो उचित प्रयोगात्मक परिणामों को प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण हैं। प्रोटोकॉल केवल उन जानवरों में प्रभावी होगा जो कोकीन स्व-प्रशासन को ठीक से प्राप्त करते हैं, और आज तक, यह केवल ऊपर उल्लिखित मापदंडों का उपयोग करके परीक्षण किया गया है। यह संभव है कि कोकीन की खुराक, सुदृढीकरण की अनुसूची, और क्यू मापदंडों को व्यवहार परिणामों पर बहुत कम प्रभाव के साथ संशोधित किया जा सकता है, अपवाद के साथ कि सुदृढीकरण के दूसरे क्रम के कार्यक्रम से एमिग्डाला-स्वतंत्र कोकीन की मांग हो सकती है जो प्रक्रिया की प्रभावकारिता को कम कर सकती है, हालांकि इसका सीधे परीक्षण नहीं किया गया है। . प्रोटोकॉल में कई बिंदु हैं जहां ऑप्टिक फाइबर के उचित निर्माण और कामकाज को मान्य करने से सफल ऑप्टिकल उत्तेजना सुनिश्चित करने में मदद मिलेगी। हेडकैप, और पॉलिश ऑप्टिक फाइबर से नुकसान को रोकने के लिए फेरूल को ठीक से स्कोर करना आवश्यक है, और यह परीक्षण करने के लिए कि प्रत्यारोपण के माध्यम से प्रकाश उत्पादन का नुकसान 30% 9 से अधिक नहीं है। इसके अतिरिक्त, लेजर उत्तेजना पैरामीटर महत्वपूर्ण विचार हैं। लेजर अपेक्षाकृत कम शक्ति (5-7 किलोवाट) पर संचालित किया जाना चाहिए। निरंतर, कम आवृत्ति उत्तेजना का उपयोग लिमिटेड को प्रेरित करने के लिए किया जाता है, और इसे इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग के साथ एमजीएन-एलए सिनैप्टिक ताकत को मापकर कार्यात्मक रूप से मान्य किया जा सकता है। अंत में, परिणामों ने प्रति समूह 10 जानवरों के अंतिम एन के साथ क्यू-प्रेरित बहाली में महत्वपूर्ण कमी का संकेत दिया, हालांकि, प्रयोगकर्ताओं को एक बड़े एन के साथ शुरू करने का अनुमान लगाना चाहिए, क्योंकि यह संभावना है कि कुछ जानवरों को अंतिम विश्लेषण से बाहर रखने की आवश्यकता होगी। वायरस और ऑप्टिकल फाइबर के उचित शारीरिक प्लेसमेंट और अभिव्यक्ति को सत्यापित करना महत्वपूर्ण है, और केवल उन जानवरों से डेटा का उपयोग करना है जिनमें हिस्टोलॉजी को सत्यापित किया गया है।

इस प्रोटोकॉल के साथ देखे गए कोकीन की मांग पर मजबूत व्यवहार प्रभाव के बावजूद, कई सीमाएं हैं जिन पर विचार किया जाना चाहिए। एक के लिए, विधि का परीक्षण केवल चूहों में किया गया है जिन्हें कोकीन के साथ जोड़े गए एकल ऑडियोविज़ुअल क्यू के साथ प्रशिक्षित किया गया था। यह स्पष्ट नहीं है कि ऐसे परिदृश्य में क्या होगा जहां कई अलग-अलग संकेत वातानुकूलित थे, जो मानव व्यसन का अधिक सटीक प्रतिनिधित्व होगा, जिससे कई पर्यावरणीय उत्तेजनाएं नशीली दवाओं के उपयोगसे अत्यधिक जुड़ी हुई हैं 15,16,17। हमारी प्रयोगशाला के साक्ष्य इंगित करते हैं कि दवा की मांग को कम करने के लिए ऑप्टोजेनेटिक लिमिटेड की क्षमता सिनैप्टिक ताकत में कमी के कारण है जो दवा-क्यू से जुड़ी यादों को कमजोर करती है। हालांकि, यह स्पष्ट नहीं है कि किस हद तक तटस्थ, या यादें जो कोकीन स्व-प्रशासन से जुड़ी नहीं हैं, इस प्रोटोकॉल से प्रभावित हो सकती हैं। इसके अलावा, जबकि विधि केवल एक सर्किट पर सिनैप्टिक ताकत को प्रभावित करती है, अन्य सर्किट मेमोरी को एन्कोडिंग करने और / या कोकीन की मांग करने वाले व्यवहारको चलाने के लिए भी महत्वपूर्ण हो सकते हैं। अंत में, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि लिमिटेड को केवल सिनैप्स पर प्रेरित किया जा सकता है जहां वायरस पर्याप्त रूप से व्यक्त किया जाता है, संभवतः उत्तेजना प्रोटोकॉल से अप्रभावित कुछ सिनैप्टिक कनेक्शन छोड़ देता है, जो संभावित रूप से व्यवहार प्रभाव को सीमित करता है। इसके अलावा, सबूत बताते हैं कि न्यूरॉन्स और सिनैप्स के केवल छोटे समूह किसी विशेष मेमोरी के एन्कोडिंग में शामिल होते हैं, जिससे इस विचार को विश्वसनीयता मिलती है कि पूरे मस्तिष्क क्षेत्र के भीतर लिमिटेड प्रेरण व्यवहार परिवर्तन को प्रभावित करने के लिए सबसे अच्छी रणनीति नहीं है, जबकि अन्य दृष्टिकोण विशेष रूप सेन्यूरॉन्स की क्यू- या प्रासंगिक रूप से सक्रिय आबादी को लक्षित करने के लिए मौजूद हैं। 22. इसके बावजूद, प्रोटोकॉल क्यू-प्रेरित दवा की मांग को कम करने में प्रभावी है, संभवतः क्योंकि कम आवृत्ति ऑप्टिकल उत्तेजना लिमिटेड प्रेरण को सिनैप्स तक सीमित करती है जो पहले बार-बार कोकीन-क्यू पेयरिंग4 द्वारा प्रबलित किए गए हैं।

यह प्रोटोकॉल अधिक सामान्य रूप से उपयोग किए जाने वाले ऑप्टोजेनेटिक व्यवहार अध्ययनों के लिए एक महत्वपूर्ण अग्रिम प्रदान करता है जहां न्यूरॉन्स की गतिविधि सक्रिय या बाधित होती है, जबकि जानवर वास्तविक समय19,23 में व्यवहार कर रहा होता है। इसके बजाय, ऑप्टोजेनेटिक्स का उपयोग यहां कोकीन-प्रेरित प्लास्टिसिटी को उलटने के लिए न्यूरोमॉड्यूलेटरी टूल के रूप में किया जाता है। इस विधि का एक लाभ यह है कि ऑप्टोजेनेटिक हेरफेर व्यवहार परीक्षण से स्वतंत्र है, जैसे कि ऑप्टोजेनेटिक्स के संभावित भ्रामक प्रभाव (जैसे, स्थानीय सर्किट प्रभाव, प्रकाश उत्तेजना के बाद दुर्दम्य अवधि, एंटीड्रोमिक उत्तेजना प्रभाव, आदि)। 24 परिणामों को प्रभावित नहीं करना चाहिए, जिससे विश्वास बढ़ जाता है कि परिकल्पित तंत्रिका तंत्र व्यवहार में परिवर्तन की मध्यस्थता कर रहा है। इसलिए इस विधि का उपयोग कई अनुप्रयोगों में किया जा सकता है कि सिनैप्टिक प्लास्टिसिटी, विशेष रूप से सिनैप्टिक ताकत में वृद्धि, जैसा कि एलटीपी के साथ होता है, व्यवहार में परिवर्तन से संबंधित है। इसी तरह के दृष्टिकोण तंत्रिका उत्तेजना प्रौद्योगिकियों के नैदानिक अनुप्रयोग के लिए भी प्रासंगिक हो सकते हैं जहां मस्तिष्क में असामान्य कनेक्शन निष्क्रिय व्यवहार को कम किया जा सकता है। इसी तरह, क्योंकि ओसीएचआईईएफ वायरल निर्माण कम और उच्च आवृत्ति उत्तेजना दोनों के लिए उत्तरदायी है, वर्णित प्रयोगों के दायरे से परे इन विधियों के लिए संभावित अनुप्रयोग हैं। उदाहरण के लिए, ऑप्टोजेनेटिक-प्रेरित एलटीपी न्यूरोडीजेनेरेटिव और न्यूरोडेवलपमेंटल विकारों की एक विस्तृत श्रृंखला में पाए जाने वाले प्लास्टिसिटी में घाटे को उलटने के लिए फायदेमंद हो सकताहै। इसके अलावा, एमजीएन-एलए सिनैप्स में द्विदिश प्लास्टिसिटी को सीधे भय से जुड़े विकारों से संबंधित व्यवहारों के विनियमन से जोड़ा गयाहै।

दवा-प्रेरित व्यवहार का समर्थन करने वाले विशिष्ट तंत्रिका सर्किट को संशोधित करना नशीली दवाओं के उपयोग से दीर्घकालिक संयम स्थापित करने के लिए आवश्यक है। यह प्रोटोकॉल विवो ऑप्टोजेनेटिक्स में एक सटीक तंत्रिका सर्किट की प्लास्टिसिटी को उलटने के लिए नई प्रगति का उपयोग करता है जो पर्यावरणीय संकेतों की उपस्थिति में बार-बार कोकीन स्व-प्रशासन द्वारा मजबूत होता है। इस विशिष्ट न्यूरोमॉड्यूलेशन का परिणाम कोकीन की मांग करने वाली प्रतिक्रिया को ट्रिगर करने के लिए बाद के क्यू री-एक्सपोज़र के लिए कम संभावना है, जिसका पदार्थ उपयोग विकारों के लिए भविष्य के उपचारों के विकास के लिए महत्वपूर्ण प्रभाव हो सकता है।

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Disclosures

खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं।

Acknowledgments

लेखक यूएसपीएचएस अनुदान K01DA031745 (MMT), R01DA042029 (MMT), DA035805 (YHH), F31DA039646 (MTR), T32031111 (MTR), और पेंसिल्वेनिया स्वास्थ्य विभाग से समर्थन स्वीकार करना चाहते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.9% Saline Fisher Scientific NC0291799
A.M.P.I. Stimulus Isolator Iso-Flex
AAV5.hSyn.oChIEF.tdTomato Duke Viral Vector Core (via Roger Tsien) #268 See Lin et al., 2009; Nabavi et al., 2014
AAV5.hSyn.tdTomato (Control) Duke Viral Vector Core Control See Lin et al., 2009; Nabavi et al., 2014
Artificial Tears (Opthalmic Ointment) Covetrus 70349
ATP Magnesium Salt Fisher Scientific A9187
Betadine Butler Schein 38250
Calcium chloride Fisher Scientific C1016
Cesium chloride Fisher Scientific 289329
Cesium hydroxide Fisher Scientific 516988
Cesium methanesulfonate Fisher Scientific C1426
Cocaine HCl NIDA Drug Supply Center 9041-001
Cryostat Leica CM1950
D-Glucose Sigma-Aldrich G8270
DMSO Fisher Scientific BP231-1
Dual-Channel Temperature Controller Warner Instruments TC-344C
EGTA Fisher Scientific E3889
Ethanol University of Pittsburgh Chemistry Stockroom 200C5000
Ferrule Dust Caps Thor Labs CAPL White plastic dust caps for 1.25 mm Ferrules
Ferrule Mating Sleeves Doric Lenses F210-3011 Sleeve_BR_1.25, Bronze, 1.25 mm ID
Ferrules Precision Fiber Products MM-FER2007C-2300 Ø1.25 mm Multimode LC/PC Ceramic ferrule, Ø230 μm hole size
Fiber Optic Thor Labs FP200URT 200 μm core multimode fiber (0.5 NA)
Fiber Optic Rotary Joint Prizmatix (Ordered from Amazon) 18 mm diameter, FC-FC connector for fiber
Fiber Stripping Tool Thor Labs T12S21
Fluoroshield with DAPI Sigma-Aldrich F6057
Gentamicin Henry Schein 6913
GTP Sodium Salt Fisher Scientific G8877
Hamilton syringe Hamilton 80085 10 μL volume, 26 gauge, 2 inch, point style 3
Heat Gun Allied Electronics 972-6966 250 V, 750-800 °F
Heat-Curable Epoxy Precision Fiber Products PFP-353ND-8OZ
Heparin Henry Schein 55737
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Hydrochloric Acid Fisher Scientific 219405490
Isoflurane Henry Schein 29405
Ketamine HCl Henry Schein 55853 Ketamine is a controlled substance and should be handled according to institutional guidelines
Lactated Ringer’s Henry Schein 9846
Laser, driver, and laser-to-fiber coupler OEM Laser Systems BL-473-00100-CWM-SD-xx-LED-0 100 mW, 473-nm, diode-pumped solid-state laser (One option)
L-glutathione Fisher Scientific G4251
Lidocaine Butler Schein 14583
Light Sensor Thor Labs PM100D Compact energy meter console with digital display
Loctite instant adhesive Grainger 5E207
Magnesium sulfate Sigma-Aldrich 203726
Microelectrode Amplifier/Data Acquisition Molecular Devices MULTICLAMP700B / Digidata 1440A
Microinjector pump Harvard Apparatus 70-4501 Dual syringe
Micromanipulator Sutter Instruments MPC-200/ROE-200
Microscope Olympus BX51WI Upright microscope for electrophysiology
Microscope Olympus BX61VS Epifluorescent slide-scanning microscope
N-methyl-D-glucamine Sigma-Aldrich M2004
Orthojet dental cement, liquid Lang Dental 1504BLK black
Orthojet dental cement, powder Lang Dental 1530BLK Contemporary powder, black
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
Patch Cables Thor Labs FP200ERT Multimode, FT030 Tubing
Picrotoxin Fisher Scientific AC131210010
Polishing Disc Thor Labs D50FC
Polishing Pad Thor Labs NRS913 9" x 13"
Polishing Paper Thor Labs LFG5P 5 μm grit
Polishing Paper Thor Labs LFG3P 3 μm grit
Polishing Paper Thor Labs LFG1P 1 μm grit
Polishing Paper Thor Labs LFG03P 0.3 μm grit
Potassium chloride Sigma-Aldrich P9333
Potassium hydroxide Fisher Scientific P5958
Potassium methanesulfonate Fisher Scientific 83000
QX-314-Cl Alomone Labs Q-150
Rimadyl (Carprofen) Henry Schein 24751
Self-Administration Chambers/Software Med Associates MED-NP5L-D1
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S5761
Sodium chloride Sigma-Aldrich S7653
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich 1064980500
Sodium L-Ascorbate Sigma-Aldrich A7631
Sodium Pentobarbital Henry Schein 24352
Sodium phosphate Sigma-Aldrich S9638
Sodium phosphocreatine Fisher Scientific P7936
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich P2256
Stainless steel machine screws WW Grainger  6GB25 M2-0.40mm Machine Screw, Pan, Phillips, A2 Stainless Steel, Plain, 3 mm Length
Stereotaxic adapter for ferrules Thor Labs XCL
Stereotaxic Frame Stoelting 51603
Sucrose Sigma-Aldrich S8501
Suture Thread Fine Science Tools 18020-50 Silk thread; Size: 5/0, Diameter: 0.12 mm
TEA-Chloride Fisher Scientific T2265
Thiourea Sigma-Aldrich T8656
Vetbond Tissue Adhesive Covetrus 001505
Vibratome Leica VT1200S
Xylazine Butler Schein 33198

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References

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न्यूरोसाइंस अंक 176 दीर्घकालिक अवसाद बहाली एमिग्डाला ऑप्टोजेनेटिक्स न्यूरोमॉड्यूलेशन
न्यूरोप्लास्टी को उलटने और चूहों में कोकीन की मांग को रोकने के लिए ऑप्टोजेनेटिक्स का उपयोग करना
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Rich, M. T., Huang, Y. H., Torregrossa, M. M. Using Optogenetics to Reverse Neuroplasticity and Inhibit Cocaine Seeking in Rats. J. Vis. Exp. (176), e63185, doi:10.3791/63185 (2021).

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