Summary
עבודה זו מציגה פרוטוקול גמיש לשימוש בטכנולוגיית משטחים אלסטומריים (FLECS) בעלי תווית פלואורסצנטית בפורמט מיקרווול לכימות פשוט יותר של כוחות התכווצות של תאים חד-תאיים המבוססים על תזוזות חזותיות של מיקרופטרנים של חלבון פלואורסצנטי.
Abstract
יצירת כוח התכווצות תאית היא תכונה בסיסית המשותפת כמעט לכל התאים. כוחות התכווצות אלה חיוניים להתפתחות תקינה, לתפקוד הן ברמת התא והן ברמת הרקמה, ומווסתים את המערכות המכניות בגוף. תהליכים ביולוגיים רבים תלויים בכוח, כולל תנועתיות, הידבקות וחלוקה של תאים בודדים, כמו גם התכווצות והרפיה של איברים כגון הלב, שלפוחית השתן, הריאות, המעיים והרחם. בהתחשב בחשיבותה בשמירה על תפקוד פיזיולוגי תקין, התכווצות תאית יכולה גם להניע תהליכי מחלה כאשר הם מוגזמים או משובשים. אסטמה, יתר לחץ דם, לידה מוקדמת, הצטלקות פיברוטית ושלפוחית השתן הלא פעילה הם כולם דוגמאות לתהליכי מחלה מונעים מכנית שניתן להקל עליהם עם שליטה נכונה בכוח ההתכווצות התאי. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מקיף לשימוש בטכנולוגיית בדיקת התכווצות מבוססת מיקרו-לוחית חדשנית הידועה בשם משטחים אלסטומריים אלסטומריים בעלי תווית פלואורסצנטית (FLECS), המספקת ניתוח פשוט ואינטואיטיבי של התכווצות של תא יחיד באופן בקנה מידה מאסיבי. להלן, אנו מספקים פרוטוקול צעד חכם לקבלת שתי עקומות תגובה במינון שש נקודות המתארות את ההשפעות של שני מעכבי התכווצות על התכווצות של תאי שריר חלקים שלפוחית השתן האנושית העיקרית בהליך פשוט תוך שימוש במיקרו-לוחית אחת בלבד של בדיקת FLECS, כדי להדגים טכניקה נכונה למשתמשים בשיטה. באמצעות טכנולוגיית FLECS, כל החוקרים עם מעבדות ביולוגיות בסיסיות ומערכות מיקרוסקופיה פלואורסצנטיות מקבלים גישה לחקר פנוטיפ תאים פונקציונלי בסיסי אך קשה לכימות זה, ובכך למעשה מורידים את מחסום הכניסה לתחום הביולוגיה של הכוח וההקרנה הפנוטיפית של כוח התא המתכווץ.
Introduction
כוחות מכניים שנוצרו על ידי תאים חיוניים לתפקוד תקין באיברים שונים בכל הגוף כגון המעיים, שלפוחית השתן, הלב ואחרים. איברים אלה חייבים ליצור דפוסים יציבים של התכווצות תאים והרפיה כדי לשמור על המצב ההומיאוסטטי הפנימי. התכווצות לא תקינה של תאי שריר חלקים (SMC) יכולה להוביל להתפרצות של הפרעות שונות, כולל, למשל, דיסמיוטיות מעיים, המאופיינת בדפוסים חריגים של התכווצות שרירים חלקה במעיים1, כמו גם את התנאים האורולוגיים של שלפוחית השתן הפרוע 2 או לא פעילה 3. בתוך דרכי הנשימה, SMCs המציגים דפוסי התכווצות לא סדירים יכולים לעורר hyperresponsiveness אסתמטי4, פוטנציאל הידוק דרכי הנשימה והפחתת זרימת האוויר של חמצן לתוך הריאות. מצב פיזי נפוץ נוסף, יתר לחץ דם, נגרם על ידי תנודות בהתכווצות שרירים חלקה בתוך כלי הדם5. ברור, מנגנוני התכווצות בתוך תאים ורקמות יכול להוביל למחלות הדורשות אפשרויות טיפול. כמו תנאים אלה ללא ספק נובעים התנהגויות התכווצות תפקודיות של תאים, זה הופך להיות הגיוני הכרחי כדי למדוד את פונקציית התכווצות התא עצמו, בעת סינון מועמדים פוטנציאליים לתרופה.
מתוך הכרה בצורך בכלים לחקר כוח התכווצות תאית, פותחו מספר שיטות בדיקת התכווצות כמותית על ידי חוקרים אקדמיים, כולל מיקרוסקופיה של כוח המתיחה (TFM)6, TFM7 micropatterned, בדיקות ג'ל צף8, ובדיקות מיקרופוסט אלסטומריות9. טכנולוגיות אלה נוצלו בפורמט מנה אחת, כמו גם בפורמט צלחת מרובת היטב במחקרים רבים ואף הוצעו למדידות כוח תלת מימדיות10,11,11,12,13,14. בעוד שטכנולוגיות אלה אפשרו מחקר חלוצי בתחום הרחב של הביולוגיה של כוח התא, כולן הוגבלו במידה רבה למעבדות בעלות יכולות ומשאבים ספציפיים, בפרט: יכולת לייצר מצעים של TFM, יכולת ליישם כראוי אלגוריתמים מורכבים ולא אינטואיטיביים כדי לפתור מפות תזוזה של TFM, ומערכות מיקרוסקופיות מדויקות יחסית שיכולות לרשום תמונות שצולמו לפני ואחרי הסרת מדגם מהבמה (לניתוק תאים). לכן, עבור חוקר לא מאומן, מחסום הכניסה להשתמש בשיטות אלה יכול להיות גבוה למדי בהתחשב בקבוצה הנרחבת של דרישות ליישם טכנולוגיות אלה. בנוסף, רזולוציית ההדמיה הנדרשת לטכנולוגיות קיימות רבות (יעדי פי 40 ומעלה) יכולה להגביל באופן משמעותי את התפוקה הניסיונית, בעוד שטכנולוגיות מדידה בתפזורת יכולות להסוות תרומות מתאים חריגים ולמנוע גילוי של הבדלי התכווצות מתונים יותר. שימו לב, ככל הידוע למחברים, רק גישת בדיקת הג'ל הצף הנמוך והכמותית למחצה הבשילה במידה מספקת כדי להיות זמינה לחוקרים (ראו איור 1).
איור 1: סכמטית כוללת של שיטת טכנולוגיית FLECS. (A) תאים דבקים במיקרו-פאטרנים של חלבונים דביקים המוטבעים באופן קוולנטי בשכבה אלסטומרית דקה הנתמכת על ידי זכוכית. (B) מבט עליון על צורות מיקרו-פטרן אפשריות שונות ופיצוץ של תא המתכווץ במיקרו-פאטרן בצורת 'X'. (ג) כיסוי של מיקרו-פטרנים פלואורסצנטיים ותמונות ניגודיות פאזה של תא מתכווץ. (D) תמונות קורס זמן של תא מכווץ יחיד. סרגלי קנה מידה = 25 מיקרומטר. נתון זה הותאם באישור פושקארסקי ואח ' 15. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
בעקבות ההתפתחויות האחרונות במיקרוטכנולוגיה, המחברים פיתחו טכנולוגיה מבוססת מיקרופלט המאפשרת מדידות כמותיות של התכווצות תאים חד-תאיים במאות אלפי תאים הנקראים FLECS (משטחים אלסטומריים מכווצים בעלי תווית פלואורסצנטית)15,16,17,18,19,20 כחלופה ל-TFM., בגישה זו, מיקרו-פאטרנים של חלבונים פלואורסצנטיים מוטמעים בסרטים רכים אשר מעוותים ומתכווצים כאשר תאים מפעילים עליהם כוחות גרירה, באופן אינטואיטיבי ומדיד. חשוב לציין, מיקרופטנים חלבון להגביל את מיקום התא, צורה, ואת אזור ההתפשטות, מה שמוביל לתנאי בדיקה אחידים. אלה מאפשרים מדידות פשוטות המבוססות רק על השינויים המימדיים שלהם, אשר נפתרים מאוד מרחבית אפילו בתמונות הגדלה פי 4. השיטה כוללת מודול ניתוח תמונה מבוסס דפדפן ומאפשרת ניתוח פשוט של כוח תא מכווץ ללא צורך בהליכי טיפול עדינים או רישום של סמני נאמנות, כך שהוא צריך להיות מופעל על ידי כל חוקר עם מתקן תרבית תאים בסיסי ומיקרוסקופ פלואורסצנטי פשוט עם הגדלה נמוכה (איור 2 ). טכנולוגיה זו, המוכנה למדף וזמינה מסחרית, תוכננה תוך התחשבות במשתמש הקצה ומטרתה להפחית את מחסום הכניסה לכל מדען מעבדה לחקור ביולוגיה של כוח תאי.
איור 2: סכמטית של תבנית לוחית 24 באר עבור בדיקת התכווצות של תא יחיד. פורמט זה שימש בניסויים המתוארים במסמך זה ומתוארים בחלק הווידאו של המאמר. סרגלי קנה מידה = 25 מיקרומטר. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
בעבודה זו, אנו מציגים פרוטוקול ליישום פורמט צלחת היטב 24 היטב של פלטפורמת טכנולוגיית FLECS כדי לכמת את ההשפעות של תרופות מווסתות כוח על התכווצות התא בתאי שריר חלקים שלפוחית השתן העיקרית. ניתן להתאים ולעצב פרוטוקול כללי זה לפי הצורך כדי להסביר לוחות זמנים שונים אחרים, סוגי תאים ותנאי טיפול מעניינים אחרים, ולהגדילו כדי לענות על שאלות אחרות בביולוגיה של כוח.
Protocol
1. יום 1: הכנת צלחת 24 באר
- התחל את ההליך על ידי הוספת 20 מ"ל של מדיום תרבית התא לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל. בניסוי זה, F12 Ham מבוסס מדיום בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS) משמש.
- להשיג צלחת 24 היטב שנועדה לבדוק התכווצות התא. הגדר את פיפטה ל 500 μL ולקבל מסננת תא עבור העברת תאים.
הערה: הצלחת זמינה מהמחברים על פי בקשה. - הרימו והחזקו את הצלחת ביד אחת והמשיכו לקלף בעדינות את סרט הפלסטיק מראש הצלחת. ואז בזהירות להגדיר את הצלחת בחזרה למטה.
- הפעל שואב אבק ושאף את השכבה העליונה של תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS) מהבארות כדי למנוע שפיכה. הסר את ה- PBS שורה אחת בכל פעם. ברגע הבארות כבר לא מלא לחלוטין, להחזיק את הצלחת ביד אחת ולהסיר בזהירות את שאר PBS מן הבארות. מלא במהירות עם 500 μL של מדיום תרבית תאים. יש להקפיד להימנע ממגע בין השאיפה לתחתית הבאר.
- יש לנער את הצלחת בעדינות ולהקיש על הצד כדי להבטיח שכל תחתית הבאר מכוסה בתמיסה. לאחר שכל הבארות מלאות בינוני, הגדר את הצלחת בצד.
2. יום 1: זריעת תאים
- לאחזר את בקבוקון התרבות עם מעבר 7 או נמוך יותר שלפוחית השתן האנושית העיקרית חלקה תאים (BSM) מן החממה 37 °C (37 °C). תחת מיקרוסקופ, בדוק את המורפולוגיה של התאים וודא שהתאים גדלו לפחות 90% מפגש אבל פחות מ 100% מפגש.
- נהל את פרוטוקול ניתוק התא. בתוך ארון בטיחות ביולוגית סטרילי, טריפסין התאים במשך 2.5 דקות עד התאים מנותקים לפני מרווה אותם עם מדיום בתוספת סרום (10% FBS).
- לאחר שהתאים מנותקים, השתמש בהמוציטומטר כדי לספור את התאים ולדלל את ההשעיה של התא לכ -50,000 תאים / מ"ל במדיום בתוספת סרום. חשוב לציין, תאים דורשים לפחות 2% סרום כדי להתחבר micropatterns.
- לפני זריעה, במהירות לסנן את ההשעיה התא דרך מסננת תא 40 או 100 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל עם פיפטה סרולוגית כדי לשבור גושים של תאים לתאים בודדים.
- הוסף בזהירות 500 μL של 50,000 תאים / השעיית תא מ"ל לתוך כל אחת מ -24 הבארות על הצלחת באמצעות פיפטה P1000 על ידי חלוקת הפתרון dropwise על פני עמדות שונות בבארות.
- לאחר זריעת התא, תן לצלחת לשבת בטמפרטורת החדר במשך שעה אחת כדי לאפשר לתאים להתיישב ישירות על המיקרו-פאטרנים מבלי להיות מושפעים ממיקרו-זרמים הנוצרים על ידי אידוי. לאחר 1 שעות, מניחים את הצלחת לתוך אינקובטור 37 °C (37 °F) לילה. התאים יתאספו בעצמם ויתפשטו על פני המיקרו-פאטרנים הדביקים בתקופה זו ויתחילו להפעיל רמות התכווצות בסיסית.
3. יום 2: תוספת של תרופה לבדיקה
הערה: הריכוז הסופי של דימתיל סולפוקסיד (DMSO) בבארות המכילות תאים דבוקים לא יכול לעלות על 1% ולא ניתן להוסיף סמים / DMSO ישירות לתאים, אך יש לדלל תחילה אותו ולערבב אותו לפתרון ביניים של מדיום התא.
- צור סדרה של שישה שלבים, שמונה פי שמונה דילול סמים על ידי העברת 30 μL של התרופה המלאי לתוך כרכים רצופים 210 μL של DMSO וערבוב יסודי בין כל שלב העברה. בעבודה זו, סדרה של שישה שלבים, שמונה פי שמונה דילול של blebbistatin מוכן במינונים הנעים בין 40 μM ל 1 nM, ב- DMSO.
- עבור כל פתרון תרופה מלאי (משלב 3.1), לערבב 30 μL של תרופה לתוך 470 μL של מדיום תרבית התא. פתרון הביניים מניב דילול של DMSO פי 16.7.
- העבר 200 μL של כל פתרון ביניים לבאר המתאימה על צלחת 24 באר (אשר כבר מכיל 100 μL של בינוני בכל באר). זה מניב דילול נוסף של פי שישה של DMSO.
- שלבים 3.2 ו-3.3 מניבים ביחד ריכוז סופי של 1% של DMSO בבארות.
- מניחים את הצלחת המטופלת באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך הזמן המתאים. לניסוי זה, דגירה של 30 דקות משמשת.
- מיד לפני ההדמיה, הוסיפו את פתרון הכתמים הגרעיניים החיים Hoechst 33342 לכל באר (דילול סופי של 1:10,000). אפשר לו לדגור במשך 15 דקות נוספות כדי לתייג את גרעיני התא.
4. יום 2: הדמיית צלחת הבאר
- גש למיקרוסקופ המצויד כדי לדמות את הערוצים הן עבור גרעיני התא (DAPI) והן עבור המיקרו-פאטרנים (TRITC).
- תמונה ראשונה של התאים עם DMSO בלבד.
- לאחר מכן התמקדו הן במיקרו-פאטרנים והן בגרעין התא המסומן בתווית כדי לזהות תאים בודדים ולוודא ששני הערוצים מיושרים באופן מושלם כדי לאפשר ניתוח תמונה אוטומטי.
- חוזרים על הפעולה במיקומים מרובים בכל אחת מ-24 הבארות שעל הצלחת. ניתן לצלם תמונות עם מטרה 4x (או באופן אופציונלי גבוה יותר כדי לזרז הדמיה ולרכוש נקודות נתונים מקסימליות לכל תמונה).
- יצא את התמונות כקבצי TIF ופתח אותן במחשב המחובר לאינטרנט באמצעות ImageJ כדי לנתח את הנתונים.
5. לאחר הניסוי: ניתוח תמונה
הערה: ניתוח תמונה בוצע באמצעות פורטל Biodock.ai ותוכנת הדמיה.
- העלה את התמונות שנרכשו למחשב.
- ודא שזוגות תואמים של מיקרו-פאטרן ותמונות גרעיניות נקראים כראוי.
- ודא ששמות תמונות micropattern כולם לובשים את הטופס "sharedCoreName_pt.tif".
- ודא ששמות תמונות גרעינים מקבלים את הטופס "sharedCoreName_dapi.tif".
- המר תמונות מ- TIF ל- PNG באמצעות ImageJ.
- לאחר פתיחת ImageJ, טען בערוץ אחד בכל פעם. עבור ניסוי זה, טען תחילה תמונות micropattern כערימה לתוך ImageJ.
- באמצעות image > Adjust > בהירות/ניגודיות, התאם את בהירות התמונה כדי להדגיש את המיקרו-פאטרנים ולהפחית את הרקע לשחור. בנוסף לכך, להחליק את התמונות.
- באמצעות תמונה > סוג > 8 סיביות, המר את התמונות ל- 8 סיביות.
- לאחר מכן יצא את התמונה לסוג PNG וסמן את רמת פרוסת התיבה כשם קובץ. כעת צור תיקיה חדשה PNGs ושמור את קבצי PNG שם באותו שם עם אותו שם.
- חזור על תהליך זה עבור תמונות גרעינים.
- העלה זוגות תמונות PNG לתוכנת עיבוד התמונה לצורך הניתוח.
- צור ואמת את החשבון. למחברים יש חשבון המאפשר גישה פתוחה למשתמשים אקדמיים.
- אמת את תיק הלקוח על-ידי יצירת קשר עם המחברים.
- היכנס לתוכנה.
- תחת הכרטיסיה נתונים מימין, לחץ על העלה אצווה.
- יבא את התמונות על-ידי גרירה ושחרור של זוגות תמונות לתוך החלון שמופיע ונותן שם לאצווה. לחץ על אישור.
- סמן את התיבה לצד שם האצווה ולחץ על נתח.
- במסך הבא, גלול מטה וסמן את התיבה לצד ניתוח התכווצות ולחץ על בחר. בהמשך העמוד, בחר 10x כהגדלה ששימשה להדמיה מתפריט נפתח.
- לחץ על שלח. לאחר ניתוח הנתונים קורא הושלם, לחץ על שם האצווה. במסך הבא, לחץ על הורד נתונים בצד השמאלי של הדף.
הערה: הקבצים שהורדו יכילו תמונות שנותחו, תוצאות סיכום המדווחות על התכווצות ממוצעת בכל תמונה וניתוח מפורט של כל מיקרו-פאטרן שזוהה בכל תמונה, תוך דיווח על גודלם, מיקומם, מספר התאים שנדבקו והתכווצותם. - ערכי התכווצות התוויית נגד ריכוזי תרופות כדי ליצור עקומת תגובת ריכוז ולקבוע את העוצמה היחסית של טיפולים שונים.
- לחץ על שלח. לאחר ניתוח הנתונים קורא הושלם, לחץ על שם האצווה. במסך הבא, לחץ על הורד נתונים בצד השמאלי של הדף.
Representative Results
אזורים בתמונות שנרכשו מבארות שטופלו ב-DMSO בלבד ואלה שטופלו ב-40 מיקרומטר בלביסטאין מוצגים זה לצד זה באיור 3. ניתן לראות בבירור כי תאים שטופלו ב- DMSO בלבד מציגים רמה משמעותית של התכווצות בהתבסס על העיוותים הבולטים מאוד של המיקרו-פאטרנים שנדבקו על ידי תאי שריר חלקים בשלפוחית השתן (BSMCs) באותה באר. לעומת זאת, בתמונה של מטופל היטב עם 40 μM blebbistatin, הרפיה משמעותית התא הוא ציין7 כמו micropatterns דבק על ידי BSMCs הם כמעט לא מובחנים בגודל מן micropatterns שאינם דבקים על ידי תאים, המציין התכווצות מינימלית. תמונות אלה ממחישות את הייצוג החזותי האינטואיטיבי והברור של התכווצות התא הבודד המוצעת על ידי שיטת המיקרו-פאטרינג הפלואורסצנטית. שלא כמו שיטות מבוססות TFM, שבהן התנועה הכל-כיוונית של חלקיקים פלואורסצנטיים רבים המופצים באופן אקראי מתחת למונולייר תאים צפופים נועדה להעביר כוח התכווצות יחסי, כאן, הגיאומטריות המכווצות האחידות והמסומנות של המיקרו-פאטרנים מספקות מידע איכותי מיידי וקל לפרשנות על התכווצות תאים בודדים. ניתן לכמת אותם ישירות על-ידי החלת פעולות אובייקט בינאריות סטנדרטיות על התמונות.
איור 3: השוואות זה לצד זה של תמונות שצולמו של בארות המכילות רק 1% טיפול DMSO (משמאל) או המכילות 40 מיקרומטר של ביביסטין (מימין). ניתן לראות בבירור כי טיפול עם blebbistatin מפחית באופן משמעותי את התכווצות של תאים בודדים כפי שצוין על ידי micropatterns גדול יותר, ללא מכווץ. גרעינים כחולים מציינים אילו מיקרו-פאטרנים קשורים לתאים. סרגל קנה מידה = 25 מיקרומטר. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
על-ידי החלת מודול הניתוח מבוסס הדפדפן כדי לנתח את זוגות התמונות שנרכשו של מיקרו-פאטרנים וגרעיני תאים, מתקבלות התפלגות התכווצות של תאים חד-תאיים עבור כל אוכלוסייה כפי שמוצג באיור 4. מתואר בפירוט בדו"ח קודם על מתודולוגיית FLECS15, הניתוח עובד על ידי איתור המיקום והכיוונים של כל micropattern בצורת "X", לספור את מספר הגרעינים דבוקים ישירות מעל מרכז כל micropattern, חישוב האורך הממוצע של כל micropattern, וחישוב מרחק הפיקסלים של התכווצות של כל micropattern ביחס לאורך הממוצע של micropatterns ריק (אפס התייחסות התכווצות). לכן, micropatterns ריק לשמש מטרה חשובה לנרמול נתוני התכווצות. חשוב לציין, תאים שאינם נקשרים למיקרו-פטרנים יצטברו בגבולות הבאר בשל מיקרו-זרמים שבהם הם לא ישפיעו על ניתוח התמונה. כפי שניתן לראות בחלקות אלה, ההתכווצות הבלתי מוגבלת של אוכלוסיית התאים המטופלת רק באמצעות פקדי DMSO משתרעת על פני טווח גדול של עד 20 פיקסלים, כאשר מרכז נמצא בסביבות 10 פיקסלים. בינתיים, תאים שטופלו בבלביסטן מתכווצים באופן משמעותי פחות וההפצה שלהם נדחפת למרכז של קצת יותר מ-6 פיקסלים. חשוב לציין, כל מיקרו-פאטרן שנמצא בתמונה שנקשרת בדיוק בתא מיוצג בהפצות אלה. זה מדגים את היכולת של השיטה להעביר תגובות תאיות דיפרנציאליות לטיפולים תרופתיים.
איור 4: היסטוגרמה המתארת נתוני התכווצות של תאים חד-תאיים המתקבלים מניתוח תמונות שצולמו של בארות המכילות 1% DMSO בלבד (כחול) או 40μM blebbistatin. ההתפלגות של תאים שטופלו ב- DMSO היא רחבה ומרוכזת בערך התכווצות גדול בהרבה (~ 10 פיקסלים) מאשר ההתפלגות המטופלת בבלביסטן, המדגימה את ההשפעות הכמותיות של טיפול בתאים עם blebbistatin. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
על ידי ניצול כל הבארות על צלחת אחת 24-well והדמיה לפחות 3 אתרים לבאר, עקומות מינון תגובה שש נקודות נוצרים בו זמנית עבור שתי תרכובות סמים. איור 5 מציג את נתוני תגובת הריכוז עבור BSMCs שטופלו באותו טווח של מינונים של blebbistatin או ציטוצ'אלסין D (שניהם מעכבי התכווצות ידועים). כפי שניתן לראות מפרופילי תגובת הריכוז, ציטוכלסין D הוא המעכב החזק יותר של התכווצות טוניק בתאים אלה. על ידי התאמת עקומה סיגמואידית לנקודות הנתונים, ניתן לחשב ערכי IC50 עבור כל תרופה. הניסויים שלנו מראים כי IC50 הם 7.9 מיקרומטר ו 100 ננומטר עבור blebbistatin ו cytochalasin D, בהתאמה, לאחר ~ 30 דקות של חשיפה לתרופות. חשוב לציין, בסך הכל, ערכים אלה עולים בקנה אחד עם דוחות קודמים, אימות הדיוק הכמותי של השיטה כדי לקבוע את העוצמה של מעכבי התכווצות7,21.
איור 5: עקומות תגובת ריכוז המתארות את ההשפעות של blebbistatin ו- cytochalasin D על התכווצות התאים בתאים בודדים. כל נקודת נתונים כוללת שלוש תמונות עבור מצב זה. עקומה סיגמואידלית התאימה לכל קבוצת נתונים. התוצאות מצביעות על כך כי ציטוכלסין D הוא חזק יותר, בעל ערך IC50 נמוך יותר. נתונים אלה ניתנים לאיסוף מלוחית FLECS אחת של 24 בארות. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Discussion
שיטה פשוטה זו למדידת התכווצות כמותית במאות אלפי תאים בכל פעם בתנאי טיפול שונים ושימוש במכשירי מיקרוסקופיה סטנדרטיים בלבד מספקת חלופה נגישה ל- TFM המסורתי לחוקרים ללמוד ביולוגיה של הכוח התאי. מכיוון שהטכנולוגיה המוצגת מספקת תצוגה חזותית של התכווצות תאים על ידי ניתוח שינויים במיקרו-פאטרנים פלואורסצנטיים בעלי צורה קבועה, גודל ההתכווצות המיוצרת על ידי כל תא נתון מובן באופן אינטואיטיבי - ככל שהמיקרו-פאטרן קטן יותר, כך גדל כוח ההתכווצות המופעל על ידי התא.
ראוי לציין, על ידי מתן שליטה על גורמים כגון צורה, אזור התפשטות, ומולקולת הידבקות המרכיבה את micropatterns (כל הגורמים הידועים לווסת התכווצות התא22,23,24), הטכנולוגיה המוצגת מבטלת באופן שיטתי משתנים נוספים שעשויים לבלבל פרשנויות של מחקרי התכווצות תאים.
בניסוי זה, 10 kPa נוקשות שימשה בג'ל ו 70 מיקרופטרן (אורך אלכסוני) שימש מורכב סוג של קולגן IV. מלבד פרמטרים אלה, ניתן להחליף את מולקולת הדבק בקולגנים שונים, פיברונקטין, ג'לטין ומטריצה חוץ-תאית אחרת (ECM). ניתן לכוונן את הנוקשות של הג'ל ל-0.1 kPa, ולעלות לטווח ה-MPa. ניתן לעצב את הגיאומטריה micropattern דה נובו להיות כל צורה עם גודל תכונה מינימלי של ~ 5 מיקרומטר. פרמטרים אלה מנותקים וניתן למטב אותם באופן עצמאי להקשר ביולוגי מסוים.
טכנולוגיה זו אומתה בהרחבה כדי להיות תואמת לסוגי תאים דביקים ומתכווצים מאוד של פנוטיפ מזנכימלי כולל סוגים שונים של תאי שריר חלקים (שלפוחית השתן האנושית העיקרית, מעיים, קנה הנשימה, הסימפונות, הרחם, אבי העורקים ועורקים), תאי גזע מזנכימליים וצאצאיהם המובחנים, פיברובלסטים שונים (ריאתי, עור ולב), מיופיברובלסטים ותאי אנדותל. בנוסף, מקרופאגים שמקורם במונוציטים ייצרו גם כוח פאגוציטי גדול מדיד על המיקרו-פאגוטרנים, במיוחד אם המיקרו-פאטרן מורכב מאופסונין ידוע. קווי סרטן שונים ניתן גם לבדוק באמצעות השיטה.
השיטה עשויה להציב כמה אתגרים לשימוש עם תאים קטנים יחסית כגון תאי T ונויטרופילים, או סוגי תאים עם פנוטיפ אפיתל בעיקר. הסיבה העיקרית לכך היא כי השיטה מסתמכת על הידבקות חזקה והתפשטות מלאה של תאים על פני micropattern על מנת ליצור את אות התכווצות מדיד. תאים שנקשרים בצורה חלשה, נקשרים זה לזה או אינם מתפשטים לחלוטין לא ייצרו אותות התכווצות מדידים. התנהגויות אלה, שהן נדירות יחסית, ניתנות להקלה על ידי התאמת גודל המיקרו-פאטרן כך שיהיה קטן יותר, או באמצעות מולקולות דבק חלופיות בתוך המיקרו-פאטרנים שיקדמו טוב יותר הידבקות והתפשטות בתאים אלה.
משתמשי הטכנולוגיה חייבים להעריך בקפידה ניסוחים בינוניים שונים של תרבית תאים אפשרית עבור סוג העניין המסוים שלהם, שכן רכיבים שונים, גורמי גדילה, רמות סרום ורגישויות pH עשויים להניע התנהגויות משתנות בתאים שונים. אופטימיזציה של הפרוטוקול צריכה להקדים שינוי קנה מידה של כל זרימות עבודה ניסיוניות, ורכיבי מדיה צריכים תמיד להיות טריים, סטריליים ועקביים עם אצוות קודמות.
בסופו של דבר, אם רזולוציה של תא בודד אינה נחוצה למטרות המשתמש, או אם לסוג תא היעד יש יכולת התפשטות מינימלית, ייתכן ש- TFM המסורתי מתאים באותה מידה או יותר לניסויים כאלה. מטרת המחברים ותקוותם היא כי כלי זה מספק שדרה נוספת עבור ביולוגים תא ללמוד התכווצות הסלולר, במיוחד בהקשר של מסכי סמים פנוטיפיים אוטומטיים בעלי תפוקה גבוהה.
ספציפי לשימושים עתידיים במסכי סמים, לוחות תפוקה גבוהים יותר כגון צלחת FLECS 384-well ניתן להשתמש. בלוחות כאלה, מטרות 4x על מיקרוסקופים רבים יכול ללכוד באר אחת שלמה בשדה הראייה שלהם, להבטיח כי כל התגובות התכווצות התאים נלכדים. על ידי שימוש במערכת הדמיה בעלת תפוקה גבוהה, ניתן לצלם צלחת שלמה של 384 בארות תוך כ-5 דקות, מה שהופך את המערכת הזו למהירה באופן דרמטי מאפשרויות אחרות, ולכן מתאימה לגילוי תרופות פנוטיפיות בעלות תפוקה גבוהה. ואכן, המחברים מריצים באופן שגרתי מסכי סמים שבועיים על ~ 50 384-wellplates (בסך הכל יותר מ -19,000 בארות) באמצעות אוטומציה.
Disclosures
I.P. הוא ממציא על משפחת פטנטים שהונפקה הגנה על השיטות והמערכות של טכנולוגיית FLECS. I.P., Y.W., J.Z., E.C., ו- R.H. הם כולם עובדים של Forcyte Biotechnologies, Inc. R.D. הוא פרופסור באוניברסיטת קליפורניה בלוס אנג'לס ומייסד שותף של Forcyte Biotechnologies, Inc. I.P., Y.W., J.Z., ו R.D. מחזיקים באינטרסים פיננסיים ב Forcyte Biotechnologies, Inc. , שהוא בעל הרישיון הבלעדי של הפטנטים לעיל ומסחור טכנולוגיית FLECS.
Acknowledgments
עבודת המעבדה נערכה בתמיכת משאב ההקרנה המשותף המולקולרי של UCLA (MSSR) שבו פורסייט מממנת פעילויות מחקר, וחממת ההגדלה במכון NanoSystems בקליפורניה (CNSI), שם פורסייט ביוטכנולוגיה בע"מ היא חברה תושבת. המחברים יעניקו גישה למודול ניתוח FLECS Biodock.ai לכל החוקרים האקדמיים על פי בקשה. ל.ה. ואיי.פי תרמו באופן שווה לעבודה זו.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bladder smooth muscle cell culture | Sciencell | #4310 | |
| Blebbistatin | Sigma-Aldrich | B0560 | |
| Cell culture media | Thermofisher | 11765054 | Ham's F12 medium supplemented with 10% FBS and 1% p/s |
| Cell strainer | Fisher Scientific | 7201432 | |
| Conical Tube | Fisher Scientific | 05-539-13 | |
| Culture flask | Fisher Scientific | FB012941 | |
| Cytochalasin D | Sigma-Aldrich | C8273 | |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Fisher Scientific | D1284 | |
| Eppendorf tubes | Fisher Scientific | 05-402-31 | |
| Fluorescent microscope | Molecular Devices | ImageXpress Confocal | |
| Forcyte-manufactured 24-well plate | Forcyte Biotechnologies | 24-HC4R-X1-QB12 | |
| Hoescht 3342 Live Nuclear Stain | Thermofisher | 62249 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | BP39920 |
References
- Ohama, T., Hori, M., Ozaki, H. Mechanism of abnormal intestinal motility in inflammatory bowel disease: How smooth muscle contraction is reduced. Journal of Smooth Muscle Research. 43 (2), 43-54 (2007).
- Peyronnet, B., et al. A comprehensive review of overactive bladder pathophysiology: On the way to tailored treatment. European Urology. 75 (6), 988-1000 (2019).
- Aldamanhori, R., Osman, N. I., Chapple, C. R. Underactive bladder: Pathophysiology and clinical significance. Asian Journal of Urology. 5 (1), 17-21 (2018).
- Sanderson, M. J., Delmotte, P., Bai, Y., Perez-Zogbhi, J. F. Regulation of airway smooth muscle cell contractility by Ca2+ signaling and sensitivity. Proceedings of the American Thoracic Society. 5 (1), 23-31 (2008).
- Brozovich, F. V., et al. Mechanisms of vascular smooth muscle contraction and the basis for pharmacologic treatment of smooth muscle disorders. Pharmacological Reviews. 68 (2), 476-532 (2016).
- Munevar, S., Wang, Y., Dembo, M. Traction force microscopy of migrating normal and H-ras transformed 3T3 fibroblasts. Biophysical Journal. 80 (4), 1744-1757 (2001).
- Tseng, Q., et al. A new micropatterning method of soft substrates reveals that different tumorigenic signals can promote or reduce cell contraction levels. Lab on a Chip. 11 (13), 2231-2240 (2011).
- Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences. 76 (3), 1274-1278 (1979).
- Tan, J. L., et al. Cells lying on a bed of microneedles: an approach to isolate mechanical force. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (4), 1484-1489 (2003).
- Rokhzan, R., et al. high-throughput measurements of cell contraction and endothelial barrier function. Laboratory Investigation. 99 (1), 138-145 (2019).
- Park, C. Y., et al. High-throughput screening for modulators of cellular contractile force. Integrative Biology. 7 (10), 1318-1324 (2015).
- Kaylan, K. B., Kourouklis, A. P., Underhill, G. H. A high-throughput cell microarray platform for correlative analysis of cell differentiation and traction forces. Journal of Visualized Experiments. (121), e55362 (2017).
- Huang, Y., et al. Traction force microscopy with optimized regularization and automated Bayesian parameter selection for comparing cells. Scientific Reports. 9, 539 (2019).
- Franck, C., Maskarinec, S. A., Tirrell, D. A., Ravichandran, G. Three-dimensional traction force microscopy: A new tool for quantifying cell-matrix interactions. PLOS ONE. 6, 17833 (2011).
- Pushkarsky, I., et al. Elastomeric sensor surfaces for high-throughput single-cell force cytometry. Nature Biomedical Engineering. 2 (2), 124-137 (2018).
- Pushkarsky, I. FLECS technology for high-throughput single-cell force biology and screening. ASSAY and Drug Development Technologies. 16 (1), 7-11 (2017).
- Koziol-White, C. J., et al. Inhibition of PI3K promotes dilation of human small airways in a rho kinase-dependent manner. British Journal of Pharmacology. 173 (18), 2726-2738 (2016).
- Orfanos, S., et al. Obesity increases airway smooth muscle responses to contractile agonists. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 315 (5), 673-681 (2018).
- Tseng, P., Pushkarsky, I., Carlo, D. D. Metallization and biopatterning on ultra-flexible substrates via dextran sacrificial layers. PLOS ONE. 9, 106091 (2014).
- Yoo, E. J., et al. Gα12 facilitates shortening in human airway smooth muscle by modulating phosphoinositide 3-kinase-mediated activation in a RhoA-dependent manner. British Journal of Pharmacology. 174 (4), 4383-4395 (2017).
- MacGlashan, D., Vilariño, N. Polymerization of actin does not regulate desensitization in human basophils. Journal of Leukocyte Biology. 85 (4), 627-637 (2009).
- Hocking, D. C., Sottile, J., Langenbach, K. J. Stimulation of integrin-mediated cell contractility by fibronectin polymerization. Journal of Biological Chemistry. 275 (14), 10673-10682 (2000).
- Tolić-Nørrelykke, I. M., Wang, N. Traction in smooth muscle cells varies with cell spreading. Journal of Biomechanics. 38 (7), 1405-1412 (2005).
- Ye, G. J. C., et al. The contractile strength of vascular smooth muscle myocytes is shape dependent. Integrative Biology. 6 (2), 152-163 (2014).
