Summary
Dette arbejde præsenterer en fleksibel protokol til anvendelse af fluorescerende mærkede elastomeriske kontraktbare overflader (FLECS) Teknologi i mikrobrøndformat til forenklet, hands-off kvantificering af enkeltcellekontraktile kræfter baseret på visualiserede forskydninger af fluorescerende proteinmikromønstre.
Abstract
Cellulær kontraktil kraftgenerering er et grundlæggende træk, der deles af stort set alle celler. Disse kontraktile kræfter er afgørende for korrekt udvikling, fungerer på både celle- og vævsniveau og regulerer de mekaniske systemer i kroppen. Talrige biologiske processer er kraftafhængige, herunder bevægelighed, vedhæftning og opdeling af enkeltceller samt sammentrækning og afslapning af organer som hjerte, blære, lunger, tarme og livmoder. I betragtning af dets betydning for at opretholde korrekt fysiologisk funktion kan cellulær kontraktilitet også drive sygdomsprocesser, når de overdrives eller forstyrres. Astma, hypertension, for tidlig fødsel, fibrotisk ardannelse og underaktiv blære er alle eksempler på mekanisk drevne sygdomsprocesser, der potentielt kan lindres med korrekt kontrol af cellulær kontraktil kraft. Her præsenterer vi en omfattende protokol til brug af en ny mikropladebaseret kontraktilitetsanalyseteknologi kendt som fluorescerende mærkede elastomeriske kontraktbare overflader (FLECS), der giver forenklet og intuitiv analyse af enkeltcellekontraktilitet på en massivt skaleret måde. Heri giver vi en trinvis protokol til opnåelse af to sekspunkts dosisresponskurver, der beskriver virkningerne af to kontraktile hæmmere på sammentrækningen af primære humane blæreglat muskelceller i en simpel procedure, der kun anvender en enkelt FLECS-assaymikroplade for at demonstrere korrekt teknik til brugere af metoden. Ved hjælp af FLECS-teknologi får alle forskere med grundlæggende biologiske laboratorier og fluorescerende mikroskopisystemer adgang til at studere denne grundlæggende, men vanskelige at kvantificere funktionelle cellefænotype, hvilket effektivt sænker adgangsbarrieren inden for kraftbiologi og fænotypisk screening af kontraktil cellekraft.
Introduction
Cellegenererede mekaniske kræfter er afgørende for korrekt funktion i forskellige organer i hele kroppen, såsom tarmene, blæren, hjertet og andre. Disse organer skal generere stabile mønstre af cellekontraktion og afslapning for at opretholde den indre homeostatiske tilstand. Unormal sammentrækning af glatte muskelceller (SMC) kan føre til udbrud af forskellige lidelser, herunder for eksempel intestinal dysmotilitet, der er karakteriseret ved unormale mønstre af intestinal glat muskelkontraktion1, samt de urologiske tilstande af overaktiv2 eller underaktiv blære3. Inden for luftvejene kan SMC'er, der udviser uregelmæssige sammentrækningsmønstre, udløse astmatisk hyperresponsivitet4, potentielt stramme luftvejene og mindske luftstrømmen af ilt ind i lungerne. En anden udbredt fysisk tilstand, hypertension, er forårsaget af udsving i sammentrækningen af glatte muskler i blodkarrene5. Det er klart, at kontraktile mekanismer i celler og væv kan føre til sygdomme, der kræver behandlingsmuligheder. Da disse tilstande umiskendeligt stammer fra cellernes dysfunktionelle kontraktile adfærd, bliver det logisk og nødvendigt at måle selve cellekontraktilfunktionen, når man screener potentielle lægemiddelkandidater.
I erkendelse af behovet for værktøjer til at studere cellulær kontraktil kraft er der udviklet flere kvantitative sammentrækningsassaymetoder af akademiske forskere, herunder trækkraftmikroskopi (TFM)6, mikromønstret TFM7, flydende gelassays8 og elastomeriske mikropostassays9. Disse teknologier er blevet brugt i enkeltskålsformat såvel som multi-well-plate-format i adskillige undersøgelser og er endda blevet foreslået til tredimensionelle kraftmålinger10,11,12,13,14. Mens disse teknologier har muliggjort banebrydende forskning inden for det ekspansive område af cellekraftbiologi, har de alle stort set været begrænset til laboratorier, der besidder specifikke evner og ressourcer, især: evne til at fremstille TFM-substrater, evne til korrekt at anvende komplekse og ikke-intuitive algoritmer til at løse TFM-forskydningskort og relativt præcise mikroskopisystemer, der kan registrere billeder taget før og efter prøvefjernelse fra scenen (til celledisociation). For en uuddannet forsker kan adgangsbarrieren for at anvende disse metoder således være ret høj i betragtning af det omfattende sæt krav til anvendelse af disse teknologier. Derudover kan den billedopløsning, der kræves for mange eksisterende teknologier (40x mål eller derover), betydeligt begrænse eksperimentel gennemstrømning, mens bulkmålingsteknologier kan maskere bidrag fra afvigende celler og forhindre opdagelse af mildere kontraktile forskelle. Det bemærkes, så vidt forfatterne ved, at kun den lave gennemstrømning og semi-kvantitative flydende gelassay-tilgang er modnet tilstrækkeligt til at blive tilgængelig for forskere (se figur 1).
Figur 1: Overordnet skematisk oversigt over FLECS-teknologimetoden. (A) Celler klæbes til klæbende proteinmikromønstre, der er kovalent indlejret i et tyndt elastomerisk lag understøttet af glas. (B) Top-view af forskellige mulige mikromønsterformer og en sprængning af en celle, der kontraherer en »X«-formet mikromønster. (C) Overlejring af fluorescerende mikromønstre og fasekontrastbilleder af en kontraherende celle. (D) Tidsforløbsbilleder af en enkelt kontraherende celle. Skalastænger = 25 μm. Denne figur blev tilpasset med tilladelse fra Pushkarsky et al15. Klik her for at se en større version af denne figur.
Efter de seneste fremskridt inden for mikroteknologi udviklede forfatterne en mikropladebaseret teknologi, der muliggør kvantitative målinger af enkeltcellekontraktion i hundredtusinder af celler kaldet FLECS (fluorescerende mærkede elastomeriske kontraktbare overflader)15,16,17,18,19,20 , som et alternativ til TFM. I denne tilgang er fluorescerende proteinmikromønstre indlejret i bløde film, der deformeres og krymper, når celler anvender trækkraft på dem på en intuitiv og målbar måde. Det er vigtigt, at proteinmikromønstrene begrænser celleposition, form og spredningsområde, hvilket fører til ensartede testbetingelser. Disse tillader enkle målinger, der kun er baseret på deres dimensionelle ændringer, som er meget løst rumligt, selv i 4x forstørrelsesbilleder. Metoden omfatter et browserbaseret billedanalysemodul og muliggør enkel analyse af kontraktil cellekraft uden at kræve delikate håndteringsprocedurer eller registrering af tillidsmarkører, således at den bør kunne betjenes af enhver forsker med en grundlæggende cellekulturfacilitet og simpelt fluorescerende mikroskop med lav forstørrelse (figur 2 ). Denne teknologi, som er hyldeklar og kommercielt tilgængelig, blev designet med slutbrugeren i tankerne og har til formål at reducere adgangsbarrieren for enhver laboratorieforsker til at studere cellulær kraftbiologi.
Figur 2: Skematisk oversigt over pladeformatet med 24 brønde til enkeltcellekontraktilitetsassayet. Dette format blev brugt i de eksperimenter, der er beskrevet heri og afbildet i videodelen af artiklen. Skalabjælker = 25 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
I dette arbejde præsenterer vi en protokol til anvendelse af FLECS Technology-platformens 24 brøndpladeformat for at kvantificere virkningerne af kraftmodulerende lægemidler på cellulær kontraktilitet i primære blæreglatmuskelceller. Denne protokol til generelle formål kan tilpasses og ændres efter behov for at tage højde for forskellige andre tidsskalaer, celletyper og behandlingsbetingelser af interesse og skaleres til at besvare andre spørgsmål i gældende biologi.
Protocol
1. Dag 1: Klargøring af pladen med 24 brønde
- Begynd proceduren ved at tilsætte 20 ml af cellekulturmediet i et 50 ml konisk rør. I dette forsøg anvendes F12 Hams baserede medium suppleret med 10% føtalt kvægserum (FBS).
- Få en 24 brøndplade designet til at analysere cellekontraktilitet. Sæt pipetten til 500 μL, og få en cellesil til cellepassering.
BEMÆRK: Pladen er tilgængelig fra forfatterne efter anmodning. - Løft og hold pladen i den ene hånd, og fortsæt med forsigtigt at skrælle plastfilmen fra toppen af pladen. Sæt derefter forsigtigt pladen ned igen.
- Tænd for en vakuumaspirator, og aspirer det øverste lag af fosfatbufret saltvand (PBS) fra brøndene for at forhindre spild. Fjern PBS'en en række ad gangen. Når brøndene ikke længere er helt fulde, skal du holde pladen i den ene hånd og forsigtigt fjerne resten af PBS'en fra brøndene. Fyld hurtigt med 500 μL cellekulturmedium. Pas på at undgå kontakt mellem aspiratoren og bunden af brønden.
- Ryst pladen forsigtigt og tryk på siden for at sikre, at hele bunden af brønden er dækket af opløsning. Når alle brønde er fyldt med medium, skal du sætte pladen til siden.
2. Dag 1: Cellesåning
- Dyrkningskolben med passage 7 eller lavere primære humane blæreglatte muskelceller (BSM) hentes fra 37 °C-inkubatoren. Under et mikroskop skal du kontrollere cellemorfologi og sikre, at cellerne er vokset til mindst 90% sammenløb, men mindre end 100% sammenløb.
- Udfør celle dissociationsprotokollen. I et sterilt biosikkerhedsskab trypsiniseres cellerne i 2,5 minutter, indtil cellerne løsnes, før de slukkes med serumstædseret medium (10% FBS).
- Når cellerne er dissocieret, skal du bruge et hæmocytometer til at tælle cellerne og fortynde cellesuspensionen til ca. 50.000 celler / ml i serumstædlet medium. Det er vigtigt, at celler kræver mindst 2% serum for at binde sig til mikromønstrene.
- Før såning spændes cellesuspensionen hurtigt gennem en 40 eller 100 μm cellesil i et 50 ml konisk rør med en serologisk pipette for at opdele klumper af celler i enkeltceller.
- Tilsæt forsigtigt 500 μL af 50.000 celler/ml cellesuspension i hver af de 24 brønde på pladen ved hjælp af en P1000-pipette ved at dispensere opløsningen dråbevis på tværs af forskellige positioner i brøndene.
- Efter cellesåning skal pladen sidde ved stuetemperatur i 1 time for at lade cellerne sætte sig direkte på mikromønstrene uden at blive påvirket af mikrostrømme genereret ved fordampning. Efter 1 time anbrings pladen i en 37 °C inkubator natten over. Cellerne vil selv samle og sprede sig over de klæbende mikromønstre i løbet af denne tid og begynde at udøve basale sammentrækningsniveauer.
3. Dag 2: Tilsætning af testlægemiddel
BEMÆRK: Den endelige koncentration af dimethylsulfoxid (DMSO) i brøndene, der indeholder klæbende celler, må ikke overstige 1%, og lægemiddel/DMSO kan ikke tilsættes direkte til cellerne, men skal først fortyndes og blandes i en mellemopløsning af cellemedium.
- Opret en seks-trins, otte gange lægemiddelfortyndingsserie ved at overføre 30 μL af lagerlægemidlet til på hinanden følgende 210 μL volumener DMSO og grundigt blande mellem hvert overførselstrin. I dette arbejde fremstilles en seks-trins, otte gange fortyndingsserie af blebbistatin i doser fra 40 μM til 1 nM i DMSO.
- For hver stamlægemiddelopløsning (fra trin 3.1) blandes 30 μL lægemiddel i 470 μL cellekulturmedium. Den mellemliggende opløsning giver en 16,7 gange fortynding af DMSO.
- Overfør 200 μL af hver mellemopløsning til den relevante brønd på 24 brøndpladen (som allerede indeholder 100 μL medium i hver brønd). Dette giver en yderligere seks gange fortynding af DMSO.
- Trin 3.2 og 3.3 giver tilsammen en endelig koncentration på 1% dmso i brøndene.
- Den behandlede plade anbrings i en 37 °C-inkubator i passende varighed. Til dette eksperiment anvendes en 30 minutters inkubation.
- Umiddelbart før billeddannelse tilsættes Hoechst 33342 levende nuklear pletopløsning til hver brønd (1:10.000 endelig fortynding). Lad det inkubere i yderligere 15 minutter for at mærke cellekernerne.
4. Dag 2: Billeddannelse af brøndpladen
- Få adgang til et mikroskop, der er udstyret til at afbilde kanalerne for både cellekernerne (DAPI) og mikromønstrene (TRITC).
- Forestil dig først kun cellerne med DMSO.
- Fokuser derefter på og billede både mikromønstrene og de mærkede cellekerner for at identificere enkeltceller og sikre, at begge kanaler er perfekt justeret for at muliggøre automatiseret billedanalyse.
- Gentag i flere positioner i hver af de 24 brønde på pladen. Billeder kan tages med 4x målsætning (eller eventuelt højere for at fremskynde billeddannelse og opnå maksimale datapunkter pr. Billede).
- Eksporter billederne som TIF-filer, og åbn dem på en webforbundet computer med ImageJ for at analysere dataene.
5. Efter eksperimentet: Billedanalyse
BEMÆRK: Billedanalyse blev udført ved hjælp af Biodock.ai portal- og billedbehandlingssoftware.
- Upload de erhvervede billeder til en computer.
- Sørg for, at tilsvarende par mikromønster og nukleare billeder er navngivet korrekt.
- Sørg for, at mikromønsterbillednavne alle har form af "sharedCoreName_pt.tif".
- Sørg for, at kernebillednavne alle har form af "sharedCoreName_dapi.tif".
- Konverter billeder fra TIF til PNG ved hjælp af ImageJ.
- Når ImageJ er åbnet, skal du indlæse en kanal ad gangen. Til dette eksperiment skal du først indlæse mikromønsterbilleder som en stak i ImageJ.
- Brug Image > Juster > Lysstyrke/Kontrast, juster billedets lysstyrke for at fremhæve mikromønstrene og reducere baggrunden til sort. Ud over dette skal du udjævne billederne.
- Brug Image > Type > 8-bit til at konvertere billederne til 8-bit.
- Eksporter derefter billedet til PNG-type, og marker afkrydsningsfeltet udsnitsniveau som filnavn. Opret nu en ny mappe PNG'er og gem PNG-filerne der med samme navn.
- Gentag denne proces for kernebilleder.
- Upload PNG-billedpar til billedbehandlingssoftwaren til analysen.
- Opret og valider kontoen. Forfatterne har en konto for at muliggøre åben adgang til akademiske brugere.
- Valider kontoen ved at kontakte forfatterne.
- Log ind på softwaren.
- Klik på Upload batch under fanen Data til venstre.
- Importer billederne ved at trække og slippe billedpar i det vindue, der dukker op, og navngiv batchen. Klik på OK.
- Markér afkrydsningsfeltet ud for batchnavnet, og klik på Analysér.
- På det næste skærmbillede skal du rulle ned og markere afkrydsningsfeltet ud for Kontraktilitetsanalyse og klikke på Vælg. Længere nede på siden skal du vælge 10x som den forstørrelse, der blev brugt til billeddannelse fra en rullemenu.
- Klik på Send. Når dataanalysen læser Fuldført, skal du klikke på batchnavnet. Klik på Download data i højre side af siden på det næste skærmbillede.
BEMÆRK: De downloadede filer indeholder billeder, der blev analyseret, sammenfattende resultater, der rapporterer gennemsnitlig sammentrækning i hvert billede, og en detaljeret analyse af hvert mikromønster, der blev registreret i ethvert billede, rapportering af deres størrelser, positioner, antal celler, der er klæbet, og sammentrækning. - Plot sammentrækningsværdier mod lægemiddelkoncentrationer for at generere en koncentrationsresponskurve og bestemme de relative potenser af forskellige behandlinger.
- Klik på Send. Når dataanalysen læser Fuldført, skal du klikke på batchnavnet. Klik på Download data i højre side af siden på det næste skærmbillede.
Representative Results
Regioner af de billeder, der er erhvervet fra brønde, der kun blev behandlet med DMSO, og dem, der blev behandlet med 40 μM blebbistatin, er vist side om side i figur 3. Det kan tydeligt observeres, at DMSO-behandlede celler udviser et signifikant niveau af sammentrækning baseret på de meget fremtrædende deformationer af mikromønstrene, der klæbes af blæreglatmuskelceller (BSMC'er) i den brønd. Omvendt observeres signifikant celleafslapning på billedet af brønden behandlet med 40 μM blebbistatin7, da de mikromønstre, der klæbes til af BSMC'er, næsten ikke kan skelnes i størrelse fra de mikromønstre, der ikke klæbes af celler, hvilket indikerer minimal sammentrækning. Disse billeder demonstrerer den intuitive og klare visuelle repræsentation af enkeltcellekontraktilitet, der tilbydes af den fluorescerende mikromønstermetode. I modsætning til TFM-baserede metoder, hvor den omnidirektionelle bevægelse af talrige fluorescerende partikler tilfældigt fordelt under et tæt cellemonolag er beregnet til at formidle relativ kontraktil kraft, giver mikromønstrenes ensartede og markerede kontraherede geometrier her øjeblikkelig og let fortolkelig kvalitativ information om sammentrækning af individuelle celler. Disse kan kvantificeres direkte ved at anvende standard binære objektoperationer på billederne.
Figur 3: Side-om-side sammenligninger af billeder taget af brønde, der enten kun indeholder 1% DMSO-behandling (venstre) eller indeholdende 40 μM blebbistatin (højre). Det kan tydeligt observeres, at behandling med blebbistatin signifikant reducerer kontraktiliteten af de enkelte celler som angivet af de større, ikke-kontraherede mikromønstre. Blå kerner angiver, hvilke mikromønstre der er bundet af celler. Skalabjælke = 25 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Ved at anvende det browserbaserede analysemodul til at analysere de erhvervede billedpar af mikromønstre og cellekerner opnås enkeltcellekontraktilitetsfordelinger for hver population som vist i figur 4. Beskrevet detaljeret i en tidligere rapport om FLECS-metoden15 fungerer analysen ved at lokalisere positioner og orienteringer for hvert "X" -formet mikromønster, tælle antallet af kerner, der klæbes direkte over midten af hvert mikromønster, beregne gennemsnitslængden af hvert mikromønster og beregne pixelafstanden for sammentrækningen af hver mikromønster i forhold til gennemsnitslængden af tomme mikromønstre (nulkontraktionsreference). Derfor tjener de tomme mikromønstre et vigtigt formål med at normalisere sammentrækningsdataene. Det er vigtigt, at celler, der ikke binder til mikromønstrene, akkumuleres på brøndgrænserne på grund af mikrostrømme, hvor de ikke påvirker billedanalysen. Som det ses i disse plots, spænder den uforstyrrede kontraktilitet af cellepopulationen, der kun behandles med DMSO-kontroller, over et stort område så højt som 20 pixels, med et center fundet på omkring 10 pixels. I mellemtiden trækker celler behandlet med blebbistatin sig betydeligt mindre sammen, og deres fordeling skubbes ned til et center på lidt over 6 pixels. Det er vigtigt, at hvert eneste mikromønster, der findes i billedet, der binder nøjagtigt på celle, er repræsenteret i disse fordelinger. Dette demonstrerer metodens evne til at formidle differentielle cellulære reaktioner på lægemiddelbehandlinger.
Figur 4: Histogrammer, der viser enkeltcellekontraktilitetsdata opnået ved analyse af billeder taget af brønde, der kun indeholder 1% DMSO (blå) eller 40 μM blebbistatin. Fordelingen af DMSO-behandlede celler er bred og centreret ved en meget større sammentrækningsværdi (~ 10 pixels) end den blebbistatin-behandlede fordeling, hvilket viser de kvantitative virkninger af behandling af celler med blebbistatin. Klik her for at se en større version af denne figur.
Ved at udnytte alle brøndene på en enkelt 24-brønds plade og afbilde mindst 3 steder pr. Brønd genereres seks-punkts dosis-responskurver samtidigt for to lægemiddelforbindelser. Figur 5 viser koncentrationsresponsdata for BSMC'er behandlet med samme interval af doser blebbistatin eller cytochalasin D (begge kendte kontraktilitetshæmmere). Som det fremgår af koncentrationsresponsprofilerne, er cytochalasin D den mere potente hæmmer af tonisk sammentrækning i disse celler. Ved at tilpasse en sigmoidalkurve til datapunkterne kan IC50-værdier beregnes for hvert lægemiddel. Vores eksperimenter indikerer, at IC50 er 7,9 μM og 100 nM for henholdsvis blebbistatin og cytochalasin D efter ~30 minutters eksponering for lægemidlerne. Det er vigtigt, at disse værdier samlet set er i overensstemmelse med tidligere rapporter, hvilket validerer den kvantitative nøjagtighed af metoden til bestemmelse af styrken af sammentrækningshæmmere7,21.
Figur 5: Koncentrationsresponskurver, der viser virkningerne af blebbistatin og cytochalasin D på cellulær kontraktilitet i enkeltceller. Hvert datapunkt består af tre billeder for den pågældende betingelse. En sigmoidal kurve var egnet til hvert sæt data. Resultaterne indikerer, at cytochalasin D er mere potent og har en lavere IC50-værdi . Disse data kan indsamles fra en enkelt FLECS-plade med 24 brønde. Klik her for at se en større version af denne figur.
Discussion
Denne forenklede metode til kvantitativt at måle sammentrækning i hundredtusinder af celler ad gangen under forskellige behandlingsbetingelser og kun ved hjælp af standardmikroskopiinstrumenter giver et tilgængeligt alternativ til traditionel TFM for forskere til at studere cellulær kraftbiologi. Fordi den præsenterede teknologi giver en visuel visning af cellekontraktion ved at analysere ændringer i regelmæssigt formede fluorescerende mikromønstre, forstås størrelsen af sammentrækningen produceret af en given celle intuitivt - jo mindre mikromønsteret er, desto større er den kontraktile kraft, der udøves af cellen.
Især ved at tilbyde kontrol over faktorer som form, spredningsområde og vedhæftningsmolekyle, der omfatter mikromønstrene (alle faktorer, der vides at regulere cellekontraktilitet22,23,24), eliminerer den præsenterede teknologi systematisk yderligere variabler, der kan forvirre fortolkninger af cellekontraktionsundersøgelser.
I dette eksperiment blev der anvendt 10 kPa stivhed i gelen, og der blev anvendt et mikromønster på 70 μm (diagonal længde) bestående af type IV kollagen. Udover disse parametre kan klæbemiddelmolekylet erstattes med forskellige kollagener, fibronectin, gelatine og anden ekstracellulær matrix (ECM). Gelens stivhed kan indstilles ned til 0,1 kPa og op i MPa-området. Mikromønstergeometrien kan designes de novo til at være enhver form med minimal funktionsstørrelse på ~ 5 μm. Disse parametre er afkoblet og kan uafhængigt optimeres til en bestemt biologisk sammenhæng.
Denne teknologi er blevet grundigt valideret til at være kompatibel med stærkt klæbende og kontraktile celletyper af en mesenkymal fænotype, herunder forskellige glatte muskelcelletyper (primær human blære, tarm, trakeal, bronchial, livmoder, aorta og arteriel), mesenkymale stamceller og deres differentierede afkom, forskellige fibroblaster (lunge, dermal og hjerte), myofibroblaster og endotelceller. Derudover vil monocytafledte makrofager også producere stor målbar fagocytisk kraft på mikromønstrene, især hvis mikromønsteret består af et kendt opsonin. Forskellige kræftlinjer kan også analyseres ved hjælp af metoden.
Metoden kan give nogle udfordringer for brugen med celler, der enten er relativt små, såsom T-celler og neutrofiler, eller celletyper med en overvejende epitelfænotype. Hovedårsagen til dette er, at metoden er afhængig af stærk vedhæftning og fuldstændig spredning af celler over mikromønsteret for at generere det målbare kontraktile signal. Celler, der binder svagt, binder sig til hinanden eller ikke spredes fuldstændigt, vil ikke producere målbare kontraktile signaler. Denne adfærd, som er relativt sjælden, kan afbødes ved at justere mikromønsterstørrelsen til at være mindre eller ved at anvende alternative klæbemiddelmolekyler i mikromønstrene, der bedre fremmer vedhæftning og spredning i disse celler.
Brugere af teknologien skal omhyggeligt evaluere forskellige mulige cellekulturmedieformuleringer for deres særlige celletype af interesse, da forskellige komponenter, vækstfaktorer, serumniveauer og pH-følsomheder kan drive variabel adfærd i forskellige celler. Optimering af protokollen bør gå forud for skalering af eventuelle eksperimentelle arbejdsgange, og mediekomponenter skal altid være friske, sterile og i overensstemmelse med tidligere batches.
I sidste ende, hvis enkeltcelleopløsning ikke er nødvendig for en brugers mål, eller hvis målcelletypen har minimal spredningskapacitet, kan traditionel TFM være lige så eller mere egnet til sådanne eksperimenter. Forfatternes mål og håb er, at dette værktøj giver en ekstra mulighed for cellebiologer til at studere cellulær sammentrækning, især i forbindelse med automatiserede fænotypiske lægemiddelskærme med høj gennemstrømning.
Specifikt for fremtidige anvendelser i lægemiddelskærme kan der anvendes plader med højere gennemstrømning såsom en FLECS-plade med 384 brønde. I sådanne plader kan 4x mål på mange mikroskoper fange en hel enkelt brønd i deres synsfelt, hvilket sikrer, at alle cellulære kontraktile reaktioner fanges. Ved at bruge et billedbehandlingssystem med høj gennemstrømning kan en hel plade med 384 brønde afbildes på cirka 5 minutter, hvilket gør dette system dramatisk hurtigere end andre muligheder og derfor velegnet til fænotypisk lægemiddelopdagelse med høj gennemstrømning. Faktisk kører forfatterne rutinemæssigt ugentlige lægemiddelskærme på ~ 50 384-brøndplader (i alt mere end 19.000 brønde) ved hjælp af automatisering.
Disclosures
I.P. er opfinder på en udstedt patentfamilie, der beskytter FLECS-teknologiens metoder og systemer. I.P., Y.W., J.Z., E.C. og R.H. er alle ansatte hos Forcyte Biotechnologies, Inc. R.D. er professor ved UCLA og medstifter af Forcyte Biotechnologies, Inc. I.P., Y.W., J.Z. og R.D. har økonomiske interesser i Forcyte Biotechnologies, Inc., som er den eksklusive licenstager af ovennævnte patenter og kommercialiserer FLECS Technology.
Acknowledgments
Laboratoriearbejdet blev udført med støtte fra UCLA Molecular Shared Screening Resource (MSSR), hvor Forcyte sponsorerer forskningsaktiviteter, og Magnify Incubator ved California NanoSystems Institute (CNSI), hvor Forcyte Biotechnologies, Inc. er et hjemmehørende selskab. Forfatterne vil give adgang til Biodock.ai FLECS-analysemodulet til alle akademiske forskere efter anmodning. L.H. og I.P. bidrog ligeligt til dette arbejde.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bladder smooth muscle cell culture | Sciencell | #4310 | |
| Blebbistatin | Sigma-Aldrich | B0560 | |
| Cell culture media | Thermofisher | 11765054 | Ham's F12 medium supplemented with 10% FBS and 1% p/s |
| Cell strainer | Fisher Scientific | 7201432 | |
| Conical Tube | Fisher Scientific | 05-539-13 | |
| Culture flask | Fisher Scientific | FB012941 | |
| Cytochalasin D | Sigma-Aldrich | C8273 | |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Fisher Scientific | D1284 | |
| Eppendorf tubes | Fisher Scientific | 05-402-31 | |
| Fluorescent microscope | Molecular Devices | ImageXpress Confocal | |
| Forcyte-manufactured 24-well plate | Forcyte Biotechnologies | 24-HC4R-X1-QB12 | |
| Hoescht 3342 Live Nuclear Stain | Thermofisher | 62249 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | BP39920 |
References
- Ohama, T., Hori, M., Ozaki, H. Mechanism of abnormal intestinal motility in inflammatory bowel disease: How smooth muscle contraction is reduced. Journal of Smooth Muscle Research. 43 (2), 43-54 (2007).
- Peyronnet, B., et al. A comprehensive review of overactive bladder pathophysiology: On the way to tailored treatment. European Urology. 75 (6), 988-1000 (2019).
- Aldamanhori, R., Osman, N. I., Chapple, C. R. Underactive bladder: Pathophysiology and clinical significance. Asian Journal of Urology. 5 (1), 17-21 (2018).
- Sanderson, M. J., Delmotte, P., Bai, Y., Perez-Zogbhi, J. F. Regulation of airway smooth muscle cell contractility by Ca2+ signaling and sensitivity. Proceedings of the American Thoracic Society. 5 (1), 23-31 (2008).
- Brozovich, F. V., et al. Mechanisms of vascular smooth muscle contraction and the basis for pharmacologic treatment of smooth muscle disorders. Pharmacological Reviews. 68 (2), 476-532 (2016).
- Munevar, S., Wang, Y., Dembo, M. Traction force microscopy of migrating normal and H-ras transformed 3T3 fibroblasts. Biophysical Journal. 80 (4), 1744-1757 (2001).
- Tseng, Q., et al. A new micropatterning method of soft substrates reveals that different tumorigenic signals can promote or reduce cell contraction levels. Lab on a Chip. 11 (13), 2231-2240 (2011).
- Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences. 76 (3), 1274-1278 (1979).
- Tan, J. L., et al. Cells lying on a bed of microneedles: an approach to isolate mechanical force. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (4), 1484-1489 (2003).
- Rokhzan, R., et al. high-throughput measurements of cell contraction and endothelial barrier function. Laboratory Investigation. 99 (1), 138-145 (2019).
- Park, C. Y., et al. High-throughput screening for modulators of cellular contractile force. Integrative Biology. 7 (10), 1318-1324 (2015).
- Kaylan, K. B., Kourouklis, A. P., Underhill, G. H. A high-throughput cell microarray platform for correlative analysis of cell differentiation and traction forces. Journal of Visualized Experiments. (121), e55362 (2017).
- Huang, Y., et al. Traction force microscopy with optimized regularization and automated Bayesian parameter selection for comparing cells. Scientific Reports. 9, 539 (2019).
- Franck, C., Maskarinec, S. A., Tirrell, D. A., Ravichandran, G. Three-dimensional traction force microscopy: A new tool for quantifying cell-matrix interactions. PLOS ONE. 6, 17833 (2011).
- Pushkarsky, I., et al. Elastomeric sensor surfaces for high-throughput single-cell force cytometry. Nature Biomedical Engineering. 2 (2), 124-137 (2018).
- Pushkarsky, I. FLECS technology for high-throughput single-cell force biology and screening. ASSAY and Drug Development Technologies. 16 (1), 7-11 (2017).
- Koziol-White, C. J., et al. Inhibition of PI3K promotes dilation of human small airways in a rho kinase-dependent manner. British Journal of Pharmacology. 173 (18), 2726-2738 (2016).
- Orfanos, S., et al. Obesity increases airway smooth muscle responses to contractile agonists. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 315 (5), 673-681 (2018).
- Tseng, P., Pushkarsky, I., Carlo, D. D. Metallization and biopatterning on ultra-flexible substrates via dextran sacrificial layers. PLOS ONE. 9, 106091 (2014).
- Yoo, E. J., et al. Gα12 facilitates shortening in human airway smooth muscle by modulating phosphoinositide 3-kinase-mediated activation in a RhoA-dependent manner. British Journal of Pharmacology. 174 (4), 4383-4395 (2017).
- MacGlashan, D., Vilariño, N. Polymerization of actin does not regulate desensitization in human basophils. Journal of Leukocyte Biology. 85 (4), 627-637 (2009).
- Hocking, D. C., Sottile, J., Langenbach, K. J. Stimulation of integrin-mediated cell contractility by fibronectin polymerization. Journal of Biological Chemistry. 275 (14), 10673-10682 (2000).
- Tolić-Nørrelykke, I. M., Wang, N. Traction in smooth muscle cells varies with cell spreading. Journal of Biomechanics. 38 (7), 1405-1412 (2005).
- Ye, G. J. C., et al. The contractile strength of vascular smooth muscle myocytes is shape dependent. Integrative Biology. 6 (2), 152-163 (2014).
