Summary
Diese Arbeit präsentiert ein flexibles Protokoll für die Verwendung von FLECS-Technologie (fluoreszenzmarkierte elastomere kontrahierbare Oberflächen) im Mikrowellenformat zur vereinfachten, freihändigen Quantifizierung von einzelligen kontraktilen Kräften basierend auf visualisierten Verschiebungen fluoreszierender Proteinmikromuster.
Abstract
Die Erzeugung zellulärer kontraktiler Kräfte ist ein grundlegendes Merkmal, das praktisch alle Zellen teilen. Diese kontraktilen Kräfte sind entscheidend für die richtige Entwicklung, funktionieren sowohl auf Zell- als auch auf Gewebeebene und regulieren die mechanischen Systeme im Körper. Zahlreiche biologische Prozesse sind kraftabhängig, einschließlich Motilität, Adhäsion und Teilung von Einzelzellen sowie Kontraktion und Entspannung von Organen wie Herz, Blase, Lunge, Darm und Gebärmutter. Angesichts ihrer Bedeutung für die Aufrechterhaltung der ordnungsgemäßen physiologischen Funktion kann die zelluläre Kontraktilität auch Krankheitsprozesse antreiben, wenn sie übertrieben oder gestört wird. Asthma, Bluthochdruck, vorzeitige Wehen, fibrotische Narben und unteraktive Blase sind Beispiele für mechanisch bedingte Krankheitsprozesse, die möglicherweise durch die richtige Kontrolle der zellulären kontraktilen Kraft gelindert werden könnten. Hier präsentieren wir ein umfassendes Protokoll für die Verwendung einer neuartigen Mikrotiterplatten-basierten Kontraktilitätsassay-Technologie, die als fluoreszenzmarkierte elastomere kontrahierbare Oberflächen (FLECS) bekannt ist und eine vereinfachte und intuitive Analyse der Einzelzellkontraktilität in einer massiv skalierten Weise ermöglicht. Hierin stellen wir ein schrittweises Protokoll zur Verfügung, um zwei Sechs-Punkt-Dosis-Wirkungs-Kurven zu erhalten, die die Auswirkungen von zwei kontraktilen Inhibitoren auf die Kontraktion der primären glatten Blasenmuskelzellen in einem einfachen Verfahren mit nur einer einzigen FLECS-Assay-Mikrotiterplatte beschreiben, um den Benutzern der Methode die richtige Technik zu demonstrieren. Mit der FLECS-Technologie erhalten alle Forscher mit grundlegenden biologischen Labors und fluoreszierenden Mikroskopiesystemen Zugang zur Untersuchung dieses grundlegenden, aber schwer zu quantifizierenden funktionellen Zellphänotyps, wodurch die Eintrittsbarriere in das Gebiet der Kraftbiologie und des phänotypischen Screenings der kontraktilen Zellkraft effektiv gesenkt wird.
Introduction
Zellerzeugte mechanische Kräfte sind für die ordnungsgemäße Funktion in verschiedenen Organen im ganzen Körper wie Darm, Blase, Herz und anderen unerlässlich. Diese Organe müssen stabile Muster der Zellkontraktion und -entspannung erzeugen, um den inneren homöostatischen Zustand aufrechtzuerhalten. Eine abnormale Kontraktion der glatten Muskelzelle (SMC) kann zum Auftreten verschiedener Erkrankungen führen, darunter beispielsweise die intestinale Dysmotilität, die durch abnormale Muster der Kontraktion der glatten Darmmuskulatur1 gekennzeichnet ist, sowie die urologischen Zustände der überaktiven2 oder unteraktiven Blase3. Innerhalb der Atemwege können SMCs, die unregelmäßige Kontraktionsmuster aufweisen, eine asthmatische Hyperreaktionsfähigkeit auslösen4, die möglicherweise die Atemwege straffen und den Luftstrom von Sauerstoff in die Lunge verringern. Ein weiterer weit verbreiteter körperlicher Zustand, Bluthochdruck, wird durch Schwankungen in der Kontraktion der glatten Muskulatur in den Blutgefäßen verursacht5. Es ist klar, dass kontraktile Mechanismen in Zellen und Geweben zu Krankheiten führen können, die Behandlungsmöglichkeiten erfordern. Da diese Bedingungen eindeutig auf das dysfunktionale kontraktile Verhalten von Zellen zurückzuführen sind, wird es logisch und notwendig, die kontraktile Zellfunktion selbst zu messen, wenn potenzielle Arzneimittelkandidaten untersucht werden.
In Anerkennung des Bedarfs an Werkzeugen zur Untersuchung der zellulären Kontraktionskraft wurden von akademischen Forschern mehrere quantitative Kontraktionsassay-Methoden entwickelt, darunter Traktionskraftmikroskopie (TFM)6, mikrostrukturiertes TFM7, schwimmende Gel-Assays8 und elastomere Mikropost-Assays9. Diese Technologien wurden in zahlreichen Studien sowohl im Single-Dish-Format als auch im Multi-Well-Plate-Format eingesetzt und sogar für dreidimensionale Kraftmessungen vorgeschlagen10,11,12,13,14. Während diese Technologien bahnbrechende Forschung auf dem weitläufigen Gebiet der Zellkraftbiologie ermöglicht haben, waren sie alle weitgehend auf Labore beschränkt, die über spezifische Fähigkeiten und Ressourcen verfügen, insbesondere: die Fähigkeit, TFM-Substrate herzustellen, die Fähigkeit, komplexe und nicht intuitive Algorithmen zur Lösung von TFM-Verschiebungskarten richtig anzuwenden, und relativ präzise Mikroskopiesysteme, die Bilder registrieren können, die vor und nach der Probenentnahme aus dem Stadium (für die Zelldissoziation) aufgenommen wurden. Daher kann für einen ungeschulten Forscher die Eintrittsbarriere für die Verwendung dieser Methoden angesichts der umfangreichen Anforderungen an die Anwendung dieser Technologien recht hoch sein. Darüber hinaus kann die für viele bestehende Technologien erforderliche Bildauflösung (40-fache Objektive oder mehr) den experimentellen Durchsatz erheblich einschränken, während Massenmesstechnologien Beiträge von Ausreißerzellen maskieren und die Entdeckung milderer kontraktiler Unterschiede verhindern könnten. Bemerkenswert ist, dass nach Kenntnis der Autoren nur der Ansatz des Floating-Gel-Assays mit niedrigem Durchsatz und semi-quantitativer Floating-Gel-Assays ausreichend ausgereift ist, um den Forschern zur Verfügung zu stehen (siehe Abbildung 1).
Abbildung 1: Gesamtschema der FLECS-Technologiemethode . (A) Zellen haften an adhäsiven Proteinmikromustern, die kovalent in eine dünne, von Glas getragene Elastomerschicht eingebettet sind. (B) Draufsicht auf verschiedene mögliche Mikromusterformen und ein Aufblasen einer Zelle, die ein "X"-förmiges Mikromuster kontrahiert. (C) Überlagerung von fluoreszierenden Mikromustern und Phasenkontrastbildern einer kontrahierenden Zelle. (D) Zeitverlaufsbilder einer einzelnen kontrahierenden Zelle. Maßstabsstäbe = 25 μm. Diese Figur wurde mit Genehmigung von Pushkarsky et al15 adaptiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Nach den jüngsten Fortschritten in der Mikrotechnologie entwickelten die Autoren eine auf Mikrotiterplatten basierende Technologie, die quantitative Messungen der Einzelzellkontraktion in Hunderttausenden von Zellen ermöglicht, die als FLECS (fluoreszenzmarkierte elastomere kontrahierbare Oberflächen) bezeichnet werden15,16,17,18,19,20 , als Alternative zu TFM. Bei diesem Ansatz werden fluoreszierende Proteinmikromuster in weiche Filme eingebettet, die sich auf intuitive und messbare Weise verformen und schrumpfen, wenn Zellen Zugkräfte auf sie ausüben. Wichtig ist, dass die Proteinmikromuster die Zellposition, -form und -ausbreitungsfläche einschränken, was zu einheitlichen Testbedingungen führt. Diese erlauben einfache Messungen, die nur auf ihren dimensionalen Veränderungen basieren, die selbst in 4-fach vergrößerten Bildern räumlich hochaufgelöst sind. Die Methode umfasst ein browserbasiertes Bildanalysemodul und ermöglicht eine einfache Analyse der kontraktilen Zellkraft, ohne dass empfindliche Handhabungsverfahren oder die Registrierung von treuhänderischen Markern erforderlich sind, so dass sie von jedem Forscher mit einer grundlegenden Zellkulturanlage und einem einfachen Fluoreszenzmikroskop mit geringer Vergrößerung bedient werden kann (Abbildung 2 ). Diese Technologie, die regalfertig und kommerziell verfügbar ist, wurde für den Endbenutzer entwickelt und zielt darauf ab, die Eintrittsbarriere für jeden Laborwissenschaftler zu reduzieren, um die zelluläre Kraftbiologie zu studieren.
Abbildung 2: Schematische Darstellung des 24-Well-Plattenformats für den Einzelzell-Kontraktilitätsassay. Dieses Format wurde in den hier beschriebenen Experimenten verwendet und im Videoteil des Artikels dargestellt. Maßstabsbalken = 25 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll für die Anwendung des 24-Well-Plate-Formats der FLECS-Technologieplattform vor, um die Auswirkungen von kraftmodulierenden Medikamenten auf die zelluläre Kontraktilität in primären glatten Blasenmuskelzellen zu quantifizieren. Dieses Allzweckprotokoll kann bei Bedarf angepasst und modifiziert werden, um verschiedene andere Zeitskalen, Zelltypen und Behandlungsbedingungen von Interesse zu berücksichtigen, und skaliert werden, um andere Fragen der Kraftbiologie zu beantworten.
Protocol
1. Tag 1: Vorbereitung der 24 Well Plate
- Beginnen Sie den Eingriff, indem Sie 20 ml des Zellkulturmediums in einen 50 ml konischen Schlauch geben. In diesem Experiment wird das auf F12 Schinken basierende Medium verwendet, das mit 10% fetalem Rinderserum (FBS) ergänzt wird.
- Erhalten Sie eine 24-Well-Platte, die entwickelt wurde, um die Zellkontraktilität zu untersuchen. Stellen Sie die Pipette auf 500 μL und erhalten Sie ein Zellsieb für den Zellpassaging.
HINWEIS: Die Platte ist bei den Autoren auf Anfrage erhältlich. - Heben Sie die Platte an, halten Sie sie in einer Hand und ziehen Sie die Kunststofffolie vorsichtig von der Oberseite der Platte ab. Stellen Sie dann den Teller vorsichtig wieder ab.
- Schalten Sie einen Vakuumsauger ein und saugen Sie die oberste Schicht der phosphatgepufferten Kochsalzlösung (PBS) aus den Vertiefungen ab, um ein Verschütten zu verhindern. Entfernen Sie die PBS zeilenweise. Sobald die Bohrlöcher nicht mehr vollständig gefüllt sind, halten Sie die Platte in einer Hand und entfernen Sie vorsichtig den Rest des PBS aus den Brunnen. Schnell mit 500 μL Zellkulturmedium füllen. Achten Sie darauf, den Kontakt zwischen dem Aspirator und dem Boden des Brunnens zu vermeiden.
- Schütteln Sie die Platte vorsichtig und klopfen Sie auf die Seite, um sicherzustellen, dass der gesamte Boden des Brunnens mit Lösung bedeckt ist. Sobald alle Vertiefungen mit Medium gefüllt sind, stellen Sie die Platte zur Seite.
2. Tag 1: Zellaussaat
- Holen Sie sich den Kulturkolben mit Passage 7 oder niedrigeren primären Zellen der glatten Blasenmuskulatur (BSM) aus dem 37 ° C-Inkubator. Überprüfen Sie unter dem Mikroskop die Zellmorphologie und stellen Sie sicher, dass die Zellen zu mindestens 90% Konfluenz, aber weniger als 100% Konfluenz gewachsen sind.
- Führen Sie das Zelldissoziationsprotokoll durch. In einer sterilen Biosicherheitskabine werden die Zellen 2,5 Minuten lang trypsinisiert, bis sich die Zellen gelöst haben, bevor sie mit serumhaltigem Medium (10% FBS) abgeschreckt werden.
- Sobald die Zellen dissoziiert sind, verwenden Sie ein Hämozytometer, um die Zellen zu zählen und die Zellsuspension auf etwa 50.000 Zellen / ml in serumhaltigem Medium zu verdünnen. Wichtig ist, dass Zellen mindestens 2% Serum benötigen, um sich an die Mikromuster zu binden.
- Vor der Aussaat die Zellsuspension durch ein 40- oder 100-μm-Zellsieb schnell in ein konisches 50-ml-Röhrchen mit einer serologischen Pipette abseihen, um Zellklumpen in einzelne Zellen aufzuspalten.
- Fügen Sie vorsichtig 500 μL der 50.000 Zellen / ml-Zellsuspension in jede der 24 Vertiefungen auf der Platte mit einer P1000-Pipette hinzu, indem Sie die Lösung tropfenweise über verschiedene Positionen in den Vertiefungen dosieren.
- Lassen Sie die Platte nach der Zellaussaat 1 h bei Raumtemperatur sitzen, damit sich die Zellen direkt auf den Mikromustern absetzen können, ohne von Mikroströmen beeinflusst zu werden, die durch Verdampfung erzeugt werden. Nach 1 h die Platte über Nacht in einen 37 °C Inkubator stellen. Die Zellen werden sich während dieser Zeit selbst zusammensetzen und über die adhäsiven Mikromuster ausbreiten und beginnen, basale Kontraktionsniveaus auszuüben.
3. Tag 2: Zugabe von Testdroge
HINWEIS: Die Endkonzentration von Dimethylsulfoxid (DMSO) in den Vertiefungen, die anhaftende Zellen enthalten, darf 1% nicht überschreiten und Medikament / DMSO kann nicht direkt zu den Zellen hinzugefügt werden, sondern sollte zuerst verdünnt und in eine Zwischenlösung von Zellmedium gemischt werden.
- Erstellen Sie eine sechsstufige, achtfache Wirkstoffverdünnungsreihe, indem Sie 30 μL des Stammarzneimittels in aufeinanderfolgende 210 μL-Volumina DMSO übertragen und gründlich zwischen den einzelnen Übertragungsschritten mischen. In dieser Arbeit wird eine sechsstufige, achtfache Verdünnungsreihe von Blebbistatin in Dosen von 40 μM bis 1 nM in DMSO hergestellt.
- Für jede Stammarzneimittellösung (aus Schritt 3.1) mischen Sie 30 μL Arzneimittel in 470 μL Zellkulturmedium. Die Zwischenlösung ergibt eine 16,7-fache Verdünnung von DMSO.
- Übertragen Sie 200 μL jeder Zwischenlösung auf die entsprechende Vertiefung auf der 24-Well-Platte (die bereits 100 μL Medium in jeder Vertiefung enthält). Dies führt zu einer zusätzlichen sechsfachen Verdünnung von DMSO.
- Die Schritte 3.2 und 3.3 ergeben zusammen eine Endkonzentration von 1 % DMSO in den Bohrlöchern.
- Legen Sie die behandelte Platte für die entsprechende Dauer in einen 37 °C-Inkubator. Für dieses Experiment wird eine 30-minütige Inkubation verwendet.
- Unmittelbar vor der Bildgebung wird Hoechst 33342 in jedes Bohrloch (1:10.000 endgültige Verdünnung) gegeben. Lassen Sie es für weitere 15 Minuten inkubieren, um die Zellkerne zu markieren.
4. Tag 2: Abbildung der Well-Plate
- Greifen Sie auf ein Mikroskop zu, das ausgestattet ist, um die Kanäle sowohl für die Zellkerne (DAPI) als auch für die Mikromuster (TRITC) abzubilden.
- Stellen Sie zuerst die Zellen nur mit DMSO ab.
- Konzentrieren Sie sich dann sowohl auf die Mikromuster als auch auf die markierten Zellkerne, um einzelne Zellen zu identifizieren und sicherzustellen, dass beide Kanäle perfekt ausgerichtet sind, um eine automatisierte Bildanalyse zu ermöglichen.
- Wiederholen Sie dies an mehreren Positionen in jeder der 24 Vertiefungen auf der Platte. Bilder können mit einem 4-fachen Objektiv aufgenommen werden (oder optional höher, um die Bildgebung zu beschleunigen und maximale Datenpunkte pro Bild zu erfassen).
- Exportieren Sie die Bilder als TIF-Dateien und öffnen Sie sie auf einem mit dem Internet verbundenen Computer mit ImageJ, um die Daten zu analysieren.
5. Nach dem Experiment: Bildanalyse
HINWEIS: Die Bildanalyse wurde mit Biodock.ai Portal- und Bildgebungssoftware durchgeführt.
Representative Results
Bereiche der Bilder, die aus Bohrlöchern aufgenommen wurden, die nur mit DMSO behandelt wurden, und solche, die mit 40 μM Blebbistatin behandelt wurden, sind in Abbildung 3 nebeneinander dargestellt. Es kann deutlich beobachtet werden, dass nur DMSO-behandelte Zellen ein signifikantes Maß an Kontraktion aufweisen, basierend auf den sehr ausgeprägten Verformungen der Mikromuster, an die die glatten Blasenmuskelzellen (BSMCs) in diesem Brunnen haften. Umgekehrt wird im Bild des gut mit 40 μM Blebbistatin behandelten Blebbistatins eine signifikante Zellrelaxation beobachtet7 , da die von BSMCs angehafteten Mikromuster in ihrer Größe fast nicht von den Mikromustern zu unterscheiden sind, die von den Zellen nicht eingehalten werden, was auf eine minimale Kontraktion hinweist. Diese Bilder demonstrieren die intuitive und klare visuelle Darstellung der Einzelzellkontraktilität, die die fluoreszierende Mikrostrukturierungsmethode bietet. Im Gegensatz zu TFM-basierten Methoden, bei denen die omnidirektionale Bewegung zahlreicher fluoreszierender Partikel, die zufällig unter einer dichten Zellmonoschicht verteilt sind, eine relative kontraktile Kraft vermitteln soll, liefern hier die einheitlichen und markierten kontrahierten Geometrien der Mikromuster sofortige und leicht interpretierbare qualitative Informationen über die Kontraktion einzelner Zellen. Diese können direkt quantifiziert werden, indem Standard-Binärobjektoperationen auf die Bilder angewendet werden.
Abbildung 3: Parallele Vergleiche von Bildern, die von Bohrlöchern aufgenommen wurden, die entweder nur 1% DMSO-Behandlung (links) oder 40 μM Blebbistatin (rechts) enthielten. Es kann deutlich beobachtet werden, dass die Behandlung mit Blebbistatin die Kontraktilität der einzelnen Zellen signifikant reduziert, wie die größeren, nicht kontrahierten Mikromuster anzeigen. Blaue Kerne geben an, welche Mikromuster durch Zellen gebunden sind. Maßstabsleiste = 25 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Durch die Anwendung des browserbasierten Analysemoduls zur Analyse der aufgenommenen Bildpaare von Mikromustern und Zellkernen werden Einzelzellkontraktilitätsverteilungen für jede Population erhalten, wie in Abbildung 4 gezeigt. Die Analyse, die in einem früheren Bericht über die FLECS-Methodik15 ausführlich beschrieben wurde, lokalisiert die Positionen und Orientierungen jedes "X"-förmigen Mikromusters, zählt die Anzahl der Kerne, die direkt über dem Zentrum jedes Mikromusters haften, berechnet die mittlere Länge jedes Mikromusters und berechnet den Pixelabstand der Kontraktion jedes Mikromusters in Bezug auf die mittlere Länge leerer Mikromuster (Nullkontraktionsreferenz). Daher dienen die leeren Mikromuster einem wichtigen Zweck zur Normalisierung der Kontraktionsdaten. Wichtig ist, dass sich Zellen, die nicht an die Mikromuster binden, aufgrund von Mikroströmen, wo sie die Bildanalyse nicht beeinflussen, an den Bohrlochgrenzen ansammeln. Wie in diesen Diagrammen zu sehen ist, erstreckt sich die ungestörte Kontraktilität der Zellpopulation, die nur mit DMSO-Kontrollen behandelt wird, über einen großen Bereich von bis zu 20 Pixeln, wobei ein Zentrum bei etwa 10 Pixeln liegt. Inzwischen ziehen sich mit Blebbistatin behandelte Zellen deutlich weniger zusammen und ihre Verteilung wird auf ein Zentrum von etwas mehr als 6 Pixeln gedrückt. Wichtig ist, dass jedes einzelne Mikromuster im Bild, das genau an die Zelle bindet, in diesen Verteilungen dargestellt wird. Dies zeigt die Fähigkeit der Methode, differentielle zelluläre Reaktionen auf medikamentöse Behandlungen zu vermitteln.
Abbildung 4: Histogramme, die einzellige Kontraktilitätsdaten darstellen, die aus der Analyse von Bildern von Bohrlöchern stammen, die nur 1% DMSO (blau) oder 40μM Blebbistatin enthalten. Die Verteilung der DMSO-behandelten Zellen ist breit und zentriert sich auf einen viel größeren Kontraktionswert (~ 10 Pixel) als die mit Blebbistatin behandelte Verteilung, was die quantitativen Auswirkungen der Behandlung von Zellen mit Blebbistatin zeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Durch die Verwendung aller Bohrlöcher auf einer einzigen 24-Well-Platte und die Abbildung von mindestens 3 Stellen pro Bohrloch werden gleichzeitig Sechs-Punkt-Dosis-Wirkungs-Kurven für zwei Wirkstoffverbindungen erzeugt. Abbildung 5 zeigt die Konzentrations-Wirkungs-Daten für BSMCs, die mit dem gleichen Dosisbereich von Blebbistatin oder Cytochalasin D (beides bekannte Kontraktilitätsinhibitoren) behandelt wurden. Wie aus den Konzentrations-Wirkungs-Profilen hervorgeht, ist Cytochalasin D der stärkere Inhibitor der tonischen Kontraktion in diesen Zellen. Durch Anpassung einer sigmoidalen Kurve an die Datenpunkte können IC50-Werte für jedes Medikament berechnet werden. Unsere Experimente zeigen, dass die IC50 7,9 μM bzw. 100 nM für Blebbistatin bzw. Cytochalasin D sind, nach ~ 30 Minuten Exposition gegenüber den Medikamenten. Wichtig ist, dass diese Werte insgesamt mit früheren Berichten übereinstimmen und die quantitative Genauigkeit der Methode zur Bestimmung der Wirksamkeit von Kontraktionshemmern bestätigen7,21.
Abbildung 5: Konzentrations-Wirkungs-Kurven, die die Auswirkungen von Blebbistatin und Cytochalasin D auf die zelluläre Kontraktilität in Einzelzellen darstellen. Jeder Datenpunkt besteht aus drei Bildern für diese Bedingung. An jeden Datensatz wurde eine sigmoidale Kurve angepasst. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass Cytochalasin D stärker ist und einen niedrigeren IC50-Wert aufweist. Diese Daten können von einer einzigen 24-Well-FLECS-Platte gesammelt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Discussion
Diese vereinfachte Methode zur quantitativen Messung der Kontraktion in Hunderttausenden von Zellen gleichzeitig unter verschiedenen Behandlungsbedingungen und unter Verwendung von Standard-Mikroskopieinstrumenten bietet Forschern eine zugängliche Alternative zum traditionellen TFM, um die zelluläre Kraftbiologie zu untersuchen. Da die vorgestellte Technologie eine visuelle Darstellung der Zellkontraktion durch die Analyse von Veränderungen in regelmäßig geformten fluoreszierenden Mikromustern ermöglicht, wird das Ausmaß der von einer bestimmten Zelle erzeugten Kontraktion intuitiv verstanden - je kleiner das Mikromuster, desto größer die kontraktile Kraft, die von der Zelle ausgeübt wird.
Insbesondere durch die Kontrolle über Faktoren wie Form, Ausbreitungsfläche und Adhäsionsmolekül, die die Mikromuster umfassen (alles Faktoren, von denen bekannt ist, dass sie die Zellkontraktilität regulieren22,23,24), eliminiert die vorgestellte Technologie systematisch zusätzliche Variablen, die die Interpretation von Zellkontraktionsstudien durcheinander bringen können.
In diesem Experiment wurde eine Steifigkeit von 10 kPa im Gel und ein Mikromuster von 70 μm (diagonale Länge) verwendet, das aus Kollagen vom Typ IV bestand. Neben diesen Parametern kann das adhäsive Molekül durch verschiedene Kollagene, Fibronektin, Gelatine und andere extrazelluläre Matrix (ECM) ersetzt werden. Die Steifigkeit des Gels kann auf 0,1 kPa und bis in den MPa-Bereich eingestellt werden. Die Mikromustergeometrie kann de novo so ausgelegt werden, dass sie eine beliebige Form mit einer minimalen Merkmalsgröße von ~ 5 μm aufweist. Diese Parameter sind entkoppelt und können unabhängig für einen bestimmten biologischen Kontext optimiert werden.
Diese Technologie wurde umfassend validiert, um mit hochadhäsiven und kontraktilen Zelltypen eines mesenchymalen Phänotyps kompatibel zu sein, einschließlich verschiedener glatter Muskelzelltypen (primäre menschliche Blase, Darm, Tracheal, Bronchial, Gebärmutter, Aortik und Arterie), mesenchymale Stammzellen und ihre differenzierten Nachkommen, verschiedene Fibroblasten (pulmonal, dermal und kardial), Myofibroblasten und Endothelzellen. Darüber hinaus erzeugen Monozyten-abgeleitete Makrophagen auch eine große messbare phagozytische Kraft auf die Mikromuster, insbesondere wenn das Mikromuster aus einem bekannten Opsonin besteht. Mit der Methode können auch verschiedene Krebslinien untersucht werden.
Die Methode kann einige Herausforderungen für die Verwendung mit Zellen darstellen, die entweder relativ klein sind, wie T-Zellen und Neutrophile, oder Zelltypen mit einem überwiegend epithelialen Phänotyp. Der Hauptgrund dafür ist, dass die Methode auf eine starke Adhäsion und vollständige Ausbreitung der Zellen über das Mikromuster angewiesen ist, um das messbare kontraktile Signal zu erzeugen. Zellen, die schwach binden, aneinander binden oder sich nicht vollständig ausbreiten, erzeugen keine messbaren kontraktilen Signale. Diese Verhaltensweisen, die relativ selten sind, können gemildert werden, indem die Mikromustergröße kleiner eingestellt wird oder indem alternative Adhäsionsmoleküle innerhalb der Mikromuster verwendet werden, die die Adhäsion und Ausbreitung in diesen Zellen besser fördern.
Benutzer der Technologie müssen verschiedene mögliche Zellkulturmediumformulierungen für ihren jeweiligen Zelltyp sorgfältig bewerten, da verschiedene Komponenten, Wachstumsfaktoren, Serumspiegel und pH-Empfindlichkeiten zu unterschiedlichen Verhaltensweisen in verschiedenen Zellen führen können. Die Optimierung des Protokolls sollte der Skalierung aller experimentellen Workflows vorausgehen, und Medienkomponenten sollten immer frisch, steril und konsistent mit früheren Chargen sein.
Wenn die Einzelzellauflösung für die Ziele eines Benutzers nicht erforderlich ist oder wenn der Zielzelltyp eine minimale Streukapazität aufweist, kann herkömmliches TFM für solche Experimente gleichermaßen oder besser geeignet sein. Ziel und Hoffnung der Autoren ist es, dass dieses Tool Zellbiologen eine zusätzliche Möglichkeit bietet, die zelluläre Kontraktion zu untersuchen, insbesondere im Zusammenhang mit automatisierten phänotypischen Hochdurchsatz-Wirkstoff-Screens.
Speziell für zukünftige Anwendungen in Arzneimittel-Screens können Platten mit höherem Durchsatz wie eine 384-Well-FLECS-Platte verwendet werden. In solchen Platten können 4x-Objektive an vielen Mikroskopen einen ganzen einzigen Brunnen in ihrem Sichtfeld erfassen, wodurch sichergestellt wird, dass alle zellulären kontraktilen Reaktionen erfasst werden. Durch die Verwendung eines Hochdurchsatz-Bildgebungssystems kann eine gesamte 384-Well-Platte in etwa 5 Minuten abgebildet werden, wodurch dieses System dramatisch schneller als andere Optionen ist und daher für die phänotypische Wirkstoffforschung mit hohem Durchsatz geeignet ist. Tatsächlich führen die Autoren routinemäßig wöchentliche Drogenscreenings auf ~ 50 384-Wellplates (insgesamt mehr als 19.000 Wells) mit Automatisierung durch.
Disclosures
I.P. ist Erfinder einer erteilten Patentfamilie, die die Methoden und Systeme der FLECS-Technologie schützt. I.P., Y.W., J.Z., E.C. und R.H. sind alle Mitarbeiter von Forcyte Biotechnologies, Inc. R.D. ist Professor an der UCLA und Mitbegründer von Forcyte Biotechnologies, Inc. I.P., Y.W., J.Z. und R.D. halten finanzielle Anteile an Forcyte Biotechnologies, Inc., der der exklusive Lizenznehmer der oben genannten Patente ist und FLECS Technology kommerzialisiert.
Acknowledgments
Die Laborarbeit wurde mit Unterstützung der UCLA Molecular Shared Screening Resource (MSSR), wo Forcyte Forschungsaktivitäten sponsert, und des Magnify Incubator am California NanoSystems Institute (CNSI), wo Forcyte Biotechnologies, Inc. ein ansässiges Unternehmen ist, durchgeführt. Die Autoren gewähren allen wissenschaftlichen Forschern auf Anfrage Zugang zum Biodock.ai FLECS-Analysemodul. L.H. und I.P. trugen gleichermaßen zu dieser Arbeit bei.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bladder smooth muscle cell culture | Sciencell | #4310 | |
| Blebbistatin | Sigma-Aldrich | B0560 | |
| Cell culture media | Thermofisher | 11765054 | Ham's F12 medium supplemented with 10% FBS and 1% p/s |
| Cell strainer | Fisher Scientific | 7201432 | |
| Conical Tube | Fisher Scientific | 05-539-13 | |
| Culture flask | Fisher Scientific | FB012941 | |
| Cytochalasin D | Sigma-Aldrich | C8273 | |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Fisher Scientific | D1284 | |
| Eppendorf tubes | Fisher Scientific | 05-402-31 | |
| Fluorescent microscope | Molecular Devices | ImageXpress Confocal | |
| Forcyte-manufactured 24-well plate | Forcyte Biotechnologies | 24-HC4R-X1-QB12 | |
| Hoescht 3342 Live Nuclear Stain | Thermofisher | 62249 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | BP39920 |
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