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Neuroscience

एक्टिन गतिशीलता, क्लच युग्मन और विकास शंकु अग्रिम के लिए कर्षण बल का विश्लेषण

Published: October 21, 2021 doi: 10.3791/63227
Automatic Translation
1, 2, 1, 2, 1
1Laboratory of Systems Neurobiology and Medicine, Division of Biological Science, Nara Institute of Science and Technology, 2Laboratory of Data-Driven Biology, Division of Biological Science, Nara Institute of Science and Technology

Summary

आगे बढ़ने के लिए, विकास शंकु को बाहरी वातावरण के खिलाफ कर्षण बलों को लागू करना चाहिए। कर्षण बलों की पीढ़ी एक्टिन गतिशीलता और क्लच युग्मन पर निर्भर करती है। वर्तमान अध्ययन विकास शंकु अग्रिम के लिए एक्टिन गतिशीलता, क्लच युग्मन और कर्षण बलों का विश्लेषण करने के तरीकों का वर्णन करता है।

Abstract

कार्यात्मक नेटवर्क स्थापित करने के लिए, न्यूरॉन्स को अपने उपयुक्त गंतव्यों पर माइग्रेट करना चाहिए और फिर अक्षतंतुओं को अपने लक्ष्य कोशिकाओं की ओर बढ़ाना चाहिए। ये प्रक्रियाएं विकास शंकुओं की प्रगति पर निर्भर करती हैं जो न्यूराइट्स की युक्तियों पर स्थित हैं। अक्षीय विकास शंकु अपने स्थानीय माइक्रोएन्वायरमेंट को संवेदन करके ड्राइविंग बलों को उत्पन्न करते हैं और साइटोस्केलेटल गतिशीलता और एक्टिन-आसंजन युग्मन (क्लच युग्मन) को मॉड्युलेट करते हैं। दशकों के शोध ने न्यूरोनल माइग्रेशन और चेताक्षीय मार्गदर्शन को विनियमित करने के लिए मार्गदर्शन अणुओं, उनके रिसेप्टर्स और डाउनस्ट्रीम सिग्नलिंग कैस्केड की पहचान की है; हालांकि, विकास शंकु अग्रिम और नेविगेशन ड्राइव करने के लिए बलों को उत्पन्न करने के लिए आवश्यक आणविक मशीनरी अभी स्पष्ट होने लगी हैं। न्यूरोनल विकास शंकु के अग्रणी किनारे पर, एक्टिन फिलामेंट्स प्रतिगामी प्रवाह से गुजरते हैं, जो एक्टिन पोलीमराइजेशन और एक्टोमायोसिन संकुचन द्वारा संचालित होता है। एफ-एक्टिन प्रतिगामी प्रवाह और चिपकने वाला सब्सट्रेट के बीच एक क्लच युग्मन विकास शंकु अग्रिम के लिए कर्षण बलों को उत्पन्न करता है। वर्तमान अध्ययन एकल धब्बेदार इमेजिंग द्वारा एफ-एक्टिन प्रतिगामी प्रवाह की निगरानी के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करता है। महत्वपूर्ण रूप से, जब एक एफ-एक्टिन मार्कर लाइफएक्ट के साथ संयुक्त किया जाता है, तो यह तकनीक 1) एफ-एक्टिन पोलीमराइजेशन दर और 2) एफ-एक्टिन प्रतिगामी प्रवाह और चिपकने वाले सब्सट्रेट के बीच क्लच युग्मन दक्षता को निर्धारित कर सकती है। दोनों विकास शंकु अग्रिम और नेविगेशन के लिए बलों को उत्पन्न करने के लिए महत्वपूर्ण चर हैं। इसके अलावा, वर्तमान अध्ययन कर्षण बल माइक्रोस्कोपी के एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करता है, जो 3) विकास शंकु द्वारा उत्पन्न कर्षण बल को निर्धारित कर सकता है। इस प्रकार, एकल धब्बेदार इमेजिंग और कर्षण बल माइक्रोस्कोपी के विश्लेषण को युग्मन करके, जांचकर्ता विकास शंकु अग्रिम और नेविगेशन के अंतर्निहित आणविक यांत्रिकी की निगरानी कर सकते हैं।

Introduction

विकासशील कशेरुकी मस्तिष्क में, न्यूरॉन्स कार्यात्मक न्यूरोनल नेटवर्क 1,2,3 स्थापित करने के लिए उचित सिनैप्टिक भागीदारों की ओर विस्तृत रूप से संगठित प्रवास और परियोजना अक्षतंतुओं से गुजरते हैं। विकास शंकु, जो संवेदी और गतिशील संरचनाएं हैं जो न्यूराइट्स की नोक पर स्थित हैं, न्यूरोनल माइग्रेशन और अक्षतंतु आउटग्रोथ 3,4,5 की गति और दिशा निर्धारित करते हैं। चूंकि न्यूरॉन्स कसकर पैक किए गए वातावरण से घिरे होते हैं, इसलिए विकास शंकु को आगे बढ़ने के लिए अपने पर्यावरण के खिलाफ बलों को लागू करना चाहिए6,7। न्यूरोनल माइग्रेशन और अक्षीय मार्गदर्शन के अंतर्निहित तंत्र को समझने के लिए, विकास शंकु अग्रिम के लिए आणविक यांत्रिकी का विश्लेषण आवश्यक है।

दशकों के विश्लेषण से पता चला है कि विकास शंकु अग्रिम को चलाने के लिए कर्षण बल 'क्लच' तंत्र द्वारा उत्पन्न होता है; इस तंत्र को न केवल क्षैतिज विकास शंकु में बल्कि न्यूरॉन्स 8,9,10,11,12 को स्थानांतरित करने की अग्रणी प्रक्रिया विकास शंकु में भी कार्य करने के लिए सोचा जाता है। अर्थात्, विकास शंकु में एक्टिन फिलामेंट्स (एफ-एक्टिन्स) अग्रणी किनारे पर पॉलिमराइज़ करते हैं और समीपस्थ रूप से डीपोलीमराइज़ करते हैं, अग्रणी-किनारे झिल्ली को बाहर निकालते हैं13,14,15। परिणामी बल, एक्टोमायोसिन संकुचन के साथ संयोजन के रूप में, प्रतिगामी प्रवाह 7,11,16,17,18,19,20,21 नामक एफ-एक्टिन के पीछे की ओर आंदोलन को प्रेरित करता है। क्लच- और सेल आसंजन अणु एफ-एक्टिन प्रतिगामी प्रवाह और चिपकने वाले सब्सट्रेट के बीच यांत्रिक युग्मन की मध्यस्थता करते हैं और सब्सट्रेट पर एफ-एक्टिन प्रवाह के बल को प्रसारित करते हैं, जिससे विकास शंकु अग्रिम 7,8,9,11,12,22 के लिए कर्षण बल उत्पन्न होता है। . समवर्ती रूप से, एक्टिन-सब्सट्रेट युग्मन एफ-एक्टिन प्रवाह वेग को कम कर देता है और अग्रणी-किनारे झिल्ली 9,10 को बाहर निकालने के लिए बल में एक्टिन पोलीमराइजेशन को परिवर्तित करता है।

अक्षीय विकास शंकु स्थानीय रासायनिक संकेतों को समझते हैं और उन्हें विकास शंकु नेविगेशन 3,23,24,25 के लिए एक दिशात्मक ड्राइविंग बल में ट्रांसड्यूस करते हैं। उदाहरण के लिए, एक अक्षतंतु मार्गदर्शन अणु नेट्रिन -1 कोलोरेक्टल कैंसर (डीसीसी) में हटाए गए अपने रिसेप्टर को उत्तेजित करता है, और Rho guanosine ट्राइफॉस्फेट (GTP) - बाध्यकारी प्रोटीन सेल डिवीजन नियंत्रण प्रोटीन 42 (Cdc42) और रास से संबंधित C3 बोटुलिनम विष सब्सट्रेट 1 (Rac1), और उनके डाउनस्ट्रीम किनेज p21-सक्रिय किनेज 1 (Pak1)26 को सक्रिय करता है। Cdc42 और Rac1 को बढ़ावा देते हैं 1) एक्टिन पोलीमराइजेशन, और Pak1 फॉस्फोराइलेट्स एक क्लच अणु shootin122,26. शूटिन 1 एक एक्टिन-बाइंडिंग प्रोटीन कोर्टेक्टिन 27 के माध्यम से एफ-एक्टिन प्रतिगामी प्रवाह के साथ बातचीत करता है। शूटिन 1 भी एल 1 सेल आसंजन अणु (एल 1-सीएएम) 20,24 के साथ बातचीत करता है। शूटिन 1 फॉस्फोराइलेशन cortactin और L1-CAM के लिए बाध्यकारी संबंधों को बढ़ाता है, और shootin1-मध्यस्थता 2) क्लच युग्मन 24,27 को बढ़ाता है। विकास शंकु के भीतर, एक्टिन पोलीमराइजेशन और क्लच युग्मन के विषम सक्रियण 3) नेट्रिन -1 स्रोत के पक्ष में कर्षण बल में वृद्धि करते हैं, जिससे विकास शंकु मोड़ के लिए दिशात्मक ड्राइविंग बल उत्पन्न होता है (चित्रा 1)24। न्यूरोनल माइग्रेशन और अक्षतंतु मार्गदर्शन के संबंध में पिछले कुछ दशकों में गहन शोध ने मार्गदर्शन अणुओं, उनके रिसेप्टर्स और संबंधित डाउनस्ट्रीम सिग्नलिंग कैस्केड 2,10,28,29,30 की समझ को बढ़ाया है। हालांकि, विकास शंकु अग्रिम के लिए बलों को उत्पन्न करने के लिए आणविक मशीनरी अभी स्पष्ट होने लगी हैं; यह mechanobiological विश्लेषण के लिए प्रोटोकॉल के सीमित उपयोग के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है.

वर्तमान अध्ययन एकल धब्बेदार इमेजिंग 16,18 द्वारा एफ-एक्टिन प्रतिगामी प्रवाह की निगरानी के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करता है। सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी, कताई-डिस्क कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी और कुल हस्तक्षेप प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति (TIRF) माइक्रोस्कोपी 25,31,32,33,34,35,36,37,38 का उपयोग करके एफ-एक्टिन प्रतिगामी प्रवाह की निगरानी बड़े पैमाने पर की गई है . वर्तमान अध्ययन में प्रोटोकॉल, हालांकि, एक मानक एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग करता है और इस प्रकार आसानी से अपनाने योग्य है11,16,18,20,22,23,24,27,39,40,41,42। जब Lifeact43 द्वारा F-actin लेबलिंग के साथ संयुक्त, एकल धब्बेदार इमेजिंग एक्टिन पोलीमराइजेशन दर और F-actin प्रतिगामी प्रवाह और चिपकने वाला सब्सट्रेट 39,42 के बीच क्लच युग्मन दक्षता के परिमाणीकरण के लिए अनुमति देता है। वर्तमान अध्ययन आगे एक फ्लोरोसेंट मनका-एम्बेडेड पॉलीएक्रिलामाइड (पीएए) जेल 11,22,23,24,27,39,41,42,44 का उपयोग करके कर्षण बल माइक्रोस्कोपी के एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करता है। यह विधि बल-प्रेरित मनका आंदोलनों 44,45 की निगरानी करके विकास शंकु के तहत कर्षण बल का पता लगाती है और मात्रा निर्धारित करती है। एक ओपन-सोर्स कर्षण बल विश्लेषण कोड प्रदान किया जाता है, और विकास शंकु माइग्रेशन के दौरान कर्षण बल को परिमाणित करने की विधि को विस्तार से समझाया गया है। एकल धब्बेदार इमेजिंग और कर्षण बल माइक्रोस्कोपी की सहायता से, विकास शंकु प्रवास और नेविगेशन के अंतर्निहित आणविक यांत्रिकी को समझने की सुविधा होगी। ये तकनीकें डेंड्राइटिक स्पाइन इज़ाफ़ा के अंतर्निहित आणविक यांत्रिकी का विश्लेषण करने के लिए भी लागू होती हैं, जिसे सीखने और मेमोरी 42 में महत्वपूर्ण माना जाता है।

Protocol

प्रयोगशाला जानवरों का उपयोग करने वाले सभी प्रयोगों को नारा इंस्टीट्यूट ऑफ साइंस एंड टेक्नोलॉजी की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति के साथ किया गया था। जांचकर्ताओं को प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए अपनी संस्थागत और राष्ट्रीय पशु नियामक समितियों द्वारा स्थापित दिशानिर्देशों का पालन करना चाहिए।

1. समाधान और मीडिया की तैयारी

  1. पूरक फ़ाइल 1 में संक्षेप के रूप में समाधान और संस्कृति मीडिया तैयार करें

2. पॉली-डी-लाइसिन (पीडीएल) / लैमिनिन-लेपित सब्सट्रेट की तैयारी

  1. कोट 14 मिमी व्यास के ग्लास-बॉटम व्यंजन 100 μg / mL पीडीएल के साथ, फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा (पीबीएस, पीएच 7.4) में भंग हो गया, और 37 डिग्री सेल्सियस पर एक ह्यूमिडिफाइड इनक्यूबेटर में रात भर के लिए इनक्यूबेट करें।
    नोट: इस चरण के बाद कांच की सतहों को सूखने मत करो
  2. PDL समाधान निकालें और पिपेट 1 mL PBS के ग्लास पर 10 s तीन बार के लिए निकालें।
  3. 5 μg / mL लैमिनिन के साथ व्यंजनों को कोट करें, पीबीएस में भंग हो गए, और 37 डिग्री सेल्सियस पर एक ह्यूमिडिफाइड इनक्यूबेटर में रात भर के लिए इनक्यूबेट करें।
  4. लैमिनिन समाधान निकालें और पिपेट 10 s तीन बार के लिए ग्लास पर PBS के 1 mL निकालें।
  5. पीबीएस निकालें और कांच की सतहों पर neurobasal माध्यम के 0.5 मिलीलीटर जगह. व्यंजनों को 37 डिग्री सेल्सियस पर एक ह्यूमिडिफाइड इनक्यूबेटर में स्टोर करें।
    नोट: पीडीएल / लैमिनिन-लेपित व्यंजनों को 37 डिग्री सेल्सियस पर एक ह्यूमिडिफाइड इनक्यूबेटर में 2-3 दिनों के लिए संग्रहीत किया जा सकता है।

3. विच्छेदन और हिप्पोकैम्पस के पृथक्करण

  1. गर्भाशय ग्रीवा विस्थापन द्वारा एक गर्भवती माउस euthanize.
    नोट: वर्तमान अध्ययन व्यावसायिक रूप से उपलब्ध चूहों का उपयोग करता है ( सामग्री की तालिका देखें)। जांचकर्ताओं को चूहों का उपयोग करना चाहिए जो एक निष्फल वातावरण में पैदा होते हैं और मानवीय रूप से इलाज करते हैं।
  2. भ्रूण दिवस -16 (E16) माउस भ्रूण को विच्छेदित करें, और उन्हें बर्फ पर रखें।
  3. एक लैमिनर प्रवाह हुड में, कैंची के साथ दिमाग को विच्छेदित करें और उन्हें एक बाँझ 10 सेमी डिश पर रखें जिसमें 10 मिलीलीटर बर्फ-ठंडा विच्छेदन समाधान होता है।
  4. एक विच्छेदन स्टीरियो माइक्रोस्कोप के साथ, ध्यान से सेरेब्रल गोलार्धों के मेनिन्जेस को छील लें और फिर संदंश का उपयोग करके हिप्पोकैम्पी को विच्छेदित करें।
  5. हिप्पोकैम्पी को 15 एमएल ट्यूब में बर्फ-ठंडे पाचन समाधान के 5 मिलीलीटर में स्थानांतरित करें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए पानी के स्नान में हिप्पोकैम्पी को इनक्यूबेट करें।
  6. पाचन समाधान निकालें और विच्छेदन समाधान के 3 मिलीलीटर जोड़ें।
  7. धीरे से एक पाश्चर पिपेट के साथ हिप्पोकैम्पी चार बार पिपेट करें।
  8. 37 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए पानी के स्नान में हिप्पोकैम्पी को इनक्यूबेट करें।
  9. सेल निलंबन को 50 मिलीलीटर सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। अविच्छिन्न ऊतक के लिए नए विच्छेदन समाधान के 3 मिलीलीटर जोड़ें।
  10. चरण 3.7-3.9 दोहराएं जब तक कि हिप्पोकैम्पी पूरी तरह से अलग न हो जाए।
  11. एक पाश्चर पिपेट के साथ घूमते और एस्पिरेटिंग द्वारा सेल निलंबन से डीएनए के फ्लोटिंग समुच्चय को हटा दें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 180 x g पर सेल निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करें।
    नोट: क्षतिग्रस्त कोशिकाओं से व्युत्पन्न डीएनए सेंट्रीफ्यूजेशन प्रक्रिया को परेशान करेगा। यदि न्यूरॉन्स supernatant में रहते हैं, तो डीएनए को सावधानीपूर्वक हटाने के बाद सेल निलंबन को फिर से सेंट्रीफ्यूज करें।
  12. 5% CO2 के साथ 37 °C पर एक humidified इनक्यूबेटर में 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), पेनिसिलिन (100 U / mL), और streptomycin (100 μg / mL) युक्त संतुलित न्यूरोबेसल माध्यम।

4. अभिकर्मक और culturing न्यूरॉन्स

  1. supernatant निकालें और 50 mL ट्यूब में बर्फ ठंडा PBS के 5 mL जोड़ें। कोमल पिपेटिंग द्वारा सेल गोली को फिर से निलंबित कर दिया।
  2. एक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में सेल निलंबन के 10 μL को स्थानांतरित करें, 0.5% ट्रिपैन नीले समाधान के 10 μL जोड़ें, और फिर हेमोसाइटोमीटर के साथ कोशिकाओं की संख्या की गणना करें।
  3. 50 मिलीलीटर ट्यूब में सेल निलंबन को 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 180 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें।
  4. इस बीच, अभिकर्मक के लिए एलीकोट, pFN21A-HaloTag-actin के 1 μg और pmNeonGreen-N1-Lifeact प्रति 1 x 106 कोशिकाओं के 3 μg, एक माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में।
  5. centrifugation के बाद, supernatant निकालें और 50 mL ट्यूब में electroporation माध्यम (अभिकर्मक किट द्वारा प्रदान की गई) के 100 μL जोड़ें। पिपेटिंग द्वारा सेल गोली को फिर से निलंबित कर दिया।
  6. एलीकोटेड डीएनए समाधान के साथ सेल निलंबन को मिलाएं और मिश्रण को एक क्यूवेट (अभिकर्मक किट द्वारा प्रदान किया गया) में स्थानांतरित करें।
    नोट: चूंकि हवा के बुलबुले इलेक्ट्रोपोरेशन को परेशान करते हैं, इसलिए उन्हें सेल निलंबन से हटा दें।
  7. इलेक्ट्रोपोरेशन उपकरण (सामग्री की तालिका) में क्यूवेट डालें, और प्रोग्राम O-005 का उपयोग करके इलेक्ट्रोपोरेशन करें।
  8. तुरंत पहले से गर्म और संतुलित न्यूरोबेसल माध्यम के 1 एमएल जोड़ें जिसमें 10% एफबीएस, पेनिसिलिन (100 यू / एमएल), और स्ट्रेप्टोमाइसिन (100 μg / mL) शामिल हैं।
  9. एक प्लास्टिक पिपेट (अभिकर्मक किट द्वारा प्रदान की गई) का उपयोग करके सेल निलंबन को 15 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  10. एक माइक्रोट्यूब में सेल निलंबन के 10 μL को स्थानांतरित करें, 0.5% ट्राइपैन नीले समाधान के 10 μL जोड़ें, और फिर हेमोसाइटोमीटर के साथ कोशिकाओं की संख्या की गणना करें।
  11. इनक्यूबेटर से पीडीएल / लैमिनिन-लेपित ग्लास-बॉटम व्यंजन निकालें और न्यूरोबेसल माध्यम को हटा दें।
  12. सेल निलंबन के पिपेट 0.5 मिलीलीटर जिसमें प्रति डिश 2.0 x 105 कोशिकाएं होती हैं और 37 डिग्री सेल्सियस पर एक ह्यूमिडिफाइड इनक्यूबेटर में 5% सीओ 2 के साथ 3 घंटे के लिए इनक्यूबेट होती हैं।
  13. 2% बी -27 पूरक, ग्लूटामाइन (1 एमएम), पेनिसिलिन (100 यू / एमएल), और स्ट्रेप्टोमाइसिन (100 μg / mL) वाले न्यूरोबेसल माध्यम के 0.5 मिलीलीटर के साथ माध्यम को बदलें। 5% CO2 के साथ 37 °C पर 3 दिनों के लिए एक humidified इनक्यूबेटर में न्यूरॉन्स संस्कृति।

5. न्यूरोनल विकास शंकु पर एकल धब्बेदार इमेजिंग

  1. दिन इन विट्रो (DIV) 3 पर, टेट्रामिथाइल-रोडामाइन (टीएमआर) लिगैंड के साथ न्यूरॉन्स का इलाज संस्कृति माध्यम में 1: 2000 कमजोर पड़ने के कमजोर पड़ने पर। 5% CO2 के साथ 37 °C पर 1 h के लिए न्यूरॉन्स को बनाए रखें।
  2. टीएमआर लिगैंड को पहले से गर्म पीबीएस के साथ तीन बार धोएं।
  3. पीबीएस और पिपेट 0.5 मिलीलीटर गर्म लीबोविट्ज़ के एल -15 माध्यम को हटा दें जिसमें 2% बी -27 पूरक, ग्लूटामाइन (1 एमएम), पेनिसिलिन (100 यू / एमएल), और स्ट्रेप्टोमाइसिन (100 μg / mL) शामिल हैं।
  4. 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए न्यूरॉन्स बनाए रखें।
  5. एक एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप को चालू करें और स्टेज-टॉप इनक्यूबेटर को 37 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें।
    नोट: वर्तमान प्रोटोकॉल एक पूरक धातु-ऑक्साइड अर्धचालक कैमरा, एक 100x / 1.40 एनए तेल विसर्जन उद्देश्य लेंस, एक पारा लैंप और एक छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर ( सामग्री की तालिका देखें) से सुसज्जित एक एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग करता है। इस विश्लेषण के लिए समतुल्य विनिर्देशों के साथ अन्य एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का भी उपयोग किया जा सकता है।
  6. गर्म चरण-शीर्ष इनक्यूबेटर पर ग्लास-बॉटम डिश में टीएमआर लिगैंड-उपचारित न्यूरॉन्स को रखें।
  7. छवि अधिग्रहण पैरामीटर निम्नानुसार सेट करें: एक्सपोजर समय, Lifeact और HaloTag-actin फ्लोरोसेंट चैनलों के लिए 500 एमएस; binning, 1 x 1 (0.065 μm × 0.065 μm प्रति पिक्सेल); समय अंतराल, 3 s; अवधि, 50 फ्रेम.
  8. एक विकास शंकु का चयन करें जो दृढ़ता से लाइफैक्ट व्यक्त करता है और कमजोर रूप से हेलोटैग-एक्टिन को व्यक्त करता है।
    नोट: Lifeact अभिव्यक्ति विकास शंकु आकृति विज्ञान की कल्पना करने के लिए पर्याप्त मजबूत होना चाहिए। HaloTag-actin अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए कमजोर अपर्याप्त होना चाहिए (चित्रा 2A)। फ्लोरोसेंट प्रोटीन अभिव्यक्तियों के स्तर को अभिकर्मक के लिए डीएनए की मात्रा को बदलकर समायोजित किया जा सकता है।
  9. एक न्यूनतम क्षेत्र को रोशन करने के लिए डायाफ्राम के क्षेत्र को बंद करें जिसमें विकास शंकु शामिल है (चित्रा 2 बी)।
    नोट: एक न्यूनतम क्षेत्र की रोशनी पृष्ठभूमि संकेत को कम करती है और शोर (एस / एन) अनुपात में प्रतिदीप्ति संकेत को बढ़ाती है, जिससे एक्टिन धब्बेदार (चित्रा 2 बी) का पता लगाया जा सकता है। एस / एन अनुपात को और बढ़ाने के लिए, तटस्थ घनत्व फिल्टर द्वारा प्रकाश को कम किए बिना विकास शंकु को रोशन करने की सिफारिश की जाती है।
  10. समय-चूक छवियों को प्राप्त करें (पूरक फ़ाइल 2)। एक multichannel समय-चूक स्टैक छवि (tiff स्वरूप) के रूप में सहेजें।

6. एक छवि प्रसंस्करण और विश्लेषण सॉफ्टवेयर फिजी का उपयोग कर एफ-एक्टिन प्रवाह वेग और पोलीमराइजेशन दर के परिमाणीकरण

नोट:: F-actin प्रवाह वेग और actin polymerization दर परिमाणित करने के लिए अभ्यास डेटा के लिए पूरक फ़ाइल 3 को देखें।

  1. फिजी पर मल्टीचैनल टाइम-लैप्स स्टैक छवि खोलें।
  2. स्केल सेट > विश्लेषण का चयन करें, और छवियों का पिक्सेल आकार सेट करें.
  3. एक एक्टिन धब्बेदार का पता लगाएं जो फिलोपोडिया या लैमेलिपोडिया में एफ-एक्टिन बंडल के भीतर कम से कम पांच समय-फ्रेम के लिए प्रतिगामी रूप से बहता है।
  4. छवि > ट्रांस्फ़ॉर्म > घुमाएँ का चयन करें, और छवियों के कोण को समायोजित करें ताकि F-actin बंडल ऊपर की ओर इंगित हो (चित्रा 3A)।
  5. उपकरण पट्टी पर आयत पर क्लिक करें, और एक बॉक्स है कि एक्टिन धब्बेदार और एफ-एक्टिन बंडल (चित्रा 3B, 1 और 2) की नोक शामिल है आकर्षित करें।
    नोट: HaloTag-actin धब्बेदार के संकेत कमजोर हैं। इसके अलावा, विकास शंकु के डिस्टल टिप्स पर लाइफैक्ट सिग्नल कमजोर और बेहोश होते हैं (चित्रा 2 बी) क्योंकि विकास शंकु की डिस्टल युक्तियां समीपस्थ भाग की तुलना में पतली होती हैं। जांचकर्ताओं को एफ-एक्टिन प्रवाह वेग और पोलीमराइजेशन दर (चित्रा 3 बी) के परिमाणीकरण को अनुकूलित करने के लिए संकेतों को बढ़ाना चाहिए। यद्यपि समीपस्थ विकास शंकु पर लाइफैक्ट सिग्नल संतृप्त हो जाता है, यह एफ-एक्टिन्स (चित्रा 3 ई, पीली रेखा) के डिस्टल छोर के निर्धारण को परेशान नहीं करेगा।
  6. छवि > डुप्लिकेट का चयन करें और पांच समय-फ्रेम (चित्रा 3B, 3-5) इनपुट करें।
  7. असेंबल बनाने > स्टैक्स > छवि का चयन करें, और पैरामीटर इनपुट करें: कॉलम, 5; पंक्तियाँ, 1; स्केल फैक्टर, 1.
  8. OK पर क्लिक करें। छवि असेंबल स्क्रीन पर दिखाई देगा।
  9. छवि > रंग > स्प्लिट चैनलका चयन करें. यह दो फ्लोरोसेंट चैनलों को अलग करता है।
  10. F-actin प्रवाह वेग का परिमाणीकरण।
    1. विश्लेषण का चयन करें > माप सेट करें, और क्षेत्र और बाउंडिंग आयत चुनें।
    2. टूलबार पर ओवल पर क्लिक करें, और एक एक्टिन धब्बेदार (चित्रा 3 सी, 1 और 2) पर एक सर्कल खींचें।
    3. चयन जोड़ें > छवि > ओवरले का चयन करें. सर्कल छवि असेंबल (चित्रा 3 सी, 3, और 4) पर ओवरलेड है।
      नोट:: ओवरले का रंग संपादित करें > विकल्प > रंग पर परिवर्तित किया जा सकता है।
    4. शेष धब्बेदारों के लिए हलकों के ओवरलेइंग को दोहराएं (चित्र3C, 5)।
      नोट: एक्टिन धब्बेदार के केंद्रों को सही ढंग से निर्धारित करने के लिए, जांचकर्ताओं को धब्बेदारों पर हलकों को ओवरले करना चाहिए।
    5. उपकरण पट्टी पर सीधे पर क्लिक करें, और एक रेखा खींचें जो हलकों के केंद्रों को जोड़ती है (चित्रा 3 डी, 1 और 2)।
    6. विश्लेषण > माप का चयन करें। परिणाम स्क्रीन पर दिखाई देगा (चित्रा 3 डी, 3)।
      नोट:: परिणाम में प्रदर्शित ऊँचाई अवलोकन के दौरान एक्टिन धब्बेदार की स्थानांतरण दूरी इंगित करता है (चित्रा 3D, 3)।
    7. अवलोकन समय से स्थानांतरण दूरी को विभाजित करके F-actin प्रवाह वेग की गणना करें।
  11. F-actin polymerization दर का परिमाणीकरण।
    1. एक रेखा खींचें जो F-actin बंडल (चित्रा 3E, 1) की युक्तियों को लिंक करती है।
    2. विश्लेषण > माप का चयन करें। परिणाम स्क्रीन पर दिखाई देगा (चित्रा 3E, 2)।
      नोट:: परिणाम में ऊँचाई अवलोकन के दौरान F-actin बंडल की विस्तार लंबाई इंगित करता है (चित्रा 3E, 2).
    3. विस्तार लंबाई को अवलोकन समय से विभाजित करके F-actin विस्तार दर की गणना करें।
    4. F-actin polymerization दर की गणना F-actin प्रवाह वेग और विस्तार दर (चित्रा 3F) के योग के रूप में करें।

7. कर्षण बल माइक्रोस्कोपी और न्यूरॉन संस्कृतियों के लिए एक पीएए जेल की तैयारी

  1. कर्षण बल माइक्रोस्कोपी के लिए आवश्यक पीएए जैल की तैयारी (चित्रा 4)
    1. NaOH (100 mM) के पिपेट 0.5 mL, आसुत H2O में भंग, 27 मिमी व्यास के ग्लास-बॉटम व्यंजनों पर, और कमरे के तापमान (आरटी) पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    2. व्यंजनों पर NaOH समाधान में 3-aminopropyltrimethyoxysilane (APTMS) के 50 μL जोड़ें और कोमल pipetting द्वारा समाधान मिश्रण, और आरटी पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
    3. आसुत H2O के साथ ग्लास-बॉटम डिश को धोएं, और सूखा।
    4. पिपेट 0.5% ग्लूटाराल्डिहाइड समाधान के 0.5 मिलीलीटर, पीबीएस में भंग, एपीटीएमएस-उपचारित ग्लास-बॉटम डिश पर, और आरटी पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    5. आसुत H2O और सूखी के साथ कांच के नीचे के बर्तन धोलें।
    6. आसुत H2O (412 μL), 30% (w/v) एक्रिलामाइड समाधान (63 μL), 2.5% (w/v) bis-acrylamide समाधान (6 μL) और कार्बोक्सिलेट-संशोधित माइक्रोस्फीयर (फ्लोरोसेंट मनका) समाधान (20 μL) युक्त एक समाधान तैयार करें।
      नोट: भंवर फ्लोरोसेंट मनका समाधान एक्रिलामाइड समाधान में जोड़ने से पहले एकत्रित मोतियों को अलग करने के लिए।
    7. RT में 30 मिनट के लिए एक वैक्यूम कक्ष में समाधान degas.
    8. इस समाधान के लिए, 10% (w / v) अमोनियम persulphate (APS) के 1 μL जोड़ें, आसुत H2O में भंग, और N, N,N', N'-tetramethylethylenediamine (TEMED) के 1 μL, और कोमल pipetting द्वारा मिश्रण।
    9. एक 15 मिलीलीटर सेंट्रीफ्यूज ट्यूब की टोपी पर एक ग्लास कवरस्लिप (18 मिमी व्यास) रखें।
    10. तुरंत coverlip करने के लिए समाधान के 25 μL जोड़ें, और फिर धीरे से coverslip पर एक उलटा ग्लास-नीचे पकवान जगह. एक्रिलामाइड को आरटी पर 1 ज के लिए पॉलिमराइज़ करने की अनुमति दें।
    11. कवरस्लिप पर आसुत H2O लागू करें और इसे एक मुड़ी हुई नोक के साथ एक सिरिंज सुई का उपयोग करके जेल से दूर छील लें।
    12. H2O निकालें और sulfo-SANPAH (1 mM), PBS में भंग, जेल के लिए जोड़ें।
    13. बाँझ परिस्थितियों के तहत, 5 मिनट के लिए पराबैंगनी प्रकाश के लिए जैल को उजागर करें। पीबीएस के साथ जेल को 15 मिनट प्रति धोने के लिए तीन बार धोएं।
  2. एक माइक्रोस्फीयर इंडेंटेशन विधि के साथ जेल कठोरता का निर्धारण (चित्रा 5A)44.
    1. एक माइक्रोस्फीयर को स्थानांतरित करें जो व्यास और घनत्व के लिए निर्दिष्ट किया गया है, जेल में और फिर इसे लेजर स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के नमूना चरण पर रखें।
    2. जेल की सतह पर ध्यान केंद्रित करें और जेड-स्थिति (चित्रा 5 बी) रिकॉर्ड करें।
    3. इसी तरह, माइक्रोस्फीयर के तल पर ध्यान केंद्रित करें, और जेड-स्थिति (चित्रा 5 सी) रिकॉर्ड करें।
    4. जेल सतह के z-पदों और माइक्रोस्फीयर के नीचे के बीच अंतर द्वारा निर्धारित इंडेंटेशन गहराई की गणना करें।
    5. जेल के यंग के मापांक E की गणना कीजिये:
      Equation 1
      जहां f माइक्रोस्फीयर का उछाल-सही वजन है, d जेल की इंडेंटेशन गहराई है, r माइक्रोस्फीयर की त्रिज्या है, और v पॉइसन का अनुपात है (जिसका मान 0.3 है, जैसा कि पहले निर्धारित किया गया था46)।
  3. PDL और लैमिनिन के साथ जैल कोट के रूप में अनुभाग 2 में वर्णित है.
  4. जैसा कि अनुभाग 3 और 4 में वर्णित है, E16 माउस भ्रूण को विच्छेदित करें, हिप्पोकैम्पी को अलग करें, और प्रति 1.0 x 106 कोशिकाओं के 5 μg pEGFP-C1 के साथ ट्रांसफ़ेक्ट करें। पीडीएल / लैमिनिन-लेपित जैल पर बीज 2.0 x 105 कोशिकाएं।
    नोट: कर्षण बल विश्लेषण के लिए, फ्लोरोसेंटली-लेबल वाली कोशिकाओं की माइक्रोस्कोपिक इमेजिंग विकास शंकु क्षेत्र को निर्धारित करने के लिए आवश्यक है।

8. न्यूरोनल विकास शंकु पर कर्षण बल माइक्रोस्कोपी

  1. DIV3 पर, 2% B-27 पूरक, glutamine (1 mM), पेनिसिलिन (100 U / mL), और streptomycin (100 μg / mL) युक्त गर्म Leibovitz के L-15 माध्यम के 0.5 mL के साथ संस्कृति माध्यम को बदलें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए न्यूरॉन्स को बनाए रखें।
  2. एक लेजर स्कैनिंग confocal माइक्रोस्कोप चालू करें और 37 डिग्री सेल्सियस करने के लिए मंच-शीर्ष इनक्यूबेटर सेट करें।
    नोट: वर्तमान अध्ययन एक लेजर स्कैनिंग confocal माइक्रोस्कोप का उपयोग करता है जो 63x / 1.2 एनए पानी विसर्जन उद्देश्य लेंस और एक छवि अधिग्रहण और विश्लेषण सॉफ्टवेयर से सुसज्जित है ( सामग्री की तालिका देखें)।
  3. न्यूरॉन्स को ग्लास-बॉटम डिश में पहले से गर्म स्टेज-टॉप इनक्यूबेटर पर रखें।
  4. छवि अधिग्रहण पैरामीटर को निम्नानुसार सेट करें: स्कैन आकार, 512 × 512 पिक्सेल; स्कैन क्षेत्र, 1.5-3x ज़ूम; स्कैन गति, ~ 1 एस प्रति फ्रेम; लेजर तरंग दैर्ध्य, 561 एनएम (फ्लोरोसेंट मोतियों के लिए उत्तेजना तरंग दैर्ध्य) और 488 एनएम (बढ़े हुए हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (ईजीएफपी) के लिए उत्तेजना तरंग दैर्ध्य); समय अंतराल, 3 s; अवधि, 50 फ्रेम.
  5. विकास शंकु आकृति विज्ञान की कल्पना करने के लिए, एक विकास शंकु का चयन करें जो ईजीएफपी को दृढ़ता से व्यक्त करता है।
  6. जेल की सतह पर ध्यान केंद्रित करें और समय-चूक छवियों (चित्रा 6 ए और पूरक फ़ाइल 4) प्राप्त करें।
    नोट: कर्षण विश्लेषण के लिए, दो फ्लोरोसेंट चैनलों (फ्लोरोसेंट मोतियों और ईजीएफपी के लिए) और एक उज्ज्वल-क्षेत्र चैनल (विभेदक हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी) या चरण-विपरीत छवियों पर कब्जा करने की सिफारिश की जाती है) का उपयोग करें।
  7. एकल-चैनल टाइम-लैप्स RGB छवि स्टैक का उत्पादन करने और इन छवियों को टिफ़ फ़ाइलों के रूप में सहेजने के लिए एक छवि प्रसंस्करण सॉफ़्टवेयर (जैसे, फिजी) का उपयोग करें।
    नोट:: यह महत्वपूर्ण है कि जांचकर्ता भी कच्चे डेटा को सहेजें।
  8. 10% (डब्ल्यू / वी) सोडियम डोडेसिल सल्फेट (एसडीएस) के 100 μL लागू करें, आसुत H2O में भंग, ग्लास-बॉटम डिश में सब्सट्रेट से न्यूरॉन्स को जारी करके जेल सब्सट्रेट को आराम करने के लिए। तापमान को स्थिर करने के लिए डिश को 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    नोट: एक अनियंत्रित सब्सट्रेट में मोतियों की छवि का उपयोग कर्षण बल विश्लेषण (चित्रा 6 सी) के दौरान मूल मनका पदों को संदर्भित करने के लिए किया जाता है। एसडीएस समाधान का अनुप्रयोग इनक्यूबेटर में थर्मल परिवर्तन और सेल-प्रेरित विरूपण के विश्राम के कारण xyz-पदों को बदल देता है। इसलिए, जांचकर्ताओं को फोकल प्लेन और एक्स-वाई स्थिति को सही करने की आवश्यकता है।
  9. जेल की सतह पर ध्यान केंद्रित करें, और अनियंत्रित सब्सट्रेट (चित्रा 6 बी) में मोतियों की एक छवि प्राप्त करें।
  10. अनियंत्रित सब्सट्रेट में मोतियों की एक एकल-चैनल आरजीबी छवि का उत्पादन करें, और इस छवि को एक टिफ फ़ाइल के रूप में सहेजें।
  11. फिजी का उपयोग कर अनियंत्रित सब्सट्रेट में मनका छवि की एक्स-वाई स्थिति का सुधार
    1. फिजी में, अनियंत्रित सब्सट्रेट में मनका छवि और फ्लोरोसेंट मोतियों की समय-अंतराल स्टैक छवि खोलें।
    2. Concatenate > छवि > स्टैक > उपकरण का चयन करें। स्क्रीन पर एक संवाद बॉक्स दिखाई देगा (चित्रा 7A, 1)।
    3. असंयमित सब्सट्रेट में मनका छवि और क्रमशः Image1 और Image2 में फ्लोरोसेंट मोतियों की समय-चूक स्टैक छवि का चयन करें (चित्रा 7A, 2)।
    4. OK पर क्लिक करें। अनियंत्रित सब्सट्रेट में मनका छवि को टाइम-लैप्स स्टैक छवि (चित्रा 7ए, 3) में जोड़ा जाता है।
    5. स्क्रॉल पट्टी (चित्रा 7B, 1, लाल फ़्रेम) का उपयोग करके, स्टैक छवि (लाल तीर) का दूसरा फ़्रेम प्रदर्शित करें.
    6. StackReg > प्लगइन्स का चयन करें (चित्रा 7B, 2). स्क्रीन पर एक संवाद बॉक्स दिखाई देगा (चित्रा 7B, 3)।
    7. ड्रॉप-डाउन सूची (चित्रा 7B, 3, लाल फ्रेम) से कठोर शरीर का चयन करें और ठीक पर क्लिक करें। एक्स-वाई स्थिति का सुधार तब शुरू होता है।
    8. x-y स्थिति-सही स्टैक छवि के पहले फ़्रेम को प्रदर्शित करने के लिए स्क्रॉल पट्टी का उपयोग करें.
    9. छवि > डुप्लिकेट का चयन करें (चित्र7C, 1). स्क्रीन पर एक संवाद बॉक्स दिखाई देगा (चित्रा 7B, 2)।
    10. श्रेणी में इनपुट 1, डुप्लिकेट स्टैक (चित्र 7C, 2) का चयन रद्द करें, और ठीकक्लिक करें। अनस्ट्रेन्ड सब्सट्रेट में एक्स-वाई स्थिति-सही मनका छवि स्क्रीन पर दिखाई देगी (चित्रा 7 सी, 3)। इस छवि को एक टिफ़ फ़ाइल के रूप में सहेजें.
  12. कर्षण बल का परिमाणीकरण
    नोट:: कर्षण बल विश्लेषण के लिए यहाँ वर्णित विधि MATLAB और दो MATLAB toolboxes, 'छवि प्रसंस्करण टूलबॉक्स' और 'समानांतर कंप्यूटिंग टूलबॉक्स' का उपयोग करता है। जांचकर्ताओं को विश्लेषण से पहले उन्हें स्थापित करने की आवश्यकता होगी। कर्षण बल विश्लेषण कोड MATLAB संस्करण 2018a के आधार पर विकसित किया गया था। इसलिए, MATLAB संस्करण 2018a (या बाद में) विश्लेषण के लिए उपयोग किया जाना चाहिए। कर्षण बल विश्लेषण के लिए उपयोग किए जाने वाले एल्गोरिदम को पहले वर्णित किया गया था22।
    1. पूरक फ़ाइल 5 से कर्षण बल विश्लेषण कोड TFM2021 डाउनलोड करें। MATLAB में TFM 2021 खोलें
    2. TFM2021 में मुख्य.m खोलें और इसे चलाएं। एक ग्राफिकल यूजर इंटरफेस (GUI) स्क्रीन पर दिखाई देगा (चित्रा 8A)।
    3. लोड unstrained सब्सट्रेट छवि पर क्लिक करें और unstrained सब्सट्रेट में x-y स्थिति-सही मनका छवि का चयन करें।
    4. लोड फ्लोरोसेंट मनका छवियों पर क्लिक करें और मोतियों के समय चूक स्टैक छवि का चयन करें।
    5. ब्राइट-फील्ड छवियों को लोड करें पर क्लिक करें और ब्राइट-फील्ड की टाइम-लैप्स स्टैक छवि का चयन करें।
    6. लोड GFP छवियों पर क्लिक करें और EGFP के समय चूक स्टैक छवि का चयन करें।
    7. GUI (चित्रा 8A, लाल बॉक्स) पर ड्रॉप-डाउन सूची से GFP का चयन करें।
    8. जीयूआई (चित्रा 8 बी) पर प्रदर्शित सेल छवि पर दो बिंदुओं पर क्लिक करके, वृद्धि शंकु सहित ब्याज के आयत क्षेत्र (आरओआई) को निर्दिष्ट करने के लिए आरओआई पर क्लिक करें।
    9. GUI पर सहेजें बटन पर क्लिक करें (चित्रा 8A, लाल तीर). चयनित स्टैक छवियाँ, ROI के साथ, एक .mat फ़ाइल (MATLAB स्वरूप फ़ाइल) में सहेजी जाएंगी.
    10. Spot Detect पर क्लिक करें। स्क्रीन पर एक डायलॉग बॉक्स दिखाई देगा।
    11. मनका का पता लगाने के लिए थ्रेशोल्ड निर्धारित करने के लिए संवाद बॉक्स पर कोई मान (आमतौर पर 50-150) इनपुट करें. ठीक क्लिक करने से परिकलन प्रारंभ हो जाता है.
    12. गणना समाप्त करने के बाद, चरण 8.12.8 पर चयनित क्षेत्र को बड़ा करने के लिए प्लॉट ट्रैक पर क्लिक करें और पता लगाए गए मोतियों को सफेद डॉट्स (चित्रा 8 C, 1) के रूप में प्रदर्शित करें।
      नोट:: पुष्टि करें कि क्या मनका का पता लगाने (सफेद डॉट्स) फ्लोरोसेंट मोतियों के साथ ओवरलैप करता है। मनका का पता लगाने भी पृष्ठभूमि शोर का पता लगाने कर सकते हैं. इस बाह्य हस्तक्षेप को कम करने के लिए, स्पॉट का पता लगाने पर थ्रेशोल्ड मान परिवर्तित करें। इसके अलावा, मैन्युअल रूप से चरण 8.12.13 पर सही डॉट्स का चयन करें।
    13. मोतियों का चयन करें पर क्लिक करें, और एक बहुभुज क्षेत्र का सीमांकन करें जिसमें विकास शंकु के तहत सही डॉट्स शामिल हैं। कुंजीपटल पर Enter दबाएँ. बहुभुज क्षेत्र के भीतर सफेद डॉट्स एक लाल रंग में बदल जाएंगे (चित्रा 8 सी, 2)।
    14. GUI पर Estimate force पर क्लिक करें। उसके बाद, निम्न पैरामीटर के लिए इनपुट मान: पिक्सेल आकार, μm/पिक्सेल; यंग का मापांक, चरण 7.2.5 पर परिकलित मान; पॉइसन का अनुपात, 0.3.
    15. परिकलन प्रारंभ करने के लिए अनुमान बल निष्पादित करें. सॉफ़्टवेयर स्वचालित रूप से एक स्प्रेडशीट प्रारूप फ़ाइल में गणना परिणामों को सहेजेगा।
      नोट:: स्प्रेडशीट x-घटक, y-घटक, और बल परिमाण हर समय-फ्रेम (चित्रा 8D) पर दिखाता है। कर्षण बल परिमाणित करने के लिए अभ्यास डेटा के लिए पूरक फ़ाइल 6 को देखें।

Representative Results

एकल धब्बेदार इमेजिंग एक्टिन पोलीमराइजेशन दर और क्लच युग्मन दक्षता को मापने के लिए
एक उच्च Lifeact अभिव्यक्ति विकास शंकु के भीतर एफ-एक्टिन विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देता है; एक कम HaloTag-actin अभिव्यक्ति एफ-एक्टिन प्रतिगामी प्रवाह की निगरानी की अनुमति देता है (चित्रा 3, पूरक फ़ाइल 2). एक्टिन धब्बेदार का पता लगाने से एफ-एक्टिन प्रवाह वेग (चित्रा 3 सी, डी) के माप की अनुमति मिलती है। चूंकि एफ-एक्टिन प्रतिगामी प्रवाह और चिपकने वाला सब्सट्रेट का यांत्रिक युग्मन एफ-एक्टिन प्रवाह वेग को कम करता है, इसलिए क्लच युग्मन दक्षता का अनुमान वेग से लगाया जा सकता है। इसके अलावा, लाइफैक्ट के साथ एफ-एक्टिन लेबलिंग एफ-एक्टिन एक्सटेंशन के विज़ुअलाइज़ेशन को एड्स करता है और एक्टिन पोलीमराइजेशन दर (चित्रा 3 ई, एफ) को मापने के लिए उपयोगी है।

कर्षण बल का मात्रात्मक विश्लेषण
यहां प्रस्तुत पद्धति का सख्त पालन विकास शंकु (चित्रा 6 सी, पूरक फ़ाइल 4) के तहत फ्लोरोसेंट मोतियों के आंदोलनों को प्रकट करेगा। सब्सट्रेट पर एफ-एक्टिन प्रतिगामी प्रवाह कर्षण बल उत्पन्न करता है जिससे फ्लोरोसेंट मोतियों को विकास शंकु के नीचे पीछे की ओर बढ़ने के लिए प्रेरित किया जाता है। कर्षण बल विश्लेषण कोड फ्लोरोसेंट मनका विस्थापन से कर्षण बल का अनुमान लगाता है, और एक बल वेक्टर के रूप में गणना किए गए कर्षण बल को व्यक्त करता है। कर्षण बल की दिशा और परिमाण बल वेक्टर के x- और y-घटकों से निर्धारित होते हैं (चित्र8C, D)। चित्र 8D में लाल बॉक्स एक बल वेक्टर के x- और y-घटकों का प्रतिनिधित्व करता है; चित्र 8C इसी वृद्धि शंकु को दर्शाता है। एक्स-वाई निर्देशांक के संदर्भ में, वेक्टर एक्स-अक्ष के खिलाफ -93.8 डिग्री को इंगित करता है; इस अभिविन्यास को विकास शंकु (चित्रा 8 C) के पीछे की ओर निर्देशित किया जाता है। कर्षण बल F के परिमाण की गणना निम्नानुसार की गई थी:

Equation 2

Figure 1
चित्रा 1: बल उत्पादन और विकास शंकु नेविगेशन के लिए एक विकास शंकु मशीनरी। एक netrin-1 chemoattractant ढाल एक अक्षीय विकास शंकु पर अपने रिसेप्टर DCC के विषम उत्तेजना को प्रेरित करता है। यह Rac1 और Cdc42 को सक्रिय करता है, और उनके डाउनस्ट्रीम किनेज Pak1। Rac1 और Cdc42 (1) एक्टिन पोलीमराइजेशन को बढ़ावा देते हैं, जबकि Pak1 फॉस्फोराइलेट्स शूटिन 1, शूटिन 1-मध्यस्थता (2) क्लच युग्मन को बढ़ाता है। एक्टिन गतिशीलता और विकास शंकु के भीतर क्लच युग्मन का असममित सक्रियण (3) नेट्रिन -1 स्रोत के पक्ष में कर्षण बल बढ़ जाता है, जिससे विकास शंकु आकर्षण के लिए एक दिशात्मक ड्राइविंग बल उत्पन्न होता है। यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल विकास शंकु नेविगेशन के लिए प्रमुख चर (1) - (3) के परिमाणीकरण के लिए अनुमति देते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: एक पूरी तरह से खुले और संकुचित डायाफ्राम के तहत एक न्यूरोनल विकास शंकु की प्रतिदीप्ति छवियां। विकास शंकु Lifeact और HaloTag-actin व्यक्त करता है। (ए) एक उच्च लाइफैक्ट अभिव्यक्ति विकास शंकु आकृति विज्ञान के विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देती है। दूसरी ओर, हैलोटैग-एक्टिन अभिव्यक्ति का स्तर बहुत कम होता है, जब डायाफ्राम पूरी तरह से खोला जाता है तो मंद संकेतों के साथ। (बी) जब डायाफ्राम उचित रूप से संकुचित होता है, तो पृष्ठभूमि संकेत कम हो जाते हैं, और एकल एक्टिन धब्बेदार विकास शंकु में दिखाई देते हैं। स्केल बार: 5 μm. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3: एक छवि प्रसंस्करण और विश्लेषण सॉफ़्टवेयर फिजी का उपयोग करके F-actin प्रवाह वेग और एक्टिन पोलीमराइजेशन दर को परिमाणित करने के लिए चरण। (A) विश्लेषण के लिए छवि के कोण को समायोजित करें। (1) एक एक्टिन धब्बेदार (एरोहेड) का पता लगाएं और चुनें जो एक एफ-एक्टिन बंडल में बहता है। (2) छवि का चयन करें > ट्रांस्फ़ॉर्म > घुमाएँ. (3) कोण सेट करें ताकि एफ-एक्टिन बंडल को ऊपर की ओर निर्देशित किया जा सके। (4) छवि का कोण बदल जाएगा। (बी) एक्टिन धब्बेदार और एफ-एक्टिन बंडल सहित क्षेत्र का सीमांकन करना। (1) उपकरण पट्टी पर आयत पर क्लिक करें. (2) छवि पर एक क्षेत्र को चित्रित करें। छवि की चमक और इसके विपरीत एक्टिन धब्बेदार के स्पष्ट विज़ुअलाइज़ेशन और एफ-एक्टिन बंडल की नोक की अनुमति देने के लिए बढ़ाया जाता है। (3) छवि > डुप्लिकेट का चयन करें. (4) इनपुट पांच समय फ्रेम है कि एफ एक्टिन बंडल में actin धब्बेदार प्रवाह दिखाने. (5) चयनित स्टैक छवि स्क्रीन पर दिखाई देगी। (C) एक्टिन धब्बेदार पर ओवरले सर्कल। (1) टूलबार पर ओवल पर क्लिक करें। (2) एक एक्टिन धब्बेदार पर एक वृत्त खींचें। (3) चयन जोड़ें > ओवरले > छवि का चयन करें। (4) वृत्त को ऊपर उठाया जाता है। 5) शेष एक्टिन धब्बेदार पर हलकों overlaying दोहराएँ. (डी) पांच समय-सीमाओं के दौरान एक्टिन धब्बों की स्थानांतरण दूरी को मापें। (1) उपकरण पट्टी पर सीधे पर क्लिक करें. (2) एक रेखा खींचें जो हलकों के केंद्रों को जोड़ती है। (3) का चयन करें विश्लेषण > उपाय. परिणाम, पैरामीटर ऊंचाई (लाल बॉक्स) द्वारा इंगित किया गया है, एक्टिन धब्बेदार स्थानांतरण दूरी relaying. (ई) पांच समय-फ्रेम के दौरान एफ-एक्टिन फलाव की लंबाई में परिवर्तन को मापें। (1) एक रेखा खींचें जो एफ-एक्टिन फलाव की युक्तियों को जोड़ती है। (2) विश्लेषण > उपाय का चयन करें. परिणाम (लाल बॉक्स), ऊंचाई, एफ-एक्टिन बंडल की विस्तार लंबाई को इंगित करता है। (एफ) एक्टिन पोलीमराइजेशन दर की गणना एफ-एक्टिन प्रवाह वेग और विस्तार दर के योग से की जाती है। पूरक फ़ाइल 2 भी देखें. पूरक फ़ाइल 3 जांचकर्ताओं को ऊपर वर्णित पद्धति का अभ्यास करने में सहायता करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: पीएए जेल तैयारी के लिए कदम। कृपया विस्तृत विवरण के लिए चरण 7.1 देखें. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: पीएए जेल कठोरता का निर्धारण। (ए) एक माइक्रोस्फीयर इंडेंटेशन विधि। जब एक माइक्रोस्फीयर को फ्लोरोसेंट मनका-एम्बेडेड पीएए जेल पर रखा जाता है, तो माइक्रोस्फीयर का वजन जेल में इंडेंटेशन का कारण बनता है। इंडेंटेशन गहराई की गणना माइक्रोस्फीयर (बी, सी) के नीचे से पीएए जेल सतह के जेड-पदों को घटाकर की जाती है, जो एक माइक्रोस्फीयर द्वारा इंडेंट किए गए पीएए जेल की प्रतिदीप्ति छवियों और फ्लोरोसेंट मोतियों से युक्त होती है। जेल सतह (बी) और माइक्रोस्फीयर (सी) के निचले हिस्से की छवियों को कैप्चर करने के लिए एक लेजर स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग किया गया था। फ्लोरोसेंट मोतियों से संकेत इंडेंटेड क्षेत्र (बी, सर्कल) में जेल की सतह पर दिखाई नहीं देते हैं। हालांकि, उन्हें माइक्रोस्फीयर के तल पर देखा जा सकता है। स्केल बार: 50 μm. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।

Figure 6
चित्रा 6: एक न्यूरोनल विकास शंकु का बल मानचित्रण। (A-C) एक पीएए जेल में एम्बेडेड मोतियों की प्रतिदीप्ति छवियां और ईजीएफपी के साथ कल्पना की गई एक तंत्रिका विकास शंकु। टाइम-लैप्स छवियों (ए) के अधिग्रहण के बाद, न्यूरॉन को एसडीएस समाधान लागू करके जेल सब्सट्रेट से जारी किया गया था, और अनियंत्रित सब्सट्रेट में मोतियों की एक छवि पर कब्जा कर लिया गया था (बी)। (सी) अनियंत्रित सब्सट्रेट में मोतियों की छवि उनके मूल (हरे) और विस्थापित (लाल) पदों में मोतियों को दिखाती है। विकास शंकु का ईजीएफपी संकेत नीले रंग में दिखाया गया है। Kymographs (दाएं) 147 s की अवधि के लिए 3 s अंतराल पर मोतियों के आंदोलनों को दिखाते हैं, जो बॉक्स्ड क्षेत्रों 1 और 2 में तीर द्वारा इंगित किया गया है। क्षेत्र 2 में मनका एक संदर्भ मनका है। स्केल सलाखों: (ए), (बी) और (सी, बाएं) के लिए 2 μm, और (सी, मध्य) के लिए 1 μm। पूरक फ़ाइल 4 भी देखें. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्रा 7: फिजी का उपयोग करके अनियंत्रित सब्सट्रेट में मनका छवि की एक्स-वाई स्थिति को ठीक करने के लिए कदम। (ए) फ्लोरोसेंट मोतियों की समय-अंतराल स्टैक छवि के साथ अनियंत्रित सब्सट्रेट में मनका छवि को संयोजित करें। (1) Concatenate > > स्टैक > उपकरण > छवि का चयन करें। (2) unstrained सब्सट्रेट में मोतियों की छवि का चयन करें और क्रमशः Image1 और Image2 में फ्लोरोसेंट मोतियों की समय-अंतराल स्टैक छवि। OK पर क्लिक करें। (3) अनियंत्रित सब्सट्रेट में मनका छवि को समय-अंतराल स्टैक छवि में जोड़ा जाता है। (बी) फ्लोरोसेंट मनका छवि की एक्स-वाई स्थिति को सही करें। (1) छवि स्टैक में दूसरे फ्रेम (लाल तीर) का चयन करने के लिए स्क्रॉल बार (लाल फ्रेम) का उपयोग करें। (2) StackReg > प्लगइन्स का चयन करें. (3) ड्रॉप-डाउन सूची (लाल फ्रेम) से कठोर शरीर का चयन करें और ठीक पर क्लिक करें। एक्स-वाई स्थिति का सुधार शुरू हो जाएगा। (C) x-y स्थिति-सही मनका छवि सहेजें। x-y स्थिति-सही स्टैक छवि के पहले फ़्रेम का चयन करने के बाद, (1) छवि > डुप्लिकेट का चयन करें। (2) इनपुट 1 श्रेणी में और डुप्लिकेट स्टैक का चयन रद्द करें। फिर OK पर क्लिक करें। (3) अनस्ट्रेंडेड सब्सट्रेट में एक्स-वाई स्थिति-सही मनका छवि स्क्रीन पर दिखाई देगी। इस छवि को एक टिफ़ फ़ाइल के रूप में सहेजें. पूरक फ़ाइल 6 ऊपर वर्णित पद्धति का अभ्यास करने के लिए जांचकर्ताओं की सहायता करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 8
चित्र8: एक ओपन-सोर्स कर्षण बल विश्लेषण कोड का उपयोग करके न्यूरोनल ग्रोथ शंकु के तहत कर्षण बल का विश्लेषण। (ए) कर्षण बल का विश्लेषण करने के लिए जीयूआई। जीयूआई पर चयनित समय-अंतराल छवियों को ड्रॉप-डाउन सूची से और स्लाइडर के संकेत (लाल बॉक्स) के साथ पुष्टि की जा सकती है। (B) एक ऐसे क्षेत्र का चयन करें जिसमें वृद्धि शंकु शामिल हो। (1) जीयूआई पर आरओआई पर क्लिक करें। माउस कर्सर के साथ, सेल छवि पर दो बिंदु (एरोहेड्स) निर्दिष्ट करें. (2) सेल छवि पर एक लाल बॉक्स दिखाई देगा। दो क्लिक दो कोनों के स्थानों को निर्धारित करते हैं। (C) विकास शंकु के नीचे पता लगाए गए मोतियों (सफेद डॉट्स) का चयन करें। (1) जीयूआई पर, मोतियों का चयन करें पर क्लिक करें, और एक बहुभुज क्षेत्र का सीमांकन करें जिसमें क्लिक करके विकास शंकु शामिल है। Enter कुंजी दबाएँ . (2) बहुभुज क्षेत्र के भीतर सफेद डॉट्स एक लाल रंग में बदल जाएंगे। (d) कर्षण बल की दिशा और परिमाण के परिकलित परिणाम। स्प्रेडशीट में लाल बॉक्स बल वेक्टर के x- और y-घटकों का प्रतिनिधित्व करता है, जिसका अनुमान कर्षण बल विश्लेषण द्वारा लगाया जाता है। दाएँ पैनल में x-y निर्देशांक पर, वृद्धि शंकु द्वारा उत्पन्न बल वेक्टर x-अक्ष के विरुद्ध -93.8° को इंगित करता है; इस अभिविन्यास में वृद्धि शंकु के पीछे की ओर निर्देशित किया जाता है (सी). पूरक फ़ाइल 6 ऊपर वर्णित पद्धति का अभ्यास करने के लिए जांचकर्ताओं की सहायता करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 1: इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले समाधान और मीडिया के व्यंजनों। विस्तृत उपयोग के लिए पाठ देखें. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

पूरक फ़ाइल 2: Lifeact और एक तंत्रिका विकास शंकु में HaloTag-actin के फ्लोरोसेंट धब्बेदार इमेजिंग के प्रतिदीप्ति इमेजिंग. Lifeact (हरा) और HaloTag-actin (magenta). छवियों को 147 सेकंड की कुल अवधि के लिए हर 3 सेकंड में अधिग्रहित किया गया था। स्केल बार: 2 μm. चित्र 3 भी देखें। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 3: एफ-एक्टिन प्रवाह वेग और एक्टिन पोलीमराइजेशन दर को परिमाणित करने के लिए अभ्यास डेटा। Lifeact (हरे) और HaloTag-actin (magenta) की एक multichannel time-lapse स्टैक छवि। चित्र 3 भी देखें। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

पूरक फ़ाइल 4: एक न्यूरोनल विकास शंकु पर कर्षण बल का पता लगाने वाला एक बल-मानचित्रण वीडियो। मोतियों की मूल (हरा) और विस्थापित (लाल) स्थिति। विकास शंकु में ईजीएफपी संकेत नीले रंग में दिखाया गया है। छवियों को 147 सेकंड के लिए हर 3 सेकंड में अधिग्रहित किया गया था। स्केल बार: 2 μm. चित्र 6 भी देखें। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

पूरक फ़ाइल 5: कर्षण बल विश्लेषण कोड. विस्तृत उपयोग के लिए कृपया चरण 8.12 देखें. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

पूरक फ़ाइल 6: कर्षण बल परिमाणित करने के लिए अभ्यास डेटा। एक एकल चैनल आरजीबी एक अनियंत्रित सब्सट्रेट और एकल चैनल समय अंतराल स्टैक एक विकास शंकु, EGFP, और उज्ज्वल क्षेत्र के तहत फ्लोरोसेंट मोतियों की RGB छवियों में मोतियों की छवि. आंकड़े 7 और 8 भी देखें। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

Discussion

इस अध्ययन में वर्णित प्रोटोकॉल सभी प्रयोगशालाओं, संस्थानों और विश्वविद्यालयों में नियमित रूप से पाए जाने वाले व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सामग्रियों और माइक्रोस्कोपी उपकरणों का उपयोग करते हैं। इसलिए, जांचकर्ता आसानी से अपने अध्ययन में वर्तमान एकल धब्बेदार इमेजिंग और कर्षण बल माइक्रोस्कोपी को अपना सकते हैं।

धब्बेदार इमेजिंग एक्टिन पोलीमराइजेशन और क्लच युग्मन का विश्लेषण कर सकती है। इसके अलावा, धब्बेदार इमेजिंग क्लच अणुओं जैसे कि शूटिन 1 और कोर्टेक्टिन के प्रतिगामी प्रवाह की निगरानी कर सकती है, जो एफ-एक्टिन प्रतिगामी प्रवाह के साथ बातचीत करती है। एक TIRF माइक्रोस्कोप का उपयोग करके, सेल आसंजन अणु L1-CAM के प्रतिगामी प्रवाह की भी निगरानी की जा सकती है23,41; L1-CAM पकड़ और पर्ची व्यवहार से गुजरता है जो क्लच युग्मन दक्षता 23,41 को दर्शाता है। यद्यपि वर्तमान अध्ययन धब्बेदार इमेजिंग के लिए टीएमआर-हैलोटैग प्रणाली को नियोजित करता है, अन्य फ्लोरोसेंट प्रोटीन, जैसे कि ईजीएफपी और मोनोमेरिक लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन, विश्लेषण में भी उपलब्ध हैं16,18,20,23,24,27,39। एक्टिन धब्बेदारों की कल्पना करने के लिए आवश्यक फ्लोरोसेंट एक्टिन का एक कम अभिव्यक्ति स्तर और न्यूनतम क्षेत्र की रोशनी (चित्रा 2) हैं। इस प्रोटोकॉल में, Lifeact और HaloTag-actin संकेतों को क्रमिक रूप से प्राप्त किया जाता है। क्योंकि एक्टिन प्रतिगामी प्रवाह अपेक्षाकृत धीमा है (4.5 ± 0.1 μm / min)24, एफ-एक्टिन प्रतिगामी प्रवाह और एक्टिन पोलीमराइजेशन का विश्लेषण विभिन्न फ्लोरोसेंट चैनलों (~ 1 s अंतराल) के अनुक्रमिक छवि अधिग्रहण से अप्रभावित है। Lifeact एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया एफ एक्टिन मार्कर है, लेकिन actin बाध्यकारी प्रोटीन 47 के साथ प्रतिस्पर्धा कर सकते हैं. आगे के महत्व के, Lifeact actin गतिशीलता को बदल सकते हैं, जिससे F-actin संरचनाओं और सेल आकृति विज्ञान 47,48,49 को प्रभावित किया जा सकता है।

कर्षण बल माइक्रोस्कोपी विकास शंकु अग्रिम ड्राइव करने के लिए बलों का पता लगा सकते हैं। एक बाह्य कोशिकीय मैट्रिक्स के भीतर न्यूरॉन्स को माउंट करके, जांचकर्ता अर्ध-3 डी वातावरण में उत्पन्न बलों का विश्लेषण भी कर सकते हैं। उच्च आवर्धन इमेजिंग कर्षण बल के सटीक परिमाणीकरण के लिए महत्वपूर्ण है क्योंकि विकास शंकु कमजोर कर्षण बल उत्पन्न करते हैं7। यद्यपि नैनोपिलर या तनाव-संवेदनशील बायोसेंसर के साथ अन्य तरीकों का उपयोग कर्षण बल 50,51 को मापने के लिए भी किया जाता है, पीएए जेल-आधारित विधि अत्यधिक अनुकूलनीय है और एक्रिलामाइड और बीआईएस-एक्रिलामाइड 41,44,52 की सांद्रता को बदलकर सब्सट्रेट कठोरता के समायोजन की अनुमति देती है। इस प्रोटोकॉल में, पीएए जेल को 3.75% एक्रिलामाइड और 0.03% बिस-एक्रिलामाइड की अंतिम एकाग्रता पर तैयार किया जाता है; यंग का मापांक ~ 270 Pa22 है और यह कठोरता मस्तिष्क के ऊतकों (100-10,000 Pa) 53,54,55 की सीमा के भीतर है। पीएए जेल (~ 100 μm) की मोटाई के कारण, यह विधि माइक्रोस्कोपी के दौरान उच्च आवर्धन लेंस के उपयोग को सीमित करती है। उच्च आवर्धन छवियों को प्राप्त करने के लिए, जांचकर्ताओं को लेजर स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप में ज़ूम फ़ंक्शन का उपयोग करना चाहिए।

अंत में, वर्तमान धब्बेदार इमेजिंग और कर्षण बल माइक्रोस्कोपी बल पीढ़ियों में प्रमुख घटनाओं के मात्रात्मक विश्लेषण को सक्षम करते हैं। यह जानकारी उन तंत्रों की समझ में सुधार के लिए अमूल्य होगी जो विकास शंकु प्रगति और नेविगेशन को रेखांकित करते हैं।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस शोध को एएमईडी द्वारा अनुदान संख्या 21gm0810011h0005 (N.I. और Y.S.), JSPS KAKENHI (JP19H03223, N.I.) और JSPS अनुदान-इन-एड फॉर अर्ली-कैरियर वैज्ञानिकों (JP19K16258, T.M), ओसाका मेडिकल रिसर्च फाउंडेशन फॉर लाइलाज डिजीज (T.M.), और NAIST अगली पीढ़ी के अंतःविषय अनुसंधान परियोजना (NAIST) के तहत भाग में समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5% trypan blue stain solution Nacalai 29853-34
3-aminopropyltrimethyoxysilane Sigma 281778-100ML
Acrylamide monomer Nacalai 00809-85
Ammonium persulphate Cytiva 17-1311-1
Axio Observer Z1 Zeiss 431007-9902-000 Epi-fluorescence microscope (single speckle imaging)
B-27 supplement (50x) Thermo Fisher Scientific 17504-044
Bovine serum albmine Sigma A7906-10G
C-Apochromat 63x/1.2 W Corr Zeiss 421787-9970-799 Objective lens (traction force microscopy)
Coverslip (diameter 18 mm) Matsunami C018001
D-glucose Nacalai 16806-25
DNaseI Sigma DN25-100MG
Fetal bovine serum Thermo Fisher Scientific 10270-106
Fiji Open source software package https://imagej.net/software/fiji/
FluoSpheres carboxylate-modified 0.2 mm, red (580/605), 2% solid Thermo Fisher Scientific F8810 carboxylate-modified microspheres
Glass bottom dish (14 mm diameter) Matsunami D1130H
Glass bottom dish (27 mm diameter) Matsunami D1140H
Glutaraldehyde solution Sigma G5882-10X10ML
HaloTag TMR ligand Promega G8251
HBO103 W/2 Osram 4050300382128 Mercury lamp (single speckle imaging)
Image Processing Toolbox MathWork https://www.mathworks.com/products/image.html
Laminin solution from mouse EHS tumor Wako 120-05751
Leibovitz’s L-15 medium Thermo Fisher Scientific 11415064
L-glutamine Nacalai 16919-42
LSM710 Zeiss N/A Conforcal laser microscope (traction force microscopy)
MATLAB2018a MathWork https://www.mathworks.com/products/new_products/release2018a.html
Mouse C57BL/6 Japan SLC N/A
Mouse neuron nucleofector kit Lonza VPG-1001
N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine (TEMED) Nacalai 33401-72
N,N’-methylenebisacrylamide Nacalai 22402-02
Neurobasal medium Thermo Fisher Scientific 21103-049
Nucleofector I Amaxa AAD-1001 Electroporation apparatus
ORCA Flash 4.0 V2 Hamamatsu C11440-22CU CMOS camera (single speckle imaging)
Papain Nacalai 26036-34
Parallel Computing Toolbox MathWork https://www.mathworks.com/products/parallel-computing.html
pEGFP-C1 Clontech 1528177
Penicillin-streptomycin (100x) Nacalai Tesque 26253-84
pFN21A-HaloTag-actin (Minegishi et al., 2018) N/A
Phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4 (10x) Thermo Fisher Scientific 70011-044
Plan-Apochromat 100x/1.4 Oil Zeiss 420790-9901-000 Objective lens (single speckle imaging)
pmNeonGreen-N1-Lifeact (Kastian et al., 2021) N/A
Poly-D-lysine hydrobromide Sigma P6407-5MG
Slulfo-SAMPHA Thermo Fisher Scientific 22589
Sodium dodecyl sulfate Nacalai 08933-05
Sodium hydrate (NaOH) Nacalai 31511-05
Steel ball Sako tekkou N/A Microshpere to determin PAA gel rigidity. 0.6 mm diameter, 7.87 g/cm3.
ZEN2009 Zeiss https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html#introduction Image acquisition software (traction force microscopy)
ZEN2012 Zeiss https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html#introduction Image acquisition software (single speckle imaging)

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Minegishi, T., Fujikawa, R., Kastian, R. F., Sakumura, Y., Inagaki, N. Analyses of Actin Dynamics, Clutch Coupling and Traction Force for Growth Cone Advance. J. Vis. Exp. (176), e63227, doi:10.3791/63227 (2021).

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