Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Optimerede knogleprøvetagningsprotokoller til hentning af gammelt DNA fra arkæologiske rester

Published: November 30, 2021 doi: 10.3791/63250
Automatic Translation
1,2, 1,3, 1,3, 1,3
1Department of Archaeogenetics, Max Planck Institute for the Science of Human History, 2School of Human Evolution and Social Change, Arizona State University, 3Department of Archaeogenetics, Max Planck Institute for Evolutionary Anthropology

Summary

Protokollen præsenterer en række bedste praksisprotokoller til indsamling af knoglepulver fra otte anbefalede anatomiske prøveudtagningssteder (specifikke placeringer på et givet skeletelement) på tværs af fem forskellige skeletelementer fra middelalderlige individer (radiocarbon dateret til en periode på ca. 1040-1400 CE, kalibreret 2-sigma-område).

Abstract

De metoder, der præsenteres her, søger at maksimere chancerne for genopretning af menneskeligt DNA fra gamle arkæologiske rester, samtidig med at inputprøvemateriale begrænses. Dette blev gjort ved at målrette anatomiske prøveudtagningssteder, der tidligere var bestemt til at give de højeste mængder gammelt DNA (aDNA) i en sammenlignende analyse af DNA-genopretning på tværs af skelettet. Tidligere forskning har antydet, at disse protokoller maksimerer chancerne for en vellykket genopretning af gammelt humant og patogen DNA fra arkæologiske rester. DNA-udbytter blev tidligere vurderet af Parker et al. 2020 i en bred undersøgelse af aDNA-bevarelse på tværs af flere skeletelementer fra 11 individer, der blev genvundet fra middelalderen (radiocarbon dateret til en periode på ca. (ca.) 1040-1400 CE, kalibreret 2-sigma-rækkevidde) kirkegård ved Krakauer Berg, en forladt middelalderlig bosættelse nær Peißen Tyskland. Disse otte prøvetagningssteder, der spænder over fem skeletelementer (pars petrosa, permanente molarer, brysthvirvel, distal falanks og talus) gav med succes gammel menneskelig DNA af høj kvalitet, hvor udbyttet var signifikant større end det samlede gennemsnit på tværs af alle elementer og individer. Udbyttet var tilstrækkeligt til brug i de fleste almindelige nedstrøms populationsgenetiske analyser. Vores resultater understøtter præferenceanvendelsen af disse anatomiske prøvetagningssteder til de fleste undersøgelser, der involverer analyser af gammelt menneskeligt DNA fra arkæologiske rester. Implementering af disse metoder vil bidrage til at minimere ødelæggelsen af dyrebare arkæologiske prøver.

Introduction

Prøveudtagningen af gamle menneskelige rester med henblik på DNA-genopretning og analyse er i sagens natur ødelæggende 1,2,3,4. Prøverne i sig selv er dyrebare prøver, og morfologisk konservering bør bevares, hvor det er muligt. Som sådan er det bydende nødvendigt, at prøveudtagningspraksis optimeres for både at undgå unødvendig ødelæggelse af uerstatteligt materiale og for at maksimere sandsynligheden for succes. De nuværende teknikker for bedste praksis er baseret på en lille kohorte af undersøgelser, der er begrænset til enten retsmedicinske undersøgelser5,6, undersøgelser af gamle prøver, hvor udviklingen af optimal prøveudtagning ikke er det direkte mål med undersøgelsen7, eller dedikerede undersøgelser, der anvender enten ikke-menneskelige rester8 eller er rettet mod et meget lille udvalg af anatomiske prøveudtagningssteder (bruges her til at betegne et specifikt område af et skeletelement, hvorfra knoglepulver, til brug i downstream-DNA-analyser, blev genereret)9,10. Prøveudtagningsprotokollerne, der præsenteres her, blev optimeret i den første store systematiske undersøgelse af DNA-bevarelse på tværs af flere skeletelementer fra flere individer11. Alle prøver stammede fra skeletelementer, der blev fundet fra 11 personer udgravet fra kirkegården i den forladte middelalderlige bosættelse Krakauer Berg nær Peißen, Sachsen-Anhalt, Tyskland (se tabel 1 for detaljeret prøvedemografi) og kan som sådan have brug for ændring til brug med prøver uden for dette geografiske / tidsmæssige interval.

Individuel Køn Anslået alder ved død 14 C datoer (CE, Cal 2-sigma)
KRA001 Mandlig 25-35 1058-1219
KRA002 Kvindelig 20-22 1227-1283
KRA003 Mandlig 25 1059-1223
KRA004 Mandlig 15 1284-1392
KRA005 Mandlig 10-12 1170-1258
KRA006 Kvindelig 30-40 1218-1266
KRA007 Kvindelig 25-30 1167-1251
KRA008 Mandlig 20 1301-1402
KRA009 Mandlig Ukendt 1158-1254
KRA010 Mandlig 25 1276-1383
KRA011 Kvindelig 30-45 1040-1159

Tabel 1: Genetisk bestemt køn, arkæologisk bestemt estimeret alder ved død og radiokarbondatering (14C Cal 2-sigma) for alle de 11 personer, der er udtaget. Denne tabel er tilpasset fra Parker, C. et al. 202011.

Disse protokoller giver mulighed for en relativt ligetil og effektiv generering af knoglepulver fra otte anatomiske prøvetagningssteder på tværs af fem skeletelementer (inklusive pars petrosa) med begrænset laboratorieinduceret DNA-kontaminering. Af disse fem skeletelementer er syv anatomiske prøveudtagningssteder fundet på fire skeletelementer blevet bestemt til at være levedygtige alternativer til den destruktive prøveudtagning af petrouspyramiden11,12. Disse omfatter cementum, dentin og pulpkammer af permanente molarer; kortikal knogle indsamlet fra det overlegne ryghvirvelhak såvel som fra kroppen af brysthvirvler; kortikal knogle, der stammer fra den ringere overflade af den apikale tuft og skaft af de distale phalanges; og den tætte kortikale knogle langs den ydre del af tali. Mens der er flere udbredte metoder til prøveudtagning af pars petrosa 4,12,13,14, dentin og tandmassekammeret 1,2,15, offentliggjorte metoder, der beskriver den vellykkede generering af knoglepulver fra cementum 16 , hvirvellegeme, ringere hvirvelhak og talus kan være vanskelige at opnå. Som sådan demonstrerer vi her optimerede prøveudtagningsprotokoller til petrouspyramiden (trin 3.1); cementum (trin 3.2.1), dentin (trin 3.2.2) og tandmasse (trin 3.2.3) af voksne molarer; kortikal knogle i rygsøjlen (trin 3.3.1) og overlegen ryghvirvelbue (trin 3.3.2) den distale falanks (trin 3.4); og talus (trin 3.5) for at gøre effektiv anvendelse af disse skeletelementer til både aDNA og retsmedicinsk forskning mere tilgængelig.

Protocol

Al forskning, der præsenteres heri, blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne fra Max Planck Institute for the Science of Human History, Jena, Tyskland for at arbejde med gamle menneskelige rester. Før du udfører nogen trin i denne protokol, skal du sørge for at overholde alle lokale / statslige / føderale etiske krav vedrørende både at få tilladelse til den videnskabelige undersøgelse og brug af menneskelige rester til destruktiv prøveudtagning i dit område. Alle procedurer/kemisk opbevaring bør udføres i henhold til individuelle institutionelle sikkerhedsretningslinjer.

1. Overvejelser inden prøvebehandling

  1. Behandl prøver med omhu, da gamle rester er en uovervindelig og begrænset ressource (f.eks. skal prøveudtagning være så minimalt spildt som muligt, og alle rester returneres til deres respektive og lovlige udbydere, hvis det er muligt).
  2. Udfør alle trin i et renrumsmiljø, helst på en dedikeret gammel DNA-facilitet17,18,19. Brug personlige værnemidler (PPE) bestående af sterile mikroporøse overalls med hætte, sterile handsker (to par), kirurgisk maske, beskyttelsesbriller og sterile støvler eller skridsikre sko med sterile dæksler (se Materialetabel). Skift handsker ofte, især mellem prøver.
  3. Rengør og desinficer alt udstyr og overflader grundigt med blegemiddel/DNA-dekontamineringsopløsning/ethanol og UV-bestråling (bølgelængde: 254 nm), hvor det er muligt (f.eks. bor, bor, skruestik/klemmer osv.). Endelig anbefales det stærkt at tage regelmæssige ergonomiske pauser (hver 2-3 timer, hvis det er muligt) for at undgå overudmattelse på grund af renrumsmiljøet.
    BEMÆRK: Alle skeletrester skal dokumenteres korrekt (f.eks. fotograferes, vejes og om muligt mikro-CT-scannes, 3D-afbildes osv.) inden prøveudtagning (protokoller for passende dokumentation er ikke dækket i dette manuskript). Alle prøveudtagningsprotokoller kan sættes på pause mellem prøveudtagningsgentagelser, og prøverne kan opbevares på ubestemt tid i et tørt, temperaturkontrolleret (25 °C), sterilt miljø.

2. Forbehandling

  1. Dekontaminere alle anatomiske prøvetagningssteder inden knoglepulvergenerering for at minimere risikoen for forurening18.
    BEMÆRK: Effektiviteten af blegemiddel og / eller overfladefjernelse (se NOTE i trin 3.3.2 for trin til fjernelse af overflader) til prøvedekontaminering er stadig et spørgsmål om debat blandt aDNA-forskere 8,19,20,21,22,23,24,25, da begge kan påvirke det samlede DNA-udbytte, især i stærkt nedbrudte prøver. Som sådan betragtes følgende trin som valgfrie og medtages her, da de blev brugt i alle prøver til at generere de repræsentative resultater, der præsenteres i dette papir. Det anbefales, at anvendelsen af disse forbehandlingsprotokoller bestemmes fra sag til sag baseret på den molekylære anvendelse, alder, sjældenhed og niveau af morfologisk nedbrydning af hvert prøvesæt.
    1. Udfør al prøveudtagning i et dedikeret renrum under en UV-lysudstyret polymerasekædereaktion (PCR) hætte eller biosikkerhedsskab med luftstrømmen slukket. Spred steril aluminiumsfolie over bordpladen for at fange ethvert omstrejfende knoglepulver / fragmenter.
    2. Sørg for, at alle knoglefragmenter er genoprettet (til hjemtransport), inden folien bortskaffes. Skift folien mellem behandlingen af hvert skeletelement. Bortskaf brugt folie i en autoklaverbar biohazardpose/beholder.
    3. Fjern så meget løst snavs/detritus som muligt fra anatomiske prøvetagningssteder ved forsigtigt at tørre området af med en fnugfri tør steril klud (se Materialetabel). Bortskaf kludene i autoklaverbare biohazardposer eller beholdere.
    4. Dekontaminere den rensede overflade ved at tørre af med en steril klud fugtet med fortyndet kommercielt blegemiddel (~ 0,01% v / v, fortyndet med ultrarent DNase / RNasefrit vand) og lad det inkubere i 5 minutter. Bortskaf kludene i autoklaverbare biohazardposer eller beholdere.
      FORSIGTIG: Blegemiddel er et stærkt ætsende og reaktivt kemikalie; derfor bør passende sikkerhedsforanstaltninger være på plads, inden de anvendes.
    5. Fjern så meget resterende blegemiddel som muligt fra det anatomiske prøvetagningssted med en steril klud fugtet med ultrarent DNase/RNase-frit vand. Bortskaf kludene i autoklaverbare biohazardposer eller beholdere.
    6. Udsæt alle rensede anatomiske prøvetagningssteder for UV-stråling i 30 minutter (bølgelængde: 254 nm), og lad det derefter tørre helt ved stuetemperatur. Sørg for, at de anatomiske prøvetagningssteder er helt tørre, før du fortsætter med prøveudtagning eller vender tilbage til opbevaring for ikke kun at gøre knoglepulvergenerering lettere, men også for at forhindre yderligere nedbrydning af prøven (f.eks. Skimmel).
      FORSIGTIG: Udsættelse for UV-stråling kan være skadelig for øjnene.
    7. Gå straks til prøveudtagning eller opbevar skeletelementer i et tørt, temperaturkontrolleret (25 °C) sterilt miljø.

3. Generering af knoglepulver

BEMÆRK: Følgende protokoller er beregnet til brug i DNA-ekstraktion efter Dabney et al. 2019-protokollen26.

  1. Stikprøveudtagning af pars petrosa
    BEMÆRK: Denne protokol er tilpasset fra procedurer beskrevet i Pinhasi et al. 20194 og præsenteres her for brugervenlighed. Denne protokol repræsenterer ikke den nuværende, mindst destruktive metode til prøveudtagning af pars petrosa. Som sådan anbefales det at bruge protokollen beskrevet af Sirak et al. 201713 eller Orfanou et al. 202014 for prøver, hvor morfologisk konservering er af største betydning.
    1. Udfør alle prøveudtagninger i et dedikeret renrum under en UV-lysudstyret PCR-hætte eller biosikkerhedsskab (bølgelængde: 254 nm) med luftstrømmen slukket. Spred steril aluminiumsfolie over bordpladen for at fange ethvert omstrejfende knoglepulver / fragmenter.
    2. Sørg for, at alle knoglefragmenter og så meget pulver som muligt genvindes (til hjemtransport), inden folie bortskaffes. Skift folien mellem hver prøveudtagning. Bortskaf den brugte folie i en autoklaverbar biohazard pose/beholder.
    3. Fastgør det tørre, dekontaminerede element ved hjælp af en steriliseret klemme eller skruestik.
    4. Pars petrosa skæres i halve langs den overlegne sulcus petrosus (se figur 1) ved hjælp af en standard guldsmedesav udstyret med en 0,6 mm klinge (se Materialetabel) ved medium hastighed for at undgå overophedning (se BEMÆRK nedenfor trin 3.1.6).
      FORSIGTIG: Pars petrosa er meget tæt, og som sådan kan være svært at skære. Pas på at holde elementet sikkert fastspændt for at undgå skade. Bortskaf eventuelle ødelagte savklinger i den relevante skarpe beholder.
    5. Fjern petrous portionerne fra klemmen. Gendan og gem eventuelt løst/overskydende materiale.
    6. Anbring vejepapir i en steril vejebåd
    7. Hold petrous-delen over vejepapiret, skåret side vippet mod vejebakken. Bor ind i den tætte kortikale knogle mellem ansigtskanalen og mastoidantrummet (ser skinnende ud end det omgivende materiale, se figur 1) ved hjælp af tandbor udstyret med en lille målerbit (se Materialetabel) og indstillet til medium hastighed, medium drejningsmoment for at producere knoglepulver.
      BEMÆRK: Boring / skæring skal udføres i korte udbrud ved lave til mellemstore hastigheder for at undgå overophedning af knoglen og potentielt ødelægge / beskadige DNA. Anekdotisk, når den tætte del af petrous begynder at overophedes, kan en lugt beskrevet som madlavning bacon observeres. Hold straks op med at bore/save, og lad knoglen hvile, indtil den er tilstrækkeligt afkølet, før den genoptages.
    8. Gentag boringen, indtil ca. 50-100 mg pulver opsamles i vejepapiret, målt ved hjælp af en lukket vægt, der er nøjagtig til mindst 0,01 mg (se Materialetabel).
      BEMÆRK: Hvor det er muligt, foreslås det at samle 100 mg knoglepulver for at muliggøre to replikate DNA-ekstraktioner på 50 mg hver. Dette er dog ikke altid muligt på grund af enten begrænsning af selve de anatomiske prøvetagningssteder (f.eks. den distale falanks, tandmassekammeret) eller behovet for morfologisk konservering. For andre steder, såsom cementum, kan betydeligt mindre end 50 mg af materialet være tilgængeligt. Imidlertid har cementum, tandmassekammeret og distal falanks alle vist sig at give signifikant endogent DNA 11,27,28, på trods af lavere indledende input af knoglepulver fra ekstraktionsprocessen.
    9. Overfør pulver fra vejepapiret til et 2 ml mærket lavbinderrør med sikker lås til ekstraktion eller opbevaring. Vareprøver opbevares ved -20 °C på ubestemt tid.
    10. Opbevar resterende knogle/overskydende pulver i et tørt, temperaturkontrolleret (25 °C) sterilt miljø, indtil returnering/hjemtransport kan afsluttes.
    11. Bortskaf alt affald i autoklaverbare biohazardposer eller beholdere. Steriliser/dekontaminerer alt genanvendeligt udstyr (f.eks. klemmer, bor, bor, save osv.) ved hjælp af blegemiddel/DNA-dekontamineringsopløsning/ethanol og UV-eksponering (bølgelængde: 254 nm), alt efter hvad der er relevant, mellem hver prøveudtagning.

Figure 1
Figur 1: Temporal knogle inklusive pars petrosa. (A) Prøveforskæring, der viser placeringen af petrouspyramiden og sulcus petrosa. (B) Petrous del efter skæring, der fremhæver de tætte områder, der skal bores. Klik her for at se en større version af denne figur.

  1. Prøveudtagning af permanente kindtænder
    BEMÆRK: Ved prøveudtagning af permanente kindtænder skal du på forhånd vælge in situ molarer med smeltede rødder og ideelt set uden karies, revner i emaljen eller overdreven slid for de bedste resultater. Enhver tandprøvetagning fjernes og opbevares ved -20 °C med henblik på eventuelle fremtidige analyser af det orale mikrobiom (proceduren er ikke omfattet her).
    1. Prøveudtagning af cementum
      1. Udfør alle prøveudtagninger i et dedikeret renrum under en UV-lysudstyret PCR-hætte eller biosikkerhedsskab (bølgelængde: 254 nm) med luftstrømmen slukket. Spred steril aluminiumsfolie over bordpladen for at fange ethvert omstrejfende knoglepulver / fragmenter.
      2. Sørg for, at alle knoglefragmenter og så meget pulver som muligt genvindes (til hjemtransport), inden folie bortskaffes. Skift folien mellem hver prøveudtagning. Bortskaf brugt folie i en autoklaverbar biohazardpose/beholder.
      3. Læg et ark vejepapir i en steril vejebakke.
      4. Hold /fastgør den dekontaminerede kindtand ved emaljen, rod ned, over en vejebakke ved hjælp af en håndholdt klemme, såsom en justerbar skruenøgle (se Materialetabel).
      5. Udstyr en tandbor med et diamantkantet cirkulært skærehjul. Når boret er indstillet til en indstilling med medium hastighed/drejningsmoment, skal du let røre kanten af bitten til roden i en vinkel på ca. -20°.
      6. Skrab nedad i bakken for at fjerne/samle det gule, yderste materiale fra roden (cementum). Stop indsamlingen, når dentinets lettere (hvide) materiale bliver synligt.
        BEMÆRK: Det er vigtigt at matche skærebitens rotationsretning i forhold til opsamlingsbakken for at undgå, at pulveret bliver aerosoliseret og potentielt spilder prøven ved at gå helt glip af bakken. Cementum er særligt rig på DNA; Imidlertid er typiske udbytter af materiale meget mindre end andre anatomiske prøvetagningssteder (~ 7-20 mg) 11,27,28.
      7. Rekordmasse af pulver opsamlet i vejepapir ved hjælp af en lukket vægt, der er nøjagtig til mindst 0,01 mg (se Materialetabel).
      8. Overfør pulver fra vejepapiret til et 2 ml lavtbindende, sikkert låsestel til ekstraktion. Opbevares ved -20 °C på ubestemt tid.
    2. Prøveudtagning af papirmassekammeret
      1. Når cementum er opsamlet (hvis ønsket), skal du lede molaren langs cemento-emaljekrydset ved hjælp af en guldsmedsav for at fjerne kronen (se figur 2).
      2. Læg et nyt ark vejepapir i en ny vejebakke.
      3. Fastgør kronesektionen i en håndholdt klemme eller skruestik over vejebakken. Hold den afskårne side skråtstillet nedad, og bor/skrab materiale som det første gennemløb med en tandbor udstyret med en lille måleborsbit (se Materialetabel) langs kanterne af papirmassekammeret inden for kronedelen (se figur 2).
        BEMÆRK: Kun den første passage af det indre af papirmassekammeret skal indsamles og mærkes som papirmassemateriale (5-15 mg typisk udbytte), alt dybere ind i tanden betragtes som dentin.
      4. Drej tanden med den nederste del nedad, bank på klemmen med en hammer, og saml det frigjorte pulver på vejepapiret.
      5. Vægten af pulveret, der opsamles i vejepapiret, registreres ved hjælp af en lukket vægt, der er nøjagtig til mindst 0,01 mg (se Materialetabel).
      6. Overfør pulver fra vejepapiret til et 2 ml lavtbindende, sikkertlåsesrør til ekstraktion. Opbevares ved -20 °C på ubestemt tid.
    3. Prøveudtagning af dentinet
      1. Læg et nyt ark vejepapir i en ny vejebakke.
      2. Hold kronesektionen over vejebakken (pr. trin 3.2.2.3), bor ud og opsamler yderligere 50-100 mg dentin målt ved hjælp af en lukket vægt, der er nøjagtig til 0,01 mg (se materialetabel) fra det indre af papirmassekammeret på samme måde for yderligere dentinprøvetagning (se figur 2).
      3. Overfør knoglepulver fra vejepapiret til et 2 ml lavbinderrør med sikker lås til ekstraktion. Opbevares ved -20 °C på ubestemt tid.
      4. Opbevar de resterende tandstykker/overskydende pulver i et tørt, temperaturkontrolleret (25 °C) sterilt miljø, indtil repatriering/hjemtransport kan afsluttes.
      5. Bortskaf alt affald i autoklaverbare biohazardposer eller beholdere. Steriliser/dekontaminerer alt genanvendeligt udstyr (f.eks. klemmer, bor, bor, save osv.) ved hjælp af blegemiddel/DNA-dekontamineringsopløsning/ethanol og UV-eksponeringer (bølgelængde: 254 nm), alt efter hvad der er relevant, mellem hver prøveudtagning.

Figure 2
Figur 2: Permanent molær forprøvetagning . (A) Forbehandlet molar før prøveudtagning, der viser krone, cementum (gulligt lag af roden) og skærestedet ved cemento-emaljekrydset. (B) Den samme molære post-cementum-samling, der viser skærestedet ved cemento-emaljekrydset. (C) Molær efterskæring og prøveudtagning, der viser anatomiske prøveudtagningssteder for tandmassekammeret og dentin i kronen. Klik her for at se en større version af denne figur.

  1. Prøveudtagning af brysthvirvlerne
    1. Prøveudtagning af hvirvellegemet
      1. Udfør alle prøveudtagninger i et dedikeret renrum under en UV-lysudstyret PCR-hætte eller biosikkerhedsskab (bølgelængde: 254 nm) med luftstrømmen slukket. Spred steril aluminiumsfolie over bordpladen for at fange ethvert omstrejfende knoglepulver / fragmenter.
      2. Sørg for, at alle knoglefragmenter og så meget pulver som muligt genvindes (til hjemtransport), inden folie bortskaffes. Skift folien mellem hver prøveudtagning. Bortskaf brugt folie i en autoklaverbar biohazardpose/beholder.
      3. Læg et lille ark vejepapir i en standardvejebakke.
      4. Fastgør hvirvlerne med en klemme eller håndskruestik med hvirvellegemet udad.
      5. Hold hvirvlerne over vejebakken med rygsøjlen vippet nedad. Ved hjælp af en tandboremaskine udstyret med en lille målerboring (se Materialetabel), der er indstillet til lavt drejningsmoment, bores langs den yderste rand (ringere og overlegen) af den kortikale knogle, der omgiver det annullerede indre væv i hvirvellegemet (se figur 3).
      6. Skrab biten mod det kortikale lag over en standardvægtningsbakke, indtil 50-100 mg materiale er opsamlet, målt ved hjælp af en lukket balance nøjagtig til 0,01 mg (se Materialetabel).
      7. Overfør knoglepulver fra vejepapiret til et 2 ml lavtbindende, sikkert låsestel til ekstraktion. Opbevares ved -20 °C på ubestemt tid.
    2. Prøveudtagning af den overlegne hvirvelbue
      BEMÆRK: Dette trin er valgfrit. Fjern og kassér det yderste lag af den kortikale knogle i den overlegne rygbue ved hjælp af en tandbor udstyret med en lille måleborbit (se Materialetabel) ved at skrabe den langs overfladen19. Dette foreslås ikke til prøveudtagning fra hvirvellegemet, da laget af kortikal knogle generelt er meget tyndt og sandsynligvis vil være helt udtømt ved denne proces (se NOTE i punkt 2).
      1. Læg et lille ark vejepapir i en standardvejebakke.
      2. Fastgør hvirvlerne i en håndklemme/skruestik med hvirvelprocessen udad, overlegen side nedad.
      3. Mens du holder hvirvlerne, det overlegne aspekt nede, over en vejebakke, bores du opad i midten af det V-formede hak dannet ved fusion af den spinøse proces med lamellerne (se figur 3) ved hjælp af en tandbor med en lille målebit (se Materialetabel) indstillet til lav hastighed og højt drejningsmoment.
      4. Stop boringen, når der er et mærkbart fald i modstanden. Skift boreposition en smule og gentag, indtil 50-100 mg knoglepulver er opsamlet, målt ved hjælp af en lukket balance nøjagtig til 0,01 mg (se Materialetabel).
      5. Overfør knoglepulver fra vejepapiret til et 2 ml lavbindingsrør til ekstraktion. Opbevares ved -20 °C på ubestemt tid.
      6. Opbevar resterende knogle/overskydende pulver i et tørt, temperaturkontrolleret (25 °C) sterilt miljø indtil retur/hjemtransport.
      7. Bortskaf alt affald i autoklaverbare biohazardposer eller beholdere. Steriliser/dekontaminerer alt genanvendeligt udstyr (f.eks. klemmer, bor, bor, save osv.) ved hjælp af blegemiddel/DNA-dekontamineringsopløsning/ethanol og UV-eksponering (bølgelængde: 254 nm), alt efter hvad der er relevant, mellem hver prøveudtagning.

Figure 3
Figur 3: Vertebral krop og overlegen vertebral bue kortikal knogle anatomiske prøveudtagningssteder for brysthvirvelen. Klik her for at se en større version af denne figur.

  1. Prøveudtagning af den distale falanks
    BEMÆRK: Dette trin er valgfrit. Fjern og kassér det yderste lag af skaftets kortikale knogle og/eller apikale tuft ved hjælp af et tandbor udstyret med en lille måleborsbit ved at skrabe det langs overfladen19. Dette er muligvis ikke muligt for prøver med for tynd kortikal knogle eller juvenil rester (se NOTE i punkt 2).
    1. Udfør alle prøveudtagninger i et dedikeret rent rum under en UV-lysudstyret PCR-hætte eller biosikkerhedsskab (UV-bølgelængde: 254 nm) med luftstrømmen slukket. Spred steril aluminiumsfolie over bordpladen for at fange ethvert omstrejfende knoglepulver / fragmenter.
    2. Sørg for, at alle knoglefragmenter og så meget pulver som muligt genvindes (til hjemtransport), inden folie bortskaffes. Skift folien mellem hver prøveudtagning. Bortskaf brugt folie i en autoklaverbar biohazardpose/beholder.
    3. Læg et lille ark vejepapir i en standardvejebakke.
    4. Fastgør prøven i håndholdt klemme/skruestik, overlegen side opad.
    5. Hold prøven over vejebakken, saml knoglepulver fra den kortikale knogle fra den nedre side af den apikale tuft og skaft ved at bore gennem de yderste tætte lag (se figur 4) ved hjælp af en tandbor udstyret med en lille målerboring (se Materialetabel).
    6. Stop boringen, når der er et markant fald i modstanden, da dette betyder lettere, annulleret materiale. Gentag denne proces, der udstråler udad fra den første boring, indtil mindst 50-100 mg knoglepulver er opsamlet, målt ved hjælp af en lukket balance nøjagtig til 0,01 mg (se Materialetabel).
    7. Overfør knoglepulver fra vejepapiret til et 2 ml lavbinderrør med sikker lås til ekstraktion. Opbevares ved -20 °C på ubestemt tid.
    8. Opbevar det resterende knogle-/overskudspulver i et tørt, temperaturkontrolleret (25 °C) sterilt miljø indtil returnering/hjemtransport.
    9. Bortskaf alt affald i autoklaverbare biohazardposer eller beholdere. Steriliser/dekontaminerer alt genanvendeligt udstyr (f.eks. klemmer, bor, bor, save osv.) ved hjælp af blegemiddel/DNA-dekontamineringsopløsning/ethanol og UV-eksponering, alt efter hvad der er relevant, mellem hver prøveudtagning.
      BEMÆRK: For mindre prøver (f.eks. Juvenil prøver) kan der være betydeligt mindre end de foreslåede 50-100 mg kortikal knogle til rådighed til prøve. Men selv i lave mængder har dette anatomiske prøvetagningssted vist sig at være særligt rigt på DNA11.

Figure 4
Figur 4: Distal falanks, der viser placeringen af tæt kortikal knogle langs skaftet og den nedre side af den apikale tuft. Klik her for at se en større version af denne figur.

  1. Prøveudtagning af Talus
    1. Udfør alle prøveudtagninger i et dedikeret renrum under en UV-lysudstyret PCR-hætte eller biosikkerhedsskab (bølgelængde: 254 nm) med luftstrømmen slukket. Spred steril aluminiumsfolie over bordpladen for at fange ethvert omstrejfende knoglepulver / fragmenter.
    2. Sørg for, at alle knoglefragmenter og så meget pulver som muligt genvindes (til hjemtransport), inden folie bortskaffes. Skift folien mellem hver prøveudtagning. Bortskaf brugt folie i en autoklaverbar biohazardpose/beholder.
    3. Læg et lille ark vejepapir i en standardvejebakke.
    4. Fastgør prøven i håndholdt klemme/skruestik, kuppel opad.
    5. Hold talus, kuplen opad og den mediale overflade mod samleren over vejebakken. Skrab kortikal knogle fra halsen af talus til en dybde på ~ 1 mm (se figur 5) ved hjælp af en tandbor med en lav gauge bit (se Materialetabel) indstillet til lav hastighed og højt drejningsmoment.
    6. Skift boreposition en smule, og gentag, indtil ca. 50-100 mg knoglepulver er opsamlet, målt ved hjælp af en lukket balance nøjagtig til 0,01 mg (se Materialetabel).
    7. Overfør knoglepulver fra vejepapiret til et 2 ml lavbindingsrør til ekstraktion. Opbevares ved -20 °C på ubestemt tid.
    8. Opbevar det resterende knogle/overskydende pulver i et tørt, temperaturkontrolleret (25 °C) sterilt miljø, indtil returnering/hjemtransport kan afsluttes.
    9. Bortskaf alt affald i autoklaverbare biohazardposer eller beholdere. Steriliser/dekontaminerer alt genanvendeligt udstyr (f.eks. klemmer, bor, bor, save osv.) ved hjælp af blegemiddel/DNA-dekontamineringsopløsning/ethanol og UV-eksponering (bølgelængde: 254 nm), alt efter hvad der er relevant, mellem hver prøveudtagning.

Figure 5
Figur 5: Prøveudtagningsområde af talus til kortikal knoglegendannelse. Klik her for at se en større version af denne figur.

BEMÆRK: Talus har meget lidt kortikal knogle (et tyndt ydre lag). Materialet skal ikke kun opsamles fra overfladen, men også det underliggende tætte lag af cancelløs knogle.

Representative Results

I en separat undersøgelse 11 blev DNA ekstraheret fra knoglepulver genereret fra hvert anatomisk prøveudtagningssted hos11 individer ved hjælp af en standard DNA-ekstraktionsprotokol optimeret til korte fragmenter fra forkalket væv2. Enkeltstrengede biblioteker blev derefter produceret28 og sekventeret på en HiSeq 4000 (75 bp parret ende) til en dybde på ~ 20.000.000 læsninger pr. Prøve. De resulterende sekvensdata blev derefter evalueret for endogent humant DNA-indhold ved hjælp af EAGER-pipeline29 (BWA-indstillinger: Frølængde på 32, 0,1 mismatchstraf, kortlægningskvalitetsfilter på 37). Alle repræsentative resultater rapporteres ved hjælp af de samme målinger som Parker et al. 202011 for konsistens. Biblioteker fra de pulveriserede dele af pars petrosa gav i gennemsnit højere endogent DNA end nogen af de andre 23 undersøgte anatomiske prøvetagningssteder (figur 6A-B). De syv yderligere anatomiske prøveudtagningssteder, der er præsenteret i denne protokol (cementum, første passage af tandmassekammeret og dentin af permanente molarer; kortikal knogle fra hvirvellegemet og overlegen hvirvelbue i brysthvirvelen; kortikal knogle fra den apikale tuft af den distale falanks; og kortikal knogle fra talus hals) producerede de næsthøjeste udbytter (uden statistisk signifikans mellem disse anatomiske prøveudtagningssteder; Figur 6A-B; Supplerende fil 1: EndogenousDNAPreCap). Disse alternative placeringer producerede alle konsekvent DNA-udbytter, der er tilstrækkelige til standardpopulationsgenetiske analyser såsom mitokondrieanalyser og enkeltnukleotidpolymorfisme (SNP) analyser. Duplikeringsraterne i bibliotekerne fra alle anatomiske prøvetagningssteder var lave (klyngefaktorer < 1,2 i gennemsnit, beregnet som forholdet mellem alle kortlægningslæsninger og unikke kortlægningslæsninger, tabel 2; Supplerende fil 1: ClusterFactor), hvilket indikerer, at alle de screenede biblioteker var af meget høj kompleksitet. Tilsvarende var de gennemsnitlige eksogene humane DNA-kontamineringsestimater lave, i gennemsnit < 2% (X-kromosomforurening hos mænd, n = 7, som rapporteret af ANGSD30-rørledningen) på alle anatomiske prøvetagningssteder undtagen den overlegne hvirvelbue (gennemsnitlig estimeret forurening: 2,11%, med en prøve fjernet som en outlier; KRA005: 19,52%, se tabel 2; Supplerende fil 1: Xkontaminering). Den gennemsnitlige fragmentlængde (efter filtrering for at fjerne alle læsninger < 30 bp) var lavest i materialet indsamlet fra tandmassekammeret og dentinet uden signifikant variation blandt andre anatomiske prøvetagningssteder (henholdsvis 55,14 bp og 60,22 bp sammenlignet med en gennemsnitlig median på 62,87, parvis p-værdier < 0,019, tabel 2; Supplerende fil 1: Gns. Derudover indeholder tænderne og brysthvirvlerne hver flere anatomiske prøveudtagningssteder, hvor der blev observeret høj endogen DNA-genopretning, hvilket gør dem særligt velegnede som alternativer til pars petrosa.

Figure 6
Figur 6: Humant DNA-indhold for alle screenede prøver. Sorte linjer repræsenterer det samlede gennemsnit, mens røde linjer repræsenterer medianen (solid: menneskelig DNA-andel, stiplet: kortlagte menneskelige læsninger pr. Million læste genereret). Individuelle anatomiske prøvetagningssteder med en gennemsnitlig human DNA-andel højere end det samlede gennemsnit (8,16%) farves i alle analyser. (A) Andelen af læsninger, der kortlægger hg19-referencegenomet. Den blå stiplede linje repræsenterer det teoretiske maksimum i betragtning af rørledningens kortlægningsparametre (genereret ved hjælp af Gargammel31 til at simulere en tilfældig fordeling på 5.000.000 aflæsninger fra hg19-referencegenomet med simuleret skade). Individuelle midler (sort X) og medianer (rød cirkel) rapporteres for de prøver med en højere gennemsnitlig human DNA-andel end det samlede gennemsnit. Konfidensintervaller angiver øvre og nedre grænser eksklusive statistiske outliers. (B) Antallet af unikke læsninger, der kortlægges til hg19-referencegenomet pr. million læsninger af sekventeringsindsats (75 bp parret ende). Konfidensintervaller angiver øvre og nedre grænser eksklusive statistiske outliers. Dette tal er tilpasset fra Parker, C. et al. 202011. Klik her for at se en større version af denne figur.

Tabel 2: Gennemsnitlige duplikeringsniveauer (kortlægningslæsninger/unikke læsninger), gennemsnitlige og medianfragmentlængder og estimater for X-kromosomforurening for alle anatomiske prøvetagningssteder. Fejl rapporteret som standardfejlen i middelværdien. Denne tabel er tilpasset fra Parker, C. et al. 202011.

Prøveudtagning sted Gennemsnitlig duplikeringsfaktor (# kortlagte læsninger /# unikke kortlagte læsninger) Gennemsnitlig fragmentlængde i bp Gennemsnitlig anslået andel af X-kromosomforurening
Petrous pyramide 1.188 ± 0,006 65.40 ± 1.36 0,000 ± 0,003
Cementum 1.197 ± 0,028 67,28 ± 1,76 0,011 ± 0,003
Dentin 1.188 ± 0,061 60.22 ± 2,37 0,002 ± 0,007
Papirmasse 1.179 ± 0,024 55.14 ± 2,90 0,013 ± 0,006
Distal falanks 1.191 ± 0,049 65,95 ± 1,08 0,013 ± 0,005
Vertebral krop 1.194 ± 0,037 66.14 ± 1.03 0,008 ± 0,003
Overlegen hvirvelbue 1.19 ± 0,017 63.02 ± 1.23 0,021 ± 0,009*
Talus 1.198 ± 0,010 68.20 ± 1.24 0,011 ± 0,003
*Prøve KRA005 fjernet som outlier ved 0,1952

Kode tilgængelighed
Alle analyseprogrammer og R-moduler, der anvendes i analyserne af dette manuskript, er frit tilgængelige fra deres respektive forfattere. Al brugerdefineret R-kode er tilgængelig efter anmodning.

Data tilgængelighed
Alle rådata, der anvendes til beregning af repræsentative resultater, er frit tilgængelige i European Nucleotide Archive ENA-datalageret (tiltrædelsesnummer PRJ-EB36983) eller supplerende materialer fra Parker, C. et al.11.

Supplerende fil 1. Klik her for at downloade denne fil.

Discussion

Nuværende praksis inden for gammel human populationsgenetik er fortrinsvis at prøve fra pars petrosa (trin 2.1), når det er muligt. Pars petrosa kan dog være en vanskelig prøve at opnå, da den er højt værdsat for et utal af skeletvurderinger (f.eks. Befolkningshistorie32, estimering af fosteralder veddød 33 og kønsbestemmelse34), og historisk set kan prøveudtagning af pars petrosa til DNA-analyse være meget destruktiv3,4 (inklusive protokollen præsenteret her, selvom nye, minimalt invasive protokoller13,14 nu er blevet bredt vedtaget for at afhjælpe denne bekymring). Dette forstærkes af det faktum, at der indtil for nylig ikke var forsøgt en storstilet, systematisk undersøgelse af menneskelig DNA-genopretning på tværs af skelettet11, hvilket gør det udfordrende at finde en passende prøveudtagningsstrategi, når petrouspyramiden ikke er tilgængelig.

De protokoller, der præsenteres her, hjælper med at afhjælpe denne udfordring ved at tilvejebringe et sæt optimerede procedurer for DNA-prøveudtagning fra arkæologiske / retsmedicinske skeletrester, herunder pars petrosa samt syv alternative anatomiske prøveudtagningssteder på tværs af fire yderligere skeletelementer. De omfattede kritiske trin har alle til formål at minimere risikoen for DNA-tab/-beskadigelse som følge af enten ineffektiv prøveudtagning (trin 2.1.6 og 3.2.1.3) eller overophedning af prøver under boring/skæring (trin 3.1.6). Derudover er det blevet bemærket i hele protokollen, at det kan være nødvendigt at ændre/udelade forbehandlingstrinnene for at sikre den bedste ydeevne i stærkt nedbrudte prøver. Det skal også bemærkes, at selv blandt de udvalgte elementer, der præsenteres her, er der stadig flere mulige alternative prøveudtagningsteknikker (især for pars petrosa13,14) samt rigelig plads til yderligere optimering af de underudnyttede anatomiske prøveudtagningssteder, der præsenteres her (dvs. talus: trin 2.5 og hvirvlerne: trin 2.3).

Det er også vigtigt at huske på, at disse protokoller er designet og testet ved hjælp af gamle ungdoms-voksne rester af høj kvalitet (god morfologisk konservering) med henblik på endogene humane DNA-analyser. De fremlagte resultater strækker sig muligvis ikke til mere stærkt nedbrudte materialer, andre bevaringssammenhænge, spædbarnsrester, ikke-menneskelige rester eller undersøgelser af patogener eller mikrobiomet, da der stadig er behov for en større udforskning af brugen af disse protokoller i yderligere sammenhænge. Derudover kan de alternative skeletelementer, der præsenteres her (tænderne, hvirvlerne, distal falanks og tali) være udfordrende at tildele et enkelt individ blandt blandede rester, hvilket kræver prøveudtagning fra flere elementer for at sikre en enkelt oprindelse. På trods af disse begrænsninger kan det at gøre disse protokoller bredt tilgængelige hjælpe med at lindre noget af heterogeniteten omkring prøveudvælgelse og -behandling ved at give en generaliseret og kvantitativt optimeret ramme til brug i en bred vifte af fremtidige aDNA / retsmedicinske undersøgelser af menneskelige rester.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter at rapportere.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne takke laboratoriepersonalet på Max Planck Institute for Science of Human History for deres hjælp til udvikling og implementering af disse protokoller. Dette arbejde ville ikke have været muligt uden input og hårdt arbejde fra Dr. Guido Brandt, Dr. Elizabeth Nelson, Antje Wissegot og Franziska Aron. Denne undersøgelse blev finansieret af Max Planck Society, Det Europæiske Forskningsråd (ERC) under EU's Horizon 2020 forsknings- og innovationsprogram under tilskudsaftaler nr. 771234 - PALEoRIDER (WH, ABR) og starttilskud nr. 805268 CoDisEASe (til KIB).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
#16 Dental Drill Bit NTI H1-016-HP example drilling bit
0.6 mm scroll saw blade Fisher Scientific 50-949-097 blade for Jewellers Saw
22mm diamond cutting wheel Kahla SKU 806 104 358 514 220 Dremel cutting attachment
Commercial Bleach Fisher Scientific NC1818018
Control Company Ultra-Clean Supreme Aluminum Foil Fisher Scientific 15-078-29X
DNA LoBind Tubes (2 mL) Eppendorf 22431048
Dremel 225-01 Flex Shaft Attachment Dremel 225-01 Dremel flexible extension
Dremel 4300 Rotary Tool Dremel 4300 Example drill
Dremel collet and nut kit Dremel 4485 Adapters for various Dremel tool attachments/bits
Eagle 33 Gallon Red Biohazard Waste Bag Fisher Scientific 17-988-501
Eppendorf DNA LoBind 2 mL microcentrifuge tube Fisher Scientific 13-698-792
Ethanol (Molecular Biology Grade) Millipore Sigma 1.08543
FDA approved level 2 Surgical Mask Fisher Scientific 50-206-0397 PPE
Fisherbrand Comfort Nitrile Gloves Fisher Scientific 19-041-171X PPE
Fisherbrand Safety Glasses Fisher Scientific 19-130-208X PPE
Granger Stationary Vise Fisher Scientific NC1336173 benchtop vise
Invitrogen UltraPure DNase/Rnase free distilled water Fisher Scientific 10-977-023
Jewellers Saw Fisher Scientific 50-949-231
Kimwipes Sigma-Aldritch Z188956
Labconco Purifier Logic Biosafety cabinet Fisher Scientific 30-368-1101
LookOut DNA Erase Millipore Sigma L9042-1L
Medium weighing boat Heathrow Scientific HS120223
MSC 10pc plier/clamp set Fisher Scientific 50-129-5352 Miscellaneous clamps/vise grips for securely holding samples while drilling/cutting
Sartorius Quintix Semi-Micro Balance Fisher Scientific 14-560-019 enclosed balance
Tyvek coveralls with hood Fisher Scientific 01-361-7X PPE
Weigh paper Heathrow Scientific HS120116

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Adler, C. J., Haak, W., Donlon, D., Cooper, A. Survival and recovery of DNA from ancient teeth and bones. Journal of Archaeological Science. 38 (5), 956-964 (2011).
  2. Dabney, J., Meyer, M. Extraction of highly degraded DNA from ancient bones and teeth. Ancient DNA: Methods and Protocols. , 25-29 (2019).
  3. Palsdottir, A. H., Bläuer, A., Rannamäe, E., Boessenkool, S., Hallsson, J. Not a limitless resource: ethics and guidelines for destructive sampling of archaeofaunal remains. Royal Society Open Science. 6 (10), 191059 (2019).
  4. Pinhasi, R., Fernandes, D. M., Sirak, K., Cheronet, O. Isolating the human cochlea to generate bone powder for ancient DNA analysis. Nature Protocols. 14 (4), 1194-1205 (2019).
  5. Latham, K. E., Miller, J. J. DNA recovery and analysis from skeletal material in modern forensic contexts. Forensic Sciences Research. 4 (1), 51-59 (2019).
  6. Mundorff, A. Z., Bartelink, E. J., Mar-Cash, E. DNA preservation in skeletal elements from the World Trade Center disaster: Recommendations for mass fatality management. Journal of Forensic Sciences. 54 (4), 739-745 (2009).
  7. Gamba, C., et al. Genome flux and stasis in a five millennium transect of European prehistory. Nature Communications. 5 (1), 1-9 (2014).
  8. Alberti, F., et al. Optimized DNA sampling of ancient bones using Computed Tomography scans. Molecular Ecology Resources. 18 (6), 1196-1208 (2018).
  9. Hansen, H. B., et al. Comparing ancient DNA preservation in petrous bone and tooth cementum. PLoS ONE. 12 (1), 0170940 (2017).
  10. Sirak, K., et al. Human auditory ossicles as an alternative optimal source of ancient DNA. Genome Research. 30 (3), 427-436 (2020).
  11. Parker, C., et al. A systematic investigation of human DNA preservation in medieval skeletons. Scientific Reports. 10 (1), 18225 (2020).
  12. Pinhasi, R., et al. Optimal ancient DNA yields from the inner ear part of the human petrous bone. PLoS ONE. 10 (6), 0129102 (2015).
  13. Sirak, K. A., et al. A minimally-invasive method for sampling human petrous bones from the cranial base for ancient DNA analysis. BioTechniques. 62 (6), 283-289 (2017).
  14. Orfanou, E., Himmel, M., Aron, F., Haak, W. Minimally-invasive sampling of pars petrosa (os temporale) for ancient DNA extraction. protocols.io. , Available from: https://www.protocols.io/view/minimally-invasive-sampling-of-pars-petrosa-os-tem-bqd8ms9w (2020).
  15. Damgaard, P. B., et al. Improving access to endogenous DNA in ancient bones and teeth. Scientific Reports. 5 (1), 1-12 (2015).
  16. Harney, É, et al. A minimally destructive protocol for DNA extraction from ancient teeth. Genome Research. 31 (3), 472-483 (2021).
  17. Cooper, A., Poinar, H. N. Ancient DNA: Do it right or not at all. Science. 289 (5482), 1139 (2000).
  18. Llamas, B., et al. From the field to the laboratory: Controlling DNA contamination in human ancient DNA research in the high-throughput sequencing era. STAR: Science & Technology of Archaeological Research. 3 (1), 1-14 (2017).
  19. Llamas, B., et al. From the field to the laboratory: Controlling DNA contamination in human ancient DNA research in the high-throughput sequencing era. STAR: Science & Technology of Archaeological Research. 3 (1), 1-14 (2017).
  20. Boessenkool, S., et al. Combining bleach and mild predigestion improves ancient DNA recovery from bones. Molecular Ecology Resources. 17 (4), 742-751 (2017).
  21. García-Garcerà, M., et al. Fragmentation of contaminant and endogenous DNA in ancient samples determined by shotgun sequencing; Prospects for human palaeogenomics. PLoS ONE. 6 (8), 24161 (2011).
  22. Malmström, H., et al. More on contamination: The use of asymmetric molecular behavior to identify authentic ancient human DNA. Molecular Biology and Evolution. 24 (4), 998-1004 (2007).
  23. Basler, N., et al. Reduction of the contaminant fraction of DNA obtained from an ancient giant panda bone. BMC Research Notes. 10, 754 (2017).
  24. Kemp, B. M., Smith, D. G. Use of bleach to eliminate contaminating DNA from the surface of bones and teeth. Forensic Science International. 154 (1), 53-61 (2005).
  25. Korlević, P., et al. Reducing microbial and human contamination in DNA extractions from ancient bones and teeth. BioTechniques. 59 (2), 87-93 (2015).
  26. Dabney, J., Meyer, M. Extraction of highly degraded DNA from ancient bones and teeth. Methods in Molecular Biology. 1963, 25-29 (2019).
  27. Hansen, H. B., et al. Comparing ancient DNA preservation in petrous bone and tooth cementum. PLoS ONE. 12 (1), 0170940 (2017).
  28. Gansauge, M. -T., et al. Single-stranded DNA library preparation from highly degraded DNA using T4 DNA ligase. Nucleic Acids Research. 45 (10), 79 (2017).
  29. Peltzer, A., et al. EAGER: efficient ancient genome reconstruction. Genome Biology. 17 (1), 60 (2016).
  30. Korneliussen, T. S., Albrechtsen, A., Nielsen, R. ANGSD: analysis of next generation sequencing data. BMC Bioinformatics. 15, 356 (2014).
  31. Renaud, G., Hanghøj, K., Willerslev, E., Orlando, L. Gargammel: A sequence simulator for ancient DNA. Bioinformatics. 33 (4), 577-579 (2017).
  32. Ponce de León, M. S., et al. Human bony labyrinth is an indicator of population history and dispersal from Africa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (16), 4128-4133 (2018).
  33. Nagaoka, T., Kawakubo, Y. Using the petrous part of the temporal bone to estimate fetal age at death. Forensic Science International. 248, 188 (2015).
  34. Norén, A., Lynnerup, N., Czarnetzki, A., Graw, M. Lateral angle: A method for sexing using the petrous bone. American Journal of Physical Anthropology. 128 (2), 318-323 (2005).

Tags

Genetik udgave 177 arkæogenetik aDNA knogleprøvetagning retsmedicin DNA-prøveudtagning bioantropologi
Optimerede knogleprøvetagningsprotokoller til hentning af gammelt DNA fra arkæologiske rester
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Parker, C. E., Bos, K. I., Haak, W., … More

Parker, C. E., Bos, K. I., Haak, W., Krause, J. Optimized Bone Sampling Protocols for the Retrieval of Ancient DNA from Archaeological Remains. J. Vis. Exp. (177), e63250, doi:10.3791/63250 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter