Summary
基于INAD蛋白复合物的组装机理，在该方案中，开发了一种修饰的亲和纯化加竞争策略，以纯化内源性 果蝇 TRP通道。
Abstract
果蝇 光转导是已知最快的G蛋白偶联信号通路之一。为了确保该级联反应的特异性和效率，钙（Ca2 +）渗透性阳离子通道瞬时受体电位（TRP）与支架蛋白，失活无后电位D（INAD）紧密结合，并与眼睛特异性蛋白激酶C（ePKC）和磷脂酶Cβ/无受体电位A（PLCβ / NORPA）形成大信号蛋白复合物。然而， 果蝇 TRP通道的生化特性尚不清楚。基于INAD蛋白复合物的组装机理，建立了一种修饰的亲和纯化加竞争策略，以纯化内源性TRP通道。首先，将纯化的组氨酸（His）标记的NORPA 863-1095片段与Ni珠结合并用作诱饵，以从 果蝇 头匀浆中拉下内源性INAD蛋白复合物。然后将过量纯化的谷胱甘肽S-转移酶（GST）标记的TRP 1261-1275片段添加到Ni珠中以与TRP通道竞争。最后，通过尺寸排阻色谱法将上清液中的TRP通道与过量的TRP 1261-1275肽分离。这种方法可以从生化和结构角度研究 果蝇 TRP通道的门控机制。纯化的 果蝇 TRP通道的电生理学特性也可以在未来测量。
Introduction
光转导是吸收的光子被转换成神经元的电码的过程。它专门在脊椎动物和无脊椎动物中中继视蛋白和随后的G蛋白偶联信号级联。在 果蝇中， 通过使用其五个PDZ结构域，支架蛋白灭活无后电位D（INAD）组织了一个超分子信号传导复合物，该复合物由瞬时受体电位（TRP）通道，磷脂酶Cβ/无受体电位A（PLCβ / NORPA）和眼睛特异性蛋白激酶C（ePKC）1组成。这种超分子信号复合物的形成保证了 果蝇 光转导机制的正确亚细胞定位，高效率和特异性。在这种复杂的光敏TRP通道中充当NORPA的下游效应器，并介导钙流入和光感受器的去极化。先前的研究表明， 果蝇 TRP通道的开放是由质子介导的，破坏局部脂质环境，或机械力2，3，4。 果蝇 TRP通道也与钙调蛋白5 相互作用，并通过正反馈和负反馈6，7，8由钙调节。
到目前为止，关于果蝇TRP和TRP样（TRPL）通道的门控机制的电生理学研究是基于切除的膜贴片，来自解离的野生型果蝇光感受器的全细胞记录，以及S2，SF9或HEK细胞2，9，10，11，12，13中的异质表达通道，但不是在纯化通道上。全长果蝇TRP通道的结构信息也尚不清楚。为了研究纯化蛋白质在重构膜环境中的电生理性质并获得全长果蝇TRP通道的结构信息，获得纯化的全长TRP通道是必要的第一步，类似于哺乳动物TRP通道研究中使用的方法14，15，16，17。
近日，基于INAD蛋白复合物18，19，20的组装机理，首次开发了亲和纯化加竞争策略，通过链霉亲和素珠5从果蝇头匀浆中纯化TRP通道。考虑到链霉亲和素微球的低容量和昂贵的成本，这里引入了一种改进的纯化方案，该方案使用His标记的诱饵蛋白和相应的低成本Ni珠，其容量要高得多。该方法有助于从结构角度研究TRP通道的门控机理，并用纯化的蛋白质测量TRP通道的电生理性质。
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Protocol
1. 净化带有商品及服务税标签的关税退税和他标记的诺帕片段
- 纯化 GST 标记的 TRP 1261-1275 片段
- 使用CaCl 2热冲击转化方法21将pGEX 4T-1 TRP 1261-1275质粒10转化为大肠杆菌（大肠杆菌）BL21（DE3）细胞。在10mL卢里亚贝塔尼（LB）培养基中接种单个菌落，并在37°C下生长过夜。 然后，在37°C的1LLB培养基中扩增10mL接种培养物。
- 在细胞的光密度（OD600）达到0.5后，将细胞冷却至16°C并加入0.1mM异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷（IPTG;终浓度）以诱导目标蛋白的过表达并在16°C下孵育18小时。
- 过表达后，通过以3，993× g离心20分钟沉淀1L培养的细胞，并重悬于40mL磷酸盐缓冲盐水（PBS）缓冲液中。
- 将重悬的电池加载到高压均质机中，在4°C下预冷。 缓慢将均质机压力增加到800巴。打开入口水龙头，让重悬的细胞循环通过具有非常窄狭缝的阀门。
注意：电池由大压降和气蚀引起的高剪切力均匀化。 - 将5 mL谷胱甘肽珠子加载到重力流柱中，并用50 mL PBS缓冲液洗涤珠子，共三次。
- 从高压均质机中以48，384× g离心细胞裂解物。将离心细胞裂解物（40mL）的上清液加入重力流柱中平衡的谷胱甘肽珠中，并在4°C下孵育30分钟。 每10分钟重悬谷胱甘肽珠。
- 孵育30分钟后，打开色谱柱出口水龙头以分离磁珠和流过级分。丢弃流过分数。用50 mL PBS缓冲液冲洗剩余的谷胱甘肽珠两次。
- 向谷胱甘肽珠中加入15 mL洗脱缓冲液并孵育30分钟。每10分钟重悬一次珠子。
- 孵育30分钟后，在50 mL锥形管中洗脱GST标记的TRP 1261-1275片段，并在尺寸排阻柱（制备级）中加载，该柱使用50 mM Tri（pH 7.5，100mM NaCl，1mM EDTA，1mM DTT）缓冲液平衡。
- 将尺寸排阻柱的洗脱流速保持在3 mL / min。以5 mL /管的速率收集洗脱的蛋白质。
- 通过分析280nm处的紫外吸收信号，并通过SDS-PAGE凝胶分析（电泳参数：堆叠凝胶为150 V，分离凝胶为200 V）来鉴定尺寸排阻柱中目标蛋白的峰。用考马斯蓝R250染色凝胶。
- 使用在台式冷冻离心机中以3，000× g 离心的15 mL超滤离心柱将纯化的GST标记的TRP 1261-1275片段从尺寸排除柱浓缩至1mL。
- 使用比尔-兰伯特定律确定浓缩蛋白质的浓度。使用分光光度计测量GST标记的TRP 1261-1275片段在280nm处的紫外线吸收。
- 通过将蛋白质序列导入Protparam程序（https://web.expasy.org/protparam/）来获得280nm处的消光系数。通常，1 L培养的GST标记的TRP 1261-1275产生1mL的600μM蛋白质（6×10-7mol ）。所需材料见 表1 。
- 净化他标记的NORPA 863-1095片段
- 使用CaCl 2热冲击转化方法21将pETM.3C NORPA 863-1095质粒20转化为大肠杆菌BL21（DE3）细胞。在10mLLB培养基中接种单个菌落，并在37°C下生长过夜。 然后，在37°C的1L LB培养基中扩增10mL接种培养物。
- 在细胞的OD600 达到0.5后，将细胞冷却至16°C并加入0.1mM IPTG（终浓度）以诱导目标蛋白的过表达，并在16°C下孵育18小时。
- 过表达后，通过以3，993× g离心20分钟沉淀1L培养的细胞，并在40mL结合缓冲液中重悬。接下来，按照步骤1.1.4中所述，将重悬的细胞在4°C的高压均质机中裂解。
- 将5 mL镍珠装入重力流柱中，并用50 mL结合缓冲液洗涤三次。
- 从高压均质机中以48，384× g离心细胞裂解物。将离心细胞裂解物的上清液加入重力流柱中平衡的Ni珠中，并在4°C下孵育30分钟。 每10分钟重悬一次镍珠。
- 孵育30分钟后，打开色谱柱出口水龙头以分离磁珠和流过级分。丢弃流出的馏分，并用50 mL洗涤缓冲液洗涤剩余的镍珠两次。
- 向镍珠中加入15 mL洗脱缓冲液并孵育30分钟。每10分钟重悬一次镍珠。
- 孵育30分钟后，将洗脱的His标记的NORPA 863-1095片段收集在50 mL锥形管中，并加载到尺寸排阻柱（制备级）中，该柱使用50mM Tris（pH 7.5，100mM NaCl，1mM EDTA，1mM DTT）平衡。
- 将尺寸排阻柱的洗脱流速保持在3 mL / min。以5 mL /管的速率收集洗脱的蛋白质。
- 通过分析280nm处的紫外吸收信号，并通过SDS-PAGE凝胶分析（电泳参数：堆叠凝胶为150 V，分离凝胶为200 V）来鉴定尺寸排阻柱中目标蛋白的峰。使用考马斯蓝R250染色凝胶。
- 使用在台式冷冻离心机中以3，000× g 离心的15 mL超滤离心柱将纯化的His标记的NORPA 863-1095片段从尺寸排阻柱浓缩至1mL。
- 使用比尔-兰伯特定律确定浓缩蛋白质的浓度。使用分光光度计测量 His 标记的 NORPA 863-1095 片段在 280 nm 处的紫外线吸收。
- 通过将蛋白质序列导入Protparam程序（https://web.expasy.org/protparam/）来获得280nm处的消光系数。通常，1 L培养的His标记的NORPA 863-1095片段产生1mL的600μM蛋白质（6×10-7mol ）。所需材料见 表2 。
2. 果蝇 头的制备
- 使用CO 2麻醉方法22，23在50 mL锥形离心管中收集成蝇;立即在液氮中冷冻10分钟，并储存在-80°C冰箱中。
- 收集足够数量的苍蝇后，用手用力摇晃冷冻的50 mL锥形管，以分离苍蝇的腿，头部，翅膀和身体。将混合物转移到三个顺序堆叠的预冷不锈钢筛（分别为20/30/40目尺寸）中并摇动筛子。
- 接下来，由于磁头不能通过40目筛，因此使用刷子将飞头从40目筛上扫下，将其转移到50 mL锥形管中，并将其储存在-80°C。
- 连续收集苍蝇及其头部并将其储存在-80°C冰箱中，直到它们达到实验所需的量（0.5g）。通常，要收集0.5 g的头部，需要在50 mL锥形管中收集35 mL苍蝇。所需材料见 表3 。
3. 果蝇 TRP通道净化
- 称取总共0.5克头，并使用预冷的研钵在液氮中完全均质化。将匀浆的头溶解在10x v / w裂解缓冲液（5mL）中，在4°C的振荡器中孵育20分钟，然后在4°C下以20，817× g 离心20分钟。
- 收集旋降式上清液（“20817 g S”， 图4），并在4°C下以100，000× g 进一步离心60分钟。 使用旋降上清液（“100，000 g S”， 图4）进行以下下拉测定。
- 将1 mL镍珠加入重力流柱中，并在4°C下用10mL双蒸馏H2O（ddH2O）洗涤珠子，共三次。在4°C下用10柱体积的裂解缓冲液平衡磁珠三次。
- 将500μL纯化的600μM纯化的His标记的NORPA 863-1095蛋白（3×10-7mol ）加入Ni柱中，并在4°C下孵育30分钟。 每10分钟重悬一次珠子。
- 打开色谱柱出口水龙头，将磁珠和流出分数分开。取流过分数进行SDS页面分析（诺帕F， 图4）。在本节中，诱饵蛋白固定在Ni珠上。
- 在4°C下用10柱体积的裂解缓冲液（10mL）洗涤镍珠，并保持洗涤分数以进行SDS-PAGE分析（洗涤1， 图4A）。重复上述步骤并保留样品以进行SDS-PAGE分析（洗涤2， 图4A）。在本节中，去除了Ni珠上过量的诱饵蛋白。
- 在4°C下离心100，000×g后加入果蝇头匀浆的上清液，其中His标记的NORPA 863-1095片段已被固定。
- 将上清液与Ni珠在4°C下孵育30分钟。每10分钟重悬一次珠子。然后，打开色谱柱出口水龙头以分离磁珠和流过分数。
- 收集用于SDS-PAGE分析的上清液（Dro头裂解F， 图4A）。在本节中，匀浆中的INAD蛋白复合物（INAD / TRP / ePKC）被镍珠上固定的NORPA 863-1095片段捕获。
- 在4°C下用10柱体积的裂解缓冲液（10mL）洗涤镍珠，并保持上清液免受重力沉淀以进行SDS-PAGE分析（洗涤3， 图4A）。重复上述步骤并收集用于SDS-PAGE分析的上清液（洗涤4， 图4A）。在本节中，去除Ni珠上的未结合蛋白质。
- 将500μL600μMG标记的TRP 1261-1275蛋白（3×10-7mol ）加入镍珠中，并在4°C下孵育20分钟。 每10分钟重悬一次珠子。
- 从重力柱中收集洗脱的分数（TRP E1， 图4B），其中包含内源性 果蝇 TRP通道。重复上述步骤并收集洗脱分数（TRP E2， 图4B）。在此步骤中，通过使用GST标记的TRP 1261-1275片段作为竞争对手，从镍珠上捕获的INAD蛋白复合物（INAD / TRP / ePKC）中洗脱TRP通道。
- 用10柱体积的结合缓冲液（10 mL; 表 1）在4°C下收集洗涤分数用于SDS-PAGE分析（洗涤5， 图4B）。
- 向Ni珠中加入500μL洗脱缓冲液（表1），并在4°C下孵育20分钟。 从重力流柱中收集洗脱分数（NORPA E1， 图4B）。重复上述步骤，并收集洗脱分数（NORPA E2， 图4B）。
- 使用洗脱缓冲液，洗脱带有INAD / ePKC蛋白复合物的His标记的NORPA 863-1095片段。接下来，将镍珠重悬于500μL结合缓冲液中。
- 取重悬的镍珠运行SDS-PAGE（由考马斯蓝R250染色）以分析洗脱效率并评估洗脱缓冲液是否有效（磁珠， 图4B）。所需材料见 表4 。
4. 果蝇 TRP通道的尺寸排阻柱纯化
- 在蛋白质纯化系统上安装尺寸排阻柱（分析级）。用色谱柱缓冲液（50 mM 三 HCl pH 7.5，150 mM 氯化钠，2 mM DTT，0.75 mM DDM）平衡色谱柱，该缓冲液通过 0.45 μm 过滤器过滤。
- 使用4mL超滤离心柱从步骤3.14浓缩TRP E1和E2级分，在4°C下以3，000× g 在冷冻离心机中离心。
- 用色谱柱缓冲液冲洗样品循环，并将样品加载到样品循环中。将样品注入大小排阻柱，并以适当的流速（0.5 mL / min）洗脱蛋白质。
- 通过在280nm处的吸收鉴定目标蛋白的峰，并运行SDS-PAGE凝胶以检测纯化的内源性 果蝇 TRP通道（图5）。所需材料见 表5 。
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Representative Results
在本文中，演示了一种纯化内源性 果蝇 TRP通道的蛋白质纯化方法（图1）。
首先，应用重组蛋白表达和纯化来获得诱饵和竞争蛋白。然后，将GST标记的TRP 1261-1275片段在LB培养基的大 肠杆菌 BL21（DE3）细胞中表达，并使用谷胱甘肽珠和尺寸排阻柱纯化（图2）。使用考马斯蓝R250染色的SDS-PAGE分析对样品进行了验证。在SDS-PAGE样品制备过程中，将30μL蛋白质样品与10μL4x上样染料混合，并在100°C下煮沸10分钟。然后，将15μL煮沸的样品单独上样到每个孔中。His标记的NORPA 863-1095片段在LB培养基的大 肠杆菌 BL21（DE3）细胞中也类似地表达，并通过Ni珠和尺寸排阻柱纯化（图3）。浓缩纯化的GST标记的TRP 1261-1275和His标记的NORPA 863-1095用于纯化内源性 果蝇 TRP通道。
其次，使用预冷的研钵在液氮中收集 果蝇 头并均质化，然后溶解在10x v / w裂解缓冲液中（表4）。将溶解的头部匀浆在4°C的振荡器中孵育20分钟，并在4°C下以20，817× g 离心20分钟。 收集离心下清液（20817 g S， 图4A）并在4°C下以100，000× g 进一步离心60分钟。 第二个旋降上清液（100，000 g S， 图4A）用于随后的下拉测定。
最后，基于下拉和竞争法的原理，采用亲和纯化加竞争策略对内源性TRP通道进行纯化。纯化的His标记的NORPA 863-1095片段与Ni珠结合并用作诱饵，从 果蝇 头匀浆中拉下内源性INAD蛋白复合物。然后，添加过多纯化的GST标记的TRP 1261-1275片段，以竞争来自Ni珠上捕获的INAD配合物的TRP通道（TRP E1，TRP E2， 图4B）。最后，通过尺寸排阻色谱法将洗脱的TRP通道与过量的GST标记的TRP 1261-1275肽分离（图5）。在SDS-PAGE样品制备过程中，将30μL蛋白质样品与10μL4x上样染料混合，并在100°C下煮沸10分钟。然后，将15μL样品单独上样到每个孔中。作为副产物，INAD-ePKC-NORPA 863-1095 配合物也可以通过在 TRP 1261-1275 肽竞争后洗脱镍珠来获得（NORPA E1、NORAP E2， 图 4B）。使用这种方法，来自0.5g飞头的最终纯化的 果蝇 TRP通道的典型产量为50μL 3μM TRP蛋白（1.5×10-10 摩尔）。如果需要更多纯化的TRP通道，请相应地增加飞头，镍珠，诱饵蛋白和竞争对手的数量。
图1：用于纯化内源性 果蝇 TRP通道的示意图 （A）纯化的His标记NORPA 863-1095蛋白固定在Ni珠上。（B） 果蝇 头均质化，并将离心100，000× g 后的旋降上清液添加到NORPA结合的镍珠中，其中NORPA 863-1095蛋白作为诱饵捕获内源性INAD蛋白复合物（INAD/TRP/ePKC）。（C）添加GST标记的TRP 1261-1275片段以竞争来自捕获的INAD蛋白复合物的内源性 果蝇 TRP通道。（D）通过尺寸排阻柱进一步纯化洗脱的TRP蛋白，以分离过多的GST标记的TRP 1261-1275片段。红色箭头分别突出显示 TRP 通道和 GST 标记的 TRP 1261-1275 片段的洗脱位置。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：通过谷胱甘肽磁珠和大小排阻色谱纯化 GST 标记的 TRP-CT 1261-1275 蛋白。将馏分收集在5 mL /管中。收集箭头位置（管44-48）处的馏分并浓缩用于内源性TRP通道的以下纯化。（B）考马斯蓝R250染色的SDS-PAGE凝胶在谷胱甘肽珠亲和纯化和随后的尺寸排阻柱纯化中显示了GST标记的TRP 1261-1275片段。箭头突出显示了 SDS-PAGE 凝胶中 GST 标记的 TRP 1261-1275 片段的位置。缩写：P：来自 大肠杆菌的颗粒。 BL21（DE3）细胞裂解物在PBS缓冲液中均质化并以48，384× g离心后;S：来自 大肠杆菌的 上清液。BL21（DE3）细胞裂解物在48，384× g下均质和离心后;F：在4°C下与谷胱甘肽珠一起孵育30分钟后，流过级分;W1和W2：第一和第二洗涤分数由10列体积的PBS缓冲液;B：用SDS-PAGE凝胶分析重悬谷胱甘肽珠上未洗脱的蛋白质，评价洗脱效率;E：通过洗脱缓冲液从谷胱甘肽珠中洗脱分数。用于GST标记的蛋白质纯化的缓冲液配方在 表1中描述。 请点击此处查看此图的大图。
图3：通过Ni珠和尺寸排阻色谱纯化His标记的NORPA 863-1095蛋白。流速 = 3 毫升/分钟将馏分收集在5 mL /管中。收集箭头位置（管44-49）处的馏分并浓缩用于内源性TRP通道的以下纯化。（B）考马斯蓝R250染色的SDS-PAGE凝胶在Ni柱纯化和随后的尺寸排阻柱纯化中显示His标记的NORPA 863-1095蛋白。箭头突出显示了他标记的NORPA 863-1095蛋白在SDS-PAGE凝胶中的位置。缩写：P：来自大肠杆菌的颗粒。BL21（DE3）细胞裂解物在结合缓冲液中均质化并在48，384×g下离心后;S：来自大肠杆菌的上清液部分。BL21（DE3）细胞裂解物在48，384×g下均质和离心后;F：将前一个S级分与Ni珠在4°C下孵育30分钟后的流出级分;W1和W2：第一和第二洗涤分数由10列体积的洗涤缓冲液;B：洗脱后重悬的Ni珠上的未洗脱蛋白质;E：通过洗脱缓冲液从Ni珠中洗脱级分。用于His标记蛋白纯化的缓冲液配方列于表2中。请点击此处查看此图的大图。
图4：内源性 果蝇 TRP通道的纯化。 通过SDS-PAGE分析每一步收集的样品，并用考马斯蓝R-250染料染色。（A）20817g S：20，817× g 离心后头部的上清液部分均质化;NORPA F：在His标记的NORPA 863-1095片段结合后的镍珠的流过分数;Wash1和Wash2：将Ni珠的第一和第二洗涤级分通过裂解缓冲液与His标记的NORPA 863-1095结合后;100，000 g S：将先前的20，817g S上清液进一步离心至100，000× g ，并收集上清液用于SDS-PAGE;Dro头裂解F：与100，000g S样品孵育后的Ni珠的流过分数;Wash3 和 Wash4：在与 100，000 g S 样品孵育后，通过裂解缓冲液洗涤镍珠组分。（B） TRP E1和E2：由GST标记的TRP 1261-1275片段洗脱的第一和第二个TRP通道分数;Wash5：通过GST标记的TRP 1261-1275进行竞争后通过结合缓冲液洗涤镍珠的部分;诺帕E1和E2：带有捕获的INAD /ePKC配合物的His标记的NORPA 863-1095片段的第一和第二洗脱分数;磁珠：洗脱缓冲液处理后留在重悬的Ni珠中的未洗脱蛋白。内源性 果蝇 TRP通道纯化的缓冲液配方在 表4中描述。 请点击此处查看此图的大图。
图5：通过尺寸排阻色谱纯化内源性 果蝇 TRP通道蛋白。 （A）大小排阻柱中内源性 果蝇 TRP通道蛋白的纯化谱。流速 = 0.5 毫升/分钟以0.5 mL /管收集馏分。收集箭头位置（1E8-1F2）处的馏分并浓缩。（B）考马斯蓝R-250染色SDS-PAGE凝胶显示尺寸排阻柱纯化后的内源性 果蝇 TRP通道蛋白。纯化的内源性 果蝇 TRP通道蛋白的位置由红色箭头突出显示。 请点击此处查看此图的大图。
表1：纯化GST标记的TRP 1261-1275片段所需的材料。请按此下载此表格。
表2：提纯His标记的NORPA 863-1095片段所需的材料。请按此下载此表格。
表3：制备 果蝇 头所需的材料 ，请点击此处下载此表。
表4：果蝇TRP通道纯化所需的材料，请点击此处下载此表。
表5：果蝇TRP通道的尺寸排阻柱纯化所需的材料请点击此处下载此表。
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Discussion
INAD包含五个PDZ域，是 果蝇 光转导机制的核心组织者。先前的研究表明，INAD PDZ3与TRP通道C端尾部结合，具有精细的特异性（KD = 0.3μM）18。INAD PDZ45串联与具有极高结合亲和力（KD = 30 nM）的NORPA 863-1095片段相互作用。这些发现为设计亲和纯化加竞争策略提供了坚实的生化基础，使NORPA CC-PBM片段可用作下拉诱饵，而TRP C末端尾部（片段1261-1275）可用作竞争试剂。因此，这种方法的第一个关键点是了解INAD复合物的组装机理，并获得足够的NORPA和TRP片段。同时，由于TRP通道是需要从膜中提取并在溶液中稳定下来的膜蛋白，因此洗涤剂的使用是该方法的第二个关键点。作为用于TRP通道24，25的结构和功能研究的常用洗涤剂，该方法中使用了n-十二烷基-B-D-马尔托糖苷（DDM）。如果纯化结果不尽如人意，则需要仔细检查诱饵蛋白、竞争对手蛋白和洗涤剂的质量。此外，TRP通道的提取效率可以通过使用TRP抗体的蛋白质印迹来追踪。
在之前的一项研究5中，昂贵的链霉亲和素珠用于从飞头提取物中纯化TRP通道，这限制了实验室的常规纯化。因此，通过使用His标记的NORPA 863-1095片段与Ni珠结合来改进该方法，以降低成本并提高产量。目前，在改进的方法中纯化的TRP通道的收率足以进行透射电子显微镜（TEM）负染色实验，其中纯化的TRP通道形成四聚体（数据未显示），表明纯化过程不会破坏TRP通道的四聚体形成。因此，该协议可能适用于未来的冷冻电镜和电生理学实验。
然而，由于实验中使用的竞争对手（NORPA 863-1095片段，TRP 1261-1275片段）与野生型蛋白质具有相似的结合亲和力，因此这种方法的局限性在于必须使用大量竞争性蛋白质和珠子来拉低目标蛋白质。对于无法大规模纯化诱饵的实验室来说，这将是不方便的。
这种方法的潜在未来应用将是使用冷冻电镜技术研究 果蝇 TRP通道的结构信息。此外，测量人工双层脂质膜中纯化的内源性TRP通道的电生理性质也是可行的。此外，在这个重构的模型系统中，通过调节INAD复合物组合物和脂质组合物来表征纯化的内源性TRP通道的电生理性质将是有趣的。最后，结合结构信息和电生理特性，未来可以仔细研究TRP通道的门控和调节机制。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
本研究由国家自然科学基金（no.31870746）、深圳市基础研究基金（JCYJ20200109140414636）和广东省自然科学基金（编号：2021A1515010796）资助。我们感谢LetPub（www.letpub.com）在编写本手稿期间提供的语言帮助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacterial strains | |||
| BL21(DE3) Competent Cells | Novagen | 69450 | Protein overexpression |
| Experiment models | |||
| D.melanogaster: W1118 strain | Bloomington Drosophila Stock Center | BDSC:3605 | Drosophila head preparation |
| Material | |||
| 20/30/40 mesh stainless steel sieves | Jiufeng metal mesh company | GB/T6003.1 | Drosophila head preparation |
| 30% Acrylamide-N,N′-Methylenebisacrylamide(29:1) | Lablead | A3291 | SDS-PAGE gel preparation |
| Ammonium Persulfate | Invitrogen | HC2005 | SDS-PAGE gel preparation |
| Cocktail protease inhibitor | Roche | 05892953001 | Protease inhibitor |
| Coomassie brilliant blue R-250 | Sangon Biotech | A100472-0025 | SDS-PAGE gel staining |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sangon Biotech | A620058-0100 | Size-exclusion column buffer preparation |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA) | Sangon Biotech | A500838-0500 | Size-exclusion column buffer preparation |
| Glycine | Sangon Biotech | A610235-0005 | SDS-PAGE buffer preparation |
| Glutathione Sepharose 4 Fast Flow beads | Cytiva | 17513202 | Affinity chromatography |
| Imidazole | Sangon Biotech | A500529-0001 | Elution buffer preparation for Ni-column |
| Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sangon Biotech | A600168-0025 | Induction of protein overexpression |
| LB Broth Powder | Sangon Biotech | A507002-0250 | E.coli. cell culture |
| L-Glutathione reduced (GSH) | Sigma-aldrich | G4251-100G | Elution buffer preparation for Glutathione beads |
| Ni-Sepharose excel beads | Cytiva | 17371202 | Affinity chromatography |
| N-Dodecyl beta-D-maltoside (DDM) | Sangon Biotech | A610424-001 | Detergent for protein purification |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-aldrich | T9281-100ML | SDS-PAGE gel preparation |
| PBS | Sangon Biotech | E607008-0500 | Homogenization buffer for E.coli. cell |
| PMSF | Lablead | P0754-25G | Protease inhibitor |
| Prestained protein marker | Thermo Scientific | 26619/26616 | Prestained protein ladder |
| Size exclusion column (preparation grade) | Cytiva | 28989336 | HiLoad 26/60 Superdex 200 PG column |
| Size exclusion column (analytical grade) | Cytiva | 29091596 | Superose 6 Increase 10/300 GL column |
| Sodium chloride | Sangon Biotech | A501218-0001 | Protein purification buffer preparation |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sangon Biotech | A500228-0001 | SDS-PAGE gel/buffer preparation |
| Tris base | Sigma-aldrich | T1503-10KG | Protein purification buffer preparation |
| Ultrafiltration spin column | Millipore | UFC901096/801096 | Protein concentration |
| Equipment | |||
| Analytical Balance | DENVER | APX-60 | Metage of Drosophila head |
| Desk-top high-speed refrigerated centrifuge for 15mL and 50mL conical centrifugation tubes | Eppendorf | 5810R | Protein concentration |
| Desk-top high-speed refrigerated centrifuge 1.5mL centrifugation tubes | Eppendorf | 5417R | Centrifugation of Drosophila head lysate after homogenization |
| Empty gravity flow column (Inner Diameter=1.0cm) | Bio-Rad | 738-0015 | TRP protein purification |
| Empty gravity flow column (Inner Diameter=2.5cm) | Bio-Rad | 738-0017 | Bait and competitor protein purification from E.coli. |
| Gel Documentation System | Bio-Rad | Universal Hood II Gel Doc XR System | SDS-PAGE imaging |
| High-speed refrigerated centrifuge | Beckman coulter | Avanti J-26 XP | Centrifugation of E.coli. cells/cell lysate |
| High pressure homogenizer | UNION-BIOTECH | UH-05 | Homogenization of E.coli. cells |
| Liquid nitrogen tank | Taylor-Wharton | CX-100 | Drosophila head preparation |
| Protein purification system | Cytiva | AKTA purifier | Protein purification |
| Refrigerator (-80°C) | Thermo | 900GP | Drosophila head preparation |
| Spectrophotometer | MAPADA | UV-1200 | OD600 measurement of E.coli. cells |
| Spectrophotometer | Thermo Scientific | NanoDrop 2000c | Determination of protein concentration |
| Ultracentrifuge | Beckman coulter | Optima XPN-100 Ultracentrifuge | Ultracentrifugation |
References
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