Summary
Cet article rapporte une inhibition in vivo de la CENP-E par chirurgie abdominale et injection testiculaire de GSK923295, un modèle précieux pour la division méiotique masculine. En utilisant les tests d’immunofluorescence, de cytométrie en flux et de microscopie électronique à transmission, nous montrons que l’inhibition de la CENP-E entraîne un désalignement chromosomique et une instabilité du génome dans les spermatocytes de souris.
Abstract
Chez les eucaryotes, la méiose est essentielle à la stabilité du génome et à la diversité génétique dans la reproduction sexuée. Les analyses expérimentales des spermatocytes dans les testicules sont essentielles pour les recherches sur l’assemblage du fuseau et la ségrégation chromosomique dans la division méiotique masculine. Le spermatocyte de souris est un modèle idéal pour les études mécanistes de la méiose, cependant, les méthodes efficaces pour les analyses des spermatocytes font défaut. Dans cet article, une méthode pratique et efficace pour l’inhibition in vivo de la kinésine-7 CENP-E dans les spermatocytes de souris est décrite. Une procédure détaillée pour l’injection testiculaire d’un inhibiteur spécifique GSK923295 par chirurgie abdominale chez des souris âgées de 3 semaines est présentée. En outre, une série de protocoles pour la collecte et la fixation des tissus, la coloration à l’hématoxyline-éosine, l’immunofluorescence, la cytométrie en flux et la microscopie électronique à transmission sont décrites ici. Nous présentons ici un modèle d’inhibition in vivo via la chirurgie abdominale et l’injection testiculaire, qui pourrait être une technique puissante pour étudier la méiose masculine. Nous démontrons également que l’inhibition de la CENP-E entraîne un désalignement chromosomique et un arrêt de métaphase dans les spermatocytes primaires au cours de la méiose I. Notre méthode d’inhibition in vivo facilitera les études mécanistes de la méiose, servira de méthode utile pour les modifications génétiques des lignées germinales mâles et mettra en lumière de futures applications cliniques.
Introduction
La méiose est l’un des événements les plus importants, les plus rigides et les plus conservés de l’évolution dans les organismes eucaryotes, et elle est essentielle à la gamétogenèse, à la reproduction sexuée, à l’intégrité du génome et à la diversité génétique 1,2,3. Chez les mammifères, les cellules germinales subissent deux divisions cellulaires successives, la méiose I et II, après un seul cycle de réplication de l’ADN. Contrairement aux chromatides sœurs en mitose, les chromosomes homologues dupliqués s’apparient et se séparent en deux cellules filles au cours de la méiose I 4,5. Dans la méiose II, les chromatides sœurs se séparent et se séparent pour former des gamètes haploïdes sans réplication de l’ADN6. Des erreurs dans l’une ou l’autre des deux divisions méiotiques, y compris les défauts d’assemblage du fuseau et la déségrégation chromosomique, peuvent entraîner la perte de gamètes, des syndromes de stérilité ou d’aneuploïdie 7,8,9.
Des études de plus en plus nombreuses ont montré que les moteurs de la famille des kinésines jouent un rôle crucial dans la régulation de l’alignement et de la ségrégation chromosomiques, de l’assemblage du fuseau, de la cytocinèse et de la progression du cycle cellulaire dans les cellules mitotiques et méiotiques10,11,12. Kinesin-7 CENP-E (protéine Centromère E) est un moteur kinétochore dirigé vers une extrémité plus nécessaire à la congression des chromosomes, au transport et à l’alignement des chromosomes, et à la régulation du point de contrôle de l’assemblage du fuseau dans la mitose 13,14,15,16,17,18. Au cours de la méiose, l’inhibition de la CENP-E par l’inhibiteur spécifique GSK923295 entraîne l’arrêt du cycle cellulaire, le désalignement chromosomique, la désorganisation du fuseau et l’instabilité du génome dans les cellules spermatogènes19. Les schémas de localisation et la dynamique de la CENP-E aux centromères des spermatocytes en division indiquent que la CENP-E interagit avec les protéines kinétochores pour l’assemblage séquentiel des centromères au cours de la méiose I20,21. Dans les ovocytes, CENP-E est nécessaire pour l’alignement chromosomique et l’achèvement de la méiose I13,22,23. L’injection d’anticorps ou de morpholino de CENP-E entraîne un désalignement des chromosomes, une orientation anormale des kinétochores et un arrêt de la méiose I dans les ovocytes de souris et de drosophile 23. Par rapport aux rôles essentiels de la CENP-E dans la mitose, les fonctions et les mécanismes de la CENP-E dans la méiose restent largement inconnus. Les mécanismes détaillés de la CENP-E dans la conférence chromosomique et la stabilité du génome dans les cellules méiotiques mâles restent à clarifier.
La spermatogenèse est un processus physiologique complexe et de longue durée, impliquant la prolifération séquentielle de la spermatogonie, la méiose et la spermiogenèse. Par conséquent, l’ensemble du processus est extraordinairement difficile à reproduire in vitro chez les mammifères et d’autres espèces24,25. Il est impossible d’induire la différenciation des spermatocytes après le stade pachytène in vitro. Les études sur les divisions méiotiques masculines ont généralement été limitées à des analyses expérimentales de la prophase méiotique précoce25,26. Malgré de nombreux efforts technologiques, y compris la culture à court terme des spermatocytes27,28 et les méthodes de culture d’organes25, il existe peu de méthodes efficaces pour étudier la division méiotique masculine. De plus, la délétion génétique de gènes essentiels entraîne généralement un arrêt du développement et une létalité embryonnaire. Par exemple, les embryons de souris dépourvus de CENP-E ne parviennent pas à s’implanter et ne peuvent pas développer une implantation passée29, ce qui constitue un obstacle dans les études mécanistes de la CENP-E dans la méiose. Pris ensemble, l’établissement d’un système pratique et réalisable pour étudier la division méiotique masculine peut grandement promouvoir le domaine de recherche de la méiose.
L’inhibiteur perméable aux petites cellules est un outil puissant pour étudier les moteurs de kinésine dans la division cellulaire et les processus de développement. L’inhibiteur allostérique, GSK923295, se lie spécifiquement au domaine moteur CENP-E, bloque la libération d’ADP (adénosine diphosphate), et stabilise finalement les interactions entre CENP-E et les microtubules30. Dans cette étude, un modèle murin d’inhibition in vivo est présenté par chirurgie abdominale et injection testiculaire de GSK923295. L’inhibition de la CENP-E entraîne un désalignement chromosomique dans la métaphase I des spermatocytes primaires. De plus, l’inhibition de la CENP-E entraîne l’arrêt méiotique des spermatocytes et la perturbation de la spermatogenèse. Une série de protocoles sont décrits pour les analyses des spermatocytes et peuvent être appliqués pour observer les microtubules du fuseau méiotique, les chromosomes homologues et les organites subcellulaires dans les spermatocytes. Notre méthode d’inhibition in vivo est une méthode efficace pour les études de la division méiotique et de la spermatogenèse.
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Protocol
Toutes les expériences sur les animaux ont été examinées et approuvées par le Comité de soin et d’utilisation des animaux de l’Université médicale du Fujian (numéro de protocole SYXK 2016-0007). Toutes les expériences sur les souris ont été effectuées conformément aux directives pertinentes du Care and Use of Laboratory Animals des National Institutes of Health (NIH publications numéro 8023, révisé en 1978).
1. Construction de modèles murins d’inhibition CENP-E médiés par GSK923295
- Stériliser les instruments chirurgicaux à 121 °C pendant 30 min. Irradier l’établi chirurgical ultra-propre avec des ultraviolets-C (UVC) pendant 2 h. Pesez les souris mâles de 3 semaines ICR (Institute of Cancer Research) utilisées pour les expériences et calculez les doses d’anesthésique nécessaires.
- Anesthésier les souris en administrant une combinaison de kétamine (100 mg/kg) et de xylazine (10 mg/kg) par injection intrapéritonéale. Vérifiez la profondeur de l’anesthésie des souris grâce à une combinaison de réflexe cornéen de souris, de réflexe nociceptif, de respiration et de tonus musculaire. Confirmez que les souris sont profondément anesthésiées.
REMARQUE : Placez l’animal sur un coussin chauffant pour fournir un soutien thermique pendant la chirurgie. - Attachez les membres de la souris et fixez-les sur le plateau de cire. Placez une goutte de pommade vétérinaire sur les yeux de souris pour prévenir la sécheresse sous anesthésie. Rasez les poils abdominaux de la souris du bas-ventre au scrotum à l’aide d’un rasoir animal expérimental. Fixez la zone chirurgicale avec un champ stérile.
- Désinfectez l’abdomen ventral avec un gommage à la bétadine suivi de trois fois d’éthanol à 75%. Ouvrez la cavité abdominale à l’aide d’un scalpel stérile et faites une ouverture de <5 mm.
- Serrez la peau avec des pinces chirurgicales stériles et tirez le coussinet adipeux épididymaire avec une pince à dissection stérile pour localiser les testicules à l’aide d’une pince à épiler stérile. Fixez le testicule avec une pince stérile sous un stéréoscope et injectez lentement 10 μL de GSK923295 dans les tubules séminifères à une concentration finale de 10 μM en utilisant 10 μL de rhéodyne30. Pour la construction du groupe témoin, injecter 10 μL de solution de DMSO (diméthylsulfoxyde)/PBS (solution saline tamponnée au phosphate) à 1 %.
NOTE: Conserver la solution GSK923295 à une concentration de 10 mM à -80 °C. Dissoudre 0,1 μL de 10 mM GSK923295 dans 100 μL de solution PBS pour préparer les 10 μM de GSK923295 solution. - Repoussez doucement le testicule dans la cavité abdominale avec des pinces chirurgicales stériles. Suturer le péritoine et la peau séparément avec deux à quatre points de suture en utilisant la ligne de suture d’un diamètre de 0,1 mm.
- Étiquetez un endroit de 3 x 3 mm sur le dos de l’animal avec un marqueur permanent après une chirurgie abdominale, remettez la souris dans la cage d’alimentation et assurez-vous d’un environnement propre et exempt d’agents pathogènes avec suffisamment de nourriture et d’eau.
- Gardez l’environnement dans un état stérile grâce à l’air filtré, aux aliments stérilisés et à l’eau. Prenez soin de l’animal jusqu’à ce qu’il ait retrouvé suffisamment de conscience pour maintenir une position couchée sternale. Pour l’analgésie postopératoire, administrer une dose de buprénorphine (0,1 mg/kg) par voie sous-cutanée toutes les 12 heures pendant 3 jours. Assurez-vous que la souris n’est pas retournée en compagnie d’autres animaux jusqu’à ce qu’elle soit complètement rétablie.
REMARQUE: Les souris reçoivent des soins postopératoires et administrent une anesthésie locale appropriée à la plaie en utilisant 0,5% de lidocaïne pour réduire la douleur postopératoire si nécessaire.
2. Coloration et histopathologie de l’hématoxyline-éosine (HE)
- Quatre jours après la chirurgie abdominale, euthanasier les souris avec du CO 2 à un débit de 2 L/min dans une chambre de CO2. Confirmer la mort par luxation cervicale comme méthode de confirmation de l’euthanasie. Utilisez des ciseaux chirurgicaux pour ouvrir le scrotum et enlever les testicules avec une pince. Prélever les testicules de souris 4 jours après GSK923295 injection et les fixer dans 30 ml de solution de formaldéhyde à 10% à température ambiante pendant 12 h.
- Pour la déshydratation par gradient, incuber séquentiellement l’échantillon dans 40 mL d’éthanol à 70 % pendant 1 h, dans 40 mL d’éthanol à 85 % pendant 1 h, dans 40 mL d’éthanol à 95 % pendant 1 h et dans 40 mL d’éthanol à 100 % pendant 1 h.
- Incuber l’échantillon dans 40 mL de xylène pendant 40 min, puis dans 40 mL de paraffine pendant 1 h à 65 °C. Placez les mouchoirs au fond de la boîte d’intégration. Ajouter la paraffine fondue dans la boîte d’intégration. Refroidir les tissus pour une solidification complète à 4 °C pendant 6 h.
- Fixez les échantillons sur le support de l’ultramicrotome, maintenez l’angle entre les échantillons et la surface du couteau à 5-10° et ajustez l’épaisseur de la tranche à 5 μm. Préparer les profilés de 5 μm d’épaisseur à l’aide d’un ultramicrotome, étaler les lames dans un bain-marie à 40 °C et sécher les profilés dans un séchoir à lames pendant 12 h à 37 °C.
- Incuber les lames dans 200 mL de xylène pendant 40 min, dans 200 mL d’éthanol à 100% pendant 6 min, dans 200 mL d’éthanol à 95% pendant 2 min, dans 200 mL d’éthanol à 90% pendant 2 min, dans 200 mL d’éthanol à 80% pendant 2 min, et dans 200 mL d’éthanol à 70% pendant 2 min, respectivement.
- Rincer les lames à l’eau distillée pendant 5 min et les colorer avec la solution d’hématoxyline de Mayer pendant 6 min à température ambiante.
REMARQUE : Solution d’hématoxyline de Mayer : 0,011 mol/L d’hématoxyline, 6,7 % d’éthanol anhydre, 0,646 mol/L de sulfate d’aluminium et de potassium et 0,003 mol/L d’iodate de sodium. - Rincer les lames à l’eau courante pendant 5 min et incuber avec de l’eau distillée pendant 2 min.
- Incuber les lames dans du chlorhydrate d’éthanol à 1% pendant 3 s, puis les rincer à l’eau courante pendant 2 min.
- Colorer l’échantillon avec 1% d’éosine pendant 15 s, puis les incuber avec de l’éthanol à 95% pendant 5 s, avec 100% d’éthanol pendant 2 min et dans du xylène pendant 40 min.
- Scellez les lames à l’aide de 15 μL de gomme neutre et de la glissière de couverture de 24 x 50 mm.
3. Immunofluorescence et microscopie confocale
- Recueillir les sections de paraffine de 5 μm d’épaisseur des testicules de souris pour l’immunofluorescence. Incuber les lames dans du xylène pendant 40 min, dans de l’éthanol à 100% pendant 6 min, dans de l’éthanol à 95% pendant 2 min, dans de l’éthanol à 90% pendant 2 min, dans de l’éthanol à 80% pendant 2 min, et dans de l’éthanol à 70% pendant 2 min. Rincer les lames à l’eau distillée pendant 5 min et rincer les lames avec 0,01 M PBS pendant 5 min.
- Placer les lames dans la solution de récupération de l’antigène (tampon de citrate 0,01 M) et faire bouillir sous haute pression à l’aide d’un autocuiseur pendant 4 minutes pour le prélèvement de l’antigène. Refroidir les lames naturellement à température ambiante. Rincer deux fois à l’eau distillée pendant 5 min et au PBS pendant 5 min.
NOTE: 0,01 M tampon de citrate (pH 6,0): 2,1 mmol / L d’acide citrique, 11,6 mmol / L de citrate trisodique dihydraté. - Perméabiliser les cellules en incubant les lames dans 500 μL de TritonX-100/PBS à 0,25% pendant 10 min. Rincer les lames avec du PBS pendant 5 min trois fois.
- Pour le blocage de l’antigène, incuber les échantillons avec 300 μL d’albumine sérique bovine (BSA)/PBST à 3 % (0,1 % de Tween-20 dans le PBS) pendant 1 h. Incuber les échantillons avec les anticorps primaires dans 3% BSA/PBST pendant 16 h à 4 °C. Mettez les lames dans une boîte humidifiée pour éviter que les tissus ne se dessèchent. Réchauffer les lames naturellement à température ambiante pendant 30 min.
- Jetez l’anticorps primaire, puis rincez les lames dans PBST pendant 5 minutes trois fois. Diluer les anticorps secondaires dans 3% BSA/PBST. Incuber les échantillons avec des anticorps secondaires pendant 1-2 h à 37 °C. Rincer les échantillons dans PBST pendant 5 min cinq fois.
- Colorer les noyaux avec 50 μL de 4', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) pendant 5 min à température ambiante. Montez le couvercle avec le support de montage anti-décoloration et scellez le couvercle avec du vernis à ongles.
- Observez et enregistrez les signaux fluorescents dans les lames à l’aide d’un microscope fluorescent équipé d’un objectif NA 40x/ 0.75.
4. Cytométrie de flux
- Recueillir les testicules de souris dans des boîtes de Petri de 6 cm et couper les testicules en morceaux de 1 mm3 à l’aide de ciseaux chirurgicaux.
- Digérer les testicules à l’aide de 1 mL de collagénase à 1 % dans un tube à centrifuger de 1,5 mL pendant 10 min à 37 °C, puis centrifuger les échantillons à 1 000 x g pendant 5 min pour précipiter les cellules spermatogènes.
- Jeter le surnageant, puis ajouter 1 mL de solution de trypsine-EDTA (acide éthylène diamine tétraacétique) à 0,25 % pendant 20 min à 37 °C, puis centrifuger les échantillons à 1 000 x g pendant 5 min.
- Jeter le surnageant, puis incuber les cellules précipitées avec 1 mL d’éthanol froid à 70 % pendant plus de 8 h à 4 °C.
- Centrifuger les échantillons à 1 000 x g pendant 5 min, puis recueillir les sédiments cellulaires. Colorer les cellules spermatogènes avec une solution de coloration à 500 μL d’iodure de propidium (PI) (50 μg/mL PI, 100 μg/mL de RNase A et 0,2 % de Triton X-100 dans du PBS) à 37 °C pendant 30 min.
REMARQUE: Secouez doucement le tube de centrifugation toutes les 5 minutes pour éviter les agrégations cellulaires. - Filtrer les échantillons à l’aide d’un écran à 300 mailles pour éliminer les débris cellulaires; recueillir les cellules dans un tube d’écoulement et les stocker à 4 °C.
- Détecter les signaux de fluorescence et la diffusion de la lumière à la longueur d’onde d’excitation de 488 nm à l’aide d’un cytomètre en flux. Analysez le contenu de l’ADN et la diffusion de la lumière à l’aide du logiciel Modfit MFLT32.
5. Microscopie électronique à transmission
- Couper les testicules en morceaux de 1 mm3 à l’aide du scalpel tranchant, et incuber rapidement les échantillons avec une solution de glutaraldéhyde-1,5% de paraformaldéhyde dans 0,1 M PBS (pH 7,2) pendant 4 h à 4 °C pour éviter les changements d’ultrastructure. Rincer les échantillons avec 0,1 M PBS pendant 5 min trois fois.
REMARQUE: Le scalpel et les ciseaux doivent être tranchants et essayer d’éviter la compression et la traction artificielles. Le traitement des échantillons doit être effectué dans le fluide de fixation. - Fixer les échantillons dans une solution de ferrocyanure de potassium à 1 % d’acide osmique à 1,5 % à 4 °C pendant 1,5 h. Sécher l’eau avec du papier filtre et rincer les échantillons avec 0,1 M PBS pendant 5 min trois fois.
- Déshydrater les échantillons dans 40 mL d’éthanol à 50 % pendant 10 min à 4 °C. Incuber les échantillons dans 40 mL de colorant d’acétate d’uranium saturé à 70 % d’éthanol à 4 °C pendant 12 h, dans 40 mL d’éthanol à 90 % pendant 10 min à 4 °C, dans 40 mL d’éthanol-acétone à 90 % pendant 10 min à température ambiante et dans 40 mL d’acétone anhydre pendant 10 min trois fois à température ambiante.
- Incuber les échantillons dans un mélange d’agents d’enrobage acétone-époxy anhydre 618 (v / v = 1:1) pendant 1,5 h, puis incorporer les échantillons dans des agents d’enrobage de résine époxy 618 à 35 °C pendant 3 h.
- Pour la polymérisation de la résine, incuber les échantillons dans des agents d’enrobage de résine époxy 618 à 35 °C pendant 12 h, à 45 °C pendant 12 h, puis à 60 °C pendant 24 h.
- Installez les échantillons et le couteau en verre, puis ajustez les distances entre les échantillons et le couteau. Préparez les sections ultra-minces de 90 nm d’épaisseur à l’aide d’un microtome ultra-mince. Tranchez les échantillons à une vitesse constante, puis placez les lames sur un treillis de nickel. Placez les lames dans une boîte de Petri à température ambiante.
- Colorer les lames avec de l’acétate d’uranyle à 2% pendant 10 min, puis colorer les échantillons avec du citrate de plomb à 2% pendant 10 min. Rincer les lames à l’eau distillée. Sécher les lames pendant 24 h à température ambiante.
- Observez les lames et enregistrez des images électroniques à 70-100 kV à l’aide d’un microscope électronique à transmission.
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Representative Results
Nous avons construit avec succès un modèle in vivo d’inhibition du CENP-E de testicules de souris par chirurgie abdominale et injection testiculaire de GSK92329519. Les principales étapes techniques de cette méthode sont illustrées à la figure 1. Après injection testiculaire de GSK923295 pendant 4 jours, les testicules ont été prélevés pour d’autres analyses. Dans le groupe témoin, l’onde spermatogène dans les tubules séminifères était régulière et organisée (Figure 2A). Cependant, dans le groupe GSK923295, l’onde spermatogène a été modifiée dans les tubules séminifères, et les spermatocytes primaires arrêtés en métaphase ont été significativement augmentés après l’inhibition de la CENP-E (Figure 2B-D). Il est important de noter que plusieurs chromosomes homologues n’étaient pas alignés à la plaque équatoriale après l’inhibition de la CENP-E (Figure 2B-D). De plus, l’inhibition de la CENP-E a également conduit à l’augmentation des spermatocytes de métaphase I dans les tubules séminifères (Figure 2E,F,G). Pris ensemble, l’inhibition de la CENP-E entraîne un désalignement chromosomique dans les spermatocytes primaires pendant la méiose I, ce qui suggère que la CENP-E est responsable de la congression chromosomique et de l’alignement des spermatocytes dans la méiose.
Pour valider davantage ces résultats, nous avons effectué les tests d’immunofluorescence pour détecter les cellules spermatogènes dans les tubules séminifères. Nous avons constaté que l’onde spermatogène régulière montrée dans le groupe témoin était manifestement modifiée et devenait irrégulière dans le groupe GSK923295 (Figure 3). Le fuseau méiotique des spermatocytes en division a été marqué avec un anticorps anti-α-tubuline, et le filament transversal des complexes synaptonémiques dans les spermatocytes a été marqué avec un anticorps anti-complexe synaptonémique 3 (SYCP3) (Figure 3A). Les cellules SYCP3 positives par tubule séminifère ont diminué après l’inhibition de la CENP-E (Figure 3B). Pendant ce temps, les points SYCP3 par cellule en métaphase n’ont pas été perturbés après l’inhibition de CENP-E (Figure 3C). De plus, les étirements SYCP3 par cellule n’ont pas non plus été affectés dans les groupes GSK92395 (Figure 3D). De manière frappante, nous avons constaté que les distances des pôles de fuseau dans les spermatocytes de métaphase I étaient augmentées après l’inhibition de la CENP-E (Figure 3E,F). Ces résultats d’immunofluorescence suggèrent que le CENP-E est nécessaire pour le désalignement chromosomique et les processus de spermatogenèse, et est indispensable pour le maintien du fuseau bipolaire et l’organisation du fuseau méiotique.
Pour étudier les populations cellulaires dans les testicules de souris, nous avons digéré les testicules et effectué des tests de coloration PI et de cytométrie en flux (Figure 4). Les procédures techniques importantes ont été illustrées à la figure 4A-C. Les cellules spermatogènes sont constituées de plusieurs populations cellulaires, y compris les spermatogonies, les spermatocytes primaires, les spermatocytes secondaires, les spermatides et les spermatozoïdes. Le contenu en ADN de ces cellules spermatogènes a été montré à la figure 4A. Nous avons démontré que l’inhibition de la CENP-E entraînait la diminution des cellules haploïdes de 42,95 ± 1,09% dans le groupe témoin à 38,26 ± 1,86% dans le groupe GSK923295 (Figure 4B-D). Les rapports entre les cellules diploïdes et les cellules aneuploïdiques n’ont pas été significativement influencés après l’inhibition de la CENP-E (Figure 4E,F). De plus, les ratios des cellules tétraploïdes passent de 17,76 ± 1,52 % dans le groupe témoin à 28,88 ± 2,05 % dans le groupe GSK923295 (Figure 4G). Pris ensemble, nous constatons que les populations cellulaires des cellules spermatogènes sont légèrement modifiées après l’inhibition de la CENP-E. L’inhibition de la CENP-E entraîne la diminution des cellules haploïdes et l’augmentation des cellules tétraploïdes, ce qui indique que l’inhibition de la CENP-E est associée à l’arrêt de la métaphase dans les spermatocytes en division.
De plus, nous avons observé la structure submicroscopique des cellules spermatogènes en utilisant la microscopie électronique à transmission (Figure 5). L’organisation de la chromatine, le réticulum endoplasmique et les mitochondries des spermatocytes ont été montrés à la figure 5. Nous avons constaté que l’organisation des cellules spermatogènes était légèrement perturbée dans le groupe GSK923295 (Figure 5).
Figure 1 : Mise en place d’un modèle d’inhibition in vivo des testicules de souris par chirurgie abdominale et administration testiculaire. (A) Tous les instruments chirurgicaux utilisés en chirurgie abdominale. 1) ciseaux disséquants, 2) pinces à aiguille, 3) pinces droites, 4) pincet, 5) rhéodyne, 6) seringue de 1 mL, 7) scalpel avec poignée no 3 et lame no 11, 8) stylolite, 9) aiguilles rondes à coudre, 1/2 0,6 x 14 mm, 1/2 0,7 x 17 mm, 10) tampons d’éthanol. (B) Après anesthésie, les souris ont été placées en décubitus dorsal sur un plateau de cire, le bas-ventre a été préparé et désinfecté avec de l’éthanol à 75%. (C) Une ouverture de <5 mm a été faite au milieu du bas-ventre. (D) Le coussinet adipeux épididymaire a été tiré avec une pince à dissection stérile pour localiser les testicules. Le testicule a été injecté avec 10 μL GSK923295 à l’aide d’un rhéodyne de 10 μL. (E) Le péritoine et la peau ont été suturés simultanément avec deux points de suture. (F) La plaie a été désinfectée avec de l’éthanol à 75%. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : L’inhibition de la CENP-E a entraîné l’arrêt de la méiose I et du désalignement chromosomique dans les spermatocytes de souris. (A) Coloration HE des cellules spermatogènes dans le groupe témoin. Les flèches indiquent les spermatocytes. (B) Coloration HE des cellules spermatogènes du groupe GSK923295. Les testicules ont été injectés avec GSK923295 pendant 4 jours à une concentration finale de 10 μM. Les flèches indiquent un désalignement chromosomique dans les spermatocytes. Pour toutes les images, barre d’échelle, 10 μm. (C) Rapport des spermatocytes en métaphase dans les tubules séminifères. Contrôle, 13,43 ± 1,68%; GSK923295, 42,29 ± 3,94%. N = 1308 cellules ont été analysées. Groupe = 4. Test t de l’étudiant. Barres d’erreur, signifie ± SEM. ***, P < 0,001. (D) Rapport des tubules séminifères avec spermatocytes en division. Contrôle, 5,38 ± 2,64%; GSK923295, 33,96 ± 3,87%. N = 151 tubules séminifères ont été analysés. Groupe = 4. (E) Images d’immunofluorescence de Histone H3 (phospho Ser 10) et TUBA4A dans les groupes témoin et GSK923295. TUBA4A, rouge; Histone H3 (phospho Ser 10), vert; DAPI, bleu. Barre d’échelle, 10 μm. La boîte agrandie est agrandie. (F) La quantification du nombre de cellules de métaphase dans les tubules séminifères. Contrôle, 11,45 ± 1,55; GSK923295, 18,91 ± 2,36. N = 11. (G,H) Analyses linéaires des intensités fluorescentes des Histones H3 et TUBA4A dans les spermatocytes de métaphase I du groupe témoin (G) et du groupe GSK923295 (H). TUBA4A, rouge; Histone H3 (phospho Ser 10), vert; DAPI, bleu. L’axe X indique la distance relative. L’axe des Y indique les intensités fluorescentes. Test t de l’étudiant. Barres d’erreur, moyenne ± SEM. *, P < 0,05; ***, P < 0,001. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : L’inhibition de la CENP-E par GSK923295 conduit à la désorganisation des tubules séminifères et à la perturbation de la spermatogenèse. (A) Images d’immunofluorescence représentatives de SYCP3 et TUBA4A dans les groupes témoin et GSK923295. SYCP3, rouge; TUBA4A, vert; DAPI, bleu. Barre d’échelle, 10 μm. (B) Cellules SYCP3 positives par tubules séminifères dans les groupes témoin et GSK923295. Contrôle, 56,00 ± 5,43%; GSK923295, 39,00 ± 1,73%. N = 10. (C) Les quantifications des points SYCP3 par cellules métaphasiques. Contrôle, 10.00 ± 1.02; GSK923295, 9,71 ± 0,86, N = 7. (D) Les quantifications des étirements de SYCP3 par cellule dans les groupes témoin et GSK923295. Contrôle, 8,63 ± 0,22; GSK923295, 8,21 ± 0,21. N = 19. (E) Les analyses de la distance des pôles de fuseau dans les spermatocytes de métaphase I. Témoin, 8,20 ± 0,28 μm; GSK923295, 9,30 ± 0,29 μm. N = 30. (F) Images d’immunofluorescence des tubules séminifères dans le groupe témoin et le groupe GSK923295. Les flèches indiquent les spermatocytes. DAPI, vert; β-tubuline, vert. Les images agrandies de la boîte en pointillés ont été montrées dans le zoom. Pour toutes les images, barre d’échelle, 10 μm. Test t de l’étudiant. Barres d’erreur, moyenne ± SEM. ns, P > 0,05; **, P < 0,01. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Analyse par cytométrie en flux de cellules spermatogènes dans des testicules de souris. (A) Illustrations schématiques des principales étapes de l’analyse du cycle cellulaire des cellules spermatogènes de souris. Les spermatocytes diploïdes subissent la méiose I et II pour former les spermatides haploïdes. La valeur C indique la teneur en ADN. La valeur N (ploïdie) indique le nombre de jeux de chromosomes. (B,C) Analyse par cytométrie en flux des cellules spermatogènes du groupe témoin (B) et du groupe GSK923295 (C). Pour l’inhibition in vivo de la CENP-E, GSK923295 a été injecté dans des testicules de souris ICR mâles âgés de 3 semaines à une concentration finale de 10 μM pendant 4 jours. Pour l’analyse du cycle cellulaire, n = 3 000 cellules ont été mesurées et analysées. P4, les cellules haploïdes (1C). P5, les cellules diploïdes (2C). P6, les cellules tétraploïdes (4C). (D) Rapports des cellules haploïdes dans les groupes témoin et GSK923295. Contrôle, 42,95 ± 1,09%; GSK923295, 38,26 ± 1,86%. N = 8. (E) Rapports des cellules diploïdes dans les groupes témoin et GSK923295. Contrôle, 20,10 ± 0,91%; GSK923295, 17,95 ± 0,81%. N = 8. (F) Rapports des cellules aneuploïdes (2C ~ 4C) dans les groupes témoin et GSK923295. Contrôle, 3,41 ± 0,23%; GSK923295, 3,39 ± 0,25 %. N = 8. (G) Rapports des cellules tétraploïdes dans les groupes témoin et GSK923295. Contrôle, 17,76 ± 1,52%; GSK923295, 28,88 ± 2,05%. N = 8. Pour tous les graphiques, test t de l’élève. Barres d’erreur, moyenne ± SEM. ns, P > 0,05; *, P < 0,05; , P < 0,001. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Analyse en microscopie électronique des cellules spermatogènes du groupe témoin et du groupe GSK923295. (A) Images représentatives des tubules séminifères dans le groupe témoin. Barre d’échelle, 5 μm. (B) Image agrandie du noyau du spermatocyte. Les flèches indiquent la chromatine homologue des spermatocytes. Barre d’échelle, 1 μm. (C) Image agrandie du cytoplasme des spermatocytes. Barre d’échelle, 1 μm. (D) Images représentatives des tubules séminifères dans le groupe GSK923295. Les testicules ont été traités avec 10 μM GSK923295 pendant 4 jours. Barre d’échelle, 5 μm. (E) Image agrandie du noyau du spermatocyte dans le groupe GSK923295. Barre d’échelle, 1 μm. (F) Image agrandie du cytoplasme des spermatocytes du groupe GSK923295. Barre d’échelle, 1 μm. Pour tous les graphes, sc, spermatocyte; sd, spermatide. ER, réticulum endoplasmique; mt, mitochondries. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Dans cette étude, nous avons établi un modèle in vivo d’inhibition CENP-E de testicules de souris en utilisant la chirurgie abdominale et la micro-injection de GSK923295. La chirurgie abdominale et la méthode d’injection testiculaire utilisées dans cette étude présentent les avantages suivants. Tout d’abord, il ne se limite pas à l’âge des souris. Les expérimentateurs peuvent effectuer une injection testiculaire à un stade précoce, par exemple chez des souris âgées de 3 semaines ou moins. Deuxièmement, GSK923295 a un effet inhibiteur spécifique et excellent sur le CENP-E. Troisièmement, cette méthode est simple à utiliser et hautement reproductible. En outre, l’intégrité des testicules est maintenue, ce qui convient à l’étude des tissus intacts dans le contexte des organes.
Ce protocole comporte plusieurs étapes critiques. Par exemple, il est important de maintenir un environnement stérile pendant la chirurgie abdominale pour la prévention des infections postopératoires31. En outre, pour les souris d’âges différents ou d’animaux de laboratoire différents, les quantités d’injection doivent être ajustées de manière appropriée en fonction de la taille des testicules et de l’efficacité des médicaments19,32. En outre, le temps de digestion approprié et l’observation microscopique sont nécessaires pour la détermination des cellules individuelles et les tests ultérieurs de population cellulaire pendant la cytométrie en flux. Cependant, il y a plusieurs limitations dans ces protocoles. Il est difficile d’utiliser la chirurgie abdominale pour construire un modèle de souris lorsque l’âge de la souris est inférieur à 2 semaines. Les principales raisons sont que les souris sont trop jeunes, que le régime postopératoire est difficile et que le taux de survie est faible. Les médicaments utilisés dans les modèles animaux sont liquides et présentent les caractéristiques de membranes cellulaires facilement pénétrantes 19,32,33, qui conviennent aux applications de cette méthode d’administration.
La compréhension de la méiose est stimulée par la culture cellulaire in vitro et les études d’élimination des gènes, mais elle n’est pas facilement applicable aux spermatocytes de mammifères28. L’obstacle aux études mécanistes de la méiose masculine a été l’absence d’un système approprié pour la manipulation et l’observation des spermatocytes en division dans la méiose27. La souris est un excellent organisme modèle dans la recherche des mécanismes cellulaires et moléculaires de la méiose au cours de la spermatogenèse. La première vague de spermatocytes de souris commence la méiose au jour 10 post-partum (dpp) et se développe en spermatozoïdes matures à 35 dpp, ce qui fournit une fenêtre temporelle de développement pour les études de la division méiotique et de la spermatogenèse34.
L’injection de testicules, y compris l’injection directe à travers le scrotum et la micro-injection via la chirurgie abdominale, est une technique utile pour les études de la spermatogenèse35,36. L’injection directe à travers le scrotum est rapide et simple, et ne provoque qu’un traumatisme chirurgical mineur, qui convient aux souris de 4 semaines ou plus avec les testicules descendant vers le scrotum. Cependant, il est impossible d’injecter le testicule non descendu des souris âgées de 3 semaines ou plus jeunes. La micro-injection par chirurgie intrapéritonéale ou chirurgie du scrotum convient à l’injection de testicules non descendus, ce qui nécessite des compétences chirurgicales compétentes d’opérateurs expérimentaux, un stéréomicroscope et le matériel chirurgical et de laboratoire. Selon les sites d’injection, la micro-injection peut être classée en injection de tubules séminifères, injection de filet testiculaire et injection interstitielle testiculaire. Par rapport à d’autres modèles de testicules basés sur l’injection, l’injection d’inhibiteurs par chirurgie abdominale peut inhiber efficacement les fonctions des protéines et présente les avantages de la pénétration de la membrane cellulaire, des procédures faciles et de l’inhibition à long terme19,32. Les méthodes utilisant des siRNA, des oligonucléotides antisens ou des lentivirus ont de plus grandes limitations dans la faible efficacité de pénétration des membranes cellulaires, les effets secondaires hors cible et la dégradation facile des siRNA ou des oligonucléotides in vivo37,38,39,40.
La division méiotique dans les tissus vivants est plus complexe que celle dans les conditions de culture, dans lesquelles l’architecture tissulaire, la signalisation développementale et les facteurs environnementaux in vivo doivent être pris en considération41. Des études antérieures ont démontré que les milieux de culture et les facteurs autonomes cellulaires sont cruciaux pour la stimulation du début de la phase de division méiotique. Par exemple, l’inhibiteur de la phosphatase acide okadaïque (OA)42, l’histone spécifique du spermatocyte HIST1H1T 43, la topoisomérase II44 et le facteur favorisant la métaphase (MPF)45 favorisent la transition G2/MI dans les spermatocytes en culture. Ces conditions et facteurs de culture complexes contribuent aux limites de la culture à court terme des spermatocytes.
L’injection directe d’ADN plasmidique dans les testicules est appliquée avec succès dans le transfert de gènes médié par les testicules et la production de souris transgéniques32,46. L’électroporation in vivo implique l’injection d’un plasmide d’expression de l’ADN dans la lumière des tubules séminifères, puis l’utilisation d’une série d’impulsions électriques pour modifier la perméabilité de la membrane cellulaire, améliorer l’efficacité de l’expression transgénique et la modification génétique 45,46,47,48,49. Notre méthode pourrait être combinée avec l’électroporation in vivo, ainsi que des protéines marquées par fluorescence et des outils d’édition de gènes, ce qui rend cette approche plus puissante pour les analyses de la division méiotique masculine dans le contexte physiologique des tissus et des organes.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous remercions tous les membres du laboratoire de cytosquelette de l’Université médicale du Fujian pour leurs discussions utiles. Nous remercions Jun-Jin Lin du Public Technology Service Center de l’Université médicale du Fujian pour son assistance technique en cytométrie en flux. Nous remercions Ming-Xia Wu et Lin-Ying Zhou du laboratoire de microscopie électronique du Public Technology Service Center de l’Université médicale du Fujian pour leur assistance technique en microscopie électronique. Nous remercions Si-Yi Zheng, Ying Lin, Qi Ke et Jun Song du Centre d’enseignement expérimental des sciences médicales fondamentales de l’Université médicale du Fujian pour leur soutien. Cette étude a été financée par les subventions suivantes: Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (numéro de subvention 82001608), Fondation des sciences naturelles de la province du Fujian, Chine (numéro de subvention 2019J05071), Projet provincial de technologie de la santé du Fujian (numéro de subvention 2018-1-69), Fonds de démarrage pour la recherche scientifique, Université médicale du Fujian (numéro de subvention 2017XQ1001), Projet de financement de démarrage de la recherche scientifique de talents de haut niveau de l’Université médicale du Fujian (numéro de subvention XRCZX2017025) et Projet de recherche de l’éducation et de l’enseignement en ligne des étudiants diplômés en médecine chinoise (numéro de subvention B-YXC20200202-06).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | |
| 1 ml Syringe | Several commercial brands available | Sterile. | |
| 1.5 mL Centrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | |
| 50 mL Centrifuge Tube | Corning | 430828 | |
| 6 cm Petri dish | Corning | 430166 | |
| 95% Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10009164 | |
| tubulin rabbit polyclonal antibody | Beyotime | AF0001 | For immunofluorescence assays. Use at 1:100. |
| rabbit anti-Histone H3 (phospho S10) monoclonal antibody | Abcam | ab267372 | For immunofluorescence assays. Use at 1:100. |
| rabbit anti-TUBA4A polyclonal antibody | Sangon Biotech | D110022 | For immunofluorescence assays. Use at 1:100. |
| Anti-SYCP3 rabbit monoclonal antibody | Abcam | ab175191 | For immunofluorescence assays. Use at 1:100. |
| Adhesion microscope slides | CITOTEST | 188105 | |
| Alexa fluor 488-labeled goat anti-rabbit antibody | Beyotime | A0423 | Sencodary antibody. Use at 1:500. |
| Aluminium potassium sulphate | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10001060 | |
| Anhydrous ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 100092690 | |
| Anti-fade mounting medium | Beyotime | P0131 | Prevent photobleching of flourescent signals. |
| BD FACS Canto II | BD Biosciences | FACS Canto II | |
| Bovine Serum Albumin | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 69003435 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424BK745380 | |
| Chloral hydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 80037516 | |
| Citric acid | Shanghai Experiment Reagent Co., Ltd | 122670 | |
| Collagenase | Sangon Biotech | A004194-0100 | |
| Coverslips | CITOTEST | 10212020C | 20 × 20 mm. Thickness 0.13-0.16 mm. |
| DAPI | Beyotime | C1006 | |
| Dye vat | Several commercial brands available | 91347802 | |
| Eosin Y, alcohol soluble | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 71014460 | |
| Ether | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10009318 | |
| Formaldehyde - aqueous solution | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10010018 | |
| GSK923295 | MedChemExpress | HY-10299 | |
| Hematoxylin, anhydrous | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 71020784 | |
| ICR mouse | Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd | ||
| Image J software | National Institutes of Health | https://imagej.nih.gov/ij/ | Fluorescent image analysis. |
| Leica ultramicrotome | Leica | ||
| Leica EM UC-7 ultramicrotome | Leica | EM UC7 | |
| Modfit MFLT32 | Verity Software House | For analysis of flow cytometry results. | |
| Nail polish | Several commercial brands available | ||
| Neutral gum | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10004160 | |
| Nikon Ti-S2 microscope | Nikon | Ti-S2 | |
| Picric acid | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | J60807 | |
| Rheodyne | Sangon Biotech | F519160-0001 | 10 μl rheodyne |
| Sliced paraffin | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 69019461 | |
| Sodium iodate | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 80117214 | |
| Surgical instruments | Several commercial brands available | For abdominal surgery. Sterilize at 121 °C, 20 min. | |
| Transmission electron microscope | FEI | Tecnai G2 | |
| Trisodium citrate dihydrate | Shanghai Experiment Reagent Co., Ltd | 173970 | |
| Triton X-100 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 30188928 | Dilute in sterile PBS to make a 0.25% working solution. |
| Tween 20 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 30189328 | Dilute in sterile PBS to make a 0.1% working solution. |
| Paraformaldehyde | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 80096618 | |
| Xylene | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10023418 |
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