Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

שיטת אלקטרופורמציה יעילה וחסכונית לחקר מסלולי איתות ראשוניים תלויי סיליום במבשר תאי הגרגיר

Published: November 30, 2021 doi: 10.3791/63283
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Chemistry, Faculty of Science, Hong Kong Baptist University

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול אלקטרופורציה במבחנה לשחזור עבור מניפולציה גנטית של מבשרי תאי גרגר המוח הקטן העיקרי (GCPs) כי הוא חסכוני, יעיל, קיימא. יתר על כן, פרוטוקול זה מדגים גם שיטה פשוטה למחקר מולקולרי של מסלולי איתות קיפוד תלויי ציליום ראשוניים בתאי GCP ראשוניים.

Abstract

הסיליום העיקרי הוא אברון איתות קריטי שנמצא כמעט בכל תא שמתמר את הקיפוד (Hh) ומאותת לגירויים מפני השטח של התא. במבשר תאי הגרגיר (GCP), הסיליום הראשי משמש כמרכז איתות מרכזי המתזמר את התפשטות התאים המבשרים על ידי ויסות מסלול האיתות של Hh. החקירה של מכונות איתות Hh תלויות cilium העיקרית מתאפשרת על ידי מניפולציה גנטית במבחנה של רכיבי המסלול כדי לדמיין את הלוקליזציה הדינמית שלהם לסיליום הראשי. עם זאת, טרנספקטציה של טרנסג'נים בתרבויות העיקריות של GCPs באמצעות שיטות אלקטרופורציה הידועות כיום היא בדרך כלל יקרה ולעתים קרובות גורמת בכדאיות תאים נמוכה ויעילות טרנספקטורה לא רצויה. מאמר זה מציג פרוטוקול אלקטרופורציה יעיל, חסכוני ופשוט המדגים יעילות טרנספקטירה גבוהה של ~ 80-90% ואת הכדאיות התא האופטימלית. זוהי שיטת שינוי גנטי פשוטה, ניתנת לשחזור ויעילה החלה על חקר מסלול האיתות העיקרי התלוי בסיליום בתרבויות GCP ראשוניות.

Introduction

GCPs המוח הקטן נמצאים בשימוש נרחב כדי ללמוד את המכונות של מסלול איתות Hh בסוגי תאים אב עצביים בשל השפע הגבוה שלהם רגישות גבוהה למסלול איתות Hh ב vivo1,2,3,4. ב- GCPs, הסיליום העיקרי פועל כרכזת העברת אות Hh מרכזית 5 המתזמרת את התפשטות התאים המבשרים6,7,8. הדמיה חוץ גופית של רכיבי איתות Hh על הסיליום הראשי הוא לעתים קרובות מאתגר בשל רמות הבסיס האנדוגניות הנמוכות שלהם. לפיכך, שינוי טרנסג'ן של רמות ביטוי חלבון ותיוג פלואורופור של גן העניין הן גישות שימושיות כדי ללמוד את המסלול ברזולוציה מולקולרית. עם זאת, מניפולציה גנטית של תרבויות ראשיות GCP באמצעות גישות transfection מבוססות ליפוזום לעתים קרובות לגרום יעילות טרנספקטיבה נמוכה, מעכב חקירות מולקולריות נוספות9. אלקטרופורציה מגבירה את היעילות אך בדרך כלל דורשת ריאגנטים אלקטרופורציה ספציפיים לספקים מופקעים וסוג התאים 10.

מאמר זה מציג שיטת אלקטרופורציה יעילה וחסכונית לתפעול רכיבי מסלול האיתות של Hh בתרבויות הראשיות של GCP. באמצעות פרוטוקול אלקטרופורציה שונה זה, חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) מתויג טרנסג'ן החלקה (pEGFP-Smo) נמסר ביעילות GCPs והשיג שיעורי הישרדות וטרנספקטיה גבוהים של תאים (80-90%). יתר על כן, כפי שמעיד הכתם החיסוני, GCPs שהושפעו הטרנסג'נדרים הראו רגישות גבוהה להפעלה אגוניסטית החלקה של מסלול האיתות HH על ידי סחר EGFP-Smo לסיסים העיקריים. פרוטוקול זה יהיה ישים ישירות ומועיל לניסויים הכרוכים בשינוי גנטי במבחנה של סוגי תאים שקשה להעביר, כגון תרביות תאים ראשוניים אנושיים ומכרסמים, כמו גם תאי גזע פלוריפוטנטיים הנגרמים על ידי בני אדם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל ההליכים הקשורים לבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות לטיפול בבעלי חיים ולפרוטוקול שאושר על ידי משרד הבריאות, הונג קונג. רישיונות לניסויים בבעלי חיים בעקבות פקודת בעלי חיים (פיקוח על ניסויים) (סעיף 340) התקבלו ממשרד הבריאות, ממשלת הונג קונג. העבודה בבעלי החיים בוצעה בהתאם לאתיקה לבטיחות בעלי חיים שאושרה על ידי משרד המחקר של HKBU וועדת בטיחות המעבדות. עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים אודות כל החומרים המשמשים בפרוטוקול זה.

1. הכנה לניסיון מקדים

  1. הכנת מדיה תרבותית ומאגרים
    1. מדיום ללא סרום (SFM)
      1. כדי להכין 50 מ"ל של SFM, להוסיף 500 μL של תחליף L-גלוטמין 100x, 500 μL של פניצילין-סטרפטומיצין, 1 מ"מ של פירובט נתרן, ו 12.5 μL של 1 M KCl (הסופי 250 מיקרומטר) עד 49 מ"ל של מדיום Neurobasal.
      2. לפצל את SFM ל 2 aliquots של 10 מ"ל ו 40 מ"ל בצינורות חרוטיים 50 מ"ל ולאחסן אותם ב 4 °C (60 °F) עד חודש אחד.
    2. מדיום חסימת עיכול: 10% FBS ב- SFM
      1. הוסיפו 1.1 מ"ל של FBS מושבת בחום ל-10 מ"ל של SFM כדי להכין מדיום חוסם עיכול.
    3. מדיום תרבות GCP: SFM עם B27
      1. כדי להכין מדיום תרבית GCP, להוסיף 800 μL של תוסף B-27 ללא סרום כדי aliquot 40 מ"ל של SFM.
        הערה: ניתן לאחסן SFM בתוספת B-27 בטמפרטורה של 4 °C (4 °F) למשך עד חודש אחד. עם זאת, מדיה מוכנה טרי לייצר תוצאות אופטימליות.
    4. מאגר חיתוך: EBSS עם גלוקוז + HEPES
      1. הוסיפו 6 גרם/ל של גלוקוז לפתרון המלח המאוזן (EBSS) של ארל ללא סידן ומגנזיום המכיל 10 מ"מ HEPES (4-(2-הידרוקסיאתיל)-1-1-פיפרזין-אתנסולונית).
      2. לחטא את הפתרון על ידי עובר דרך מסנן מזרק 0.2 מיקרומטר ולאחסן אותו ב 4 °C (4 °F) לאחסון לטווח ארוך.
    5. מאגר עיכול
      הערה: יש להכין היטב לפני השימוש.
      1. הכן 2 מ"ל של חיץ עיכול לעיכול של 2-4 רקמות המוח הקטן ו 4 מ"ל עבור 4-10 רקמות. כדי להכין 4 מ"ל של מאגר עיכול, להמיס 1.5 מ"ג של L-ציסטאין (ריכוז סופי 200-400 מיקרוגרם / מ"ל) ב 4 מ"ל של EBSS. הפוך את הצינור שוב ושוב עד שהאבקה מומסת במלואה.
      2. לחטא את הפתרון באמצעות מסנן מזרק 0.2 מיקרומטר ומזרק 5 מ"ל, ולהעביר את הפתרון לצלחת תרבית תאים סטרילית 35 מ"מ.
      3. הוסף 4 μL של פפאין (1:1,000 דילול מריכוז מלאי של 20 יחידות / מ"ג) ו 40 μL של DNase I (1:100 דילול ממלאי 10 מ"ג / מ"ל לריכוז סופי של 0.1 מ"ג / מ"ל).
      4. יש לדגור על התמיסה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחממת CO2 למשך 30 דקות לפחות או עד לשימוש.
        הערה: שלב זה הוא קריטי כדי להפעיל את הפפאין. לקבלת תוצאות מיטביות, אין לחרוג מ- 45 דקות בטמפרטורה של 37 °C (50 °F) לפני השימוש. ודא שהפתרון הופך לשקוף ושאין משקעים לבנים לפני השימוש.
  2. כיסויים מקדימים
    1. כדי להכין את כיסויי לחיבור התא, דגירה אוטומטית 12 מ"מ זכוכית מכסה כיסויים עם 100 מיקרוגרם / מ"ל של פולי-D-ליזין (PDL, 1 מ"ג / מ"ל ב dH2O סטרילי) לפחות 1 שעה ב 37 °C (37 °F). יש לשמור את כיסויי הכיסוי באותו פתרון PDL בטמפרטורה של 4 °C (65 °F) עד לשימוש.
    2. ביום של תרבית התא העיקרית, לאסוף את PDL בצינור חרוטי נקי ולשטוף את כיסוי שלוש פעמים עם dH2O סטרילי ביסודיות כדי להסיר PDL שיורית.
      הערה: ניתן לאחסן את ה- PDL בטמפרטורה של 4 °C (60 °F) לשימוש חוזר.
    3. העבירו את כיסויי הזכוכית מצופים PDL לצלחת של 24 בארות על ידי הנחת כיסוי אחד בכל באר.
    4. הסר מים עודפים והוסף 200-300 μL של מטריגל (משוחזר על פי ההוראות בגליון הנתונים של המוצר ב- DMEM-F12 ללא סרום) כדי לכסות באופן מלא את המכסים.
    5. דגירה את כיסויים מטריגל עבור 1 שעות ב 37 °C (50 °F) בחממת CO2 .
      הערה: הסר את מטריגל מטריגל לפני זריעת התא. מטריגל זה ניתן לאסוף ולאחסן ב 4 °C (4 °F) לשימוש חוזר מרובים.
  3. הכנת צלחת תרבות מוכנה מראש
    1. מצופה צלחת תרבית תאים 60 מ"מ עם 2 מ"ל של 100 מיקרוגרם / מ"ל PDL (לשחזר את פתרון מלאי PDL 1 מ"ג / מ"ל ב dH2O סטרילי) על ידי דגירה ב 37 °C (15 °F) עבור 1 שעות.
    2. מיד לפני זריעת התא, להסיר ולאסוף את PDL בשימוש בצינור חרוטי נקי ולאחסן אותו ב 4 °C (60 °F) לשימוש חוזר מרובים. שטפו ושטפו את המנה מצופה ה-PDL שלוש פעמים עם dH2O סטרילי. ייבשו באוויר את צלחת התרבות לפני זריעת התא.
    3. השתמש צלחת תרבית תא אחד 60 מ"מ כדי זרע תאים שנקטפו מן המקסימום של 2 רקמות שלם המוח הקטן.
    4. הכינו מנות תרבות נוספות למוח הקטן נוסף.
      הערה: ראו שלבים 2.1.18 ו-2.1.19 לשימוש במנת התרבות המכינה.

2. יום ניסיוני 0

  1. בידוד ופולחן של GCPs ראשיים של העכבר
    הערה: שיטת התרבות של GCP שונתה מפרוטוקול רגיל, והפרוטוקול הקצר תואר בקצרה בעבודתנו הקודמת6,11,12. לקבלת תפוקת GCP אופטימלית, השתמש בגורים של יום 6 או P7 לאחר הלידה (P) לבידוד של GCP. השלם את שלבי הניתוח הבאים 2.1.6-2.1.1.10 במהירות האפשרית לקבלת כדאיות תאים אופטימלית.
    1. SFM לפני המלחמה, עיכול חוסם בינוני, בינוני תרבות, ו Opti-MEM ב 37 °C (50 °F) במהלך ניתוח.
    2. על ספסל נקי, presoak כל מנגנון הניתוח ב 70% אתנול לחיטוי.
    3. ממלאים צלחת תרבית תאים 60 מ"מ עם 2-3 מ"ל של חיץ ביתור ומצננים אותו על קרח.
    4. הכן חיץ עיכול טרי כמתואר בסעיף 1.1.5 ולשמור אותו חם ב 37 °C (50 °F).
    5. השתמש 70% אתנול כדי לנגב את הראש של הגור לחיטוי.
    6. לערוף את ראשו של הגור ללא הרדמה. השתמש מלקחיים כדי להחזיק את הראש ומספריים כירורגיים מעוקרים כדי לחתוך מהחלק האחורי של הגולגולת כדי לערוף את ראשו של הגור. הסר בזהירות את העור והגולגולת כדי לחשוף את המוח באמצעות מלקחיים.
    7. השתמשו במלקחיים כדי לצבוט את המוח הקטן ולהשרות אותו במהירות במאגר הניתוח המצונן מראש שהוכן בשלב 2.1.3.
    8. הסר את קרום המוח עם המוח הקטן שקוע במאגר ביתור תחת מיקרוסקופ ניתוח. קרום המוח המועשר בכלי הדם צריך להיראות ורדרד תחת המיקרוסקופ המנתח.
    9. הסר את כל קרום המוח באמצעות מלקחיים.
      הערה: מוח קטן ללא קרום המוח צריך להיות בעל מראה לבנבן.
    10. הסר את כל רקמות המוח הבינוני הנראות לעין ואת מקלעת הכורואידים מהמוח הקטן.
    11. מעבירים את המוח הקטן לצלחת תרבית של 35 מ"מ ממולאת מראש במאגר עיכול חם שהוכן בשלב 2.1.4. הימנע מהעברת מאגר ניתוח עודף. חותכים את המוח הקטן לחתיכות עדינות באמצעות מספריים microspring מהר ככל האפשר.
    12. מיד לדגור המוח הקטן טחון ב 37 °C (50 °F) במשך 15 דקות בחממה CO2 . להאריך את זמן הדגירה ל 20 דקות אם יותר מ 4 המוח הקטן הם להיות מעובדים.
      הערה: לאחר הדגירה, הרקמה תתקבץ יחד.
    13. מעבירים מיד את הרקמה המעוכלת לתחתית צינור צנטריפוגה סטרילי חדש של 15 מ"ל באמצעות קצה פיפטה P1000 מראש עם מדיום חסימת עיכול (הימנעו מהעברת מאגר עיכול).
    14. הוסף נפח מתאים של מדיום חסימת עיכול (1 מ"ל עבור 1 מוח קטן) כדי לסיים את העיכול ואת pipette למעלה ולמטה בעדינות 30 פעמים באמצעות micropipette P1000 כדי לנתק עוד יותר את הרקמה לתוך השעיה של תא יחיד. הימנע היווצרות בועת אוויר.
    15. להעביר בעדינות את ההשעיה התא דרך מסננת תאים 70 מיקרומטר לתוך צינור צנטריפוגה סטרילי חדש כדי להסיר גושי תאים.
    16. מעבירים 1 מ"ל נוספים של עיכול טרי החוסם מדיום דרך מסננת התא כדי לאסוף תאים שיורית ממסננת התא.
    17. צנטריפוגה מסנן ב 200 × גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT). הסר את supernatant ו resuspend את הכדור עם 1 מ"ל של SFM. חזור על שלב זה פעמיים. הימנעו מיצירת בועות אוויר.
    18. התקן מחדש את הכדור בכרך סופי של 2 מ"ל של מדיום תרבית GCP והעבר את מתלי התא לצלחת התרבות המגולמת של 60 מ"מ מצופה PDL שהוכנה בשלב 1.3. דגירה במשך 15 דקות ב 37 °C (50 °F) בחממה CO2 .
      הערה: אין לחרוג מ-20 דקות.
    19. לאחר הדגירה, הקישו על צלחת התרבות מהצד כדי לחלץ את תאי ה-GCP הדבוקים באופן רופף. לאסוף את תאי GCP חסידים במדיום תרבית על ידי צנרת עדינה באמצעות פיפטה P1000. לאסוף השעיה GCP זה לתוך צינור צנטריפוגה חדש 15 מ"ל. להשליך את צלחת 60 מ"מ.
      הערה: תאי אסטרוגליה ופיברובלסט דבקים מאוד יישארו מחוברים בתחתית צלחת 60 מ"מ ויופרדו בשלב זה. השמטת צעד זה תסכן את טוהר תרבות ה-GCP.
    20. לספור את התאים ולהמשיך אלקטרופורציה מיד.
  2. יום במבחנה (DIV) 0: אלקטרופורציה עבור קולטן Hh טרנסג'ן overexpression: pEGFP-Smo
    1. עבור electroporation באמצעות cuvette פער 2 מ"מ, להכין את תערובת אלקטרופורציה פלסמיד-תא הבא עבור כל תגובה של אלקטרופורציה: 1.2 × 106 תאים ו 10 מיקרוגרם של pEGFP-mSmo (להתאים את ריכוז מלאי ה- DNA ~ 2-5 מיקרוגרם / μL ב Tris-EDTA חוצץ או dH2O סטרילי) ב 100 μL של Opti-MEM.
      הערה: הפחת את מספר התא הכולל אם התאים אינם מספיקים (אם כי הדבר עשוי להפחית את יעילות האלקטרופורציה). עם זאת, אין להתאים את כמות הפלסמיד ולא את הנפח הכולל של Opti-MEM המשמש לכל קובט. אם מספר התא הכולל הנדרש לניסוי עולה על 1.5 × 106 תאים, הגדל את תערובת האלקטרופורציה בהתאם ובצע תגובות אלקטרופורציה מרובות בנפרד. ניתן לעשות שימוש חוזר בקובט עד 5 פעמים.
    2. הכן את צלחת זריעת התא לאחר אלקטרופורציה על ידי הוספת 0.5 מ"ל של מדיום תרבית לכל באר של צלחת תרבות 24 באר המכילה כיסויים מצופים (משלב 1.2) ולשמור אותו חם ב 37 °C (57 °F) בחממה CO2 .
    3. משלב 2.1.20, פיפטה את המספר הנדרש של תאים לתוך צינור microcentrifuge סטרילי 1.5 מ"ל ספין ב 200 × גרם במשך 5 דקות ב RT. להשליך את supernatant ו resuspend גלולה התא ב 200 μL של Opti-MEM. חזור על שלב זה פעמיים עם Opti-MEM כדי להבטיח שאף אמצעי תרבות שיורית לא נמצא בצינור
      הערה: עבור כל באר / כיסוי של צלחת 24 באר, אלקטרופורט וזרע 1.2-1.3 × 106 תאים / טוב כדי להשיג ~ 70-75% מפגש תאים ביום הבא של התרבות.
    4. הגדר את הפרמטרים של אלקטרופורציה כפי שמוצג בטבלה 1.
    5. פיפטה תגובת אלקטרופורציה בעדינות לערבב היטב ולהשתמש קצה P200 ארוך כדי להעביר נפח מדויק של 100 μL של התערובת לתוך 2 מ"מ פער cuvette. הימנעו מיצירת בועות.
    6. מניחים את הקובט בתא הקובט.
    7. לחץ על לחצן Ω של האלקטרופורטטור (ראה טבלת החומרים) ורשום לעצמך את ערך העכבה, שאמור להיות ~ 30-35. כדי להבטיח את ערך עכבה חשמלית Ω נופל בטווח של 30-35, לדבוק בנפח מדויק של 100 μL.
    8. לחץ על לחצן התחל כדי ליזום את הדופק.
    9. הקלט את הערכים של הזרם הנמדד וג'אול המוצגים במסגרת הקריאה.
    10. הסר את הקובט מתא הקובט.
    11. מיד להוסיף 100 μL של מדיום תרבות טרום המלחמה לתוך cuvette ו resuspend אותו על ידי צינור עדין למעלה ולמטה 2-3 פעמים. העבר מיד את ההשעיה התאית ללוחית 24-well שהוכנה בשלב 2.2.2.
      הערה: כדי למזער את מוות התאים, זרע את התאים מיד לאחר אלקטרופורציה.
    12. לדגור על התאים ב 37 °C (50 °F) בחממה CO2 . השאר את התאים ללא הפרעה במשך 3 שעות כדי למנוע ניתוק תאים.
    13. ב 3 שעות לאחר זריעה, בעדינות לשאוף ולהשליך מחצית המדיום supernatant כדי להסיר תאים מתים צפים ופסולת ולהחליף עם אותה כמות של מדיום תרבות לפני המלחמה.
    14. לדגור על התאים ב 37 °C (50 °F) בחממה CO2 ולחדש מחצית המדיום כל יומיים.
    15. שים לב לתאים שמתחת למיקרוסקופ הפלואורסצנטיות למחרת, כלומר DIV1 (איור 1) לאות GFP כדי לקבוע את היעילות של ביטוי יתר של Smo.
    16. לגירוי מסלול האיתות Hh ב- DIV 1 לאחר חידוש מחצית המדיום, הוסף אגוניסט מוחלק של 0.2 מיקרומטר (SAG) לתאים תוך הוספת נפח שווה של DMSO לפקד. דגירה במשך 24 שעות לפני קיבוע התא.
      הערה: שמור על עוצמת הקול של DMSO/SAG שנוספה נמוך ככל האפשר. כאן, 0.5 μL DMSO או 0.5 μL של 0.2 mM SAG נוספה לכל 500 μL של בינוני לכל באר, שהוא יחס דילול של 1:1,000.

3. DIV 2: הדמיה של ריסים ראשוניים וחקירת מסלול האיתות HH

  1. קיבוע תאים
    1. ב 24 שעות לאחר הטיפול, להסיר את המדיום תרבית ולשטוף את התאים 2-3 פעמים עם תמיסת מלח חוצץ פוספט (PBS) באמצעות פיפטה פסטר חד פעמי תוך הימנעות הרחקת התאים.
    2. תקן את התאים על ידי הוספת ~ 400 μL של 4% paraformaldehyde (מוכן PBS) ודגר ב RT במשך 10 דקות.
    3. יש לשטוף ולשטוף 2-3 פעמים באמצעות פיפטת פסטר חד פעמית.
    4. יש לאחסן ב-PBS בטמפרטורה של 4 °C (4 °F) למשך עד חודשיים או להמשיך לחיסון.
  2. כתמים אימונוציטוכימיים של GCPs וסמן ציליום ראשי
    1. בצלחת של 24 בארות, לשטוף את התאים פעמיים PBS עם רועד עדין במשך 5 דקות בכל פעם.
    2. מוסיפים 0.5 מ"ל של 100 מ"מ אמוניום כלוריד לתא ודגורים ב RT במשך 10 דקות כדי להרוות את הקיבוע.
    3. יש לשטוף פעם אחת ולשטוף 2-3 פעמים עם PBS עם טלטול עדין במשך 10 דקות בכל פעם.
    4. פיפטה עדינה 30 μL של חוצץ חסימה (BB: 0.1% טריטון X-100, 1% BSA, 2% סרום סוס מושבת בחום ב- PBS) על פיסת parafilm כדי ליצור טיפה ללא בועות אוויר.
    5. מעבירים בעדינות את כיסוי הכיסוי מהבאר לטיפת הצימרים כאשר הצד עם זריעת התא פונה כלפי מטה. לדגור על התאים עם BB בתא לח במשך 1 שעות ב RT.
    6. הכן את תערובת הנוגדנים העיקרית בצימר כפי שמוצג בטבלת החומרים. כדי לחקור את התאים עם נוגדן ראשוני, חזור על שלבים 3.2.4 ו 3.2.5, החלפת BB עם תערובת הנוגדנים העיקרית. לדגור על התאים עם הנוגדן העיקרי עבור 2 שעות ב RT.
    7. בעזרת מלקחיים, העבירו את כיסויי הכיסוי בחזרה לצלחת של 24 בארות כאשר הצד עם זרע התא פונה כלפי מעלה. לשטוף את התאים פעם אחת לשטוף 3-4 פעמים PBS עם רועד עדין במשך 10 דקות בכל פעם.
    8. הכן את תערובת הנוגדנים המשנית ב- BB כפי שמוצג בטבלת החומרים. כדי לדגור על התאים עם הנוגדן המשני, חזור על שלבים 3.2.4 ו 3.2.5, החלפת BB עם תערובת הנוגדנים המשנית. דגירה בחושך במשך 1 שעות ב RT.
    9. חזור על שלב 3.2.7 לשטיפת דגירה של נוגדנים פוסט-משניים.
    10. התקן את כיסוי הכיסוי על שקופית זכוכית מיקרוסקופית נקייה באמצעות מדיום הרכבה.
    11. ייבשו את המגלשה בחושך למשך הלילה והמשיכו להדמיה קונפוקלית13.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

באמצעות Opti-MEM (ראה טבלת החומרים) כמגיב האוניברסלי, מתודולוגיית אלקטרופורציה מוצעת זו יכולה להשיג יעילות אלקטרופורציה גבוהה באופן עקבי בשיעור של ~80-90% (איור 1). יעילות האלקטרופורציה של וקטור Smo-EGFP נקבעה ב- DIV 2 לאחר אלקטרופורציה על ידי כימות אחוז התאים החיוביים לפלואורסצנטיות ירוקה בכל תאי ה- GCP המביעים את הקופסה המשויכת - 6 (Pax6). יעילות האלקטרופורציה של קבוצות שטופלו ב-DMSO וב-SAG נראתה דומה (איור 1 וטבלה 2).

בנוסף, החיסון של סמן הסיליום העיקרי, Arl13b, מראה כי שיעור ההשתייכות של GCP ב DIV 2 של התרבות היה ~ 18% הן ברכב- והן בקבוצות שטופלו ב- SAG (DMSO: 17.35% ± 0.59%; SAG: 18.24% ± 0.88%. שיעור ההשתייכות מומחש כאחוז ה-GCPs המביעים את ה-Pax6 הנושאים ציליום ראשוני (Arl13b-positive) על פני התא ב-DIV 2 לאחר אלקטרופורציה (איור 2 וטבלה 3).

כדי לפענח את מסלול האיתות Hh התלוי בסיליום הראשי, אגוניסט של Smo, SAG, שימש להפעלת מסלול האיתות HH. עם הפעלת מסלול Hh, קולטן Smo מועשר באקזונמה של הסיליום14 העיקרי. התוצאות שלנו מראות לוקליזציה מוגברת באופן משמעותי של Smo-EGFP על האקסונמה העיקרית של תאי GCP המביעים את הסיליום ב- Pax6 המבטאים את הטיפול ב- PCP במהירות 24 שעות לאחר טיפול SAG (איור 3, נתוני כימות ששונו מעבודה קודמת6), מה שמצביע על הפעלה עמוקה של מסלול האיתות הראשי של Hh התלוי בסיליום.

Figure 1
איור 1: מערך אלקטרופורציה ויעילות האלקטרופורציה של GCPs. (א) מערך אלקטרופורציה. נכון, ראש חץ שחור מציין קובט אלקטרופורציה. (ב, ג) תמונות מייצגות מתארות את יעילות האלקטרופורציה של וקטור Smo-EGFP שנקבע על ידי כימות אחוז התאים החיוביים ל- GFP בכל תאי ה- GCP המביעים את ה- Pax6 (טבלה 2). תמונות מייצגות מתארות את האותות הפלואורסצנטיים הירוקים בתאי GCP המביעים Pax6 (סגולים) ב- DIV 2 לאחר אלקטרופורציה לאחר טיפול של 24 שעות עם (B) DMSO ו- (C) SAG. גרעינים סומנו עם DAPI (כחול). סרגלי קנה מידה = 20 מיקרומטר. קיצורים: GCPs = מבשרי תאי גרגר; GFP = חלבון פלואורסצנטי ירוק; Pax6 = חלבון קופסה מזווגת-6; DIV = יום במבחנה; DMSO = דימתיל סולפוקסיד; SAG = אגוניסט חלק; DAPI = 4',6-דימידינו-2-פנילינדולה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: אחוז ההשתייכות ב- DIV 2 של התרבות הראשית של GCP. (A, B) תמונות מייצגות מתארות את אחוז ההשתייכות ב- DIV 2 של התרבות הראשית של GCP. תמונות מייצגות מתארות את הריסים העיקריים (ירוקים) בתאי GCP המביעים Pax6 (אדומים) ב- DIV 2 לאחר אלקטרופורציה לאחר טיפול של 24 שעות עם (A) DMSO ו- (B) SAG. גרעינים סומנו עם DAPI (כחול). הסיליום הראשי (ירוק) מסומן על-ידי ראשי חץ לבנים. סרגלי קנה מידה = 20 מיקרומטר. (ג) גרף מדגים נתוני כימות של 4 ניסויים עצמאיים. ניתוח סטטיסטי, מבחן T של סטודנט לא מזווג. קווי שגיאה מתארים ±SEM. קיצורים: GCP = מבשר תא גרגר; Pax6 = חלבון קופסה מזווגת-6; DIV = יום במבחנה; DMSO = דימתיל סולפוקסיד; SAG = אגוניסט חלק; DAPI = 4',6-דימידינו-2-פנילינדולה; n.s. = לא משמעותי; SEM = שגיאה סטנדרטית של הממוצע; Arl13b = חלבון דמוי גורם ריבוסילציה ADP 13B. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: לוקליזציה מוגברת של Smo על הסיליום העיקרי של תאי GCP המבטאים את Pax6 בעת טיפול SAG. (A) תמונות מייצגות מתארות את הלוקליזציה של Smo-EGFP (ירוק) על הסיליום הראשי (תיבה מרובעת אדומה ולבנה) בתאי GCP מבטאים Pax6 ב- DIV 2 לאחר אלקטרופורציה לאחר טיפול של 24 שעות עם DMSO ו- SAG. גרעינים סומנו עם DAPI (כחול). סרגלי קנה מידה = 5 מיקרומטר. (B) גרף מדגים נתוני כימות של 4 ניסויים עצמאיים. ניתוח סטטיסטי, מבחן T של סטודנט לא מזווג. P ≤ 0.001. קווי שגיאה מתארים ± SEM. סה"כ n עבור קבוצת DMSO = 97, סה"כ n עבור קבוצת SAG = 130. איור 3B שונה מ- 6. קיצורים: GCP = מבשר תא גרגר; Smo = החלקה; Pax6 = חלבון קופסה מזווגת-6; DIV = יום במבחנה; DMSO = דימתיל סולפוקסיד; SAG = אגוניסט חלק; DAPI = 4',6-דימידינו-2-פנילינדולה; SEM = שגיאה סטנדרטית של הממוצע; Arl13b = חלבון דמוי גורם ריבוסילציה ADP 13B. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

הגדרת דופק נוקב הגדרת העברת דופק
GCPs ראשיים של עכבר נוירונים ראשוניים GCPs ראשיים של עכבר נוירונים ראשוניים
מתח 275 V 275 V 20 וולט 20 וולט
אורך 1 אלפיות השנייה 0.5 אלפיות השנייה 50 אלפיות השנייה 50 אלפיות השנייה
מרווח זמן 50 אלפיות השנייה 50 אלפיות השנייה 50 אלפיות השנייה 50 אלפיות השנייה
לא. 2 2 5 5
תעריף D 10% 10% 40% 40%
קוטביות + + ± ±

טבלה 1: הפרמטרים electroporation של GCPs הראשי של העכבר נוירונים ראשוניים באמצעות סופר אלקטרופורט NEPA21 סוג II. קיצור: GCP = מבשר תא גרגר.

יעילות אלקטרופורציה Exp. 1 (n = 486) Exp. 2 (n = 1314) Exp. 3 (n = 704) Exp. 4 (n = 476) ממוצע
קבוצה שטופלה ב- DMSO 90.57% ± 10.12% 96.62% ± 3.09% 98.89% ± 0.97% 90.72% ± 11.31% 94.02% ± 1.36%
קבוצה שטופלו ב- SAG 91.8% ± 8.69% 79.97% ± 2.77% 89.35% ± 5.67% 88.59% ± 13.54% 87.42% ± 1.71%
יעילות אלקטרופורציה ממוצעת 91.31% ± 7.99% 88.27% ± 10.81% 94.12% ± 6.36% 89.65% ± 11.21% 90.84% ± 0.84%

טבלה 2: יעילות אלקטרופורציה של וקטור Smo-EGFP מוגדר על ידי שכפול של ההשפעת של תאים חיוביים GFP בכל תאי GCP המביעים את ה- Pax6. נתונים של ארבעה ניסויים עצמאיים (Exp.) מוצגים. (סה"כ n = 2980). קיצורים: Smo = החלקה; GFP = חלבון פלואורסצנטי ירוק; GCP = מבשר תא גרגר; Pax6 = חלבון קופסה מזווגת-6.

אקספוננציה 1 הוצאה 2 הוצאה 3 אקספוננציה 4 ממוצע
שיעור השתייכות - DMSO 18.88% ± 3.61% 19.58% ± 7.42% 16.60% ± 1.48% 14.35% ± 7.99% 17.35% ± 0.59%
שיעור השתייכות - SAG 13.93% ± 3.39% 17.30% ± 2.15% 22.19% ± 10.35% 19.56% ± 1.15% 18.24% ± 0.88%

טבלה 3: אחוז ההצמדה ב- DIV 2 של התרבות הראשית של GCP. נתונים של ארבעה ניסויים עצמאיים (Exp.) מוצגים. (סה"כ n עבור קבוצת DMSO = 1169, סה"כ n עבור קבוצת SAG = 816). קיצורים: GCP = מבשר תא גרגר; DIV = יום במבחנה; DMSO = דימתיל סולפוקסיד; SAG = אגוניסט מוחלק.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

טרנספקטציה של טרנסג'נים בתרבות GCP ראשונית על ידי שיטת אלקטרופורציה קשורה בדרך כלל עם כדאיות תאים נמוכה ויעילות טרנספקטיבה ירודה9,10. מאמר זה מציג פרוטוקול אלקטרופורציה חסכוני וניתן לשחזור שהפגין יעילות גבוהה וכדאיות. בנוסף, אנו גם מדגימים שיטה פשוטה של לימוד מסלול האיתות Hh התלוי בסיליום העיקרי בתאי GCP ראשוניים.

שיטות אלקטרופורציה נפוצות אחרות דורשות לעתים קרובות ריאגנטים אלקטרופורציה ספציפיים לתאים יקרים שיש לרכוש מיצרנים ספציפיים. השיטה המתוארת כאן נחשבת חיובית שכן היא משתמשת ריאגנט אלקטרופורציה נפוץ וחסכוני עבור סוגי תאים שונים. יתר על כן, נתונים אלה הראו כי יעילות האלקטרופורציה הגיעה ~ 80-90%, וזה יעיל מאוד בהשוואה לשיטות אלקטרופורציה וטרנספקטיה אחרות9,10.

כדי לשמור על כדאיות תאים גבוהה יותר, ישנם כמה צעדים קריטיים שיש לקחת בחשבון. יש להשלים את הליכי ניתוח המוח הקטן והדיסוציאציה בתוך חלון הזמן הקצר ביותר האפשרי של 1-2 שעות. צעד קריטי נוסף הוא למנוע היווצרות בועות בתערובת אלקטרופורציה של תאי פלסמיד לפני פולסים במהלך אלקטרופורציה. לאחר פולסים, מדיום תרבות טרום המלחמה צריך להיות מתווסף מיד לתוך cuvettes ואת התאים זרעו מהר ככל האפשר. התאים חייבים להיות ללא הפרעה בזריעת התאים הראשונה של 3 שעות לאחר. אמצעי הזהירות הנ"ל ישפרו את הכדאיות התאית עד כ 70-80% ביום השני של התרבות.

מגבלה בולטת אחת של לימוד הסיליום העיקרי בפלטפורמת התרבות העיקרית היא ששיעור ההשתייכות בתאים מתורבתים הוא בדרך כלל נמוך מזה שנצפה ב- vivo. נתונים קודמים 6 הראו כי שיעור ההסתבכות ב-GCP הן ב-E15.5 והן ב-P15 היה כ-60%-80%. לעומת זאת, שיעור ההבחנה במבחנה בתרבות GCP העיקרית היה ~ 20%6. עם זאת, זוהי תופעה כללית שניתן להבחין בה ברוב סוגי התאים (אם לא כולם) כאשר משווים את קצב ההשתייכות בין הפריה חוץ גופית לבין מחקרי ויוו .

ראוי לציין, שיטה זו חלה גם על תרבויות ראשוניות אחרות כגון תאי אב עצביים ותרבות נוירונים קליפת המוח וההיפוקמפוס, אשר ניתן להשיג על ידי שינוי הפרמטר electroporation, כלומר, מתח דופק חיטוט, אורך, ומספר פולסים. כדי להרחיב את היישום של פרוטוקול זה לשדה מחקר רחב יותר, הפרמטרים המומלצים אלקטרופורציה עבור נוירונים ראשוניים מסופקים בטבלה 1. בנוסף, ריאגנט האלקטרופורציה האוניברסלי, כלומר Opti-MEM המשמש בפרוטוקול זה מסייע גם להימנע ממאמץ אופטימיזציה מייגע נוסף בהשוואה לפרוטוקולים אלקטרופורציה אחרים הדורשים אופטימיזציה ביחס לתאימות ריאגנטים. פרוטוקול אלקטרופורמציה ממוטב וחסכוני זה לחקירה של איתות הסיליום הראשי ו- Hh בתרבויות GCP ראשוניות יכול לשמש כהליך התייחסות למחקרים ראשוניים אחרים הקשורים לסיליום באמצעות תרבויות ראשוניות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.

Acknowledgments

מחקר זה נתמך על ידי קרן הזרעים HKBU ומענק הסטארט-אפ Tier-2 (RG-SGT2/18-19/SCI/009), קרן מחקר מועצת המחקר השיתופית של המועצה למענק מחקר (CRF-C2103-20GF) ל- C.H.H. Hor.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
GCP Culture
B27 supplement Life Technologies LTD 17504044
Cell strainer, 70 µm Corning 352350
DNase I from bovine pancreas Roche 11284932001
Earle’s Balanced Salt Solution Gibco, Life Technologies 14155063
FBS, qualified Thermo Scientific SH30028.02
GlutamMAXTM-I ,100x Gibco, Life Technologies 35050061 L-glutamine substitute
L-cysteine Sigma Aldrich C7352
Matrigel BD Biosciences 354277 Basement membrane matrix
Neurobasal Gibco, Life Technologies 21103049
Papain,suspension Worthington Biochemical Corporation LS003126
Poly-D-lysine Hydrobromide Sigma Aldrich P6407
SAG Cayman Chemical 11914-1 Smoothened agonist
IF staining
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A7906
Paraformaldehyde Sigma Aldrich P6148
Triton X-100 Sigma Aldrich X100
Primary antibody mix
Anti-GFP-goat ab Rockland 600-101-215 Dilution Factor: 1 : 1000
Anti-Arl13b mouse monoclonal ab NeuroMab 75-287 Dilution Factor: 1 : 1000
Anti-Pax6 rabbit polyclonal ab Covance PRB-278P Dilution Factor: 1 : 1000
Secondary antibody mix
Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG Invitrogen A-11055 Dilution Factor: 1 : 1000
Alexa Fluor 555 donkey anti-mouse IgG Invitrogen A-31570 Dilution Factor: 1 : 1000
Alexa Fluor 647 donkey anti-rabbit IgG Invitrogen A-31573 Dilution Factor: 1 : 1000
DAPI Thermo Scientific 62247 Dilution Factor: 1 : 1000
Electroporation
CU 500 cuvette chamber Nepagene CU500
EPA Electroporation cuvette (2 mm gap) Nepagene EC-002
Opti-MEM Life Technologies LTD 31985070 reduced-serum medium for transfection
pEGFP-mSmo Addgene 25395
Super Electroporator NEPA21 TYPE II In Vitro and In Vivo Electroporation Nepagene NEPA21 electroporator

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chang, C. H., et al. Atoh1 controls primary cilia formation to allow for SHH-triggered granule neuron progenitor proliferation. Developmental Cell. 48 (2), 184-199 (2019).
  2. Dahmane, N., Ruizi Altaba, A. Sonic Hedgehog regulates the growth and patterning of the cerebellum. Development. 126 (14), 3089-3100 (1999).
  3. Lewis, P. M., Gritti-Linde, A., Smeyne, R., Kottmann, A., Mcmahon, A. P. Sonic Hedgehog signaling is required for expansion of granule neuron precursors and patterning of the mouse cerebellum. Developmental Biology. 270 (2), 393-410 (2004).
  4. Wechsler-Reya, R. J., Scott, M. P. Control of neuronal precursor proliferation in the cerebellum by Sonic Hedgehog. Neuron. 22 (1), 103-114 (1999).
  5. Bangs, F., Anderson, K. V. Primary cilia and mammalian Hedgehog signaling. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (5), 028175 (2017).
  6. Hor, C. H. H., Lo, J. C. W., Cham, A. L. S., Leung, W. Y., Goh, E. L. K. Multifaceted functions of Rab23 on primary cilium- and Hedgehog signaling-mediated cerebellar granule cell proliferation. Journal of Neuroscience. 41 (32), 6850-6863 (2021).
  7. Han, Y. G., et al. Dual and opposing roles of primary cilia in medulloblastoma development. Nature Medicine. 15 (9), 1062-1065 (2009).
  8. Spassky, N., et al. Primary cilia are required for cerebellar development and Shh-dependent expansion of progenitor pool. Developmental Biology. 317 (1), 246-259 (2008).
  9. Wang, T., Larcher, L., Ma, L., Veedu, R. N. Systematic screening of commonly used commercial transfection reagents towards efficient transfection of single-stranded oligonucleotides. Molecules. 23 (10), 2564 (2018).
  10. Chicaybam, L., et al. An efficient electroporation protocol for the genetic modification of mammalian cells. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 99 (2017).
  11. Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Chiara Manzini, M. Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (23), e990 (2009).
  12. Mizoguchi, T., et al. Impaired cerebellar development in mice overexpressing VGF. Neurochemical Research. 44 (2), 374-387 (2019).
  13. Zhou, Y. Confocal imaging of nerve cells. Current Laboratory Methods in Neuroscience Research. , Springer. New York, NY. 235-247 (2014).
  14. Corbit, K. C., et al. Vertebrate Smoothened functions at the primary cilium. Nature. 437 (7061), 1018-1021 (2005).

Tags

מדעי המוח בעיה 177 ריסים ראשיים מבשר גרגיר המוח הקטן אלקטרופורציה במבחנה מסלול איתות קיפוד תרבות GCP ראשונית החלקה
שיטת אלקטרופורמציה יעילה וחסכונית לחקר מסלולי איתות ראשוניים תלויי סיליום במבשר תאי הגרגיר
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lo, J. C. W., Wong, W. L., Hor, C.… More

Lo, J. C. W., Wong, W. L., Hor, C. H. H. Efficient and Cost Effective Electroporation Method to Study Primary Cilium-Dependent Signaling Pathways in the Granule Cell Precursor. J. Vis. Exp. (177), e63283, doi:10.3791/63283 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter