Summary
Dit protocol schetst een methode voor het efficiënt extraheren van levende nematoden uit natuurlijke substraten in het veld.
Abstract
Naast robuuste experimentele modelorganismen zijn Caenorhabditis elegans en zijn verwanten ook echte dieren die in de natuur leven. Studies van wilde nematoden in hun natuurlijke omgeving zijn waardevol voor het begrijpen van vele aspecten van de biologie, waaronder de selectieve regimes waarin onderscheidende genomische en fenotypische karakters evolueren, de genetische basis voor complexe variatie in eigenschappen en de natuurlijke genetische diversiteit die fundamenteel is voor alle dierpopulaties. Dit manuscript beschrijft een eenvoudige en efficiënte methode voor het extraheren van nematoden uit hun natuurlijke substraten, waaronder rottende vruchten, bloemen, schimmels, bladafval en grond. De Baermann trechtermethode, een klassieke nematologietechniek, isoleert selectief actieve nematoden uit hun substraten. Omdat het bijna alle actieve wormen uit het monster herstelt, maakt de Baermann-trechtertechniek het herstel mogelijk van zeldzame en langzaam groeiende genotypen die samen voorkomen met overvloedige en snelgroeiende genotypen, die kunnen worden gemist in extractiemethoden waarbij meerdere generaties reproductie betrokken zijn. De techniek is ook zeer geschikt om metagenetische, populatie-genetische en ecologische vragen aan te pakken. Het vangt de hele populatie tegelijkertijd in een steekproef, waardoor een onbevooroordeeld beeld ontstaat van de natuurlijke verdeling van leeftijden, geslachten en genotypen. Het protocol maakt inzet op schaal in het veld mogelijk, waarbij substraten snel worden omgezet in wormplaten, en de auteurs hebben het gevalideerd door veldwerk op meerdere continenten.
Introduction
Waardevolle biologische inzichten komen naar voren als onderzoekers die C. elegans in het laboratorium bestuderen hun focus uitbreiden naar C. elegans en gerelateerde rhabditid-nematoden in het wild. Studies van wilde nematoden plaatsen genen en genomen in hun natuurlijke context en onthullen functies die mogelijk worden verduisterd door laboratoriumomstandigheden1,2,3,4,5. Deze studies genereren inzicht in de voorwaarde voor evolutie zelf, genetische variatie6,7,8,9,10. De natuurlijke genetische variatie die door wilde monsters wordt vastgelegd, biedt ook ingangen in de genetische basis van veel complexe eigenschappen11,12,13.
Bij het ontwerpen van studies die de isolatie van natuurlijke populaties van nematoden vereisen, met name bij het uitvoeren van veldwerk op afstand, komen praktische overwegingen naar voren. Dit protocol is bedoeld om hele populaties actieve nematoden die op OP50 kunnen worden gekweekt, netjes te isoleren van aas of wilde substraten. De methode is zeer geschikt voor het extraheren van vrijlevende rhabditid en diplogasterid nematoden, waaronder Caenorhabditis, Oscheius en Pristionchus.
Er zijn veel technieken om nematoden te isoleren van hun substraten14,15. De meest basale benadering is om het substraat direct op een nematode-medium plaat te plaatsen en dieren te plukken terwijl ze eruit kruipen8,15. Deze methode vereist grote hoeveelheden tijd en arbeid als het doel is om alle nematoden uit een monster te isoleren. Meer geavanceerde technieken maken gebruik van het gewicht, de grootte, de mobiliteit of een combinatie van deze dieren14. Elke methode heeft zijn voor- en nadelen op het gebied van installatie en doorvoer. Ze verschillen ook in hun bemonsteringsbias en kunnen voor bepaalde nematoden kiezen als de dieren in het monster variëren langs de as van het scheidingsprincipe van de methode.
De Baermann-trechtermethode werd voor het eerst beschreven in 1917 door de Nederlandse arts G. K. T. F. Baermann, die het apparaat op Java uitvond tijdens het bestuderen van bodembewonende nematoden, waaronder de parasitaire haakworm16. De Baermann trechter functioneert op basis van het principe van mobiliteit. Het substraat wordt in een trechter geplaatst die is bekleed met een doek of papieren filter (voor deze studie wordt een "Kimwipe" gebruikt, in het huidige protocol "pluisvrij doekje" genoemd) en aan de onderkant dichtgedicht. De trechter wordt vervolgens gevuld met water, waardoor het monster wordt ondergedompeld terwijl het filter het scheidt van de afgesloten uitlaat. Actieve nematoden in het monster laten zich los in het water en zwemmen door het filter en bezinken uiteindelijk op de bodem van de trechter. De trechteruitlaat wordt geopend en een druppel nematoden wordt op een plaat uitgestoten (figuur 1).
Figuur 1: Samenvatting van de Baermann-trechtertechniek. (A) Het verzamelen van een bacterierijk monster van een interessante locatie. (B) Het monster onderdompelen in een Baermann-trechter en wachten tot de wormen eruit wringen en zinken. (C) Het vrijgeven van een enkele druppel uit de trechter. (D) Het verplaatsen van enkele hermafrodieten of gepaarde vrouwtjes naar afzonderlijke platen. Illustratie gemaakt door Ramin Rahni. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
De Baermann-trechter werkt niet voor elk soort nematode (zie het gedeelte Discussie voor specifieke alternatieven) en is het meest geschikt voor die actieve vormen in het groottebereik van Caenorhabditis of kleiner14. Als een studie echter de Baermann-trechter kan gebruiken, zijn er veel voordelen. De methode is praktisch in het veld en vereist beperkte installatie, hands-on tijd en kosten. De onderzoeker blijft achter met een schoon monster zonder de obstructie van het substraat op de plaat, wat het plukken gemakkelijk maakt. Het gebruik van een filter voorkomt ook besmetting van de plaat door insectenlarven of mijten, die borden kauwen of jagen op nematoden in het monster. Het belangrijkste is dat de Baermann-trechter bijna de hele populatie efficiënt uit het substraat haalt14, wat nodig kan zijn afhankelijk van het ontwerp van de studie. Onderzoekers die bijvoorbeeld geïnteresseerd zijn in het tellen van het stadium of de geslachtsverdeling van wilde populaties, het vinden van langzaam groeiende of zeldzame genotypen of het bemonsteren van nematoden die niet worden aangetrokken door OP50, kunnen baat hebben bij deze methode. Dit is geschikt voor onderzoekers die ecologische17, populatiegenetische18 of metagenetische19 vragen bestuderen, omdat het bemonsteringsschema een momentopname maakt van de populatie op het bemonsteringstijdstip.
Het huidige manuscript beschrijft een compleet protocol voor het isoleren van populaties van nematoden met behulp van de Baermann-trechter en het vaststellen van isofemale- en isohermafrodietlijnen in het veld, met behulp van apparatuur die is gekozen voor eenvoudig transport. Voor onderzoekers die veldwerk uitvoeren in de buurt van hun laboratoria, kunnen veel van deze stappen worden weggelaten of vereenvoudigd.
Protocol
1. Bereiding van gezaaide NGM-platen in het veld
- Weeg voor vertrek 23,005 g Nematode Growth Medium (NGM) (zie Tabel met materialen) poeder en verpak deze voor in een afsluitbare plastic zak. Maak één zak voor elke liter media die gewenst is.
OPMERKING: Voorverpakking voor op reis omzeilt de noodzaak van een functionele balans in het veld. - Bereid voorafgaand aan de reis 1 ml 1M MgSO4, 1 ml 1M CaCl2 en 25 ml 1M kaliumfosfaatbuffer voor elke liter gewenste media. Om 1 l kaliumfosfaatbuffer te maken, lost u 108,3 g KH2PO4 en 35,6 g K2HPO4 op in water, zoals beschreven in WormBook20.
- Maak voor de reis een nachtcultuur van OP50 (zie Tabel met materialen) gekweekt in LB bij 37 °C, zoals beschreven in WormBook20. Vul de cultuur in conische buizen van 50 ml en wikkel de toppen met paraffinefilm om lekkage te voorkomen.
- Los in het veld de inhoud van het NGM-pakket op in 973 ml dubbel gedestilleerd water (ddH20) of het zuiverste, meest steriele water dat beschikbaar is in een kolf of fles van 1 L.
- Plaats de mediafles of fles, met een losse dop of deksel van aluminiumfolie, in een kokend heetwaterbad op een kookplaat of fornuis. Roer af en toe totdat al het poeder is opgelost en helder is (dit duurt ~ 30 min).
OPMERKING: Als er een magnetische kookplaat beschikbaar is, is een roerstaaf een uitstekende optie om de hoeveelheid handmatig roeren te beperken. - Haal de media uit het waterbad en laat afkoelen tot ~58 °C met af en toe schudden of met een roerstaaf. Zodra de media zijn afgekoeld tot 58 ° C, gebruikt u serologische of standaardpipetten om 25 ml 1M kaliumfosfaatbuffer, 1 ml 1M MgSO4 en 1 ml 1M CaCl2 toe te voegen, waarbij goed wordt gemengd tussen elke stap.
- Pipetteer of giet de media in de meest steriele omgeving die beschikbaar is in platen van de gewenste grootte en laat 's nachts afkoelen en stollen. Giet één plaat van 60 mm (~ 10 ml) voor elk substraatmonster. Giet een plaat van 35 mm (~ 3,5 ml) voor elke isomembraanlijn; het aantal benodigde kleine platen is vooraf moeilijk te voorspellen.
- Pipetteer 50 μL OP50-cultuur op elke plaat en laat deze een nacht drogen en groeien voor gebruik.
2. Verzameling van de nematodensubstraten
- Identificeer een bacterierijk substraat in het veld. Enkele voorbeelden zijn rottend fruit, bloemen, schimmels en stengels van kruidachtige planten. Grond en bladstrooisel zijn ook geschikt, hoewel ze zelden Caenorhabditis bevatten.
- Plaats met een gehandschoende hand een monster van dit substraat (1-15 cm3) in een afsluitbare plastic zak (zie Tabel met materialen) gelabeld met een unieke monster-ID (figuur 1A).
- Noteer de monster-ID, breedtegraad, lengtegraad, datum, beschrijving van het substraat en alle andere lokale omgevingsmetingen die relevant zijn voor het experiment, inclusief omgevings- en substraattemperatuur, tijdstip van verzameling, toestand van substraat, aanwezigheid van substraat-geassocieerde macro-ongewervelde dieren, enzovoort. Er is een smartphone-app beschikbaar om dit proces te stroomlijnen21.
3. Voorbereiding van een reeks Baermann-trechters
- Gebruik voor elke trechter een schaar om een segment rubberen buizen (zie Materialentabel) van ~ 3 cm lang te knippen.
- Plaats het buissegment over het uiteinde van een plastic trechter (zie Tabel met materialen). Dit kan enige moeite kosten omdat de pasvorm erg strak is.
- Schuif een buisklem over de rubberen buis en klem deze dicht.
- Om een trechterhouder te maken, gebruikt u een scalpel om cirkelvormige gaten met een diameter van 35 mm te snijden in de bodem van een kartonnen fly-flaconbak (zie Tabel met materialen) die niet is samengevouwen vanuit de vlakke verzendrichting. Een standaard tray biedt plaats aan 12 van deze gaten in een 3 x 4 array.
- Keer het karton om, vouw de zijkanten één keer naar beneden (niet twee keer, zoals men zou doen om een vliegenflaconbak te maken) en plak de zijkanten aan elkaar om de omgekeerde kartonnen lade te verheffen (figuur 2).
- Plaats trechters in de gaten en zorg er eerst voor dat de buisklemmen in de gesloten positie staan.
Figuur 2: Hergebruikte kartonnen vliegenflaconbakken, gevouwen en gesneden om elk 12 Baermann-trechters te ondersteunen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
4. Overdracht van monsters in de trechters
- Giet water (zo steriel als beschikbaar) in elke trechter en vul het ongeveer 3 cm onder de rand. Als er luchtbellen in de buis zitten, tikt u op de trechter om ze los te laten.
- Plaats met gehandschoende handen een pluisvrij doekje of specifiek een Kimwipe (doormidden gevouwen om een vierkant te maken) over de trechter en druk op het midden zodat het in het water wordt ondergedompeld.
- Breek handmatig grote vaste stukken natuurlijke substraten (fruit, bloem, aarde, bladstrooisel, enz.) in kleinere fragmenten om de afstand te minimaliseren die wormen moeten afleggen om uit het substraat te vallen.
OPMERKING: Bladstrooisel en onhandig gevormde monsters kunnen worden voorbewerkt in een keukenmachine of blender. - Plaats voorzichtig een monster van het natuurlijke substraat (1-15 cm3) op het weefsel/ pluisvrije doekje in een trechter zonder het weefsel te doorboren en zonder dat het monster boven de rand uitsteekt.
- Label de trechter, of het karton naast de trechter, met de voorbeeld-ID die overeenkomt met veldverzamelingsnotities.
- Vouw de hoeken van het weefsel/pluisvrije doekje over het monster (figuur 1B). Zorg ervoor dat het monster zich in het weefsel / pluisvrije doekje bevindt, zodat er geen vuil of vuil naar de bodem van de trechter kan gaan.
OPMERKING: Deze stap is om te voorkomen dat de hoeken over de rand van de trechter draperen, waar ze het water uit de trechter over de zijkanten zouden afvoeren. - Kies met handen, een spatel of een pipetpunt alle actieve insecten, duizendpoten of andere dieren die van trechter naar trechter kunnen reizen en monsters kruisbesmetten. Wikkel het weefsel/pluisvrije doekje volledig rond het monster of leg een tweede weefsel over de bovenkant van het monster om kruisbesmetting te voorkomen.
- Voeg meer water toe aan trechters zodat het hele monster onder water komt te staan (figuur 3).
Figuur 3: Geassembleerde Baermann trechters. Elk monster wordt gewikkeld in weefsel / pluisvrij doekje en ondergedompeld onder water in de trechter, die wordt dichtgeklemd. Gedurende een periode van ~ 12 uur migreren de nematoden door het weefsel en naar de bodem van de trechter. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
5. Extractie van nematoden uit de trechters
- Wacht tot ~ 12 uur of 's nachts. Gedurende deze tijd zullen actieve wormen uit het substraat wringen, door het weefsel / pluisvrije doekje en naar de bodem van de geklemde trechter.
OPMERKING: Veel langer dan 12 uur wachten riskeert wormsterfte als gevolg van hypoxie of pathogene infectie, wat ook een risico kan zijn bij kortere duur voor monsters die bijzonder vol zitten met wormen en bacteriën. - Schrijf de monster-ID van een trechter op de bodem van een 60 mm NGM-wormplaat gezaaid met een vlek van OP50 E. coli-bacteriën . Haal het deksel van de plaat.
- Verwijder de trechter met dat monster uit de trechterstandaard. Gebruik met één hand om de trechter rechtop boven de open wormplaat te houden en gebruik de andere hand om druk op de buisklem los te laten, waardoor één druppel water uit de buis op de wormplaat kan vallen (figuur 1C). Zodra er water uit de trechter valt, klemt u deze snel weer dicht om overstroming van de NGM-plaat te voorkomen.
OPMERKING: Om wormen te selecteren die worden aangetrokken door OP50, waaronder Caenorhabditis-soorten , laat u de druppel los van het bacteriële gazon. Wanneer het water in de plaat trekt of verdampt, zullen Caenorhabditis-nematoden in het bacteriële gazon kruipen. - Opruimen: Gooi de inhoud van de trechters weg. Was de trechters met heet water voor later hergebruik.
6. Vaststelling van de culturen
- Observeer de geïsoleerde nematoden onder de stereomicroscoop bij een vergroting van 5x-50x. De platen moeten nematoden bevatten, en bij veel lagere frequenties, kleine oligochaete anneliden, beerdiertjes, raderdiertjes en kleine schaaldieren (figuur 4).
OPMERKING: Als de trechter correct is ingesteld, zullen er geen mijten, insecten of zichtbaar niet-levend materiaal door de trechter zijn gekomen.
Figuur 4: Inhoud van de eerste druppel die uit een Baermann-trechter op een NGM-plaat wordt vrijgegeven. Klik hier voor een grotere versie van deze figuur.
- Om isohermafrodiet- of isoofemalelijnen vast te stellen, gebruikt u een wormenplectrum om elke L4-hermafrodiet of gedekte volwassen vrouw (herkenbaar aan hun grotere lichaamsgrootte en gebrek aan de verschillende mannelijke staart22) over te brengen naar een afzonderlijke 35 mm NGM-plaat gezaaid met OP50 (figuur 1D). Gebruik een aansteker om de wormenpluk te steriliseren voor en na het overbrengen van wormen.
- Gebruik paraffinefolie om platen grondig in te pakken voor op reis.
Representative Results
Dit protocol werd gebruikt om nematoden te isoleren van fruit, bloemen, schimmels, grond en stengels op Barro Colorado Island, Panamá, in het veldstation van het Smithsonian Tropical Research Institute in augustus 2018. Van de 131 substraten die gedurende vier dagen door een enkele onderzoeker werden verwerkt, leverden 130 substraten (99,2%) nematoden op. Vierenveertig van de substraten (33,6%) leverde Caenorhabditis nematoden op (figuur 5). Latere analyse van culturen die uit deze vierenveertig substraten zijn vastgesteld, door PCR en paringstests23, onthulde de aanwezigheid van zes verschillende Caenorhabditis-soorten - C. becei, C. tropicalis, C. briggsae, C. sp. 24, C. sp. 57 en C. panamensis.
Dit protocol werd opnieuw gebruikt om nematoden te isoleren van verschillende substraten in de uitsluitingszone van Tsjernobyl, Oekraïne, gedurende vier dagen in augustus 2019. Levende wormen werden teruggevonden uit 62 van de 63 bodemmonsters, 1 op de 17 ongewervelde monsters, 31 van de 75 fruitmonsters, 1 op de 12 aasmonsters (zie discussiesectie) en er werden geen wormen teruggevonden uit monsters van paddenstoelen, rivierriet of wolven (één monster verzameld van elk). Daaropvolgende sequencing van 18S ribosomaal DNA15 identificeerde deze nematoden als Oscheius, Panagrolaimus, Acrobeloides, Mesorhabditis, Panagrellus, Pristionchus en Pelodera, maar er werd geen Caenorhabditis geïdentificeerd (figuur 5).
Figuur 5: Slagingspercentages van twee ophaalreizen. Panama in 2018 (links) en Oekraïne in 2019 (rechts). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
Het centrale principe van deze methode is dat nematoden door het weefsel gaan dat ondergedompeld is in water, terwijl hun substraat en grotere ongewervelde verontreinigingen dat niet zullen doen. De kritieke stappen van het protocol zijn (1) het verzamelen van een geschikt substraat, (2) het onderdompelen van het substraat, gewikkeld in een filtermateriaal, in water, (3) het verzamelen van wormen die door het filter zijn gegaan en naar de bodem van het water zijn gezonken, en (4) het isoleren van individuele wormen om isoofemale- of isohermafrodietlijnen te creëren. Alle andere delen van de methode kunnen indien nodig worden aangepast aan de beschikbare middelen, de aard van de substraten of de veldwerkdoelen. Enkele wijzigingen die het overwegen waard zijn, zijn als volgt.
De wormen lokken door fruit te planten
Als er op de veldplaats niet voldoende bacterierijk rottend materiaal te vinden is, kan men een monster, zoals een stuk appel of tomaat, meenemen om te laten rotten. Pin het aas goed vast met een paar staken zodat grotere dieren ze niet verwijderen en het later gemakkelijk kan worden gevonden om te verzamelen. Vermijd direct zonlicht, waar het aas kan drogen voordat het gaat rotten.
Het bouwen van trechterapparatuur uit alle beschikbare materialen
Elke structuur met gaten die groot genoeg zijn om de buisklem te huisvesten en stabiel genoeg om een topzware trechter te ondersteunen, zal werken. Voor een enkele trechter is een drinkglas een geschikte houder. Elk soort tissue - gezichtsdoekjes, toiletpapier of papieren handdoeken - kan worden gebruikt.
Minder materiaal in trechters stoppen, of de wachttijd aanpassen, om hypoxie of infectie te voorkomen
Als het monster een zeer hoge concentratie wormen of bacteriën heeft, kunnen nematoden beginnen te sterven aan hypoxie of infectie voordat de incubatie van 12 uur is voltooid. Als dit een probleem is, kan de onderzoeker trechters eerder controleren of een extra trechter voorbereiden met een zeer kleine substeekproef van het dichtbevolkte substraat.
De NGM-plaatvoorbereiding aanpassen aan experimentele behoeften en beperkingen
NGM-platen kunnen worden bereid met alle media en voedselbronnen die geschikt zijn voor het experiment. Het hierboven beschreven veldprotocol is ontworpen om het bagagegewicht te minimaliseren. Afhankelijk van de bagagebeperkingen en de timing van het veldwerk, kan het brengen van reeds gegoten NGM-platen - voorbereid in het laboratorium of commercieel gekocht - de voorkeur hebben in plaats van platen in het veld te gieten.
Het uitvoeren van de trechterisolaties in het laboratorium
Het protocol beschrijft het uitvoeren van de volledige procedure onder veldomstandigheden om de aaltjespopulatie te vangen zoals deze in de natuur voorkomt. Voor sommige onderzoeksdoelen kan het voldoende zijn om nematoden later te isoleren, nadat ze terug naar het laboratorium zijn gereisd met monsters in verzegelde zakken. Zelfs dan biedt de Baermann-trechtermethode een schoner en completer monster van de overlevende nematoden dan andere isolatiemethoden. Monsters in verzegelde zakken kunnen echter tijdens het reizen worden geselecteerd, omdat ze worden blootgesteld aan mogelijke extreme temperaturen en hypoxie. Dit kan worden geminimaliseerd door isolaties zo snel mogelijk na monsterverzameling uit te voeren.
Een veelgebruikte alternatieve methode voor de Baermann-trechter is het plaatsen van het substraat rechtstreeks op een NGM-plaat en wachten tot wormen eruit kruipen, wat ofwel zeer arbeidsintensief is of resulteert in de onvolledige verzameling van de populatie. Het levert ook platen op die besmet zijn met mijten en insectenlarven. De Baermann-trechtermethode is een goedkope, low-tech, low-labor strategie om snel de hele populatie actieve wormen van hun substraat te scheiden.
De Baermann trechtermethode is niet universeel toepasbaar voor het verzamelen van alle soorten wilde nematoden. Sommige plantenbewonende nematoden doen er veel langer dan 12 uur over om uit hun substraat te komen en zullen afwezig zijn van een druppel die te vroeg wordt vrijgegeven, terwijl sommige insectenparasieten naar de bovenkant van de trechter kruipen in plaats van naar de bodem, waardoor ook de verzameling wordt ontweken14. Alternatieven voor de Baermann-trechter vereisen meer gespecialiseerde apparatuur of meer arbeid om de wormen te herstellen. Ze kunnen echter nog steeds de voorkeur hebben als de bovenstaande kanttekeningen een probleem zijn voor het experiment. Alternatieve opties, beoordeeld door van Bezooijen14, omvatten de trechtersproeimethode, die een constante nevel van water aan trechters biedt, zuurstof toevoegt en de overloop van bacteriën in suspensie mogelijk maakt. Dit zorgt voor een langere extractieperiode van nematoden uit planten. De blender centrifugaal flotatie methode herstelt langzaam bewegende, inactieve of opwaarts kruipende nematoden door ze te scheiden door hun soortelijk gewicht, de Oostenbrink elutriator past een onderstroom toe om bezinkend sediment te scheiden van gesuspendeerde nematoden, en Cobb's Methode gebruikt een reeks zeven om nematoden te isoleren op basis van hun grootte, vorm en sedimentatiesnelheid14. Om rhabditiden te verzamelen, produceert de Baermann-trechter echter snel en met minimale inspanning schone monsters.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenconflicten te hebben.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door NIH-beurzen R35GM141906 en R21ES031364 en Damon Runyon Fellowship DRG-2371-19.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 L glass bottle | NA | NA | Step 1 - vessel for making plate media |
| 1 mL pipette tips | any | NA | Step 1 - dispense worm media additives and seed plates |
| 1 mL pipetter | any | NA | Step 1 - dispense worm media additives and seed plates |
| 35 mm worm plates | Tritech | T3500 | Step 1 - worm plates |
| 4mm ID rubber tubing | Fisher | 14178A | Step 3 - part of the funnel |
| 60 mm worm plates | Greiner | 628161 | Step 1 - worm plates |
| 65 mm Funnel | Fisher | 22170156 | Step 3 - part of the funnel |
| Calcium chloride | Fisher | C79-500 | Step 1 - worm plate medium |
| Cooking pot | NA | NA | Step 1 - a water bath for melting the agar to pour plates |
| E. coli strain OP50 | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | Step 1 - worm food |
| Field microscope | OMAX | G223CS | Step 6 - for viewing worms in the field |
| Fly vial storage tray | Azer Scientific | ES-260T | Step 3 - to build a platform to hold 12 funnels |
| Hot plate or stove | NA | NA | Step 1 - to heat the water bath |
| Kimwipes | KimberlyClark | 34120 | Step 4 - filter for the funnels |
| LB media | Gibco | 10855021 | Step 1 - for growing OP50 |
| Lighter | NA | NA | Step 6 - sterilize the worm pick |
| Magnesium sulfate | Fisher | M63-500 | Step 1 - worm plate medium |
| NGM-lite agar | USBiological | N1000 | Step 1 - worm plate medium |
| Parafilm M wrapping film | Fisher | 13-374-10 | Step 6 - pack worm plates for travel |
| Potassium phosphate dibasic | Fisher | BP363-500 | Step 1 - worm plate medium |
| Potassium phosphate monobasic | Fisher | P285-3 | Step 1 - worm plate medium |
| scalpel | NA | NA | Step 3 - cut holes for the funnels |
| scissors | NA | NA | Step 3 - cut the rubber tubing |
| Tape | NA | NA | Step 3 - tape the funnel holder together |
| Tubing clamps | Fisher | 5869 | Step 3 - part of the funnel |
| Worm pick | NA | NA | Step 6 - for isolating individual worms |
| Ziplock-style storage bags | NA | NA | Step 2 - to bag a substrate sample |
References
- Frezal, L., Felix, M. A. C. elegans outside the Petri dish. Elife. 4, 05849 (2015).
- Greene, J. S., et al. Balancing selection shapes density-dependent foraging behaviour. Nature. 539 (7628), 254-258 (2016).
- Reddy, K. C., et al. Antagonistic paralogs control a switch between growth and pathogen resistance in C. elegans. PLOS Pathogens. 15 (1), 1007528 (2019).
- Schulenburg, H., Felix, M. A. The natural biotic environment of Caenorhabditis elegans. Genetics. 206 (1), 55-86 (2017).
- Zhang, F., et al. Caenorhabditis elegans as a model for microbiome research. Frontiers in Microbiology. 8, 485 (2017).
- Andersen, E. C., et al. Chromosome-scale selective sweeps shape Caenorhabditis elegans genomic diversity. Nature Genetics. 44 (3), 285-290 (2012).
- Cook, D. E., Zdraljevic, S., Roberts, J. P., Andersen, E. C. CeNDR, the Caenorhabditis elegans natural diversity resource. Nucleic Acids Research. 45, 650-657 (2017).
- Crombie, T. A., et al. Deep sampling of Hawaiian Caenorhabditis elegans reveals high genetic diversity and admixture with global populations. Elife. 8, 50465 (2019).
- Lee, D., et al. Balancing selection maintains hyper-divergent haplotypes in Caenorhabditis elegans. Nature Ecology & Evolution. 5 (6), 794-807 (2021).
- Rockman, M. V., Kruglyak, L. Recombinational landscape and population genomics of Caenorhabditis elegans. PLOS Genetics. 5 (3), 1000419 (2009).
- Evans, K. S., van Wijk, M. H., McGrath, P. T., Andersen, E. C., Sterken, M. G. From QTL to gene: C. elegans facilitates discoveries of the genetic mechanisms underlying natural variation. Trends in Genetics. 37, 933-947 (2021).
- Gaertner, B. E., Phillips, P. C. Caenorhabditis elegans as a platform for molecular quantitative genetics and the systems biology of natural variation. Genetics Research (Cambridge Core). 92 (5-6), 331-348 (2010).
- Noble, L. M., Rockman, M. V., Teotonio, H. Gene-level quantitative trait mapping in Caenorhabditis elegans. G3 Genes|Genomes|Genetics. 11 (2), 061 (2021).
- Van Bezooijen, J. Methods and techniques for nematology. , Wageningen University. (2006).
- Barrièrre, A., Félix, M. -A. Isolation of C. elegans. and related nematodes. Wormbook. , wormbook.1.115.2 (2014).
- Baermann, G. Eine einfache Methode zur Auffindung von Anklostomum (Nematoden) Larven in Erdproben. Geneeskundig tijdschrift voor Nederlandsch-Indië. 57, 131-137 (1917).
- Gray, N. F. Ecology of nematophagous fungi Panagrellus redivivus as the target organism. Plant and Soil. 297, 293-297 (1983).
- Mallez, S., Castagnone, C., Espada, M., Viera, P., Eisenback, J., Mota, M., Guillemaud, T., Castagnone-Sereno, P. First insights into the genetic diversity of the pinewood nematode in its native area using new polymorphic microsatellite loci. PLOS ONE. 8 (3), 4-11 (2013).
- Kerfahi, D., Tripathi, M. B., Porazinska, L. D., Park, J., Go, R., Adams, M. J. Do tropical rain forest soils have greater nematode diversity than High Arctic tundra? A metagenetic comparison of Malaysia and Svalbard. Global Ecology and Biogeography. 25, 716-728 (2016).
- Stiernagle, T.
- Di Bernardo, M., Crombie, T. A., Cook, D. E., Andersen, E. C. easyFulcrum: An R package to process and analyze ecological sampling data generated using the Fulcrum mobile application. PLOS ONE. 16, 0254293 (2021).
- Lints, R., Hall, D. H. Handbook of C. elegans male anatomy. WormAtlas. , (2005).
- Kiontke, K., Félix, M. -A., Ailion, M., Rockman, M. V., Braendle, C., Pénigault, J. -B., Fitch, D. H. A phylogeny and molecular barcodes for Caenorhabditis, with numerous new species from rotting fruits. BMC Evolutionary Biology. 11, 339 (2011).
