Snelle isolatie van wilde nematoden door Baermann Funnel

Caenorhabditis nematoden zijn echte dieren, die in de natuur leven. Het verzamelen van wilde nematoden stelt ons in staat om genen en genomen in hun natuurlijke context te bestuderen die functies onthullen, die kunnen worden verduisterd door de kunstmatige omstandigheden van het laboratorium. Deze techniek, extraheert wormen, uit bacterierijke organische substraten in het veld, en creëert schone culturen op petrischalen, waarbij een momentopname van elke populatie wordt vastgelegd, op het moment dat deze werd verzameld.

Deze populaties zijn zeer geschikt voor vragen over ecologie, populatiegenetica of metagenetica. Wilde stamculturen zijn ook waardevol voor kwantitatieve genetische studies. Deze techniek is eenvoudig en gemakkelijk uit te voeren, zelfs voor een beginner in veldonderzoek.

Een succesvolle verzamelreis vereist echter een doordachte voorbereiding van materialen voordat u op reis gaat. Identificeer een bacterierijk substraat in het veld, zoals rottend fruit, bloemen, schimmels, stengels van kruidachtige planten, aarde of bladstrooisel. Plaats een klein volume van het substraat in een gelabelde plastic zak.

Als rottend materiaal zeldzaam is in de veldkant van belang, plaats dan wat fruit als aas. Laat het schommelen en haal het dan op en eventuele wormen die het hebben gekoloniseerd. Noteer de monster-ID, breedtegraad, lengtegraad, datum en beschrijving van het substraat.

Noteer alle andere lokale omgevingsmetingen die relevant zijn voor het experiment, zoals omgevings- en substraattemperatuur, substraatconditie, tijdstip van verzameling en aanwezigheid van substraatgerelateerde macro-ongewervelde dieren. Gebruik een schaar om een segment van drie centimeter van rubberen buizen uit elke trechter te knippen. Plaats de slang over het uiteinde van een plastic trechter.

Schuif een buisklem over de rubberen buis en klem deze dicht. Om een trechterhouder te maken, snijdt u cirkelvormige gaten, in het midden van een uitgevouwen kartonnen vliegenvuilbak. Keer het karton om, vouw de zijkanten een keer op en plak ze aan elkaar.

Hierdoor ontstaan poten, die de gaten boven de bank verheffen. Zorg ervoor dat de buisklemmen in de gesloten positie staan en plaats trechters in de gaten. Giet steriel water in elke trechter en vul het ongeveer drie centimeter onder de rand.

Tik op de trechter om eventuele opgesloten luchtbellen in de buis los te laten. Vouw een pluisvrij doekje doormidden om een vierkant te maken en plaats het over de trechter. Druk vervolgens op het doekje om het onder te dompelen in het water.

Breek handmatig grote vaste stukken van het natuurlijke substraat. Plaats voorzichtig een deel van het monster op het doekje in de trechter. Zorg ervoor dat u het doekje niet doorboort of een monster boven de rand laat uitsteken.

Vouw de hoeken van het doekje voorzichtig over het monster om te voorkomen dat water naar buiten komt, over de rand van de trechter. Label de trechter met de voorbeeld-id, die overeenkomt met veldverzamelingsnotities. Kies alle actieve insecten of andere dieren uit die kunnen reizen en monsters kunnen kruisvervuilen.

Voeg meer water toe aan elke trechter om het hele monster onder te dompelen. Tijdens het broeden bij kamertemperatuur ‘s nachts, zullen actieve nematoden door het weefsel wiebelen en naar de bodem van de trechter zinken. Schrijf de monster-ID van een trechter, op de bodem van een zes centimeter grote NGM-wormplaat, zittend met een vlek van OP50 E.coli-bacteriën.

Verwijder het deksel van de plaat, verwijder de trechter met het monster van de trechterstandaard en houd het met één hand rechtop, boven de open wormplaat. Laat met de andere hand de druk op de buisklem los en laat een of twee druppels water uit de buis vallen op de wormplaat naast het bacteriële gazon. Zodra het water uit de trechter valt, klemt u het snel weer dicht, om overstroming van de NGM-plaat te voorkomen.

Om op te ruimen, gooit u de inhoud van de trechters weg en wast u ze met heet water voor later hergebruik. Observeer de geïsoleerde nematoden onder de stereomicroscoop. Naast aaltjes zullen er af en toe kleine, Oligo kit anneliden, Beerdiertjes, raderdiertjes en kleine schaaldieren zijn.

Om ISO-hermafrodiet of ISO-vrouwelijke lijnen vast te stellen, brengt u elke L4-hermafrodiet of gedekte volwassen vrouw over naar een afzonderlijke NGM-plaat van 3,5 centimeter, gezeten met OP50. Steriliseer de wormenprik, voor en na elke overdracht. Tot slot, wikkel platen grondig voor op reis, met een paraffinefilm.

Op Barro Colorado eiland Panama werden in 2018 131 substraten volgens deze methode verwerkt. 99% daarvan leverde aaltjes op. 34% leverde Caenorhabditis nematoden op.

In de uitsluitingszone van Tsjernobyl Oekraïne werden in 2019 170 substraten met deze methode verwerkt. 56% daarvan leverde nematoden op, waarvan geen enkele Caenorhabditis was. Deze methode werkt omdat de aaltjes door het doekje zwemmen.

maar het substraat en andere dieren blijven aan de top. Veel aspecten van een protocol kunnen worden aangepast, om gebruik te maken van alle middelen die beschikbaar zijn in het veld. Monsters verzameld met behulp van deze methode, stellen onderzoekers in staat om een breed scala aan populatiebiologische vragen in gevestigde culturen aan te pakken voor latere laboratoriumstudies.