Summary
本論文では、I/Rの発達と治療をよりよく理解するために、脊髄カスタマイズフックを用いた3日間のひよこ胚における虚血再灌流(I/R)モデリングについて述べている。このモデルは、シンプルで迅速で、安価です。
Abstract
心筋梗塞、脳卒中、末梢血管疾患などの虚血および再灌流(I/R)障害は、病気や死亡の主要な原因の一部です。イン ビトロ および インビボ モデルの多くは、現在、疾患または損傷した組織におけるI/Rメカニズムを研究するために利用可能です。しかし、現在までに 、ovo I/Rモデルには報告されておらず、I/Rメカニズムのより良い理解と薬物スクリーニングの迅速化を可能にする。この論文では、3日間のひよこ胚に脊髄をカスタマイズしたフックを用いてI/Rの発達と治療メカニズムを理解するI/Rモデリングについて説明する。このモデルは、DNA、RNA、およびタンパク質レベルの異常を調査するために使用できます。この方法は、簡単で、迅速で、安価です。現在のモデルは、独立して、または既存 のin vitro および in vivo I/Rモデルと組み合わせて使用することができます。
Introduction
虚血再灌流組織損傷は、心臓発作、虚血性脳卒中、外傷、および末梢血管疾患を含む多くの病理に関連している1、2、3、4,5。これは主に、疾患の進行に関する包括的な理解の欠如と効果的な研究モデルの欠如によるものです。虚血性損傷は、組織の特定の領域への血液供給が遮断されたときに起こる。その結果、虚血性組織は最終的に壊死するが、速度は組織によって異なる。したがって、血液供給を回復することは、損傷を軽減するのに役立つ可能性があります。しかし、再灌流は虚血単独で6,7,8よりも多くの組織損傷を引き起こすことが観察されている。したがって、効果的な治療介入を開発するためには、虚血再灌流の分子および細胞機構を理解することが必要である。現在、I/R傷害に対する有効な治療法は知られていない。この格差により、in vitroからin vivoモデルに至るまで、既存の問題9,10,11,12,13に対処するための新しい実験モデルが作成されました。
ひよこ胚(ガルス・ガルス・ドメスティックス)は、アクセスの容易さ、倫理的受容性、比較的大きなサイズ(他の胚と比較して)、低コスト、および急速な成長のために研究に広く使用されています14。72時間の発達でひよこ胚を使用して、脊髄の助けを借りて右ビテリン動脈を閉塞して放出することで、ovo I/Rの中に胚を作り出しました。フックI/R虚血再灌流モデルと命名しました(図1)。本研究で利用されたモデルは、I/R損傷15,16,17に頻繁に関連する酸化および炎症経路を含むすべての下流プロセスを正確にシミュレートすることができる。
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Protocol
Eraのラクナウ医科大学と病院の制度的動物倫理委員会は、動物実験の管理と監督を目的とした委員会(CPCSEA)に従ってこれらの実験を行うための正式な承認は必要ないという書面による免除を発行しました。しかし、胚性苦痛の可能性を最小限に抑えるために、標準的な操作手順に従った。
1. バッファ調製(表1)
- リンガーのソリューションを準備する
- リンゲルの溶液を調製するには、NaCl(123 mM)の0.72 g、CaCl2 (1.53 mM)の0.017 g、70mLのKCl(4.96 mM)の0.037 gを無菌蒸留H2Oの70 mLに溶解し、最終体積は100mLです。pH を 7.4 に調整します。完全に溶解し、オートクレーブしましょう。その後、0.22 μmフィルターを通してフィルターし、アリコートを一回使用量(約10 mL)にして室温で保存します。
- 通常の生理食塩水(0.9%塩化ナトリウム、NaCl)を準備します。
- 70 mLの無菌蒸留H2Oに、NaCl(154 mM)の0.9 gを溶解する。音量を100mLにします。121 °Cで15分間オートクレーブ。 必要に応じて、pHを 0.1 N HCl で 7.4 に調整するか、必要に応じて 0.1 N NaOH に調整します。15 mLの無菌遠心分離機チューブで10 mLのアリコートを作り、室温で保管します。
- 70%エタノール(v/v)を準備します。
- 70 mLの純粋なエタノール(Mol. 46.07 g/L)を30 mLの無菌H2Oに混ぜ合わせます。殺菌の必要性がない。
- 1xリン酸緩衝液生理食塩分(1x PBS)を準備します。
- 1x PBSの100 mLを、Na2HPO4·7H2O(5.37mM)、0.8gのNaCl(136.8 mM)、0.2gのKCl(26.8 mM)、0.2gのKH2PO4(14.6mM)の70mLに蒸留水の70mLを加えて調製します。 121 °Cで15分間、100mLとオートクレーブに溶解し、ボリュームを構成します。 pH を 7.4 に持ち込み、必要に応じて 0.1 N HCl または 0.1 N NaOH のドロップを 2、3 ドロップ追加します。15 mLの無菌遠心分離管で10 mLのアリコートを作り、室温で保管してください。
2. 1日目
- 卵の殺菌に必要なすべてのツール(70%エタノール、クリーニングワイプ、卵ラック、OHPマーカー)を配置します。
- ティッシュペーパーワイプを使用して70%エタノールで0日の卵をきれいにします。古い卵は胚を生じないかもしれないので、0日の卵だけを使用してください。
- OHPマーカーを持つ卵に現在の日付を書きます。
- 卵を36~37°Cの温度と湿度60%~65%に設定した卵インキュベーターに入れます。次の24時間の卵をインキュベートします。
3. 2日目
- アルブミン(シャープエッジはさみ、5 mLシリンジ、18G針、注射器の廃棄、および粘着テープ)の撤退に必要な機器を配置します。
- 70%エタノールで手術用はさみを拭くか、70%エタノールで拭いた後、オートクレーブを使用して滅菌します。
- 今、重ねるために37°Cの卵インキュベーターから卵を取ります。
- きれいな卵のラックの上に卵を置きます。
- 小さな粘着テープ(サイズ:長さ約1インチ×幅)を卵の端に取り付けます。
- 鋭利な尖ったエッジはさみを使用して、卵殻の端に小さな穴を作ります。5 mL のシリンジをおよそ 75° の角度で挿入します。
注意:5 mLの注射器は24 G x 1針(無菌)が付属していますが、24 G x 1針を18 G x 1.5針(滅菌)に交換することは良いことです。18 G x 1.5針は幅1.25 x 38 mmです。したがって、アルブミンの除去を容易にする。 - 卵黄嚢に針を挿入した後、アルブミンの5〜6 mLをゆっくりと引き出す。
注:これは、それが成長することができるベッドを胚に提供します。アルブミンを撤回すると、ウィンドウを確立しながらアルブミンのオーバースピルを防ぐことができます。最後に、5-6 mLのアルブミンを排除することで、窓の間に胚が損傷するリスクを軽減します。 - アルブミンを取り除いた後、粘着テープで開口部を再密封し、卵を残して37°Cで48時間インキュベートします。
4. 4日目
- プロトコルのセクション 1 で説明されているように、リンガーの溶液、通常の生理液0.9%、PBS 1x を準備します。次に、3つのソリューションをオートクレーブします。オートクレーブ処理に続いて、それぞれの溶液を室温に置きます。
- 37°Cの卵インキュベーターから卵を取り出し、殻を円形に切ります。卵殻を切る前に、粘着テープで切る部分を覆います。
メモ:窓の領域を粘着テープで覆うと、卵殻が望ましくない場所に壊れないようにします。ただし、不要な場所に侵入した場合は、粘着テープでエリアを密封してください。粘着テープで切る場所を覆うと、殻片が黄身嚢に落ちるのを防ぎます。 - 窓が望まれる場所に鋭く尖ったエッジはさみで卵殻に小さな穴を作成し、円形の開口部を切断し始めます。このプロセスはウィンドウと呼ばれます。
注:円形カットは、任意の方向から胚に簡単にアクセスできるように十分な大きさであることを確認してください。必要に応じて、胚の位置に合わせて卵の位置を変更します。 - 次に、ステレオズーム手術用顕微鏡を使用して、右ビテリン動脈(RVA)を見つける。
注意:鶏の胚は通常、72時間の段階で頭の左側が黄身に対して起こるように、発達するにつれて胸部の胸部の胸部(子宮頸部屈曲などと共に)を受ける。より大胆には、ビテリン動脈が体を出るところでは、胚はあまりねじれず、体のこの部分は黄身に向かって腹側にある。だから、直接見て、胚の右は研究者の右側にあります。 - RVA が配置されたら、26 G 針を使用して RVA の左側と右側に 2 つの小さな穴を作成します(図 2)。
- ドップラー血流イメージングプローブをRVAの上に置きます。ドップラー血流イメージングプローブは、虚血部位からRVAの遠位端に向かって5±1mmに配置されていることを確認します。2分と30 s(または必要に応じて長く)のフラックスの読み取りを取ります。これは規範的な相の読み取りになります。
- その間、鼻のペンチと歯付き鉗子を使用して、脊髄針の端をフックの形に手動で成形します(図3)。これは、脊髄の端を約1mm曲げて行います。サイズが大きいほど、I/R手順中に脊髄針を挿入したり取り外したりすることが難しくなります。
- マイクロマニピュレーターを使用して、右のビテリン動脈のすぐ下に脊髄針を挿入します。
注:RVAまたは隣接する動脈を損傷しないように細心の注意を払って脊髄針を挿入してください。最適な技術は、RVAホールの右側のすぐ上に脊髄針のカスタム設計されたフックを調整し、続いて右穴を通してステレオズーム手術顕微鏡の指導の下でマイクロマニピュレータの助けを借りて、徐々に脊髄のカスタム設計されたエッジを黄身嚢に挿入することです。脊髄針のフックが黄身嚢に入ったら、RVAの下のフックを徐々に調整して、その端が左穴の下に正確に配置されるようにします。今が脊髄針を持ち上げる時です。 - さて、マイクロマニピュレーターの助けを借りて、ドップラー血流フラックスが動脈流量の最低80%の減少を示すまで徐々に動脈を持ち上げる。
- ドップラーフラックスで80%以上のドロップダウンが達成されたら、脊髄の針を持ち上げて(動脈を上に引っ張る)5分間放置します。これはRVAにおける虚血の期間になります。
注: 虚血の期間中にドップラーフラックスを監視することが重要です。かなりの変動が見つかった場合は、テストを終了します。 - 5分の虚血期間の後、徐々に正常な血流レベルを回復するために動脈を解放する。ドップラー血流計の読み取り値は、ノルモキシア中に得られたものと同等の値を表示することを確認します。これはRVAにおける再灌流の期間になります(図4)。
- I/R手順の後、1x PBSの数滴(2〜3)を胚に塗布し、2〜3分間監視します。
注:1x PBSを使用すると、胚が乾燥するのを防ぐことができます。 - 最後に、粘着テープで窓を再密封し、卵を卵インキュベーターに5時間55分間戻します。
- 5時間と55分後に卵を卵インキュベーターから取り出し、卵ラックの上に置き、窓を開け直し、下流の処理プロトコルに従ってください。
5. 治療
- 薬物、活性化剤、または阻害剤による動脈の治療のために、I/Rプロセスの1時間後にRVAを物品切りする。
- 下流の研究では、まず胚を無菌90mmペトリ皿に置いて卵殻から取り除きます。
- 胚がペトリ皿に放出されたら、ステレオズーム手術顕微鏡の指導の下で眼の虹彩を使用してRVAを切除する。
- RVAの切除寸法が最大15±1mm(幹からの遠位)、動脈の左右に5±1mm、トランクに向かって2±1mmであることを確認します。
注: ルーラーを使用して、切除する領域を測定できます (省略可能)。 - RVAを切除した後、1x PBSを含む滅菌ペトリ皿で1x PBSで洗浄します。
- 所望の処置のために、リンガーの溶液の500 μLで満たされた1.5 mL遠心分離管(殺菌)に動脈を置く。RVAを遠心分離管に入れ、37°Cインキュベーターに5時間55分間置きます。
注:治療に応じて、何の治療もせずにRingerの溶液を使用するか、または薬物、アクチベーター、または阻害剤の所望の体積と濃度での治療を行ってください。 - 5時間及び55分のインキュベーション後、37°Cの実験室インキュベーターからRVAを取り出し、所望の処置を進める。
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Representative Results
ドップラー血流イメージング技術は、当社のモデルの有効性を評価するために使用されました。つまり、コントロールグループのデータと RVA グループのデータを比較して、作成の成功を判断しました。 図4Aは 、制御動物に関連する代表的なフラックスを示し、 図4B はRVAから得られた結果を示している。数値 1 から 8 は、I/R フェーズに関連付けられたさまざまなイベントを表します。簡単に言えば、数値1-3はノルモキシアの相に対応し、点3および4での流束の急激な減少はRVAにおける血流の減少に関連する事象を表す。80%以上のドロップダウンが達成されると、RVAは次の5分間上昇したままでした。これは虚血の相(数値4-5)であった。RVAの5分の持ち上げの後、RVAは、数値6と7で表されるリリースされました。ポイント7以降のフラックスは、RVAが正常な血流レベルを達成した後に起こる再灌流期を表し、これは再灌流の段階であった。この特定の実験は、3日間開発されたひよこ胚におけるI/Rモデリングの有効性を実証した。
このモデルの有用性を検証するために、ELISA、ウェスタンブロッティング、qRT-PCR、ゲル電気泳動解析を通して、タンパク質、RNA、DNAの発現パターンを調べました。簡単に言うと、3日間の卵を制御、I/R、および治療+I/Rの3つの実験グループに分けました。それぞれのI/R群と対照群の間には、タンパク質、遺伝子、DNAの完全性の発現に有意な差が認められた。以下で説明するように、I/R群に対する薬物治療は、I/R処置群単独と比較して、この群で観察された結果を効果的に改善した。これは、このプロトコルが基づいている以前の出版物と一致しています1。ELISA18、ウェスタンブロッティング19、qRT-PCR20、およびゲル電気泳動21については、この論文では取り上げられていない標準的な検査手順を行いました(図5、図6、図7、図8)。
虚血再灌流は、組織に有害な活性酸素種(ROS)の形成を含むいくつかのプロセスを刺激する。ROSに対する本質的な抗酸化ボディ防御システムの応答によって引き起こされる有害な影響は、I/R 傷害の重要な特徴.酸素調節タンパク質150(ORP150)、細胞質スーパーオキシドジスムターゼ1(SOD1)、および虚血性血管におけるカタラーゼの活動を検討した。対照群と比較すると、I/RはORP150、細胞質SOD1、およびカタラーゼの活性を上昇させた(図5A-C)。しかし, N-アセチル L-システイン (NAC) の補充, ROS クエンチャー, I/R グループの酸化ストレスを軽減.
モデルの炎症ポテンシャルを評価するために、ELISAを用いてIL-1βおよびTNF-α発現を調べた(図6)。インターロイキンは両方ともコントロール群と比較してI/R群で過剰発現し、我々のモデルが炎症調査に使用される可能性があることを示した。次に、炎症の増幅に関与するNOD様受容体ピリン含有タンパク質3(NLRP3)内炎経路22,23、および炎症の増幅に関与する炎症促進分子NF-kβ24,25の発現を試験し、このモデルの炎症研究に有用性を確認した。RVAで生成されたI/Rに対して、この調査は、NF-kβと同様にNLRP3インフラマソーム(図7A)の活性化の証拠を発見した(図7B)。しかし、よく知られた抗炎症薬であるナリンゲンによる治療は、薬物治療群で観察されるように炎症効果を改善した。
虚血再灌流は、プログラムされた細胞死経路26,27,28を活性化する。私たちは、I/Rがひよこ胚のアポトーシスおよびオートファジー経路に及ぼす影響を研究した。図8Aは、カスパーゼ-3およびzVAD-fmkに対するI/Rの影響を示しています。図8B-Dは、I/R群がLC3IIとLC3II/I比(オートファゴソームマーカー)、Beclin1(哺乳類細胞におけるオートファジーの有意な調節因子)、およびAtg7(基底オートファジーに必要)の発現がそれぞれタンパク質レベルで対照群よりも高いことを示している。これに対し、図8Eは、MRNAレベルに対するI/Rの効果を示しています。しかし、オートファジー阻害剤である3-MAを添加すると、結果が逆転した。これらの知見は、このモデルが異なる細胞死過程(例えば、ネクロトーシス)を調査するために使用される可能性があることを示唆している。図9は、フックI/Rモデルを用いてDNAレベルでの変化をいかに効率よく研究できるかを示しています。
最後に、フックI/Rモデルと中大脳動脈閉塞(MCAO)モデルの結果を比較して、他のモデルと比較してモデルがどれほど効果的であるかを確認します。要約すると、I/R処理RVAは、アポトーシスタンパク質切断カスパーゼ-3、オートファジータンパク質Beclin1およびAtg7、および炎症性インターロイキンTNF-αおよびIFN-ƳのレベルがコントロールRVAよりも高いレベルを有していた。興味深いことに、炎症性ストレスや細胞死経路を分析する場合でも、Hook-I/RモデルはMCAOモデルで得られた結果と非常によく似た結果を生み出した(図10)。
図1:フックI/Rのひよこ胚虚血再灌流モデルの典型的なセットアップの概略図。 写真は、ステレオズーム手術顕微鏡、レーザードップラー血流計、マイクロマニピュレータ、脊髄針、72時間発達したひよこ胚、照明源など、フックI/Rのひよこ胚虚血再灌流実験要件を示しています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:3日間のひっき胚出展部位の表像および組織切除領域(A)三角形は、ウェスタンブロッティング、RNA、およびDNA単離のための組織の切除の位置を示す。星と点は、閉塞の部位とRVAの左右に作成された穴を表し、それぞれそれを持ち上げるために動脈の下に針を挿入します。組織抽出領域の拡大画像もそれと共に提供される。表記Aは眼を、Bは心臓を、Cはビテリン動脈の左を、C'はビテリン動脈の右を表す。(B)ひよこ胚の右側の模式的表現は、RVA付近の組織切除の領域を示す。直線は、胚幹から出てくるRVAを表す。垂直線上の星はレーザードップラー血流プローブの位置を象徴しています。交差点は、閉塞の部位を示します。動脈の切除は、1mm(幹から遠位)15±、動脈の左右にそれぞれ1mm±5±、トランクに向かって2±1mmまで行った。すべての測定値は、閉塞部位からの距離を示します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:カスタムメイドの針を持つ脊髄の代表的な画像。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:典型的なレーザードップラー血流量計信号の表現。 典型的なレーザードップラー血流計信号は、対照群卵(A)から3日間のひよこ胚動脈で測定された。ベースライン(1)におけるイベントは、ノルモキシア(2)の間に、RVA(3)の即時持ち上げ、RVA(4)の即時持ち上げ、虚血中(5)、RVA(6)の即時前放出(7)、即時再灌流(7)の間、レーザードップラー流血計(B)によって記録された虚血球処理群における再灌流中(8)である。この数字は、2018年ファウジアら(薬理学のフロンティア;CC-BYライセンスの下)1から採用されました。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:酸化ストレスマーカータンパク質の発現に対する虚血再灌流の効果 ウエスタンブロッティングはORP150、SOD1、カタラーゼ発現レベルを決定するために使用された。(A) I/Rダメージ後にORP150発現が増加した。PAN-ROS阻害剤であるNACは、ORP150を制御のレベルに匹敵するレベルに下げた。(B) I/Rに続いて、SOD1発現が上昇した。SOD1発現も同様に、NAC治療後に減少した。(C) I/R事象はカタラーゼの発現を誘発した。I/Rで治療し、NACにさらされたRVAはカタラーゼレベルの低下を示した。GAPDH(A,C)およびβアクチン(B)を内部統制として使用した。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図6:ELISAを用いたIL-1βおよびTNF-αの推定 ELISAはIL-1βおよびTNF-αを定量化するために使用され、その結果、ナリンゲニンの添加によって軽減されたIL-1βおよびTNF-α発現の増加があったことが明らかになった。この研究では、ANOVAの後にニューマン・キュース検定が適用された。誤差範囲は、SD±平均値を表し、n = 3を表します。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図7:炎症マーカータンパク質の発現に対する虚血再灌流の効果. (A)I/R治療はNLRP3の発現増加をもたらした。I/R処理RVAのインキュベーションは、ナリンゲンニンでNLRP3の発現を低下させる。(B)NLRP3と同様に、NF-kβの発現もI/R処理後に増加した。ナリンゲンの治療は、NF-kβの発現を低下させた. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図8:虚血再灌流がRVA細胞のアポトーシスおよびオートファジー状態に及ぼす影響を、I/Rプロセスによるアポトーシスの誘導を探索し、切断カスパーゼ3の発現をウェスタンブロッティングを用いて評価した。I/R損傷後、切断カスパーゼ3のレベルが増加した。しかし、アポトーシス阻害剤であるzVAD-fmkによる治療は、切断カスパーゼ3発現を減少させた。(B-D)I/Rに続くオートファジーの誘導を評価するために、LC3II/I、Beclin1、およびAtg7の発現を決定した。I/Rに続いて、すべてのオートファジーマーカーの発現が増加し、オートファジー阻害剤3-MAへのI/R処理RVAの暴露は、すべてのタンパク質の発現を制御レベルに低下させ、増加した。内部制御として、GAPDH が使用されました。(E) qRT-PCR を使用してオートファジーの誘導を確認し、アンブラ1および Atg7 mRNA の発現レベルを決定しました。両方の遺伝子は、コントロールと比較してI/R群の発現のかなりの増加を示し、NAC療法後にほぼ正常なレベルに回復した。GAPDHはqRT-PCR実験の内部制御として使用された。実験(E)では、ANOVA、ニューマン・キュース検定が適用されました。誤差範囲は、SD±平均値を表し、n = 3を表します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図9:虚血再灌流がDNA損傷に及ぼす影響 I/RがDNAニックを誘導するかどうかを判断するために、ゲル電気泳動を用いたDNA損傷を調べた。I/Rは、I/Rサンプルにスメリングすることによって示されるように、ゲノムDNA分解をもたらした。I/R損傷RVAのNAC療法はDNA損傷を減少させた。1 kb の DNA ラダーを採用しました。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 10: フック I/R モデルと MCAO モデルの比較 フックI/Rモデルで生成されたデータとMCAOモデルによって生成されたデータを比較しました。(A) アポトーシスタンパク質カスパーゼ-3とオートファジータンパク質Beclin-Atg7の発現は、MCAO実験で得られた知見と一致していた対照RVAにおける同じタンパク質の発現と比較して、I/R処理RVAにおいて高かった。(B) TNF-αおよびIFN-Ƴレベルは、それぞれのコントロールと比較した場合、RVA群およびMCAO群の両方で上昇することが判明した。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| 材料/機器の名称 | 濃度 | オートクレーブ | 貯蔵 | ||
| リンガーの溶液用試薬 | |||||
| 塩化ナトリウム | 123 mM | ||||
| 塩化カリウム | 4.96 mM | ||||
| 塩化カルシウム | 1.53 mM | ||||
| 滅菌蒸留水 | 100 mL | ||||
| pH | 7.4 | 121°Cで15分 | R.T. | ||
| 0.9%の正常な生理学に対する試薬 | |||||
| 塩化ナトリウム | 154mM | ||||
| 滅菌蒸留水 | 100 mL | ||||
| pH | 7.4 | 121°Cで15分 | R.T. | ||
| 70%エタノール用試薬 | |||||
| 70% エタノール | 70 mL | ||||
| 滅菌蒸留水 | 30 mL | 不要 | R.T. | ||
| 1xリン酸緩衝剤の試薬 | |||||
| 塩化ナトリウム | 136.8 mM | ||||
| 塩化カリウム | 26.8 mM | ||||
| リン酸カリウム単塩基無水 | 14.6 mM | ||||
| リン酸水素二重水和物 | 5.37 mM | ||||
| 滅菌蒸留水 | 100 mL | 121°Cで15分 | R.T. | ||
表1:この研究で使用されるソリューションのレシピ。
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Discussion
虚血再灌流研究の目的は、細胞死を予防し、回復を促進する治療戦略を作成することです29,30.I/R研究における現在の制約を克服するために、我々は信頼性の高い、再生可能なI/Rモデルを作り出すためにフックI/Rのひよこ胚モデルを設計した。私たちの知る限りでは、私たちの知る限りでは、ストレス信号(酸化ストレスや炎症ストレスなど)を研究する以外に、ルーチンI/R実験のために3日間のひよこ胚で作成された最初のI/ Rモデルです。開発31日目のサイズとアクセシビリティの利点を考えると、ひよこ胚は、モデルの高出力、採用の簡易性、およびルーチン分析32の適応性のために、72時間の発達段階で使用された。簡単に言えば、発達3日目に、ovoひよこは、正常な生理学、疾患病理、および実験的治療の効果を視覚化するために使用することができる卵内の高度に制御され、まだアクセス可能で合理的に透明なモデルです。その巨大なサイズは、正常な生理学とストレス33の間に胚の形成と行動を研究するのに特に有用です。古いひよこ胚(4日以上インキュベートされたもの)は採用することができ、後の時点で試しましたが、モデルシステムとしての古い胚の使用は、黄身嚢が3日間の発達を超えて非常に厚く成長し、外科的処置が困難であるという事実によって厳しく制限されています。RVAは早い時間枠(例えば、1日目または2日目)に完全に形成されていないが、ウィンドウ化は催奇形性34につながる可能性があることに言及することは注目に値する。開発の初期または遅い時点に関連する制限に加えて、72時間のひよこ胚は、3日間のひよこ胚が明確に定義された循環系システム30を有するので、I/ Rプロセスを研究するための理想的なモデルとして機能する。
I/R損傷の病態生理を理解することは、I/Rモデルを設計する大きな目標です。現在、虚血・再灌流損傷を低減するための臨床的に有用な治療法はない1,35。その結果、幅広いインビトロモデルとインビボモデルが提案されている。この文脈において、ovoにおける3日間の発達のひよこ胚におけるI/Rモデリングが初めて提案された。これまでの研究では、動脈血流の閉塞再灌流は、ヒト36,37,38に見られるものと同様の実験モデルで病理学的変化を引き起こすことが示されているので、私たちのモデルが同じことを期待していました(生体モデルや患者で観察される酸化ストレスや炎症ストレスなど)。我々の研究結果により、上記の仮説は正しいことが示された。
胚から卵黄嚢への血液の循環は、ひよこ胚39のビテリン血管によって制御される。胚は黄身から栄養素を得て、ビテリン循環を 介して 空気から酸素を拡散します。したがって、栄養および酸素移動を妨害する可能性のあるビテリン容器のいずれかを制限する。これらの事実に基づいて、虚血はRVAへの血液供給を5分間遮蔽し、続いて5時間および55分間再灌流を誘発した。提案されたモデルは、I/Rに関連する様々な疾患プロセスの範囲を調べ、様々な薬物およびそれらの標的をテストするために利用することができる。現在のモデルを使用して、DNA、RNA、タンパク質の変化を調べることができます。それは高出力を与える可能性を有する。このモデルは、定期的な分析のためのシンプルさと適応性に加えて、将来の研究で調査される短期幹細胞ホーミングを調査することもできます。
in vitroモデルと比較すると、当社のモデルは使いやすく、費用対効果が高く、急速に成長し、倫理的に無実である32です。マイクロバスキュアチュア、免疫系、生理学的評価の存在は、すべてのインビトロモデルよりも利点であり、低コスト、時間効果、倫理的な問題はインビボmodels40よりも利点です。上記の利点は、当社のモデルが現在使用されている他のI/Rモデルと同等の効果を有することを示しています(図10)。潜在的な欠点は、現在のモデルが梗塞領域を定量化できないことです。直接梗塞評価は、I/R媒介性損傷に対する貴重なバイオマーカーであり、様々な治療薬の効果をマッピングする方法である可能性があります。このように、梗塞領域を定量化しようとしましたが、72羽の発達した雛の繊細な構造のために定量化できませんでした。したがって、I/Rプロセスの戦略と経路を総合的に評価するには、追加の研究が必要です。
要約すると、現在のモデルは、I/Rに関連する様々な疾患経路を調査し、様々な薬物およびそれらの標的をスクリーニングするために使用することができる。再現性、費用対効果、シンプルさが高いため、基礎科学・翻訳研究の価値あるリソースとなると期待しています。
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Disclosures
著者らは競合する利益を宣言しない。
Acknowledgments
ビデオ撮影と編集中の彼の批判的なインプットに対するハリ・シャンカール、ナレーションのためのバケル・フセイン氏、ビデオ編集のためのアスガル・リズヴィ氏、ビデオ撮影のためのモハマド・ハイダー氏、実験中の支援のためのモハマド・デンマーク・シディキ氏に感謝したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (-80°C) freezer | Haier, China | - | |
| 1.5mL Centrifuge tube | TARSONS, India | 500010X | |
| 100mm Petri dish (sterile) | Tarsons, India | 460050 | |
| 18G Needle (18G×1.5 (1.25×38mm) | Ramsons, India | 13990 | |
| 1mL Syringe | DISPO VAN | - | |
| 26G Needle (26G×1/2 (10.45x13mm) | DISPO VAN, india | 30722D | |
| 37°C egg incubator with adjustable percentage humidity | Gentek, India | GL-100 | |
| 37°C laboratory incubator | SCIENCE TECH, India | CB 101-14 | |
| 3-Methyladenine (3-MA) | Sigma Aldrich, USA | M9281 | |
| 3mL Pasture Pipette | TARSONS, India | 940050 | |
| 50mL Beaker | TARSONS, India | - | |
| 5mL Syringe | DISPO VAN, India | IP53 | |
| 70% ethanol | Merck Millipore, United States | 64-17-5 | |
| Adhesive tape/Cello tape | Sunrise, India | - | |
| Ambra1 primers | Applied Biosystems, Foster city, USA | Hs00387943_m1 | |
| Anti-mouse IgG | Cell Signaling Technology, USA | 7076S | |
| Anti-Rabbit IgG | Jackson Immuno Research Laboratories, USA | 711-035-152 | |
| Atg7 | R&D Systems, USA | MAB6608 | |
| Atg7 primers | Applied Biosystems, Foster city, USA | Hs00893766_m1 | |
| Autoclave Bag | Tarsons, India | 550022 | |
| Autoclave Machine | Local made, Lucknow, India | - | |
| Beclin-1 | Proteintech, USA | 66665-1-Ig | |
| Beta Actin | ImmunoTag, USA | ITT07018 | |
| Bovine Serum Albumin | Himedia, Mumbai, India | TC194 | |
| Calcium Chloride | Himedia, Mumbai, India | GRM534 | |
| Catalase | ImmunoTag, USA | ITT5155 | |
| Cleaning wipes | Kimberly-Clark, India | 370080 | |
| Cleaved Caspase3 | ImmunoTag, USA | ITT07022 | |
| di-Sodium hydrogen phosphate heptahydrate | Himedia, Mumbai, India | GRM39611 | |
| Doppler blood flowmeter | Moors instrument, United Kingdom | moorVMS-LDF1 | |
| Egg rack | - | - | |
| Egg rack | - | - | |
| GAPDH | ImmunoTag, USA | M1000110 | |
| GAPDH primers | Applied Biosystems, Foster city, USA | Hs02758991_g1 | |
| Glycine | Himedia, Mumbai, India | MB013 | |
| Kidney tray | HOSPITO | - | |
| LC3A/B | Cell Signaling Technology, USA | 4108S | |
| Methanol | Rankem laboratories, Mumbai, India | M0252 | |
| Micromanipulator | Narishige, Japan | M-152 | |
| N-acetyl-L-cysteine (NAC) | Sigma Aldrich, USA | A7250 | |
| Naringenin | Sigma Aldrich, USA | 67604-48-2 | |
| NF-kβ | Thermo Fisher Scientific, USA | 51-0500 | |
| NLRP3 | ImmunoTag, USA | ITT07438 | |
| Nose plier | Local made, Lucknow, India | - | |
| Ocular forceps | Stoelting, Germany | 52106-40 | |
| Ocular iris | Tufft Surgical Instruments, Jaipur, India | Hard Age Vannas Micro Scissors Angled 8CM / 3 1/8" | |
| OHP marker pen | Camlin, India | - | |
| ORP-150 | ImmunoTag, USA | ITT08329 | |
| Pointed sharp edge scissor | Stoelting, Germany | 52132-11 | |
| Potassium Chloride | Himedia, Mumbai, India | MB043 | |
| Potassium phosphate monobasic anhydrous | Himedia, Mumbai, India | MB050 | |
| Protease Inhibitor | Abcam, United States | Ab65621 | |
| SOD-1 | ImmunoTag, USA | ITT4364 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific, Mumbai, India | 27605 | |
| Sodium dodecyl sulphate | Himedia, Mumbai, India | GRM886 | |
| Spinal needle 25GA; 3.50 IN (90.51 X 90mm) | Ramson, India | GS-2029 | |
| Stereo Zoom surgical microscope | Olympus, Japan | SZ2-STU3 | |
| Syringe discarder | BIOHAZARD | 882210 | |
| Toothed forceps | Stoelting, Germany | 52102-30 | |
| Tris Base | G Biosciences, United States | RC1217 | |
| Tris Hydrochloric Acid | Himedia, Mumbai, India | MB030 | |
| Tween 20 | G Biosciences, United States | RC1227 | |
| White Leghorn Chicken 0-day eggs | - | - | |
| Z-Val-Ala-Asp(OMe)-FMK | MP Biomedicals, LLC, USA | FK009 |
References
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