Summary
Il presente protocollo descrive una piattaforma microfluidica pneumatica che può essere utilizzata per un'efficiente concentrazione di microparticelle.
Abstract
Il presente articolo introduce un metodo per fabbricare e utilizzare una valvola pneumatica per controllare la concentrazione di particelle utilizzando una piattaforma microfluidica. Questa piattaforma ha una rete tridimensionale (3D) con canali fluidi curvi e tre valvole pneumatiche, che creano reti, canali e spazi attraverso la replica duplex con polidimetilsilossano (PDMS). Il dispositivo funziona in base alla risposta transitoria di una portata del fluido controllata da una valvola pneumatica nel seguente ordine: (1) carico del campione, (2) blocco del campione, (3) concentrazione del campione e (4) rilascio del campione. Le particelle sono bloccate dalla deformazione dello strato sottile del diaframma della piastra della valvola del setaccio (Vs) e si accumulano nel canale microfluidico curvo. Il fluido di lavoro viene scaricato mediante l'azionamento di due valvole on/off. Come risultato dell'operazione, tutte le particelle di vari ingrandimenti sono state intercettate e disimpegnate con successo. Quando viene applicata questa tecnologia, la pressione di esercizio, il tempo necessario per la concentrazione e la velocità di concentrazione possono variare a seconda delle dimensioni del dispositivo e dell'ingrandimento delle dimensioni delle particelle.
Introduction
Data l'importanza dell'analisi biologica, le tecnologie dei sistemi microelettromeccanici microfluidici e biomedici (BioMEMS) 1,2 sono utilizzate per sviluppare e studiare dispositivi per la purificazione e la raccolta di micromateriali 2,3,4. La cattura delle particelle è classificata come attiva o passiva. Le trappole attive sono state utilizzate per le forze dielettriche5 esterne, magnetoforetiche6, uditive7, visive8 o termiche9 che agiscono su particelle indipendenti, consentendo un controllo preciso dei loro movimenti. Tuttavia, è necessaria un'interazione tra la particella e la forza esterna; pertanto, la velocità effettiva è bassa. Nei sistemi microfluidici, il controllo della portata è molto importante perché le forze esterne vengono trasmesse alle particelle bersaglio.
In generale, i dispositivi microfluidici passivi hanno micropilastri in microcanali10,11. Le particelle vengono filtrate attraverso l'interazione con un fluido che scorre e questi dispositivi sono facili da progettare e poco costosi da produrre. Tuttavia, causano l'intasamento delle particelle nei micro-pilastri, quindi sono stati sviluppati dispositivi più complessi per prevenire l'intasamento delle particelle12. I dispositivi microfluidici con strutture complesse sono generalmente adatti per la gestione di un numero limitato di particelle 13,14,15,16,17,18.
Questo articolo descrive un metodo per fabbricare e utilizzare una piattaforma microfluidica pneumatica per grandi concentrazioni di particelle che supera le carenze18 come menzionato sopra. Questa piattaforma può bloccare e concentrare le particelle per deformazione e azionamento del sottile strato di diaframma della piastra della valvola del setaccio (Vs) che si accumula in canali microfluidici curvi. Le particelle si accumulano in canali microfluidici curvi e le particelle concentrate possono separarsi scaricando il fluido di lavoro tramite l'azionamento di due valvole di accensione / spegnimento delle guarnizioni PDMS18. Questo metodo consente di elaborare un numero limitato di particelle o concentrare un gran numero di piccole particelle. Condizioni operative come l'entità della portata e la pressione dell'aria compressa possono prevenire danni indesiderati alle celle e aumentare l'efficienza di intrappolamento delle celle.
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Protocol
1. Progettazione della piattaforma microfluidica per la concentrazione delle particelle
- Progettare la piattaforma microfluidica pneumatica composta da una valvola pneumatica per il flusso del fluido nella rete di flusso 3D e tre valvole pneumatiche per il funzionamento della valvola setaccio (Vs), fluido (Vf) e particella (Vp) (Figura 1).
NOTA: Vs blocca le particelle concentrate dal liquido e Vf e Vp consentono il rilascio di fluidi e particelle dopo la concentrazione. Tre porte pneumatiche forniscono aria compressa dallo strato di alimentazione fluido/pneumatico (normalmente aperto) e dall'uscita della luce della valvola pneumatica per azionare la valvola. La rete di canali microfluidici è progettata con un programma CAD18,19. - Progettare il canale in modo che sia uno strato di alimentazione pneumatico e un livello di rete di canali 3D (Figura 2).
NOTA: La rete fluida è interconnessa con i canali curvi nella parte anteriore e la camera rettangolare nella regione posteriore. Vs blocca l'ingresso e le particelle si accumulano nell'area di raccolta del canale fluido curvo. I fluidi privi di particelle (liquidi privi di particelle) escono attraverso l'uscita Qf e le particelle concentrate attraverso l'uscita Qp (Figura 3). - Secondo le condizioni di cui sopra, preparare quattro tipi di stampi SU-8.
NOTA: i quattro stampi includono uno stampo che consente di controllare la valvola tramite pneumatica, due stampi che creano canali fluidi e uno stampo pulito senza forma (Figura 4 e Tabella 1). I quattro tipi di stampi menzionati sono fabbricati utilizzando processi di fotolitografia standard. Questa produzione di stampi è costituita da uno stampo SU-8 su un wafer di silicio secondo i rapportiprecedentemente pubblicati 18,19. La Figura 5 illustra il chip del dispositivo.
2. Fabbricazione della piattaforma microfluidica per la concentrazione di particelle
NOTA: la Figura 6 illustra la fabbricazione di una piattaforma microfluidica che concentra le particelle.
- Replicare lo strato PDMS utilizzando uno stampo SU-8 del canale pneumatico della valvola preparato (fase 1.3) per il controllo pneumatico della valvola.
- Versare 10 mL di PDMS liquido e 1 mL di agente polimerizzante (vedere Tabella dei materiali) in uno stampo a canale della valvola pneumatica preparato (fase 1.3) e attivare termicamente a 90 °C per 30 minuti.
- Dopo che le strutture PDMS sono state curate, separare lo stampo SU-8 del passaggio 2.1.1.
- Punzonare tre porte pneumatiche da 1,5 mm (Vs, Vf e Vp) nel canale pneumatico della valvola prodotto secondo il punto 2.1.2 utilizzando una foratura di 1,5 mm (vedere Tabella dei materiali).
- Versare 10 mL di PDMS liquido e 1 mL di agente polimerizzante in uno stampo SU-8 pulito preparato preparato nella fase 1.3 e spin-coat a 1.500 giri / min per 15 s utilizzando una centrifuga (vedere Tabella dei materiali). Quindi attivare termicamente a 90 °C per 30 minuti.
- Dopo che le strutture PDMS sono state curate, separare lo stampo SU-8 del passaggio 2.1.4.
NOTA: lo strato a membrana della valvola controlla il flusso del fluido in base alla pressione pneumatica. - Trattare il plasma atmosferico (vedi Tabella dei materiali) alle strutture PDMS preparate nei passaggi 2.1.3 e 2.1.5 per 20 s.
- Allineare direttamente le strutture PDMS trattate al plasma dal passaggio 2.1.6 in base alla struttura del canale controllando con un microscopio.
- Incollare le strutture PDMS allineate preparate nel passaggio 2.1.7 riscaldando a 90 °C per 30 min.
- Punzonare un foro di 1,5 mm di diametro nelle uscite di ingresso del canale del fluido (Qfp) e del canale del fluido (Qf e Qp) all'interno della parte del canale pneumatico a cui è legato lo strato sottile della membrana, utilizzando una foratura di 1,5 mm.
- Replicare entrambi i lati dello strato PDMS utilizzando due stampi SU-8 per creare un canale microfluidico. Utilizzare uno stampo a canale microfluidico curvo e rettangolare sulla parte anteriore e uno stampo per canale di interconnessione microfluidico sul retro.
- Versare 10 mL di PDMS liquido e 1 mL di agente polimerizzante nello stampo a canale microfluidico curvo e rettangolare e nello spin-coat a 1.200 giri/min per 15 s. Quindi creare stampi per la camera del fluido curva e i canali del fluido mediante attivazione termica a 90 °C per 30 minuti (Figura 6A).
- Separare lo strato PDMS su cui si forma il canale microfluidico, quindi creare uno stampo attivato dal calore che copre la parete di sfiato sigillata legandosi al wafer di vetro trattando il plasma atmosferico per 20 s (Figura 6B).
- Versare 3 mL di PDMS liquido nel canale di interconnessione dello stampo SU-8 (Figura 6C).
- Disporre la struttura fabbricata nel passaggio 2.2.2 con lo stampo del canale di interconnessione in PDMS liquido sullo stampo del canale di interconnessione microfluidica e asciugare la struttura sovrapposta a 130 °C per 30 minuti (Figura 6D).
NOTA: durante la polimerizzazione della struttura posteriore, lo stampo PDMS fabbricato nel passaggio 2.2.2 viene gonfiato dalla pressione termica dello strato d'aria e lo strato PDMS deformato viene attivato termicamente (Figura 6E)16. - Dopo la polimerizzazione, rimuovere lo stampo SU-8 anteriore dallo strato di rete del canale microfluidico e staccare con cura lo stampo PDMS posteriore (Figura 6F).
NOTA: Lo strato di rete fluidica 3D consente la creazione di una camera fluida curva anteriore e canali microfluidici. - Versare 10 ml di PDMS liquido e 1 mL di agente polimerizzante in uno stampo SU-8 pulito. Quindi attivare termicamente a 90 °C per 30 minuti.
- Dopo che le strutture PDMS sono state curate, separare lo stampo SU-8.
NOTA: questo passaggio crea il livello di tenuta aggiuntivo. - Trattare il plasma atmosferico in strutture PDMS preparate nei passaggi 2.2.3 e 2.2.7 per 20 s.
- Allineare direttamente le strutture PDMS trattate al plasma in base alla struttura del canale controllando con un microscopio.
- Legare le strutture PDMS allineate riscaldando a 90 °C per 30 min.
- Allineare le strutture PDMS preparate nei passaggi 2.1 e 2.2 in base alla struttura del canale e legarle trattando il plasma atmosferico per 20 s.
3. Configurazione del dispositivo
NOTA: la Figura 7 mostra la fabbricazione di una piattaforma microfluidica che concentra le particelle.
- Riempire manualmente il canale microfluidico con acqua demineralizzata priva di bolle utilizzando una siringa da 10 ml.
- Per controllare la P_Qfp e le tre valvole pneumatiche (P_Vs, P_Vf e P_Vp) che controllano il flusso delle microsfere, inserire nella piattaforma microfluidica un regolatore di pressione di precisione con quattro o più canali di uscita (vedi Tabella dei materiali) per il fluido di lavoro (Qfp).
NOTA: un regolatore di pressione di precisione con quattro canali di uscita può essere sostituito con più regolatori di pressione di precisione. In questo esperimento, la pressione di esercizio di P_Qfp era di 10 kPa, P_Vs era di 15 kPa e P_Vf e P_Vp erano entrambi di 18 kPa (Figura 8 e Tabella 2). La Figura 8 mostra la portata del fluido di lavoro nel tempo quando le particelle sono concentrate dalla piattaforma microfluidica con P_Vs di 15 kPa e la Tabella 2 mostra i risultati dell'attuazione in base alle valvole pneumatiche. - Preparare particelle di prova di polistirene carbossilico di varie dimensioni in acqua distillata (vedere Tabella dei materiali).
NOTA: Le dimensioni delle particelle utilizzate in questo esperimento erano 24,9, 8,49 e 4,16 μm; particelle di varie dimensioni possono essere utilizzate a seconda della pressione di P_Vs. - Per controllare la portata del fluido di lavoro, riempire una bottiglia di vetro mezza piena d'acqua (fluido di lavoro) e collegare il tappo della bottiglia di vetro al canale di uscita del controller e alla microvalvola.
NOTA: Collegare un tubo alla microvalvola per ricevere aria compressa dal controller e l'altro tubo per iniettare acqua. - Osservare il funzionamento della piattaforma attraverso un microscopio invertito per tutte le operazioni della piattaforma e misurare la portata operativa nel tempo all'uscita con un misuratore di portata liquido (vedere Tabella dei materiali).
4. Funzionamento del dispositivo
- Iniettare la miscela particella/fluido sotto pressione all'ingresso (Qfp) con Vp (Figura 9A).
NOTA: Il flusso di particelle e fluido pulito dall'uscita attraverso i canali interconnessi è controllato tramite Vp e Vf, rispettivamente (Tabella 2). - Applicare una pressione a Vs a 15 kPa e Vp a 18 kPa per azionare la valvola.
NOTA: In questo momento, il diaframma è deformato, le particelle del fluido Qfp sono bloccate nello spazio di contatto tra il canale del fluido curvo e il fluido curvo a sbalzo e il fluido Qfp indesiderato viene rilasciato attraverso il Qf aperto (Figura 9B, C). - Quando le particelle sono concentrate, applicare la pressione solo a Vf.
NOTA: In questo momento, quando la pressione viene applicata solo a Vf, le particelle intasate vengono rilasciate attraverso Qp (Figura 9D).
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Representative Results
La Figura 8 mostra la portata delle fluidità per un funzionamento a quattro stadi della piattaforma, come indicato nella Tabella 2. Il primo stadio è lo stato di caricamento (uno stato). La piattaforma è stata fornita con fluido con tutte le valvole aperte e il fluido di lavoro (Qf) e le particelle (Qp) sono quasi identici poiché la rete di canali microfluidici presenta simmetria strutturale. Nel secondo stadio (stato b), l'aria compressa è stata trasportata a Vs per bloccare le particelle e, man mano che il diaframma Vs si deformava, il percorso del flusso si restringeva e la portata misurata alla porta di uscita veniva ridotta dalla resistenza idraulica. Le portate di Qf e Qp erano quasi simili e la differenza era inferiore al 2,67%. Nel terzo stadio (stato c), l'aria compressa è stata consegnata a Vs e Vp per la concentrazione di particelle, con Vs e Vp chiusi e Vf aperti. Il Qp misurato era vicino allo zero e il Qf era circa 1,42 volte quello dello stato b. Nella maggior parte dei casi, la portata raddoppia quando entrambi i canali di dissipazione sono in funzione, ma la piattaforma ha diversi tipi di resistenza idraulica nei principali canali del fluido e Vs, quindi il flusso totale del fluido di lavoro è ridotto. Infine (stato d), l'aria compressa è stata consegnata solo a Vf per raccogliere le particelle concentrate e le portate di Qf e Qp sono state invertite. Il flusso era zero perché Vf bloccava Qf e Qp era circa 1,42 volte lo stato b. Il rapporto di concentrazione delle particelle (Qp/(Qf+Qp) × 100) era 3,96-4,53. Ciò dimostra che l'azionamento sequenziale programmato con la valvola pneumatica funziona bene a causa dei cambiamenti di flusso.
La Figura 9 mostra lo schermo che cattura le particelle concentrate. La Figura 9A mostra lo stato di flusso del fluido con le tre valvole pneumatiche non azionate, la Figura 9B mostra il metodo utilizzato per intrappolare le particelle, la Figura 9C mostra il metodo del setaccio e la Figura 9D mostra l'espulsione delle perle concentrate. Le particelle sono state concentrate e accumulate nell'area di raccolta quando Vs e Vp sono state chiuse, e tutte le particelle concentrate raccolte sono state rilasciate entro 4 s quando solo Vf è stato chiuso. Pertanto, il dispositivo raccoglie con successo molte particelle adatte alla raccolta e alla concentrazione delle particelle.
Figura 1: Schema schematico di una piattaforma microfluidica pneumatica per la concentrazione di microparticelle (P, porta; Q, portata; f, fluido; p, particella; V, valvola; s, setaccio). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Assemblaggio della piattaforma microfluidica pneumatica per la concentrazione di microparticelle. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Schema di Vs nella piattaforma microfluidica pneumatica per la concentrazione di microparticelle (P, porta; Q, portata; f, fluido; p, particella; V, valvola; s, setaccio). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Immagine CAD della piattaforma microfluidica pneumatica per la concentrazione di microparticelle. (A) Valvola a canale pneumatico. (B) Canale principale del fluido. (C) Canale fluido di interconnessione. (D) Immagine incrociata di ciascun canale (per le dimensioni da 1 a 7, vedere Tabella 1). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Immagine di fabbricazione della piattaforma microfluidica pneumatica per la concentrazione di microparticelle. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Schema della sezione trasversale della rete di canali fluidici 3D durante la fabbricazione. (A) Vengono creati stampi per la camera del fluido curva e il canale del fluido per lo stampaggio della replica. (B) Incollaggio al plasma dello strato PDMS dopo la polimerizzazione su un wafer di vetro. (C) Il PDMS liquido viene versato nello stampo SU-8 per creare il canale di interconnessione. (D) La camera del fluido e la struttura del canale del fluido sono disposte in PDMS liquido sullo stampo SU-8. (E) Il sistema è gonfiato dalla pressione termica dello strato d'aria. (F) La struttura gonfiata e lo stampo SU-8 vengono rimossi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: Schema della piattaforma microfluidica pneumatica predisposta per la concentrazione di microparticelle. Fare clic qui per visualizzare una versione più ampia di questa figura.
Figura 8: La portata delle fluidità per un funzionamento a quattro stadi della piattaforma. Le portate del fluido di lavoro Qf e Qp seguono i tempi di funzionamento Vf e Vp impostati (tempi di concentrazione delle particelle) in una piattaforma microfluidica pneumatica con un Vs di 15 kPa. a-d mostra lo stato di funzionamento della piattaforma microfluidica pneumatica secondo la Tabella 2. (1) Carico del campione, (2) Blocco del campione, (3) Concentrazione del campione, (4) Rilascio del campione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 9: Funzionamento del concentratore di microparticelle. (A) Prima dell'operazione. B) Setacciatura di microparticelle. (C) Completamento del setaccio di microparticelle. D) Rilascio di particelle concentrate. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Numero | Struttura | Larghezza (W) o diametro (D), (μm) | |||
| 1 | Camera pneumatica | 1200 (D) | |||
| 2 | Canale pneumatico | 50 (V) | |||
| 3 | Canale fluido | 200 (V) | |||
| 4 | Camera fluida per Vs | 800 (D) | |||
| 5 | Camera fluida per Vp (Vf) | 400 (D) | |||
| 6 | Camera di interconnessione | 400 (D) | |||
| 7 | Canale di interconnessione | 200 (V) | |||
Tabella 1: Dimensioni della piattaforma microfluidica pneumatica (da 1 a 7 nella Figura 4).
| Stato | Microfluidica pneumatica Funzionamento della piattaforma |
Funzionamento della valvola pneumatica | |||
| Segnale | Vs | Vf | Vp | ||
| un | Caricamento | 4 | SPENTO | SPENTO | SPENTO |
| b | Inceppamento | 1 | SU | SPENTO | SPENTO |
| c | Concentrazione | 2 | SU | SPENTO | SU |
| d | Rilascio | 3 | SPENTO | SU | SPENTO |
Tabella 2: Funzionamento pneumatico della piattaforma microfluidica mediante funzionamento pneumatico della valvola, mostrato nella Figura 8.
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Discussion
Questa piattaforma fornisce un modo semplice per purificare e concentrare particelle di varie dimensioni. Le particelle vengono accumulate e rilasciate attraverso il controllo pneumatico della valvola e non si osserva alcun intasamento perché non esiste una struttura passiva. Utilizzando questo dispositivo, viene presentata la concentrazione di particelle di tre dimensioni. Tuttavia, la pressione di esercizio, il tempo necessario per la concentrazione e la velocità possono variare a seconda delle dimensioni del dispositivo, dell'ingrandimento delle dimensioni delle particelle e della pressione a Vs 18,20,21.
Quando si esegue il passaggio 3.1, le bolle d'aria possono rimanere sulla superficie curva del canale. Quando la bolla d'aria rimane, l'ambiente nel canale cambia, quindi è necessario controllare il canale con molta attenzione attraverso un microscopio prima dell'operazione.
Rispetto agli studi precedenti, questa piattaforma presenta alcuni vantaggi e svantaggi. Nel metodo dielettroforetico, vengono utilizzate meno particelle bersaglio22. È stato necessario un ulteriore processo per preparare le particelle per migliorare l'interazione fisica tra particelle e forzeesterne 22,23. Devono essere considerati problemi di progettazione complessi per aumentare l'efficienza di separazione nei sistemi di separazione magnetoforetica 5,22. Questa piattaforma ha mostrato una maggiore efficienza di separazione rispetto al metodo ad ultrasuoni, che può separare i campioni ad alte portate24. Tuttavia, poiché questa piattaforma non ha una struttura passiva, non è stato osservato alcun effetto di intasamento 25,26,27 quando le perline sono state intrappolate e accumulate, a differenza del metodo passivo. 7,10 Questa piattaforma può essere utilizzata per il pretrattamento dell'acqua durante la concentrazione e l'estrazione di bioparticelle sospese, in quanto l'operazione non è influenzata dalle proprietà delle particelle fisiche18,21.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione della National Research Foundation of Korea (NRF) finanziata dal governo coreano (Ministero della Scienza e delle TIC). (No. NRF-2021R1A2C1011380).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mm puncture | Self procduction | Self procduction | This puncture was made by requesting a mold maker based on the Miltex® Biopsy Punch with Plunger (15110-15) product. |
| 4 inch Silicon Wafer/SU-8 mold | 4science | 29-03573-01 | 4 inch (100) Ptype silicon wafer/SU-8 mold |
| Carboxyl Polystyrene Crosslinked Particle(24.9 μm) | Spherotech | CPX-200-10 | Concentrated bead sample1 |
| Flow meter | Sensirion | SLI-1000 | Flow measurement |
| High-speed camera | Photron | FASTCAM Mini | Observation of concentration |
| Hot plate | As one | HI-1000 | heating plate for curing of liquid PDMS |
| KOVAX-SYRINGE 10 mL/Syringe | Koreavaccine | 22G-10ML | Fill the microfluidic channel with bubble-free demineralized water. |
| Laboratory Conona treater/Atmospheric plasma | Electro-Technic | BD-20AC | Chip bonding/atmospheric plasma |
| Liquid polydimethylsiloxane, PDMS | Dow Corning Inc. | Sylgard 184 | Components of chip |
| Microscope | Olympus | IX-81 | Observation of concentration |
| PEEK Tubes | SAINT-GOBAIN PPL CORP. | AAD04103 | Inject or collect particles |
| Polystyrene Particle(4.16 μm) | Spherotech | PP-40-10 | Concentrated bead sample3 |
| Polystyrene Particle(8.49 μm) | Spherotech | PP-100-10 | Concentrated bead sample2 |
| Pressure controller/μflucon | AMED | μflucon | Control of air pressure |
| Spin coater | iNexus | ACE-200 | spread the liquid PDMS on SU-8 mold |
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