Summary
Le présent protocole décrit une plate-forme microfluidique pneumatique qui peut être utilisée pour une concentration efficace de microparticules.
Abstract
Le présent article présente une méthode de fabrication et d’exploitation d’une vanne pneumatique pour contrôler la concentration de particules à l’aide d’une plate-forme microfluidique. Cette plate-forme dispose d’un réseau tridimensionnel (3D) avec des canaux de fluide incurvés et trois vannes pneumatiques, qui créent des réseaux, des canaux et des espaces grâce à la réplication duplex avec du polydiméthylsiloxane (PDMS). Le dispositif fonctionne en fonction de la réponse transitoire d’un débit de fluide contrôlé par une vanne pneumatique dans l’ordre suivant: (1) chargement de l’échantillon, (2) blocage de l’échantillon, (3) concentration de l’échantillon et (4) libération de l’échantillon. Les particules sont bloquées par la déformation de la fine couche de diaphragme de la plaque de la vanne de tamis (Vs) et s’accumulent dans le canal microfluidique incurvé. Le fluide de travail est évacué par l’actionnement de deux vannes marche/arrêt. À la suite de l’opération, toutes les particules de divers grossissements ont été interceptées et désengagées avec succès. Lorsque cette technologie est appliquée, la pression de fonctionnement, le temps nécessaire à la concentration et le taux de concentration peuvent varier en fonction des dimensions de l’appareil et du grossissement de la taille des particules.
Introduction
En raison de l’importance de l’analyse biologique, les technologies des systèmes microélectromécaniques microfluidiques et biomédicaux (BioMEMS) 1,2 sont utilisées pour développer et étudier des dispositifs de purification et de collecte de micromatériaux 2,3,4. La capture de particules est classée comme active ou passive. Des pièges actifs ont été utilisés pour les forces diélectriquesexternes 5, magnétophorétiques6,auditives 7,visuelles 8 outhermiques 9 agissant sur des particules indépendantes, permettant un contrôle précis de leurs mouvements. Cependant, une interaction entre la particule et la force externe est nécessaire; ainsi, le débit est faible. Dans les systèmes microfluidiques, le contrôle du débit est très important car les forces externes sont transmises aux particules cibles.
En général, les dispositifs microfluidiques passifs ont des micropiliers dans des microcanaux10,11. Les particules sont filtrées par interaction avec un fluide qui s’écoule, et ces dispositifs sont faciles à concevoir et peu coûteux à fabriquer. Cependant, ils provoquent un colmatage des particules dans les micro-piliers, de sorte que des dispositifs plus complexes ont été développés pour empêcher le colmatage des particules12. Les dispositifs microfluidiques à structures complexes conviennent généralement à la gestion d’un nombre limité de particules 13,14,15,16,17,18.
Cet article décrit une méthode de fabrication et d’exploitation d’une plate-forme microfluidique à entraînement pneumatique pour de grandes concentrations de particules qui surmonte les lacunes18 mentionnées ci-dessus. Cette plate-forme peut bloquer et concentrer les particules par déformation et actionnement de la fine couche de diaphragme de la plaque de vanne de tamis (Vs) qui s’accumule dans les canaux microfluidiques incurvés. Les particules s’accumulent dans des canaux microfluidiques incurvés, et les particules concentrées peuvent se séparer en déchargeant le fluide de travail via l’actionnement de deux joints PDMS sur / hors valves18. Cette méthode permet de traiter un nombre limité de particules ou de concentrer un grand nombre de petites particules. Les conditions de fonctionnement telles que l’ampleur du débit et la pression de l’air comprimé peuvent prévenir les dommages indésirables aux cellules et augmenter l’efficacité du piégeage des cellules.
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Protocol
1. Conception de la plateforme microfluidique pour la concentration de particules
- Concevoir la plate-forme microfluidique pneumatique composée d’une vanne pneumatique pour l’écoulement du fluide dans le réseau d’écoulement 3D et de trois vannes pneumatiques pour le fonctionnement de la vanne de tamis (Vs), de fluide (Vf) et de particules (Vp) (Figure 1).
REMARQUE: Vs bloque les particules de concentré du liquide, et Vf et Vp permettent la libération de fluide et de particules après la concentration. Trois orifices pneumatiques fournissent de l’air comprimé à partir de la couche d’alimentation fluide/pneumatique (normalement ouverte) et de la sortie de lumière de la vanne pneumatique pour actionner la vanne. Le réseau de canaux microfluidiques est conçu avec un programme de CAO18,19. - Concevez le canal de manière à être une couche d’alimentation pneumatique et une couche réseau de canaux 3D (Figure 2).
REMARQUE: Le réseau de fluides est interconnecté avec les canaux incurvés dans la partie antérieure et la chambre rectangulaire dans la région postérieure. Vs bloquent l’entrée et les particules s’accumulent dans la zone de collecte du canal de fluide incurvé. Les fluides sans particules (liquides sans particules) sont sortis par la sortie Qf et les particules concentrées par la sortie Qp (Figure 3). - Selon les conditions ci-dessus, préparez quatre types de moules SU-8.
REMARQUE: Les quatre moules comprennent un moule qui permet de contrôler la vanne via la pneumatique, deux moules qui créent des canaux de fluide et un moule propre sans forme (Figure 4 et Tableau 1). Les quatre types de moules mentionnés sont fabriqués à l’aide de procédés de photolithographie standard. Cette fabrication de moule consiste en un moule SU-8 sur une plaquette de silicium selon les rapports précédemment publiés18,19. La figure 5 illustre la puce de l’appareil.
2. Fabrication de la plate-forme microfluidique pour la concentration de particules
REMARQUE : La figure 6 illustre la fabrication d’une plateforme microfluidique qui concentre les particules.
- Répliquez la couche PDMS à l’aide d’un moule SU-8 à canal de vanne pneumatique préparé (étape 1.3) pour contrôler pneumatiquement la vanne.
- Verser 10 mL de PDMS liquide et 1 mL d’agent de durcissement (voir tableau des matériaux) dans un moule de canal de vanne pneumatique préparé (étape 1.3) et activer la chaleur à 90 °C pendant 30 min.
- Une fois les structures PDMS durcies, séparez le moule SU-8 de l’étape 2.1.1.
- Poinçonnez trois orifices pneumatiques de 1,5 mm (Vs, Vf et Vp) dans le canal de vanne pneumatique fabriqué conformément à l’étape 2.1.2 à l’aide d’une perforation de 1,5 mm (voir tableau des matériaux).
- Versez 10 mL de PDMS liquide et 1 mL d’agent de durcissement dans un moule SU-8 propre préparé préparé à l’étape 1.3 et faites tourner le manteau à 1 500 tr/min pendant 15 s à l’aide d’un enrobeur de spin (voir tableau des matériaux). Puis chauffez-vous à 90 °C pendant 30 min.
- Une fois les structures PDMS durcies, séparez le moule SU-8 de l’étape 2.1.4.
REMARQUE: La couche de membrane de la vanne contrôle l’écoulement du fluide en fonction de la pression pneumatique. - Traiter le plasma atmosphérique (voir tableau des matériaux) jusqu’aux structures PDMS préparées aux étapes 2.1.3 et 2.1.5 pendant 20 s.
- Alignez les structures PDMS directement traitées au plasma de l’étape 2.1.6 en fonction de la structure des canaux en vérifiant au microscope.
- Collez les structures PDMS alignées préparées à l’étape 2.1.7 en les chauffant à 90 °C pendant 30 min.
- Perforez un trou de 1,5 mm de diamètre dans l’entrée du canal de fluide (Qfp) et les sorties de canal de fluide (Qf et Qp) dans la partie du canal pneumatique à laquelle la fine couche de diaphragme est collée, à l’aide d’une perforation de 1,5 mm.
- Répliquez les deux côtés de la couche PDMS à l’aide de deux moules SU-8 pour créer un canal microfluidique. Utilisez un moule à canal microfluidique incurvé et rectangulaire à l’avant et un moule à canal d’interconnexion microfluidique à l’arrière.
- Versez 10 mL de PDMS liquide et 1 mL d’agent de durcissement dans le moule à canal microfluidique incurvé et rectangulaire et la couche de spin à 1 200 tr/min pendant 15 s. Créez ensuite des moules pour la chambre à fluide incurvée et les canaux de fluide par activation thermique à 90 °C pendant 30 min (Figure 6A).
- Séparez la couche PDMS sur laquelle se forme le canal microfluidique, puis créez un moule activé par la chaleur recouvrant la paroi d’aération scellée en se liant à la plaquette de verre en traitant le plasma atmosphérique pendant 20 s (Figure 6B).
- Versez 3 mL de PDMS liquide dans le canal d’interconnexion du moule SU-8 (Figure 6C).
- Disposez la structure fabriquée à l’étape 2.2.2 avec le moule du canal d’interconnexion dans un PDMS liquide sur le moule du canal d’interconnexion microfluidique et séchez la structure superposée à 130 °C pendant 30 min (Figure 6D).
REMARQUE: Lors du durcissement de la structure arrière, le moule PDMS fabriqué à l’étape 2.2.2 est gonflé par la pression thermique de la couche d’air et la couche PDMS déformée est activée thermiquement (Figure 6E)16. - Après durcissement, retirez le moule SU-8 avant de la couche réseau de canaux microfluidiques et décollez soigneusement le moule PDMS arrière (Figure 6F).
REMARQUE: La couche de réseau fluidique 3D permet la création d’une chambre fluide incurvée antérieure et de canaux microfluidiques. - Versez 10 mL de PDMS liquide et 1 mL d’agent de durcissement dans un moule SU-8 propre. Puis chauffez-vous à 90 °C pendant 30 min.
- Une fois les structures PDMS durcies, séparez le moule SU-8.
REMARQUE : cette étape crée la couche d’étanchéité supplémentaire. - Traiter le plasma atmosphérique avec des structures PDMS préparées aux étapes 2.2.3 et 2.2.7 pendant 20 s.
- Alignez les structures PDMS directement traitées au plasma en fonction de la structure des canaux en vérifiant au microscope.
- Collez les structures PDMS alignées en chauffant à 90 °C pendant 30 min.
- Aligner les structures PDMS préparées aux étapes 2.1 et 2.2 en fonction de la structure des canaux et les lier en traitant le plasma atmosphérique pendant 20 s.
3. Configuration de l’appareil
REMARQUE : La figure 7 montre la fabrication d’une plate-forme microfluidique qui concentre les particules.
- Remplissez manuellement le canal microfluidique avec de l’eau déminéralisée sans bulles à l’aide d’une seringue de 10 mL.
- Pour contrôler la P_Qfp et les trois vannes pneumatiques (P_Vs, P_Vf et P_Vp) qui contrôlent le débit de microbilles, insérez un régulateur de pression de précision avec quatre canaux de sortie ou plus (voir tableau des matériaux) pour le fluide de travail (Qfp) dans la plate-forme microfluidique.
REMARQUE: Un régulateur de pression de précision avec quatre canaux de sortie peut être remplacé par plusieurs contrôleurs de pression de précision. Dans cette expérience, la pression de fonctionnement de P_Qfp était de 10 kPa, P_Vs de 15 kPa et P_Vf et P_Vp étaient tous deux de 18 kPa (figure 8 et tableau 2). La figure 8 montre le débit du fluide de travail au fil du temps lorsque les particules sont concentrées par la plate-forme microfluidique avec P_Vs de 15 kPa, et le tableau 2 montre les résultats d’actionnement en fonction des vannes pneumatiques. - Préparer des particules d’essai de polystyrène de carboxyle de différentes tailles dans de l’eau distillée (voir tableau des matériaux).
NOTE: Les tailles de particules utilisées dans cette expérience étaient de 24,9, 8,49 et 4,16 μm; des particules de différentes tailles peuvent être utilisées en fonction de la pression de P_Vs. - Pour contrôler le débit du fluide de travail, remplissez une bouteille en verre à moitié pleine d’eau (fluide de travail) et connectez le bouchon de la bouteille en verre au canal de sortie du contrôleur et à la microvalve.
REMARQUE: Connectez un tube à la microvanne pour recevoir de l’air comprimé du contrôleur et l’autre tube pour injecter de l’eau. - Observez le fonctionnement de la plate-forme à l’aide d’un microscope inversé pour toutes les opérations de la plate-forme et mesurez le débit de fonctionnement au fil du temps à la sortie à l’aide d’un débitmètre de liquide (voir tableau des matériaux).
4. Fonctionnement de l’appareil
- Injecter le mélange particule/fluide sous pression à l’entrée (Qfp) avec Vp (Figure 9A).
REMARQUE: L’écoulement des particules et du fluide propre de la sortie à travers les canaux interconnectés est contrôlé via Vp et Vf, respectivement (tableau 2). - Appliquez une pression sur Vs à 15 kPa et Vp à 18 kPa pour actionner la vanne.
REMARQUE: À ce stade, le diaphragme est déformé, les particules du fluide Qfp sont bloquées dans l’espace de contact entre le canal de fluide incurvé et le fluide incurvé en porte-à-faux, et le fluide Qfp indésirable est libéré par le Qf ouvert (Figure 9B, C). - Lorsque les particules sont concentrées, appliquez une pression uniquement sur Vf.
REMARQUE: À ce stade, lorsque la pression est appliquée uniquement à Vf, les particules obstruées sont libérées par Qp (Figure 9D).
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Representative Results
La figure 8 montre le débit des débits de fluide pour une opération de plate-forme à quatre étages, comme mentionné dans le tableau 2. La première étape est l’état de chargement (un état). La plate-forme a été fournie avec du fluide avec toutes les vannes ouvertes, et le fluide de travail (Qf) et les particules (Qp) sont presque identiques car le réseau de canaux microfluidiques présente une symétrie structurelle. Dans la deuxième étape (état b), l’air comprimé a été transporté vers V pour bloquer les particules, et lorsque le diaphragme Vs s’est déformé, le chemin d’écoulement s’est rétréci et le débit mesuré à l’orifice de sortie a été réduit par résistance hydraulique. Les débits de Qf et Qp étaient presque similaires, et la différence était inférieure à 2,67%. Dans la troisième étape (état c), l’air comprimé a été livré à Vs et Vp pour la concentration de particules, avec Vs et Vp fermés et Vf ouverts. Le Qp mesuré était proche de zéro, et le Qf était environ 1,42 fois celui de l’état b. Dans la plupart des cas, le débit double lorsque les deux canaux de dissipation sont en fonctionnement, mais la plate-forme a différents types de résistance hydraulique dans les canaux de fluide principaux et V, de sorte que le débit total du fluide de travail est réduit. Enfin (état d), l’air comprimé a été livré uniquement à Vf pour collecter les particules concentrées, et les débits de Qf et Qp ont été inversés. Le flux était nul parce que Vf bloquait Qf, et Qp était environ 1,42 fois l’état b. Le rapport de concentration des particules (Qp/(Qf+Qp) × 100) était de 3,96-4,53. Cela montre que l’actionnement séquentiel programmé avec la vanne pneumatique fonctionne bien en raison des changements de débit.
La figure 9 montre l’écran capturant des particules concentrées. La figure 9A montre l’état d’écoulement du fluide avec les trois vannes pneumatiques non actionnées, la figure 9B montre la méthode utilisée pour piéger les particules, la figure 9C montre la méthode du tamis et la figure 9D montre l’éjection des billes concentrées. Les particules ont été concentrées et accumulées dans la zone de collecte lorsque Vs et Vp ont été fermés, et toutes les particules concentrées collectées ont été libérées en 4 s lorsque seule Vf a été fermée. Par conséquent, l’appareil collecte avec succès de nombreuses particules adaptées à la collecte et à la concentration de particules.
Figure 1 : Schéma d’une plate-forme microfluidique pneumatique pour la concentration en microparticules (P, port; Q, débit; f, fluide; p, particule; V, vanne; s, tamis). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2: Assemblage de la plate-forme microfluidique pneumatique pour la concentration de microparticules. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3 : Schéma de Vs dans la plate-forme microfluidique pneumatique pour la concentration en microparticules (P, port; Q, débit; f, fluide; p, particule; V, vanne; s, tamis). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4: Image CAO de la plate-forme microfluidique pneumatique pour la concentration de microparticules. (A) Vanne à canal pneumatique. (B) Canal principal du fluide. (C) Canal fluide d’interconnexion. (D) Image croisée de chaque canal (pour les dimensions de 1 à 7, voir tableau 1). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5: Image de fabrication de la plate-forme microfluidique pneumatique pour la concentration de microparticules. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 6: Schéma de la section transversale du réseau de canaux fluidiques 3D pendant la fabrication. (A) Des moules sont créés pour la chambre à fluide incurvée et le canal de fluide pour le moulage de répliques. (B) Liaison au plasma de la couche PDMS après durcissement sur une plaquette de verre. (C) Le PDMS liquide est versé dans le moule SU-8 pour créer le canal d’interconnexion. (D) La chambre de fluide et la structure du canal de fluide sont disposées en PDMS liquide sur le moule SU-8. (E) Le système est gonflé par la pression thermique de la couche d’air. (F) La structure gonflée et le moule SU-8 sont enlevés. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 7: Schéma de la plate-forme microfluidique pneumatique configurée pour la concentration de microparticules. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 8 : Débit des débits de fluide pour un fonctionnement de plate-forme à quatre étages. Les débits de fluide de travail Qf et Qp suivent les temps de fonctionnement Vf et Vp définis (temps de concentration des particules) dans une plate-forme microfluidique pneumatique avec un Vs de 15 kPa. a-d montre l’état de fonctionnement de la plate-forme microfluidique pneumatique conformément au tableau 2. (1) Chargement de l’échantillon, (2) Blocage de l’échantillon, (3) Concentration de l’échantillon, (4) Libération de l’échantillon. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 9 : Fonctionnement du concentrateur de microparticules. (A) Avant l’opération. B) Tamisage des microparticules. (C) Achèvement du tamis à microparticules. D) Libération de particules concentrées. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Nombre | Structure | Largeur (W) ou diamètre (D), (μm) | |||
| 1 | Chambre pneumatique | 1200 (D) | |||
| 2 | Canal pneumatique | 50 (L) | |||
| 3 | Canal fluide | 200 (O) | |||
| 4 | Chambre fluide pour Vs | 800 (D) | |||
| 5 | Chambre fluide pour Vp (Vf) | 400 (D) | |||
| 6 | Chambre d’interconnexion | 400 (D) | |||
| 7 | Canal d’interconnexion | 200 (O) | |||
Tableau 1 : Dimensions de la plate-forme microfluidique pneumatique (1 à 7 dans la figure 4).
| État | Microfluidique pneumatique Fonctionnement de la plate-forme |
Fonctionnement de la vanne pneumatique | |||
| Signal | Vs | Vf | Vp | ||
| un | Chargement | 4 | DE | DE | DE |
| b | Bloquant | 1 | SUR | DE | DE |
| c | Concentration | 2 | SUR | DE | SUR |
| d | Libérer | 3 | DE | SUR | DE |
Tableau 2 : Fonctionnement de la plate-forme microfluidique pneumatique par action de vanne pneumatique, illustré à la figure 8.
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Discussion
Cette plate-forme offre un moyen simple de purifier et de concentrer des particules de différentes tailles. Les particules sont accumulées et libérées par la commande pneumatique de la vanne, et aucun colmatage n’est observé car il n’y a pas de structure passive. En utilisant ce dispositif, la concentration de particules de trois tailles est présentée. Cependant, la pression de fonctionnement, le temps nécessaire à la concentration et le débit peuvent varier en fonction des dimensions de l’appareil, du grossissement de la taille des particules et de la pression à Vs 18,20,21.
Lors de l’exécution de l’étape 3.1, des bulles d’air peuvent rester sur la surface incurvée du canal. Lorsque la bulle d’air reste, l’environnement dans le canal change, il est donc nécessaire de vérifier le canal très soigneusement à travers un microscope avant le fonctionnement.
Par rapport aux études précédentes, cette plate-forme présente certains avantages et inconvénients. Dans la méthode diélectrophorétique, moins de particules cibles sont utilisées22. Un processus supplémentaire a été nécessaire pour préparer les particules afin d’améliorer l’interaction physique entre les particules et les forces externes22,23. Des questions de conception complexes doivent être prises en compte pour augmenter l’efficacité de séparation dans les systèmes de séparation magnétophorétique 5,22. Cette plate-forme a montré une efficacité de séparation plus élevée que la méthode ultrasonique, qui peut séparer des échantillons à des débits élevés24. Cependant, comme cette plate-forme n’a pas de structure passive, aucun effet de colmatage 25,26,27 n’a été observé lorsque les perles ont été piégées et accumulées, contrairement à la méthode passive. 7,10 Cette plate-forme peut être utilisée pour le prétraitement de l’eau lors de la concentration et de l’extraction de bioparticules en suspension, car le fonctionnement n’est pas affecté par les propriétés des particules physiques18,21.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par la subvention de la National Research Foundation of Korea (NRF) financée par le gouvernement coréen (ministère des Sciences et des TIC). (Non. NRF-2021R1A2C1011380).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mm puncture | Self procduction | Self procduction | This puncture was made by requesting a mold maker based on the Miltex® Biopsy Punch with Plunger (15110-15) product. |
| 4 inch Silicon Wafer/SU-8 mold | 4science | 29-03573-01 | 4 inch (100) Ptype silicon wafer/SU-8 mold |
| Carboxyl Polystyrene Crosslinked Particle(24.9 μm) | Spherotech | CPX-200-10 | Concentrated bead sample1 |
| Flow meter | Sensirion | SLI-1000 | Flow measurement |
| High-speed camera | Photron | FASTCAM Mini | Observation of concentration |
| Hot plate | As one | HI-1000 | heating plate for curing of liquid PDMS |
| KOVAX-SYRINGE 10 mL/Syringe | Koreavaccine | 22G-10ML | Fill the microfluidic channel with bubble-free demineralized water. |
| Laboratory Conona treater/Atmospheric plasma | Electro-Technic | BD-20AC | Chip bonding/atmospheric plasma |
| Liquid polydimethylsiloxane, PDMS | Dow Corning Inc. | Sylgard 184 | Components of chip |
| Microscope | Olympus | IX-81 | Observation of concentration |
| PEEK Tubes | SAINT-GOBAIN PPL CORP. | AAD04103 | Inject or collect particles |
| Polystyrene Particle(4.16 μm) | Spherotech | PP-40-10 | Concentrated bead sample3 |
| Polystyrene Particle(8.49 μm) | Spherotech | PP-100-10 | Concentrated bead sample2 |
| Pressure controller/μflucon | AMED | μflucon | Control of air pressure |
| Spin coater | iNexus | ACE-200 | spread the liquid PDMS on SU-8 mold |
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