Summary
本プロトコルは、効率的な微粒子濃縮に使用できる空気圧マイクロ流体プラットフォームを記述している。
Abstract
本稿では、マイクロ流体プラットフォームを用いて粒子濃度を制御する空気圧バルブを製造・運用する方法を紹介する。このプラットフォームには、湾曲した流体チャネルと3つの空気圧バルブを備えた3次元(3D)ネットワークがあり、ポリジメチルシロキサン(PDMS)による二重複製を介してネットワーク、チャネル、および空間を作成します。このデバイスは、空気圧バルブによって制御される流体流量の過渡応答に基づいて、(1)サンプルローディング、(2)サンプルブロッキング、(3)サンプル濃度、および(4)サンプルリリースの順序で動作します。粒子は、ふるいバルブ(Vs)プレートの薄いダイヤフラム層変形によってブロックされ、湾曲したマイクロ流体チャネルに蓄積する。作動流体は、2つのオン/オフバルブの作動によって排出されます。操作の結果、様々な倍率のすべての粒子が首尾よく傍受され、噛み合わなくなった。この技術を適用する場合、動作圧力、濃縮に要する時間、および濃縮速度は、装置寸法および粒径倍率に応じて変化し得る。
Introduction
生物学的分析の重要性のために、マイクロ流体および生物医学的マイクロエレクトロメカニカルシステム(BioMEMS)技術1,2は、マイクロマテリアル2,3,4の精製および収集のための装置の開発および研究に使用される。パーティクル キャプチャは、アクティブまたはパッシブに分類されます。アクティブトラップは、独立した粒子に作用する外部誘電体5、磁束6、聴覚7、視覚8、または熱9の力に使用され、それらの動きの正確な制御を可能にした。ただし、粒子と外力の間の相互作用が必要です。したがって、スループットは低くなります。マイクロ流体システムでは、外力がターゲット粒子に伝達されるため、流量を制御することは非常に重要です。
一般に、受動マイクロ流体デバイスは、マイクロチャネル10、11内にマイクロピラーを有する。粒子は流れる流体との相互作用によって濾過され、これらの装置は設計が容易で製造が安価である。しかし、それらはマイクロピラーの粒子詰まりを引き起こすので、粒子の目詰まりを防ぐためにより複雑な装置が開発されている12。複雑な構造を有するマイクロ流体デバイスは、一般に、限られた数の粒子13、14、15、16、17、18を管理するのに適している。
この記事では、上記のように欠点18を克服する大きな粒子濃度のための空気圧駆動マイクロ流体プラットフォームを製作および操作する方法を説明する。このプラットフォームは、湾曲したマイクロ流体チャネルに蓄積するふるいバルブ(Vs)プレートの薄いダイヤフラム層の変形および作動によって粒子をブロックし、濃縮することができる。粒子は湾曲したマイクロ流体チャネルに蓄積し、濃縮粒子は、2つのPDMSシールオン/オフバルブ18の作動を介して作動流体を排出することによって分離することができる。この方法は、限られた数の粒子を処理するか、または多数の小さな粒子を濃縮することを可能にする。流量の大きさや圧縮空気圧などの動作条件は、不要なセルの損傷を防ぎ、セルトラップ効率を高めることができます。
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Protocol
1. 粒子濃縮のためのマイクロ流体プラットフォームの設計
- 3Dフローネットワーク内の流体フロー用の1つの空気圧バルブと、ふるい(Vs)、流体(Vf)、および粒子(Vp)バルブ操作用の3つの空気圧バルブで構成される空気圧マイクロ流体プラットフォームを設計します(図1)。
注:Vsブロックは液体から粒子を濃縮し、VfおよびVpは濃縮後に流体および粒子放出を可能にする。3つの空気圧ポートは、流体/空気圧供給層(ノーマルオープン)と空気圧バルブライト出口から圧縮空気を供給し、バルブを作動させます。マイクロ流体チャネルネットワークは、CADプログラム18、19を用いて設計されている。 - チャンネルを空気圧供給層と3Dチャンネルネットワーク層として設計します(図2)。
注:流体ネットワークは、前部の湾曲したチャネルおよび後部の長方形のチャンバと相互接続されている。Vsは入口を塞ぎ、粒子は湾曲した流体チャネルの収集領域に蓄積する。粒子を含まない流体(粒子を含まない液体)はQf出口を通って出され、濃縮粒子はQp出口を通って出ます(図3)。 - 上記条件に従って、4種類のSU-8金型を作製した。
メモ:4つの金型には、空気圧でバルブを制御できる金型、流体チャネルを作成する2つの金型、形状のないクリーンな金型が含まれています(図4と表1)。上記の4種類のモールドは、標準的なフォトリソグラフィープロセスを使用して製造されています。この金型製作は、以前に発表されたレポート18,19に従って、シリコンウェーハ上のSU-8金型で構成されています。図5は、デバイスチップを示しています。
2. 粒子濃縮用マイクロ流体プラットフォームの作製
注: 図6 は、粒子を濃縮するマイクロ流体プラットフォームの作製を示しています。
- バルブを空気圧制御するために準備された空気圧バルブチャネルSU-8金型(ステップ1.3)を使用してPDMS層を複製します。
- 10mLの液体PDMSおよび1mLの硬化剤( 材料表を参照)を調製した空気圧バルブチャネルモールドに注ぎ(ステップ1.3)、90°Cで30分間熱活性化する。
- PDMS構造が硬化したら、ステップ2.1.1のSU-8金型を分離します。
- 1.5 mm の穿刺を使用して、ステップ 2.1.2 に従って製造された空気圧バルブ チャネルに 3 つの 1.5 mm 空気圧ポート (Vs、Vf、および Vp) を打ち抜きます ( 材料表を参照)。
- ステップ1.3で調製したクリーンなSU-8モールドに液体PDMS10mLおよび硬化剤1mLを注ぎ、スピンコーターを用いて1,500rpmで15秒間スピンコートする( 材料表を参照)。その後、90°Cで30分間加熱活性化する。
- PDMS構造が硬化したら、ステップ2.1.4のSU-8金型を分離します。
メモ:バルブダイヤフラム層は、空気圧に応じて流体の流れを制御します。 - 大気プラズマ( 材料表を参照)を、ステップ2.1.3および2.1.5で準備したPDMS構造に20秒間処理する。
- ステップ2.1.6からプラズマ処理したPDMS構造を、顕微鏡で確認して流路構造に合わせて直接整列させます。
- ステップ2.1.7で調製した整列PDMS構造体を90°Cで30分間加熱して結合させる。
- 1.5 mmの穿刺を使用して、薄いダイヤフラム層が接着されている空気圧チャネル部分内の流体チャネル入口(Qfp)および流体チャネル出口(QfおよびQp)に直径1.5mmの穴を開けます。
- 2つのSU-8金型を使用してPDMS層の両面を複製し、マイクロ流体チャネルを作成します。前面に湾曲した長方形のマイクロ流体チャネルモールドを使用し、背面にマイクロ流体相互接続チャネルモールドを使用します。
- 10 mL の液体 PDMS と 1 mL の硬化剤を湾曲した長方形のマイクロ流体流路モールドに注ぎ、1,200 rpm で 15 秒間スピンコートします。次に、90°Cで30分間熱活性化することにより、湾曲した流体チャンバおよび流体チャネル用の金型を作成します(図6A)。
- マイクロ流体流路が形成されたPDMS層を分離し、大気プラズマを20秒間処理してガラスウェハに貼り合わせて密閉された通気壁を覆う熱活性化型を作る(図6B)。
- 3 mL の液体 PDMS を SU-8 金型の相互接続チャネルに注ぎます (図 6C)。
- ステップ2.2.2で作製した構造体を液状PDMSで配線流路金型でマイクロ流体相互接続流路金型上に配置して、重ね合わせた構造体を130°Cで30分間乾燥させます(図6D)。
注:背面構造を硬化させている間、ステップ2.2.2で作製したPDMSモールドは空気層の熱圧によって膨張し、変形したPDMS層は熱的に活性化される(図6E)16。 - 硬化後、マイクロ流体チャネル網層から前面SU-8金型を取り外し、背面PDMS金型を慎重に剥離します(図6F)。
注:3D流体ネットワーク層は、前方湾曲した流体チャンバおよびマイクロ流体チャネルの作成を可能にする。 - 10 mL の液体 PDMS と 1 mL の硬化剤を清潔な SU-8 金型に注ぎます。その後、90°Cで30分間加熱活性化する。
- PDMS構造が硬化したら、SU-8金型を分離します。
メモ: この手順では、追加のシーリング層を作成します。 - ステップ2.2.3および2.2.7で準備したPDMS構造に大気プラズマを20秒間処理する。
- プラズマ処理したPDMS構造をチャンネル構造に合わせて直接整列させ、顕微鏡で確認します。
- 整列したPDMS構造体を90°Cで30分間加熱して結合させる。
- ステップ2.1、2.2で作成したPDMS構造をチャネル構造に合わせて整列させ、大気プラズマを20秒間処理して接合します。
3. デバイスのセットアップ
注: 図7は 、粒子を濃縮するマイクロ流体プラットフォームの作製を示しています。
- マイクロ流体流路に、10mLシリンジを使用して気泡のない脱塩水を手動で充填する。
- マイクロビードの流れを制御するP_Qfpと3つの空気圧バルブ(P_Vs、P_Vf、およびP_Vp)を制御するには、作動流体(Qfp)用の4つ以上の出力チャネル( 材料表を参照)を備えた精密圧力コントローラをマイクロ流体プラットフォームに挿入します。
メモ:4つの出力チャンネルを備えた精密圧力コントローラは、複数の高精度圧力コントローラと交換できます。本実験では、P_Qfpの運転圧力は10kPa、P_Vsは15kPa、P_Vf及びP_Vpは共に18kPaであった(図8 及び 表2)。 図8 は、15kPaのP_Vsを有するマイクロ流体プラットフォームによって粒子が濃縮されるときの経時的な作動流体流量を示し、 表2 は空気圧バルブによる作動結果を示す。 - 蒸留水中で様々なサイズのカルボキシルポリスチレン試験粒子を調製する( 材料表参照)。
注:この実験で使用された粒子サイズは、24.9、8.49、および4.16μmであった。P_Vsの圧力に応じて様々なサイズの粒子を使用することができる。 - 作動流体の流量を制御するには、ガラス瓶に水(作動流体)を半分充填し、ガラス瓶キャップをコントローラ出力チャネルとマイクロバルブに接続します。
メモ: 一方のチューブをマイクロバルブに接続してコントローラから圧縮空気を受け取り、もう一方のチューブを接続して水を注入します。 - すべてのプラットフォーム操作について倒立顕微鏡でプラットフォームの動作を観察し、液体流量計で出口での経時的な動作流量を測定します( 材料表を参照)。
4. 装置の動作
- 粒子/流体混合物をVpで注入口(Qfp)に圧力下で注入します(図9A)。
メモ:相互接続されたチャネルを通る出口からの粒子および清浄な流体の流れは、それぞれVpおよびVf を介して 制御される(表2)。 - Vs に 15 kPa で、Vp に 18 kPa で圧力を加えてバルブを作動させます。
注:このとき、ダイヤフラムが変形し、流体Qfpの粒子が湾曲流体チャネルと湾曲流体カンチレバーとの間の接触空間で遮断され、不要なQfp流体が開放Qfを介して放出される(図9B、C)。 - 粒子が濃縮されたら、Vfにのみ圧力をかけます。
注:この時点で、Vfにのみ圧力が加えられると、詰まった粒子はQpを介して放出されます(図9D)。
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Representative Results
図8 は、 表2で述べたように、4段階のプラットフォーム動作のための流体速度の流量を示す。第1段階は、ローディング状態(状態)である。プラットフォームには、すべてのバルブを開いた状態で流体が供給され、作動流体(Qf)と粒子(Qp)は、マイクロ流体チャネルネットワークが構造対称性を示すのとほぼ同じです。2段目(b状態)では、圧縮空気をVsに輸送して粒子をブロックし、Vsダイヤフラムが変形するにつれて流路が狭くなり、出口ポートで測定した流量が油圧抵抗によって低下した。QfとQpの流量はほぼ同じで、その差は2.67%未満でした。第3段階(c状態)では、圧縮空気を粒子濃縮のためにVsおよびVpに送達し、VsおよびVpを閉じ、Vfを開放した。測定されたQpはゼロに近く、Qfはb状態の約1.42倍であった。ほとんどの場合、両方の散逸チャネルが動作しているときに流量は2倍になりますが、プラットフォームはメイン流体チャネルとVsで異なるタイプの油圧抵抗を持つため、作動流体の総流量が減少します。最後に(d状態)、圧縮空気をVfのみに送出して濃縮粒子を回収し、QfとQpの流速を逆にした。VfがQfをブロックしたため流量はゼロとなり、Qpはb状態の約1.42倍であった。粒子の濃度比(Qp/(Qf+Qp)×100)は3.96-4.53であった。これは、空気圧バルブでプログラムされたシーケンシャルアクチュエーションが、流量の変化のためにうまく機能することを示しています。
図9は、濃縮粒子を捕捉するスクリーンを示す。図9Aは、3つの空気圧バルブが作動していない流体の流れ状態を示し、図9Bは、粒子を捕捉するために使用される方法を示し、図9Cは、ふるい法を示し、図9Dは、濃縮ビーズの噴出を示す。 VsおよびVpが閉じられたときに粒子は濃縮され、収集領域に蓄積され、Vfのみが閉じられたときに収集されたすべての濃縮粒子が4秒以内に放出された。したがって、この装置は、粒子収集および濃縮に適した多くの粒子を首尾よく収集する。
図1:微粒子濃度のための空気圧マイクロ流体プラットフォームの模式図(P、ポート;Q、流量;f、流体;p、粒子;V、バルブ;s、ふるい)。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図 2: 微粒子濃度用の空気圧マイクロ流体プラットフォームの組み立て。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:微粒子濃度のための空気圧マイクロ流体プラットフォームにおけるVsの概略(P、ポート;Q、流量;f、流体;p、粒子;V、バルブ;s、ふるい)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:微粒子濃縮のための空気圧マイクロ流体プラットフォームのCAD画像。(B)主流体チャネル。(C)相互接続流体チャネル。(d)各チャンネルのクロス画像(1~7の寸法については、表1参照)。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図 5: 微粒子濃縮用の空気圧マイクロ流体プラットフォームの製造イメージ。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図 6: 製造中の 3D 流体チャネル ネットワークの断面の概略図 。(A) 湾曲した流体チャンバとレプリカ成形用の流体チャネル用に金型が作成されます。(b)ガラスウエハへの硬化後のPDMS層のプラズマ接合。(C)液体PDMSをSU-8金型に流し込み、相互接続流路を作成する。(D)流体チャンバおよび流体チャネル構造は、SU−8金型上に液体PDMSに配置されている。(E)空気層の熱圧によって系が膨張する。(f)膨張した構造とSU-8金型を取り外す。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図7:マイクロパーティクル濃度用にセットアップされた空気圧マイクロ流体プラットフォームの概略図。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図8:4段階のプラットフォーム操作の流体速度の流量。 QfおよびQp作動流体流量は、Vsが15kPaの空気圧マイクロ流体プラットフォームにおける設定されたVfおよびVp動作時間(粒子濃度時間)に従う。a−dは、 表2による空気圧マイクロ流体プラットホーム動作状態を示す。(1)サンプルローディング、(2)サンプルブロッキング、(3)サンプル濃度、(4)サンプル放出。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図9:微粒子濃縮器の動作。 (A)手術前。(b)微粒子ふるい分け。(c)微粒子篩完成。(d)濃縮粒子の放出。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
数 | 構造 | 幅 (W) または直径 (D)、(μm) | |||
1 | 空気圧チャンバー | 1200(D) | |||
2 | 空気圧チャンネル | 50 (W) | |||
3 | 流体チャネル | 200 (W) | |||
4 | Vs用流体チャンバー | 800(D) | |||
5 | Vp(Vf)用流体チャンバ | 400(D) | |||
6 | 相互接続チャンバ | 400(D) | |||
7 | 相互接続チャネル | 200 (W) |
表1:空気圧マイクロ流体プラットフォームの寸法( 図4の1~7)。
状態 | 空気圧マイクロ流体 プラットフォームの運用 |
空気圧バルブ操作 | |||
信号 | 対 | ティッカー | 副社長 | ||
ある | 積載 | 4 | オフ | オフ | オフ |
b | ブロッキング | 1 | オン | オフ | オフ |
c | 濃度 | 2 | オン | オフ | オン |
d | 解放 | 3 | オフ | オン | オフ |
表2: 図8に示す空気圧バルブ操作による空気圧マイクロ流体プラットフォーム操作。
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Discussion
このプラットフォームは、さまざまなサイズの粒子を精製および濃縮する簡単な方法を提供します。空気圧バルブ制御により粒子が蓄積・放出され、パッシブ構造がないため目詰まりは観察されません。この装置を用いて、3つのサイズの粒子の濃度が提示される。しかしながら、動作圧力、濃縮に要する時間、および速度は、装置寸法、粒径倍率、およびVs18、20、21における圧力に応じて変化し得る。
ステップ3.1を実行すると、気泡がチャネルの曲面に残ることがあります。気泡が残ると流路内の環境が変化するため、操作前に顕微鏡で流路を非常に注意深く確認する必要があります。
以前の研究と比較して、このプラットフォームにはいくつかの長所と短所があります。誘電泳動法では、より少ない標的粒子が使用される22。粒子と外力との間の物理的相互作用を増強するために粒子を調製するために追加のプロセスが必要であった22,23。磁気フォレティック分離システム5,22における分離効率を高めるためには、複雑な設計上の問題を考慮する必要があります。このプラットフォームは、超音波法よりも高い分離効率を示し、高流速24でサンプルを分離することができる。しかし、このプラットホームはパッシブ構造を有していないため、パッシブ法とは異なり、ビーズを捕集・蓄積しても目詰まり効果25,26,27は認められなかった。7,10このプラットフォームは、操作が物理的粒子18、21の特性の影響を受けないため、懸濁したバイオ粒子を濃縮および抽出する際の水前処理に使用することができる。
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Disclosures
著者らは、開示する利益相反はありません。
Acknowledgments
この研究は、韓国政府(科学情報通信部)の資金提供を受けた韓国国立研究財団(NRF)の助成金によって支援されました。(いいえ。NRF-2021R1A2C1011380)。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1.5 mm puncture | Self procduction | Self procduction | This puncture was made by requesting a mold maker based on the Miltex® Biopsy Punch with Plunger (15110-15) product. |
4 inch Silicon Wafer/SU-8 mold | 4science | 29-03573-01 | 4 inch (100) Ptype silicon wafer/SU-8 mold |
Carboxyl Polystyrene Crosslinked Particle(24.9 μm) | Spherotech | CPX-200-10 | Concentrated bead sample1 |
Flow meter | Sensirion | SLI-1000 | Flow measurement |
High-speed camera | Photron | FASTCAM Mini | Observation of concentration |
Hot plate | As one | HI-1000 | heating plate for curing of liquid PDMS |
KOVAX-SYRINGE 10 mL/Syringe | Koreavaccine | 22G-10ML | Fill the microfluidic channel with bubble-free demineralized water. |
Laboratory Conona treater/Atmospheric plasma | Electro-Technic | BD-20AC | Chip bonding/atmospheric plasma |
Liquid polydimethylsiloxane, PDMS | Dow Corning Inc. | Sylgard 184 | Components of chip |
Microscope | Olympus | IX-81 | Observation of concentration |
PEEK Tubes | SAINT-GOBAIN PPL CORP. | AAD04103 | Inject or collect particles |
Polystyrene Particle(4.16 μm) | Spherotech | PP-40-10 | Concentrated bead sample3 |
Polystyrene Particle(8.49 μm) | Spherotech | PP-100-10 | Concentrated bead sample2 |
Pressure controller/μflucon | AMED | μflucon | Control of air pressure |
Spin coater | iNexus | ACE-200 | spread the liquid PDMS on SU-8 mold |
References
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