Terminal H-refleksmålinger hos mus

Summary

Den kliniske evaluering af spasticitet baseret på Hoffmann-refleksen (H-refleks) og anvendelse af elektrisk stimulering af perifere nerver er en etableret metode. Her giver vi en protokol til en terminal og direkte nervestimulering til H-reflekskvantificering i musens forpote.

Abstract

Hoffmann-refleksen (H-refleks), som en elektrisk analog til strækrefleksen, tillader elektrofysiologisk validering af integriteten af neurale kredsløb efter skader som rygmarvsskader eller slagtilfælde. En stigning i H-refleksresponsen sammen med symptomer som ikke-frivillige muskelsammentrækninger, patologisk forstærket strækrefleks og hypertoni i den tilsvarende muskel er en indikator for spasticitet efter slagtilfælde (PSS).

I modsætning til temmelig nerve-uspecifikke transkutane målinger præsenterer vi her en protokol til kvantificering af H-refleksen direkte ved forpotens ulnar- og mediannerver, som med mindre modifikationer kan anvendes til bagpotens tibiale og iskiasnerve. Baseret på den direkte stimulering og tilpasningen til forskellige nerver repræsenterer metoden et pålideligt og alsidigt værktøj til at validere elektrofysiologiske ændringer i spasticitetsrelaterede sygdomsmodeller.

Introduction

Hoffmann-refleksen (H-refleks), opkaldt efter fysiologen Paul Hoffmann, kan fremkaldes ved elektrisk stimulering af perifere nerver, som bærer axoner af sensoriske og motoriske neuroner, der stammer fra og fører til de samme muskler. Det er den elektrisk inducerede analog af den monosynaptiske strækrefleks og deler den samme vej¹. I modsætning til muskelstrækningen skyldes H-refleksen elektrisk stimulering. Når perifere nerver stimuleres elektrisk ved lav strømintensitet, depolariseres de Ia-afferente fibre typisk først på grund af deres store axondiameter². Deres handlingspotentialer ophidser alfamotorneuroner (αMN'er) i rygmarven, hvilket igen fremkalder handlingspotentialer, der bevæger sig ned ad αMN-axonerne mod musklen (figur 1). Denne kaskade genererer et muskulært respons med lille amplitude, afspejlet i den såkaldte H-bølge. Ved gradvist at øge stimulusintensiteten øges amplituden af H-bølgen på grund af rekrutteringen af yderligere motoriske enheder. Fra en bestemt stimulusintensitet fremkaldes handlingspotentialer i de tyndere axoner af αMN'erne direkte, hvilket registreres som M-bølgen. Denne M-bølge vises med en kortere latenstid end H-bølgen (figur 2). Hvis stimuleringsintensiteten øges yderligere, bliver amplituden af M-bølgen større på grund af rekrutteringen af flere αMN-axoner, mens H-bølgen gradvist bliver mindre. H-bølgen kan undertrykkes ved høje stimulusintensiteter på grund af antidromisk tilbageformering af aktionspotentialer i αMN-axonerne. Disse udløste handlingspotentialer kolliderer med dem fra Ia-stimuleringen og kan således annullere hinanden. Ved supramaksimale stimulusintensiteter forekommer ortodromiske (mod musklen) og antidromiske (mod rygmarven) handlingspotentialer i alle MN-axoner; førstnævnte giver anledning til den maksimale M-bølgeamplitude (Mmax), mens sidstnævnte resulterer i fuldstændig afskaffelse af H-refleks³.

Til evaluering af post-stroke spasticitet (PSS) eller rygmarvsskade (SCI) er H-refleksen blevet brugt til at vurdere det neurale grundlag for bevægelse og spasticitet hos mennesker¹. En forbedret kvantificering af ændringen i H-refleksen mellem målinger og mellem emner opnås ved at anvende forholdet mellem H- og M-bølgen (H/M-forholdet). Alternativt måles den hastighedsafhængige depression (RDD) ved hjælp af et sæt stigende frekvenser (f.eks. 0,1, 0,5, 1,0, 2,0 og 5,0 Hz). RDD afspejler integriteten af hæmmende kredsløb, der kan forstyrres af slagtilfælde eller SCI. Når alle neurale kredsløb er intakte, er der en ensartet, frekvensuafhængig undertrykkelse af H-refleksen. Men hvis der er reduceret neural hæmning som følge af slagtilfælde eller SCI, falder undertrykkelsen af H-refleksen med stigende stimuleringsfrekvens⁴.

Den korrekte elektrofysiologiske registrering ved hjælp af overfladeelektroder kan være udfordrende og kan påvirkes af motoriske opgaver, hæmmende mekanismer og αMN excitabilitet⁵. I den transkutane optagelse hos gnavere placeres en stimuluselektrode nær tibialnerven, og en optageelektrode placeres nær de relaterede muskler i forpoten. Ifølge vores erfaring er den korrekte placering af de transkutane elektroder (figur 1A) imidlertid endnu mere kompleks og variabel hos gnavere end overfladeelektrodeplacering hos mennesker. Dette kan føre til forskelle i længde, frekvens og stimuleringsintensitet, der er nødvendig for at fremkalde H-refleksen. Disse metodiske udfordringer kan forklare, hvorfor der kun er et meget begrænset antal H-refleksmålestudier (f.eks. i eksperimentelle slagmodeller ^3,4 og andre spasticitetsmodeller⁶. En præcis (langvarig) stimulering og registrering af H-refleksen på individuelle nerver kunne i princippet opnås ved hjælp af implanterbare elektroder omkring målnerven ^7,8. På grund af den udfordrende operation med potentielle bivirkninger for dyret og potentiel ustabilitet af sonden er denne tilgang ikke blevet en standard på området. Den metode, der præsenteres her, kræver også en vis kirurgisk ekspertise. Det tillader imidlertid en ny, præcis stimulering og registrering af isolerede nerver in vivo ved hjælp af lave stimuleringsintensiteter, hvilket undgår samtidig stimulering af nabonerver.

Protocol

Alle forsøg blev udført i overensstemmelse med europæiske og nationale dyreplejelove og institutionelle retningslinjer og blev godkendt af Landesamt für Natur-, Umwelt- und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen (Az: 81-02.04.2019.A309). Protokollen er optimeret til voksne mus (ca. 8-16 uger gamle C57Bl/6J-mus) og optagelse af forbenene. Det kan let tilpasses ved at stimulere de respektive nerver i bagbenet og registrere bagpotemuskler (figur 1B). En beskrivelse af optagelses- og stimuleringselektroderne tilføjes i materialetabellen. Bemærk, at protokollen kun bruges til terminalmåling.

1. Forberedelse

1. Dyret vejes og anæstesi startes ved at injicere via i.p. en blanding af ketamin (100 mg/kg) og xylazin (10 mg/kg).
2. Hold musen i opvarmningsboksen, indtil kirurgisk tolerance er nået. Vent et par minutter, indtil musen er rolig, vejrtrækningen er stabil, og reflekser er fraværende. Kontroller dybden af anæstesi ved at måle manglen på respons på tåklemmen.
3. Drej musen på ryggen og læg den på en varmepude (optimal ville være feedback-styret opvarmning ved hjælp af en rektal temperatursonde). Fastgør forpoterne med tape. Her skal du sikre dig, at båndet er placeret på en sådan måde, at måleelektroderne let indsættes i forpoterne.
4. Indsæt en rektal sonde for at måle dyrets temperatur og fastgør den med tape. Påfør øjensalve for at forhindre, at øjnene tørrer ud.

2. Kirurgi

BEMÆRK: Det bedøvede dyrs stabile tilstand, dvs. åndedræt, temperatur og tab af reflekser, bør overvåges regelmæssigt under hele proceduren. Den direkte nerve H-bølge måleprocedure er vist for den radiale/ulnar/median nerve i forpoten (figur 3A). Målingen kan også tilpasses bagpoten (iskias/tibialnerven) med modifikationer.

1. For et bedre overblik over det kirurgiske område skal du fjerne håret med en elektrisk barbermaskine eller en saks på et separat sted på forhånd. For mere erfarne kirurger er dette kun valgfrit.
   BEMÆRK: Desinfektion er ikke nødvendig her, da dette er et sluteksperiment. Dyret vil blive aflivet senere.
2. Løft huden med en pincet og lav et snit på ca. 1 cm i huden langs forpotens ventro-posterior akse (område over armhulen og brystkassen) med en fin afrundet saks.
3. Fjern forsigtigt bindevævet og udsæt musklen og nerven nedenunder. Fjern den blottede pectoralis profundus muskel ved hjælp af tang for at få adgang til mediannerven (figur 3E, F). Fjern små mængder blod og vævsvæske med blødt væv.
4. I det næste trin skal du forsigtigt skære brystet eller aksillær muskel fra toppen til bunden for at udsætte nervebundtet nedenunder. Frigør nervebundtet fra bindevæv og muskelvæv over en længde på ca. 1,5 cm.
   BEMÆRK: Her skal man være særlig forsigtig med ikke at beskadige blodkarrene, der løber parallelt med mediannerven. Når du skærer vævet, skal du altid skære langs nerven for at undgå at skade det. Hvis dette sker, skal du fjerne lækkende væske og blod med en vatpind. Astereomikroskop er ikke nødvendigt for hele eksperimentet, men det kan være nyttigt til fremstilling af nerverne.
5. Forpotens ulnar og mediannerve adskilles omhyggeligt ved hjælp af en bøjet glaspipette (figur 3E). Den øverste af de to nerver er ulnarnerven, og den nederste er mediannerven.
   BEMÆRK: Når du adskiller nerverne fra hinanden, skal du sørge for, at blodkarret nedenunder ikke er skadet.

3. Placering af elektrode

1. Anbring stimuleringskrogelektroderne parallelt i en afstand på 0,5-1,0 mm, og brug en mikromanipulator til at placere dobbeltkrogen tæt på nerven.
2. Brug glaskrogen som et værktøj til at løfte ulnarnerven på stimuleringskrogelektroderne. Træk elektroden tilbage med nerven og adskil den fra andre nerver med ca. 1-2 mm ved hjælp af mikromanipulatoren (figur 3D, F).
3. Placer elektroderne langs potens lange akse for at reducere krydstalen mellem musklerne.
   BEMÆRK: Placeringen af elektroderne er meget vigtig, men vanskelig at standardisere på grund af den enkelte anatomi. Det kræver en erfaren kirurg at placere elektroderne korrekt. Ledningerne kan også flyttes, hvis signalamplituden er utilfredsstillende.
4. Overfladisk tør elektrodekrogene, der er fastgjort til nerven, og påfør vaselin ved hjælp af en sprøjte for at give elektrisk isolering fra det tilstødende væv.
   BEMÆRK: Der skal udvises omhu for at påføre nok vaselin på elektroden og også mellem de to kroge for at sikre elektrisk isolering og forhindre nerverne i at tørre ud.

4. Placering af registrerings- og referenceelektroderne

1. For at måle H-refleksen skal du placere EMG-elektroderne intramuskulært i forpoten. Desuden placeres referenceelektroden subkutant i bagbenet (f.eks. ved hjælp af en minutstift), der holdes af en miniature alligatorklemme (figur 3B).
2. Når stimulatoren er tændt, skal du observere en vellykket stimulering som små træk i forpoten. Den mindste stimuleringsstrøm for at fremkalde M-bølgen og små synlige træk i forpoten skal ligge i området 10-50 μA.
   BEMÆRK: Hvis der ikke er synlige trækninger ved 50 μA, skal du justere stimuleringselektroderne og påføre vaselin igen. Også hos mus er det ikke ualmindeligt, at M-bølgen forekommer ved lavere stimuleringsintensiteter end H-bølge⁵.

5. Måling

1. Gentag stimuleringen af nerven 15 gange med 0,2 ms lange impulser hver. Med pauser på 2 min mellem sæt stimuli øges frekvensen fra 0,1, 0,5, 1,0, 2,0 til 5 Hz.
   BEMÆRK: Disse frekvenser er nødvendige, hvis RDD beregnes bagefter. Alle EMG-data registreres, digitaliseres og analyseres ved hjælp af software, f.eks. Spike2-software (CED, version 7.19). Den største H-bølgeamplitude forventes ved 0,1 Hz. Jo højere frekvensen er, desto mindre bliver H-bølgens amplitude på grund af RDD.
2. Efter forsøget skal du ofre dyret i henhold til instituttets IACUC-protokol. I dette eksperiment blev musetranskardial perfusion udført ved hjælp af PBS og 4% PFA under dyb anæstesi.

Representative Results

Fra n = 15 stimuleringsforsøg pr. stimuleringsfrekvens og pote vælges mindst n = 10 vellykkede optagelser til analysen. Forsøg med målefejl (f.eks. manglende M-bølge) er udelukket fra analysen. Analysér hvert forsøg separat, og generer et gennemsnit for gruppe-/tidssammenligninger senere. Latenstiden mellem stimulering og udseende af M-bølgen og H-bølgen registreres for hvert forsøg. Det er vores erfaring, at M-bølgen opstår ca. 2 ms efter stimulation, og H-bølgen efter 6-8 ms, på grund af den længere transittid gennem rygmarven (figur 1A og figur 2B). Mål amplituden af M- og H-bølgerne som peak-to-peak.

For at evaluere de fysiologiske ændringer, der opstår i rygmarvsskade eller slagtilfælde, er forholdet mellem H- og M-bølgeamplituden (H / M-forholdet, figur 2) mindre tilbøjelig til eksperimentel variabilitet, hvilket for eksempel afspejles i amplitudeforskelle. Forholdet giver således en mere pålidelig evaluering af sygdomsrelaterede elektrofysiologiske ændringer. For eksempel øges H-bølgen hos mus med et slagtilfælde i den primære og sekundære motoriske cortex, mens M-bølgen forbliver uændret (figur 2), hvilket tyder på en øget excitabilitet på αMN. Desuden er der en reduceret RDD (dvs. et reduceret fald i undertrykkelsen af H-bølgen med stigende stimuleringsfrekvens). Den nedsatte RDD er resultatet af reduceret rygmarvshæmning⁴. Således kan RDD validere aktiveringen af spinalhæmmende kredsløb, hvis afbrydelse kan resultere i spasticitet. For at beregne RDD af H-refleksen anbefales metoden beskrevet af Lee et al.⁴. Kort fortalt er H-refleksstimuleringen ved 0,1 Hz gennemsnitlig og indstillet til 100%. H-refleksen opnået for de øvrige stimuleringsfrekvenser udtrykkes som relative værdier til 0,1 Hz. Fra hvert stimuleringstog kasseres de første tre stimuleringer.

Figur 1: Illustration af optagelsesopstilling og veje til måling af Hoffman-refleks (H-refleks) og muskelrespons (M-bølge). (A) H-refleksen induceres ved stimulering af Ia-afferenter, som aktiverer tilsvarende alfa-motoneuroner i rygmarven og efterfølgende fremkalder muskelsammentrækninger i de innerverede forpotemuskler. (B) Placeringen af de elektrisk stimulerede radiale/ulnar/mediane nerver i forpoten og iskias/tibiale nerver i bagpoten. Oprettet med BioRender.com. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2: Skematiske og repræsentative elektriske registreringsresultater. (A) Skematisk oversigt over en optagelse. Stimulus og respektive stimuleringsartefakt er indstillet til 0 ms, hvilket efterfølges af det direkte muskulære respons (M-bølge) og den efterfølgende mindre top, der repræsenterer H-bølgen. I spasticitet modeller vil H-refleksen være større sammenlignet med den sunde kontrol. (B) Skærmbilleder fra en repræsentativ optagelse med softwaren, der viser originale data med en stimulusartefakt (nedre spor) og udseendet af M-bølgen alene vs. et eksempel, hvor både M- og H-bølgerne er synlige i optagelsen (henholdsvis øverste spor, midterste og højre panel). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3: Placering af elektroderne til terminal elektrofysiologisk måling. (A,B) Oversigt over den terminale H-refleksmåling med krogstimuleringselektroderne, registreringselektroderne i forpoten og referenceelektroden indsat i bagbenet. (C,D) I bagbenet, efter fjernelse af hud og muskler, bliver iskiasnerven synlig og kan opdeles i iskias- og tibiale nerver. (E) I forbenet bliver de radiale, mediane og ulnar nerver synlige. (F) Ulnarnerven kan stimuleres med krogelektroden uden stimulering af nabonerverne. Oprettet med BioRender.com. Klik her for at se en større version af denne figur.

Discussion

I modsætning til tidligere beskrevne transkutane H-refleksmålinger i mus⁶, giver vi en mere direkte og nervespecifik måling. Denne nye tilgang kan anvendes på nerverne i for- og bagbenet (fx median-, ulnar- og radiale nerver og henholdsvis tibiale og iskiasnerver), hvilket gør denne metode tilpasningsdygtig som et diagnostisk værktøj til mange sygdomsmodeller (fx slagtilfælde, multipel sklerose, amyotrofisk lateral sklerose, traumatisk hjerneskade og rygmarvsskade). Afhængigt af den valgte nerve anbefales validering af H-bølgens amplitude som funktion af stimuleringsintensiteten. Amplituden kan variere på grund af nervediameteren og motoneurons excitabilitet såvel som elektrisk kontakt. Ved at måle H/M-forholdet og RDD kan eksperimentelle påvirkninger såsom nålens placering reduceres, hvilket signifikant øger pålideligheden af de opnåede værdier.

Hovedbegrænsningen i protokollen, der præsenteres her, er terminalapplikationen uden mulighed for langsgående målinger. Endvidere bør flere metodologiske detaljer overvejes. Konstant anæstesi med minimal muskelafslapning er afgørende for pålidelig måling og bør valideres for hver specifik model / applikation. I modsætning til isofluranbedøvelse, som forårsager en stærk undertrykkelse af muskelreflekser (dvs. H-refleksen 9,10,11^, giver kombinationen af ketamin-xylazin en sikker anæstesi og anvendes i vid udstrækning til EMG-optagelser ¹². I tråd med målinger af motorfremkaldte potentialer i rotte 13 er det vores erfaring, at 100 mg/kg ketamin og¹⁰ mg/kg xylazin giver den bedste protokol for stabile og pålidelige registreringer. For en dygtig eksperimentator er det muligt at udføre for- og bagpotemålinger i et afsluttende eksperiment. Proceduren som beskrevet her for forpoten, herunder dyreforberedelse og måling af alle frekvenser for hastighedsafhængig depression, kan udføres på ca. 30-40 min. Det anbefales kraftigt at øve nervedissektionsteknikken, før du udfører in vivo-eksperimenter. I ensidige sygdomsmodeller (f.eks. Kortikalt slagtilfælde) anbefaler vi at gentage stimuleringen 15 gange på begge kontralaterale poter for at inkludere den ikke-påvirkede pote som en intern kontrol. Da kun én nerve skal stimuleres i den her viste metode, skal man være særlig omhyggelig med at fordele tilstrækkelig vaselin omkring stimuleringselektroderne, så der ikke sker stimulering af nabonerverne.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absorbent underpad	VWR	115-0684
AD converter	Cambridge Electronic Design, UK	CED 1401micro
Amplifier	Workshop Zoological Institute, UoC	-
Digital stimulator	Workshop Zoological Institute, UoC	MS 501
EMG electrodes	Workshop Zoological Institute, UoC		Two twisted, insulated copper wires (50 µm outer diameter) were soldered to a male plug and connected to a differential amplifier.
Eye ointment	Bayer	Bepanthen
Glass pipette	Workshop Zoological Institute, UoC	-	Prepare a glass pipette bent into a simple glass hook in the flame of a Bunsen burner.
Heating box	MediHeat	MediHeat V1200
Heating pad	WPI	61840 Heating pad
Hook electrodes	Workshop Zoological Institute, UoC	-	To produce the electrodes, bend stainless steel miniature pins into hooks at one end and insert into blunt cannulas to create direct mechanical contact. Solder the end of the cannula to copper wires (length approx. 50 cm), which are connected to either stimulation or recording device.
Ketamine	Pfizer	Ketavet
Rectal probe	WPI	RET-3
Stimulator isolation unit	Workshop Zoological Institute, UoC	MI 401
Sterilizer	CellPoint Scientific	Germinator 500	Routine pre- and post-operative disinfection of the surgical equipment should be done by heat sterilization. Decontaminate instruments for 15 s in the heated glass bead bath (260°C).
Temperature controller	WPI	ATC200
Vaseline	Bayer	-
Xylazine	Bayer	Rompun