Summary
ホフマン反射(H反射)に基づく痙縮の臨床的評価と末梢神経の電気刺激の使用は確立された方法です。ここでは、マウス前足のH反射定量化のための終末神経刺激と直接神経刺激のプロトコルを提供します。
Abstract
ホフマン反射(H反射)は、伸張反射の電気的類似物として、脊髄損傷や脳卒中などの損傷後の神経回路の完全性の電気生理学的検証を可能にします。H反射反応の増加は、非随意筋収縮、病理学的に増強された伸張反射、対応する筋肉の筋緊張亢進などの症状とともに、脳卒中後痙縮(PSS)の指標です。
やや神経非特異的な経皮的測定とは対照的に、ここでは、前足の尺骨神経と正中神経でのH反射を直接定量化するプロトコルを提示します。直接刺激とさまざまな神経への適応に基づいて、この方法は、痙縮関連疾患モデルの電気生理学的変化を検証するための信頼性が高く用途の広いツールです。
Introduction
生理学者ポール・ホフマンにちなんで名付けられたホフマン反射(H反射)は、同じ筋肉から生じて導く感覚ニューロンと運動ニューロンの軸索を運ぶ末梢神経の電気刺激によって誘発することができます。これは、モノシナプス伸張反射の電気的に誘発された類似体であり、同じ経路1を共有しています。筋肉のストレッチとは異なり、H反射は電気刺激から生じます。末梢神経が低電流強度で電気的に刺激される場合、Ia求心性線維は、その大きな軸索直径2のために典型的に最初に脱分極される。それらの活動電位は、脊髄のアルファ運動ニューロン(αMN)を興奮させ、それが次にαMN軸索を下って筋肉に向かって移動する活動電位を誘発します(図1)。このカスケードは、いわゆるH波に反映される小さな振幅の筋肉反応を生成します。刺激強度を徐々に増加させることにより、追加の運動単位の動員によりH波の振幅が増加する。ある刺激強度から、αMNの細い軸索の活動電位が直接誘発され、M波として記録されます。このM波は、H波よりも短いレイテンシで現れます(図2)。刺激強度をさらに高めると、より多くのαMN軸索の動員によりM波の振幅が大きくなるのに対し、H波は徐々に小さくなる。H波は、αMN軸索の活動電位のアンチドロミックバックプロパゲーションにより、高い刺激強度で抑制することができます。これらのトリガーされた活動電位は、Ia刺激からの電位と衝突し、したがって互いに打ち消し合う可能性があります。最大刺激強度を超えると、オルソドロミック(筋肉に向かって)およびアンチドロミック(脊髄に向かって)活動電位がすべてのMN軸索に発生します。前者は最大M波振幅(Mmax)を生じさせ、後者はH反射3を完全に廃止する。
脳卒中後の痙縮(PSS)または脊髄損傷(SCI)の評価には、ヒトの運動および痙縮の神経基盤を評価するためにH反射が使用されてきました1。測定間および被験者間のH反射の変化の定量化の改善は、H波とM波の比率(H / M比)を使用することによって達成されます。あるいは、速度依存性うつ病(RDD)は、上昇周波数のセット(例えば、0.1、0.5、1.0、2.0、および5.0Hz)を使用して測定される。RDDは、脳卒中またはSCIによって乱される可能性のある抑制性回路の完全性を反映しています。すべての神経回路が無傷の場合、H反射の均一で周波数に依存しない抑制があります。しかし、脳卒中またはSCIの結果として神経抑制が低下する場合、H反射の抑制は刺激頻度の増加とともに減少する4。
表面電極を使用した正しい電気生理学的記録は困難な場合があり、運動課題、抑制メカニズム、およびαMN興奮性の影響を受ける可能性があります5。げっ歯類の経皮的記録では、刺激電極が脛骨神経の近くに配置され、記録電極が前足の関連する筋肉の近くに配置されます。しかし、私たちの経験によれば、経皮電極の正しい配置(図1A)は、げっ歯類ではヒトの表面電極の配置よりもさらに複雑で可変です。これは、H反射を引き出すために必要な長さ、周波数、および刺激強度の違いにつながる可能性があります。これらの方法論的課題は、H反射測定研究の数が非常に限られている理由を説明することができます(たとえば、実験的脳卒中モデル3,4、およびその他の痙縮モデル6。個々の神経に対するH反射の正確な(長期の)刺激および記録は、原則として、標的神経を囲む埋め込み型電極を用いて達成することができる7,8。動物に潜在的な副作用とプローブの潜在的な不安定性を伴う困難な手術のために、このアプローチは現場では標準にはなりませんでした。ここで紹介する方法には、ある程度の外科的専門知識も必要です。しかし、それは、隣接する神経の同時刺激を回避する低刺激強度を使用して、in vivoで孤立した神経の新規で正確な刺激と記録を可能にします。
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Protocol
すべての実験は、ヨーロッパおよび国内の動物飼育法および施設のガイドラインに準拠して実施され、ノルトラインヴェストファーレン州自然管理局(Az:81-02.04.2019.A309)によって承認されました。このプロトコルは、成体マウス(約8〜16週齢のC57Bl / 6Jマウス)および前肢の記録に最適化されています。後肢のそれぞれの神経を刺激し、後肢の筋肉を記録することで簡単に適応できます(図1B)。記録および刺激電極の説明は、 材料の表に追加されています。このプロトコルは端末測定にのみ使用されることに注意してください。
1. 事前準備
- 動物の体重を量り、ケタミン(100 mg / kg)とキシラジン(10 mg / kg)の混合物をi.p. 経由で 注射して麻酔を開始します。
- 外科的耐性に達するまで、マウスを加温ボックスに入れたままにします。マウスが落ち着いて呼吸が安定し、反射神経がなくなるまで数分待ちます。つま先のつまみに対する反応の欠如を測定することにより、麻酔の深さを確認します。
- マウスの背中を回し、加熱パッドの上に置きます(直腸温度プローブを使用したフィードバック制御加熱が最適です)。前足をテープで固定します。ここでは、測定電極が前足に簡単に挿入されるようにテープが配置されていることを確認してください。
- 直腸プローブを挿入して動物の体温を測定し、テープで固定します。目の乾燥を防ぐために目の軟膏を塗ります。
2.手術
注:麻酔をかけた動物の安定した状態、すなわち呼吸、体温、反射神経の喪失は、手順全体を通して定期的に監視する必要があります。前足の橈骨/尺骨/正中神経の直接神経H波測定手順が示されています(図3A)。測定は、修正を加えて後足(坐骨神経/脛骨神経)に適合させることもできます。
- 手術部位の全体像を把握するには、事前に別の場所にある電気かみそりまたはハサミで毛を取り除きます。より経験豊富な外科医にとって、これはオプションにすぎません。
注:これは最終実験であるため、ここでは消毒は必要ありません。動物は後で安楽死させます。 - ピンセットで皮膚を持ち上げ、前足の腹後軸(脇の下と胸部の上の領域)に沿って皮膚を細かい丸いハサミで約1 cm切開します。
- 結合組織を慎重に取り除き、その下の筋肉と神経を露出させます。露出した前胸筋を鉗子を用いて除去し、正中神経にアクセスする(図3E、F)。軟部組織で少量の血液や組織液を取り除きます。
- 次のステップでは、乳房または腋窩の筋肉を上から下に慎重に切断して、下の神経束を露出させます。約1.5 cmの長さにわたって結合組織および筋肉組織から神経束を解放します。
注:ここでは、正中神経と平行に走る血管を傷つけないように特に注意する必要があります。組織を切断するときは、神経を傷つけないように常に神経に沿って切断してください。このような場合は、漏れている液体と血液を綿棒で取り除きます。アステレオ顕微鏡は実験全体には必要ありませんが、神経の準備には役立ちます。 - 曲がったガラスピペットを使用して、前足の尺骨神経と正中神経を注意深く分離します(図3E)。2つの神経の上部は尺骨神経であり、下部は正中神経です。
注意: 神経を互いに分離するときは、下の血管が損傷していないことを確認してください。
3. 電極配置
- 刺激フック電極を0.5〜1.0mmの距離で平行に配置し、マイクロマニピュレーターを使用してダブルフックを神経のすぐ近くに配置します。
- ガラスフックをツールとして使用して、尺骨神経を刺激フック電極に持ち上げます。神経で電極を引き戻し、マイクロマニピュレーターを使用して他の神経から約1〜2 mm分離します(図3D、F)。
- 筋肉間のクロストークを減らすために、足の長軸に沿って電極を配置します。
注:電極の配置は非常に重要ですが、個々の解剖学的構造のために標準化することは困難です。電極を正しく配置するには、経験豊富な外科医が必要です。信号の振幅が不十分な場合は、ワイヤを再配置することもできます。 - 神経に取り付けられた電極フックを表面的に乾燥させ、シリンジを使用してワセリンを塗布して、隣接する組織から電気的に絶縁します。
注意: 電気絶縁を確保し、神経が乾燥するのを防ぐために、電極と2つのフックの間に十分なワセリンを塗布するように注意する必要があります。
4. 記録電極と参照電極の配置
- H反射を測定するには、EMG電極を前足の筋肉内に配置します。加えて、参照電極を後肢の皮下に配置し(例えば、微小ピンを用いて)、小型のワニ口クリップによって保持する(図3B)。
- 刺激装置がオンになったら、前足の小さなけいれんとして成功した刺激を観察します。前足のM波と小さな目に見えるけいれんを引き出すための最小刺激電流は、10〜50μAの範囲である必要があります。
注意: 50μAでけいれんが見られない場合は、刺激電極を調整し、ワセリンを再塗布します。また、マウスでは、M波がH波よりも低い刺激強度で現れることも珍しくありません5。
5. 測定
- 神経の刺激をそれぞれ0.2 msの長さのパルスで15回繰り返します。刺激のセット間で2分の休止で、周波数は0.1、0.5、1.0、2.0、および5Hzに増加します。
注:これらの周波数は、後でRDDを計算する場合に必要です。すべてのEMGデータは、Spike2ソフトウェア(CED、バージョン7.19)などのソフトウェアを使用して記録、デジタル化、および分析されます。最大のH波振幅は0.1Hzで予想されます。周波数が高いほど、RDDによるH波の振幅は小さくなります。 - 実験後、研究所のIACUCプロトコルに従って動物を犠牲にします。この実験では、マウス経心灌流を、深部麻酔下でPBSおよび4%PFAを用いて行った。
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Representative Results
刺激頻度および足当たりのn=15回の刺激試行から、分析のために少なくともn=10個の成功した記録を選択する。測定誤差(M波の欠落など)のある試験は解析から除外されます。各試行を個別に分析し、後でグループ/時間比較の平均を生成します。刺激とM波およびH波の出現との間の潜時は、各試験について記録される。私たちの経験では、M波は刺激の約2ミリ秒後に発生し、H波は脊髄を通過する時間が長いため、6〜8ミリ秒後に発生します(図1A および 図2B)。M波とH波の振幅をピークtoピークとして測定します。
脊髄損傷または脳卒中で発生する生理学的変化を評価するために、H波とM波の振幅の比(H/M比、 図2)は実験的変動を起こしにくく、これは例えば振幅差に反映されるであろう。したがって、この比率は、疾患関連の電気生理学的変化のより信頼性の高い評価を提供します。例えば、一次運動皮質と二次運動皮質に脳卒中を起こしたマウスでは、H波は増加しているのに対し、M波は変化せず(図2)、αMNの興奮性の増加が示唆されています。さらに、RDDの減少(すなわち、刺激周波数の増加に伴うH波の抑制の減少の減少)がある。RDDの減少は、脊髄抑制の減少の結果です4。したがって、RDDは、その中断が痙縮を引き起こす可能性のある脊椎抑制回路の活性化を検証することができます。H反射のRDDを計算するには、Leeらによって記述された方法が推奨される4。簡単に言うと、0.1 HzでのH反射刺激を平均化し、100%に設定します。他の刺激周波数について得られたH反射は、0.1Hzに対する相対値として表されます。各刺激トレインから、最初の3つの刺激が破棄されます。
図1:ホフマン反射(H反射)と筋肉反応(M波)を測定するための記録セットアップと経路の図。 (A)H反射は、脊髄の対応するアルファ運動ニューロンを活性化し、続いて神経支配された前足の筋肉の収縮を誘発するIa求心性神経の刺激によって誘発されます。(B)前足の電気的に刺激された橈骨/尺骨/正中神経と後足の坐骨神経/脛骨神経の位置。BioRender.com で作成。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:概略図と代表的な電気記録結果。 (A)録音の概略図。刺激とそれぞれの刺激アーチファクトは0ミリ秒に設定され、その後に直接筋肉反応(M波)とそれに続くH波を表す小さなピークが続きます。痙縮モデルでは、H反射は健康なコントロールと比較して大きくなります。(B)刺激アーチファクトのある元のデータ(下のトレース)とM波のみの外観を示すソフトウェアを使用した代表的な記録のスクリーンショットと、記録にM波とH波の両方が見える例(それぞれ上のトレース、中央のパネル、右のパネル)。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:端子電気生理学的測定のための電極の位置決め。 (A,B)フック刺激電極、前足内の記録電極、および後肢に挿入された参照電極を使用した端子H反射測定の概要。(C,D)後肢では、皮膚と筋肉の除去後、坐骨神経が見えるようになり、坐骨神経と脛骨神経に分けることができます。(E)前肢では、橈骨神経、正中神経、尺骨神経が見えるようになります。(F)尺骨神経は、隣接する神経を刺激することなく、フック電極で刺激することができます。BioRender.com で作成。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
マウス6における前述の経皮的H反射測定とは対照的に、発明者らは、より直接的かつ神経特異的な測定を提供する。この新しいアプローチは、前肢と後肢の神経(それぞれ正中神経、尺骨神経、橈骨神経、脛骨神経、坐骨神経など)に適用でき、多くの疾患モデル(脳卒中、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、外傷性脳損傷、脊髄損傷など)の診断ツールとして適応できます。選択した神経に応じて、刺激強度の関数としてのH波の振幅の検証が推奨されます。振幅は、神経径および運動ニューロンの興奮性、ならびに電気的接触によって変化し得る。H/M比とRDDを測定することにより、針の位置などの実験的影響を低減することができ、得られた値の信頼性が大幅に向上します。
ここで紹介するプロトコルの主な制限は、縦断測定の可能性のない端末アプリケーションです。さらに、いくつかの方法論の詳細を考慮する必要があります。最小限の筋弛緩を伴う一定の麻酔は、信頼性の高い測定に不可欠であり、特定のモデル/アプリケーションごとに検証する必要があります。筋反射の強力な抑制を引き起こすイソフルラン麻酔とは対照的に(すなわち、H反射9,10,11、ケタミン-キシラジンの組み合わせは安全な麻酔を提供し、EMG記録に広く使用されています12。ラット13の運動誘発電位の測定に沿って、私たちの経験では、100 mg / kgのケタミンと10 mg / kgのキシラジンが安定した信頼性の高い記録に最適なプロトコルを提供します。熟練した実験者の場合、1回の最終実験で前足と後足の測定を行うことができます。前足についてここで記載されるような手順は、動物調製、および速度依存性うつ病のための全ての頻度の測定を含めて、約30〜40分で行うことができる。in vivo実験を行う前に、神経解剖技術を練習することを強くお勧めします。片側性疾患モデル(皮質脳卒中など)では、罹患していない足を内部コントロールとして含めるために、反対側の両足で刺激を15回繰り返すことをお勧めします。ここに示す方法では、1つの神経のみを刺激するため、隣接する神経の刺激が起こらないように、刺激電極の周りに十分なワセリンを分配するように特別な注意を払う必要があります。
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Disclosures
著者は、競合する金銭的利益を宣言していません。
Acknowledgments
著者らは、ダルハウジー大学のT.アカイがMGの研究室を訪問した際の支援に感謝の意を表します。この研究は、Friebe Foundation (T0498/28960/16) および Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) - Project-ID 431549029 - SFB 1451 からの資金提供によって支援された。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Absorbent underpad | VWR | 115-0684 | |
| AD converter | Cambridge Electronic Design, UK | CED 1401micro | |
| Amplifier | Workshop Zoological Institute, UoC | - | |
| Digital stimulator | Workshop Zoological Institute, UoC | MS 501 | |
| EMG electrodes | Workshop Zoological Institute, UoC | Two twisted, insulated copper wires (50 µm outer diameter) were soldered to a male plug and connected to a differential amplifier. | |
| Eye ointment | Bayer | Bepanthen | |
| Glass pipette | Workshop Zoological Institute, UoC | - | Prepare a glass pipette bent into a simple glass hook in the flame of a Bunsen burner. |
| Heating box | MediHeat | MediHeat V1200 | |
| Heating pad | WPI | 61840 Heating pad | |
| Hook electrodes | Workshop Zoological Institute, UoC | - | To produce the electrodes, bend stainless steel miniature pins into hooks at one end and insert into blunt cannulas to create direct mechanical contact. Solder the end of the cannula to copper wires (length approx. 50 cm), which are connected to either stimulation or recording device. |
| Ketamine | Pfizer | Ketavet | |
| Rectal probe | WPI | RET-3 | |
| Stimulator isolation unit | Workshop Zoological Institute, UoC | MI 401 | |
| Sterilizer | CellPoint Scientific | Germinator 500 | Routine pre- and post-operative disinfection of the surgical equipment should be done by heat sterilization. Decontaminate instruments for 15 s in the heated glass bead bath (260°C). |
| Temperature controller | WPI | ATC200 | |
| Vaseline | Bayer | - | |
| Xylazine | Bayer | Rompun |
References
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