Summary
Aquí, proponemos un protocolo sistematizado, accesible y reproducible para detectar especies reactivas celulares de oxígeno (ROS) utilizando una sonda de dicacetato de 2′,7′-diclorofluoresceína (DCFH-DA) en células gliales de Müller (MGC). Este método cuantifica los niveles totales de ROS celulares con un citómetro de flujo. Este protocolo es muy fácil de usar, adecuado y reproducible.
Abstract
El equilibrio redox tiene un papel importante en el mantenimiento de la homeostasis celular. El aumento de la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS) promueve la modificación de proteínas, lípidos y ADN, lo que finalmente puede conducir a la alteración de la función celular y la muerte celular. Por lo tanto, es beneficioso para las células aumentar su defensa antioxidante en respuesta a insultos perjudiciales, ya sea activando una vía antioxidante como Keap1 / Nrf2 o mejorando los eliminadores redox (vitaminas A, C y E, β caroteno y polifenoles, entre otros). La inflamación y el estrés oxidativo están involucrados en la patogénesis y progresión de las retinopatías, como la retinopatía diabética (RD) y la retinopatía del prematuro (ROP). Dado que las células gliales de Müller (MGC) desempeñan un papel clave en la homeostasis del tejido retiniano neural, se consideran un modelo ideal para estudiar estos mecanismos de protección celular. En este sentido, cuantificar los niveles de ROS con un método reproducible y sencillo es fundamental para valorar el aporte de vías o moléculas que participan en el mecanismo de defensa celular antioxidante. En este artículo, proporcionamos una descripción completa de los procedimientos necesarios para la medición de ROS con sonda DCFH-DA y citometría de flujo en MGC. Aquí se proporcionan pasos clave para el procesamiento de datos de citometría de flujo con el software, por lo que los lectores podrán medir los niveles de ROS (medios geométricos de FITC) y analizar histogramas de fluorescencia. Estas herramientas son muy útiles para evaluar no solo el aumento de ROS después de un insulto celular, sino también para estudiar el efecto antioxidante de ciertas moléculas que pueden proporcionar un efecto protector sobre las células.
Introduction
La retina neural es un tejido muy organizado que presenta capas neuronales bien definidas. En estas, las neuronas (células ganglionares, amacrinas, bipolares, horizontales y fotorreceptoras) están interconectadas entre sí y también con células gliales de Müller (MGC) y astrocitos, lo que lleva a una adecuada fototransducción y procesamiento de la información visual 1,2. Se sabe que los MGC tienen un papel importante en el mantenimiento de la homeostasis retiniana porque atraviesan toda la sección retiniana y, por lo tanto, pueden interactuar con todos los tipos de células que modulan múltiples procesos protectores. Se ha reportado que los MGC tienen varias funciones importantes para el mantenimiento y la supervivencia de las neuronas retinianas, incluyendo la glucólisis para proporcionar energía a las neuronas, la eliminación de desechos neuronales, el reciclaje de neurotransmisores y la liberación de factores neurotróficos, entre otros 3,4,5.
Por otro lado, la inflamación, el estrés oxidativo y nitrosativo están implicados en la patogénesis y progresión de muchas enfermedades humanas, incluidas las retinopatías 6,7,8,9,10,11. El equilibrio redox en las células depende de una regulación estricta de los niveles de ROS. Las ROS se generan constantemente en condiciones fisiológicas como resultado de la respiración aeróbica principalmente. Los principales miembros de la familia ROS incluyen radicales libres reactivos como el anión superóxido (O2͘͘͘͘•−), radicales hidroxilo (•OH), varios peróxidos (ROOR′), hidroperóxidos (ROOH) y el peróxido de hidrógeno sin radicales (H2O2)12,13. En los últimos años, se ha hecho evidente que las ROS desempeñan un importante papel de señalización en las células mediante el control de procesos esenciales. Los MGC tienen una fuerte defensa antioxidante por la activación del factor nuclear transcripcional eritroide-2 relacionado con el factor 2 (Nrf2) y la posterior expresión de proteínas antioxidantes para eliminar la producción excesiva de ROS en condiciones patológicas 14,15,16. Cuando las células pierden su equilibrio redox debido a una producción exagerada de ROS o una capacidad defectuosa para eliminar ROS, la acumulación de estrés oxidativo promueve modificaciones dañinas en proteínas, lípidos y ADN, lo que lleva al estrés celular o la muerte. El aumento del sistema de defensa antioxidante de la retina mejora la resolución y prevención de retinopatías, como roP y RD 17,18,19,20,21,22,23,24. Por lo tanto, la medición de la producción de ROS en tiempo real es una herramienta poderosa y útil.
Existen varios métodos para medir la producción de ROS o el estrés oxidativo en las células. Entre estos, la sonda de 2′,7′-diclorofluoresceína diacetato (DCFH-DA) es una de las técnicas más utilizadas para cuantificar directamente el estado redox de una célula 25,26,27,28. Esta sonda es lipofílica y no fluorescente. La difusión de esta sonda a través de la membrana celular permite su escisión por esterasas intracelulares en los dos enlaces éster, produciendo un producto relativamente polar e impermeable a la membrana celular, 2′,7′-diclorofluoresceína (H2DCF). Esta molécula no fluorescente se acumula intracelularmente, y la posterior oxidación por ROS produce el producto altamente fluorescente DCF. La oxidación de la sonda es producto de la acción de múltiples tipos de ROS (peroxinitrito, radicales hidroxilo, óxido nítrico o peróxidos), que pueden detectarse mediante citometría de flujo o microscopía confocal (emisión a 530 nm y excitación a 485 nm). La limitación de esta técnica es que el superóxido y el peróxido de hidrógeno no reaccionan fuertemente con H2DCF25,29. En este artículo, utilizamos la sonda DCFH-DA para medir y cuantificar ROS por citometría de flujo. Por esa razón, inducimos la producción de ROS estimulando mgC con inductor de ROS, A o B, antes de cargar las células con la sonda fluorescente. Además, utilizamos un compuesto antioxidante. Finalmente, mostramos datos representativos y fiables obtenidos utilizando este protocolo.
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Protocol
NOTA: Para las composiciones de búfer, consulte la Tabla 1.
1. Preparación del cultivo celular
NOTA: Aquí se describe la preparación del cultivo de células MIO-M1, una línea celular glial humana de Müller inmortalizada espontáneamente (Moorfield's/Institute of Ophthalmology- Müller 1). Utilice siempre la técnica aséptica adecuada y trabaje en una campana de flujo laminar.
- Prepare el medio completo modificado eagle 's medium (DMEM) de Dulbecco. A DMEM que contiene 4,5 g/L de D-glucosa y 110 mg/L de piruvato de sodio, agregue 10% de FBS inactivado por calor, 10 mM de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinatenosulfónico (HEPES), 2 mM de L-glutamina y 50 U/mL de penicilina/estreptomicina. Prepare el medio fresco, el día en que se descongelarán las células MIO-M1.
- Descongele las células MIO-M1 congeladas el día 1.
- Para hacer esto, retire el criovial que contiene 5 x 105 células MIO-M1 en FBS con 10% dmSO del almacenamiento de nitrógeno líquido e inmediatamente colóquelo en un baño de agua de 37 ° C.
NOTA: Siempre use una máscara facial o gafas de seguridad, ya que los crioviales almacenados en nitrógeno líquido presentan un riesgo de explosión cuando se descongelan. - Descongele las células MIO-M1 rápidamente (en menos de 1 min) calentando el vial en el baño de agua a 37 °C hasta que quede solo un poco de hielo en el vial.
- Limpie el exterior del vial con etanol al 70% y transfiéralo a una campana de flujo laminar.
- Transfiera las células descongeladas del vial a un tubo estéril de 15 ml y luego agregue 6 ml de medio DMEM completo precalentado gota a gota.
- Centrifugar la suspensión celular a aproximadamente 600 x g durante 5 min. Después de la centrifugación, se visualizará un sobrenadante transparente y un pellet completo. Deseche el sobrenadante con una pipeta sin perturbar la bolita celular.
- Disociar suavemente el pellet y resuspendir las células en 10 ml de medio DMEM completo. Transfiera esta suspensión celular a una placa de cultivo de tejido de 100 mm de diámetro e incube la placa durante aproximadamente 2 días a 37 °C, 5% CO2.
- Para hacer esto, retire el criovial que contiene 5 x 105 células MIO-M1 en FBS con 10% dmSO del almacenamiento de nitrógeno líquido e inmediatamente colóquelo en un baño de agua de 37 ° C.
- Cuando las células MIO-M1 se vuelvan 80%-90% confluentes en el día 4, realice los siguientes pasos.
- Transfiera la placa a una campana de flujo laminar desde la incubadora. Retire con cuidado el sobrenadante y lave 2 veces con 5 ml de PBS estéril y precalentado. Aspirar el PBS.
- Dispensar 1 ml de solución de tripsina-EDTA al 0,5% e incubar a 37 °C en la incubadora de CO2 durante 3-5 min para separar las células.
- Agregue 7 ml del medio DMEM completo para inhibir la acción de la tripsina. Desagregar los MGC tripsinizados agrupados mediante el pipeteo lento hacia arriba y hacia abajo (P1000). Recoger la suspensión celular en un tubo de 15 ml.
- Centrifugadora a 600 x g durante 5 min. Deseche el sobrenadante. Resuspender suavemente el pellet celular en 2 ml de medios DMEM completos. Transfiera 1 ml de esta suspensión celular a una placa de 100 mm que contenga 9 ml de medio DMEM completo precalentado.
- Repite la acción con otra placa de 100 mm. Incubar la placa durante aproximadamente 1 día a 37 °C en una incubadora de CO2 al 5%.
- Cuando ambas placas se vuelvan confluentes al 80% -90% (en el día 6), transfiera la placa a una campana de flujo laminar. Siga el paso 1.3. para obtener un pellet celular.
- Disociar suavemente el pellet y resuspendir las células en 5 ml de medios DMEM completos. Cuente las células MIO-M1 utilizando un hemocitómetro (cámara de Neubauer) y una solución de azul tripano siguiendo los pasos a continuación.
- Coloque la cubierta de vidrio en el área central de la cámara Neubauer. Coloque la cámara sobre una superficie plana (por ejemplo, una mesa o banco de trabajo).
- Mezcle un volumen igual de tinción azul tripano con las células. Por ejemplo, mezcle 60 μL de azul de tripano con 60 μL de células para una dilución de 1:2.
- De esta mezcla, cargue 10 μL con una micropipeta en una cámara Neubauer.
- Coloque la cámara Neubauer cargada en el escenario del microscopio. Luego, encienda la luz y ajuste el brillo.
- Mueva la etapa del microscopio a una posición óptima y ajuste el enfoque hasta obtener una imagen nítida de las células.
- Cuente las celdas dentro de los cuatro cuadrados (subdivididos en 16) ubicados en la esquina del hemocitómetro (volumen: 0.1 mm3 cada uno).
- Calcule la concentración de células utilizando las ecuaciones a continuación.
Concentración = (Número de celdas x 10.000)/Número de cuadrados
Concentración = (Número de células x 10.000)/4
Concentración = Número de células x 2500
NOTA: Si se realiza la dilución celular, la concentración obtenida debe convertirse a la concentración original antes de la dilución.
Concentración = (Número de células x 2500 x 2) = (Número de células x 5000 células/ml) - Ajuste la suspensión celular a 1 x 105 celdas/ml en medio DMEM completo y placa 2 mL de esta suspensión celular en una placa de 6 pocillos (2 x 105 celdas/pocillo). Agite la placa suavemente para distribuir las células de manera homogénea. Incubar la placa de 6 pocillos durante la noche a 37 °C en una incubadora deCO 2 al 5%.
2. Condiciones y controles del ensayo
- Incluya los siguientes controles experimentales para cada experimento:
- Control de autofluorescencia (células sin sonda DCFH-DA, control para ajustar los parámetros del citómetro de flujo).
- Control basal (células no estimuladas).
- Control positivo (células tratadas con un inductor ros, A o B).
- Control negativo (células tratadas con compuesto antioxidante)
- Muestra (células tratadas con compuesto antioxidante e inductor de ROS, A o B).
3. Realización del ensayo
NOTA: El ensayo se realiza el día 7. Siempre use la técnica aséptica adecuada y trabaje en una campana de flujo laminar a menos que se indique lo contrario.
- Preparar DMEM sérico bajo. Suplemento DMEM que contiene 4,5 g/L de D-glucosa y 110 mg/L de piruvato de sodio con 0,5% de FBS inactivado por calor, 10 mM de HEPES, 2 mM de L-glutamina y 50 U/mL de penicilina/estreptomicina. Prepare el medio fresco el día en que se tratará el MIO-M1.
- Transfiera la placa de 6 pocillos (60%-70% de confluencia) a una campana de flujo laminar desde la incubadora. Aspire el sobrenadante y lave las células 1x con PBS. Agregue 2 ml del DMEM sérico bajo por pocillo e incube la placa de 6 pocillos durante 2 h a 37 ° C, 5% CO2. Esto se hace para matar de hambre a las células.
- Después de morir de hambre en suero, trate las células con el compuesto antioxidante durante 6 h.
- Aspirar el sobrenadante y añadir 2 mL de la cepa diluida a las siguientes condiciones: control negativo (células tratadas con compuesto antioxidante) y muestra (células tratadas con compuesto antioxidante e inductor de ROS, A o B).
- Incubar la placa de 6 pocillos durante 6 h a 37 °C, 5% CO2.
NOTA: Si usa otro compuesto antioxidante o inhibidor de ROS, estandarice el tiempo y la concentración óptimos para los estímulos.
- Después de 6 h de incubación, trate las células con inductor de ROS, A o B, durante 30 min.
- Añadir los estímulos a las siguientes condiciones: control positivo (células tratadas con un inductor de ROS, A o B) y pocillos de muestra (células tratadas con compuesto antioxidante e inductor de ROS, A o B).
NOTA: Mantenga las soluciones de stock en hielo. - Incubar la placa de 6 pocillos durante 30 min a 37 °C, 5% CO2.
NOTA: Si utiliza otro inductor de ROS, estandarice adecuadamente el tiempo y la concentración óptimos para los estímulos.
- Añadir los estímulos a las siguientes condiciones: control positivo (células tratadas con un inductor de ROS, A o B) y pocillos de muestra (células tratadas con compuesto antioxidante e inductor de ROS, A o B).
- Cargue las celdas con la sonda DCFH-DA.
- Aspire el sobrenadante y lave las células en la placa de 6 pocillos 3x con PBS para eliminar todos los estímulos.
- Apague la luz de la campana de flujo laminar y trabaje en la oscuridad. Preparar una dilución de 1:1000 de la solución madre de sonda DCFH-DA de 5 mM para obtener una concentración final de 5 μM DCFH-DA en DMEM sin rojo fenol en un tubo de 15 mL.
- Mezcle suavemente con un vórtice y agregue 1 ml de esta solución a los siguientes pocillos: control basal (células no estimuladas), control positivo (células tratadas con un inductor de ROS), control negativo (células tratadas con compuesto antioxidante) y pocillos de muestra (células tratadas con compuesto antioxidante e inductor de ROS, A o B).
- Añadir 1 ml de DMEM sin rojo fenol a las células de control de la autofluorescencia.
- Incubar la placa de 6 pocillos durante 30 min a 37 °C, 5% CO2.
NOTA: La sonda es sensible a la luz. Deseche toda la solución de sonda no utilizada.
4. Preparación celular para citometría de flujo
- Después de 6 h, mantenga la placa en hielo. A partir de este paso, no es necesario utilizar una técnica aséptica adecuada y trabajar en una campana de flujo laminar.
- Lave las células 3 veces con 2 ml de PBS frío por pozo. Agregue 0.5 ml de tampón de separación en frío a cada pozo. Cosecha las células canalizando suavemente hacia arriba y hacia abajo usando una pipeta P1000.
- Recójalos en tubos etiquetados de 1,5 ml y centrífuga a 600 x g durante 5 min a 4 °C.
NOTA: Al cosechar las células, evite la formación de burbujas ajustando la pipeta P1000 a 0,4 ml. A partir de este paso, trabaje rápido. - Cuando termine la centrifugación, coloque tubos etiquetados de 1,5 ml con las células en hielo. Deseche el sobrenadante con cuidado y disocie suavemente el gránulo celular con golpeteo.
- Agregue 1 ml de tampón FACS a cada tubo etiquetado de 1,5 ml para lavar las células. Si es necesario, use un vórtice en su intensidad más baja para la disociación completa del pellet celular. Centrifugarlos a 600 x g durante 5 min a 4 °C. Repita estos pasos 2 veces más. (Realizar tres lavados en total).
- Cuando termine el último lavado, etiquete 5 ml de tubos de poliestireno de fondo redondo (tubos de citometría de flujo) para todas las condiciones experimentales (consulte el paso 2).
- Cuando finalice la centrifugación, resuspender los gránulos celulares en 200 μL de tampón FACS. Disociar suavemente el pellet en cada tubo de 1,5 ml mediante el uso de un vórtice. Transfiera a tubos de fondo redondo de 5 ml etiquetados. Mantenga los tubos en hielo hasta que se analicen en el citómetro de flujo.
5. Adquisición de datos en un citómetro de flujo
- Usando el software de citometría de flujo, cree un nuevo experimento. Para ello, en la barra de menús, vaya a Experimento y haga clic en Nuevo experimento (Ctrl+E).
- Además, en la barra de menús, vaya a Ver y haga clic en las siguientes opciones: Barra de herramientas, Barra de estado, Navegador, Citómetro, Inspector, Hoja de cálculo, Panel de adquisición y Editor biexponencial para ver estas ventanas en el espacio de trabajo.
- A la izquierda del software, haga clic en el Specimen_001 . Esto abrirá una lista de tubos (Tube_001, Tube_002, etc.). Para etiquetar los tubos para los controles y las diferentes condiciones experimentales, haga doble clic en Tube_001, Tube_002, etc. y cámbiele el nombre (consulte el paso 2.).
- Seleccione los canales/parámetros a analizar (FSC, SSC, FITC y APC o cualquier otro fluorocromo para ver el cuadrante) en el primer tubo desde la configuración del citómetro del experimento.
- Haga clic en el icono Puntero de tubo actual para seleccionar el tubo y el icono cambiará a verde. Coloque el tubo de "control de autofluorescencia" en el brazo del aspirador, moviendo la base con cuidado solo hacia la izquierda.
- Para ejecutar el ejemplo "control de autofluorescencia", vaya a la ventana Panel de adquisición y haga clic en Adquirir datos. Abra un diagrama de puntos para FSC (en el eje x) versus SSC (en el eje y).
- Ajuste rápidamente el voltaje de dispersión hacia adelante y lateral para asegurarse de que los eventos aparezcan en el gráfico. En la ventana Panel de adquisición, haga clic en Detener adquisición. En este experimento, se utilizaron los siguientes ajustes de voltaje: FSC - 200 V, SSC - 423 V.
- Para establecer el voltaje FITC, ejecute el "control positivo (celdas tratadas con un inductor ROS, A o B)". Ajuste el voltaje para que todos los eventos aparezcan en un histograma de FITC. En este caso, use un voltaje de 280 V. En la ventana Panel de adquisición, haga clic en Detener adquisición.
- Coloque de nuevo el tubo de "control de autofluorescencia" en el brazo del aspirador. En la ventana Panel de adquisición, haga clic en Adquirir datos y, a continuación, en Registrar datos y seleccione las condiciones de detención deseadas (por ejemplo, 50.000 eventos). Dibuje una puerta alrededor de las celdas de interés, excluyendo las células muertas y los escombros.
NOTA: Estos se observan como eventos mucho más pequeños que la población celular principal y aparecen en la parte inferior izquierda de la gráfica. - Cuando finalice la adquisición, retire el tubo del brazo aspirador. El equipo se lavará solo. En la ventana Panel de adquisición, haga clic en Siguiente tubo y ejecute el control Basal (celdas no estimuladas). Haga clic en Adquirir datos y, a continuación, en Registrar datos.
- Desde la puerta inicial (puerta que excluye las celdas muertas y los escombros), cree otro diagrama de puntos de FITC (en el eje x) frente a APC (en el eje y). Dibuje una puerta de cuadrante y ajuste las coordenadas para visualizar los eventos en el cuadrante inferior izquierdo de la gráfica FITC versus APC.
- Para grabar las siguientes muestras, extraiga el tubo y haga clic en Siguiente tubo > Adquirir datos > Registrar datos.
NOTA: El citómetro de flujo utilizado aquí (ver Tabla de Materiales) registra un máximo de 1 x 106 eventos por tubo. - Cuando finalice la grabación de todos los tubos, exporte los datos al disco D. Para ello, haga clic en Archivo > Exportar > archivos FCS > versión Select 3.0 o 3.1.
NOTA: Aunque la adquisición de datos utilizando un software (consulte la Tabla de materiales) se describe en detalle en este protocolo, se puede utilizar cualquier otro software de citometría de flujo. Los parámetros de adquisición (FSC, SSC y FITC) se pueden establecer de la misma manera para obtener los resultados.
6. Análisis de los datos adquiridos
- Abra el software y agregue las muestras mediante el botón de acción Agregar muestras ; se encuentra en la barra de tareas o en la banda Navegar.
- Haga clic en Agregar muestras.
- Con el explorador de archivos, vaya a la carpeta Experimental.
- Seleccione la carpeta Experimental y haga clic en Elegir.
NOTA: Los archivos de ejemplo se cargan como parte del grupo "Todos los ejemplos" en el área de trabajo.
- Haga doble clic en el primer ejemplo del área de trabajo: Control de autofluorescencia.
NOTA: Esta acción abre una ventana Gráfico que traza eventos a lo largo de los parámetros de dispersión hacia adelante (FSC-A en el eje X) frente a dispersión lateral (SSC-A en el eje y). - Dibuje una puerta poligonal para aislar las células de interés, excluyendo las células muertas y los escombros.
- Haga clic en la herramienta Puerta de polígono .
- Haga clic dentro de la gráfica para formar la puerta del polígono. Haga tantos lados como sea necesario.
- Haga doble clic en el último punto para cerrar el polígono y crear la puerta deseada.
- Proporcione un nombre para la puerta, como "celdas MIO-M1", y presione OK.
NOTA: Aparece una nueva ventana de gráfico que muestra solo los eventos MIO-M1 sin celdas muertas ni escombros. - Repetir con todas las muestras a analizar.
- Cambie la trama a un histograma. Para ello, haga clic en la etiqueta de parámetro del eje X y seleccione FITC-A. Haga clic en la etiqueta del parámetro del eje Y y seleccione Histograma. Esto cambia la gráfica a un histograma unidimensional.
- Agregue estadísticas mediante la ventana Agregar estadísticas.
- Debajo del gráfico de histograma, haga clic en Agregar estadísticas. El programa abrirá una nueva ventana de estadísticas.
- A la izquierda de la nueva ventana seleccione las estadísticas Media geométrica.
- Seleccione las celdas MIO-M 1 de población.
- En la lista de parámetros disponibles, seleccione FIT-C.
- Haga clic en el botón Agregar para aplicarlos al análisis.
NOTA: Esto crea las nuevas estadísticas "media geométrica: FITC" en el árbol de cierre de muestra, y sus valores se muestran en el espacio de trabajo.
- Ponga estos valores medios geométricos en un programa de estadística y analice.
- Haga clic en el icono L para abrir el Editor de diseño; este icono se encuentra en la pestaña Menú del espacio de trabajo. Coloque la ventana Espacio de trabajo y el Editor de diseño uno al lado del otro.
NOTA: El Editor de diseño es una ventana de espacio de trabajo separada con herramientas para mostrar múltiples gráficos gráficos y estadísticas en un informe gráfico simple. Este se puede exportar con el archivo de extensión que prefieras, como PDF o JPG, entre otros.- Desde el árbol de cierre de una muestra en la ventana Área de trabajo, arrastre la población de celdas MIO-M 1 al Editor de diseño.
- Asegúrese de que en el Editor de diseño se muestre un gráfico de histograma que contenga los eventos de la puerta. La información básica adicional se detallará en un cuadro de texto a continuación.
- Arrastre todas las muestras para compararlas en el mismo gráfico. El programa los superpondrá.
- Haga clic con el botón derecho en el gráfico del histograma y seleccione Propiedades. El programa abrirá una nueva ventana de definición de gráficos. Esta ventana tiene cuatro pestañas (Anotar, Fuentes, Leyenda y Especificar). Haga clic en la ficha Especificar y cambie el eje Y de Automático a Modal. Haga clic en Aplicar.
- Haga clic con el botón derecho en la muestra y cambie Coloración, Estilo de línea, Grosor de línea, etc. para personalizar el gráfico.
- Para exportar la imagen, haga clic en la pestaña Archivo e, inmediatamente después, seleccione Guardar imagen en la banda Documento. Elija el tipo preferido de archivo de imagen (por ejemplo, PDF).
NOTA: Se abre un cuadro de diálogo guardar que le pedirá que seleccione una ubicación de guardado. Haga clic en Guardar.
- Guarde el análisis como un archivo de área de trabajo (.wsp).
- En la esquina superior izquierda, haga clic en el icono Análisis de citometría y seleccione Guardar como.
- Elija Guardar como espacio de trabajo (WSP) para guardar el documento con datos y análisis.
- Escriba un nombre para el archivo de área de trabajo.
- Haga clic en Guardar.
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Representative Results
Como se describe en la sección de protocolo, hemos mostrado datos representativos y cuantitativos que demuestran la detección de citometría de flujo de la producción de ROS con la sonda de fluorescencia DCFH-DA de células MIO-M1 estimuladas con inductor de ROS, A o B. Como era de esperar, observamos cambios en la fluorescencia FITC en células no estimuladas por encima de los niveles de autofluorescencia (Figura 1A, comparar "control basal" vs. "control de autofluorescencia", gráfico de diagramas de puntos). Esto ocurrió debido a una producción basal de ROS en las células MIO-M1. (Figura 1B, comparar "control basal" vs. "control de autofluorescencia", gráfico de histograma).
Curiosamente, se observó un aumento significativo en la fluorescencia FITC cuando las células fueron estimuladas con inductor de ROS, A o B (Figura 1B, compare las muestras de "inductor de ROS A" vs. muestras de "control basal" e "inductor de ROS B" vs. "control basal", gráfico de histograma). Además, cuando las células fueron tratadas con el compuesto antioxidante antes del inductor de ROS, A o B, el nivel de fluorescencia disminuyó cerca de los niveles basales (Figura 1B, compare "inductor de ROS A" vs. "pretratamiento con compuesto antioxidante 6 h + inductor de ROS A 30 min", y "inductor de ROS B" vs. "pretratamiento con compuesto antioxidante 6 h + inductor de ROS B 30 min", respectivamente, gráfico de histograma). Cabe destacar que no se observaron diferencias en la señal de fluorescencia en células tratadas con compuesto antioxidante (6 h) con respecto al control basal. (Figura 1B, compare "compuesto antioxidante de 6h" vs. "control basal").
Estos resultados también fueron claramente evidentes cuando los datos se presentaron como la media geométrica de FITC (Figura 1C). Como se puede observar en el gráfico, se indican los valores medios y el correspondiente error estándar de la media (SEM).
Una ventaja clave de este protocolo es su aplicación para seguir los cambios en ROS a lo largo del tiempo. En este sentido, hemos podido observar un aumento significativo y dependiente del tiempo en ROS cuando tratamos células MIO-M1 con inductor de ROS C durante 2 h, 4 h y 6 h (Figura 2).
Para la optimización de este protocolo, hemos intentado tres estrategias diferentes para cosechar las células (tripsina-EDTA al 0,5%, solución de desprendimiento de células Accutase y tampón de separación) con resultados comparables (datos no mostrados).
Figura 1: Medición de ROS en respuesta al inductor de ROS, A o B, utilizando sonda DCFH-DA en células MIO-M1: (A) Comparación de condiciones de "control basal" vs. "control de autofluorescencia", diagrama de puntos representativo FL1 (519 nm) vs. FL2 (660 nm). (B) Histogramas representativos para la fluorescencia inducida por la sonda DCFH-DA tras la estimulación de células MIO-M1 con inductor ros, A o B, durante 30 min, o pretratada con compuesto antioxidante durante 6 h y 30 min de inductor ROS A, B o vehículo. (C) Media geométrica de la fluorescencia FITC para todos los estímulos en células MIO-M1. Los datos se presentan como media ± SEM y se analizan mediante ANOVA unidireccional seguido de la prueba posterior de Dunnett; **p < 0,01, ***p < 0,001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Medición de horas extras de ROS en respuesta al tratamiento con inductor de ROS C utilizando sonda DCFH-DA en células MIO-M1: células MIO-M1 tratadas con inductor de ROS C durante 2 h, 4 h y 6 h y cargadas con sonda DCFH-DA para determinar los niveles de ROS. Histograma representativo para la intensidad de fluorescencia inducida por la sonda DCFH-DA tras la estimulación de células MIO-M1 con inductor de ROS C durante 2 h, 4 h y 6 h. Media geométrica de fluorescencia FITC para los estímulos detallados anteriormente. Los datos se presentan como media ± SEM y se analizan mediante ANOVA unidireccional seguido de la prueba posterior de Dunnett; ns, no significativo, **p < 0,01, ***p < 0,001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Solución | Condiciones de almacenamiento | Nota | |||||
| Hidróxido de sodio (NaOH) 10 M, 1 L | 400 g de pellets de NaOH | agua destilada a 1 L | RT | "PRECAUCIÓN": La preparación de una solución concentrada de NaOH causa una reacción exotérmica. Se debe tener extrema precaución para evitar quemaduras químicas y rotura de vasos de precipitados de vidrio. Si es posible, use vasos de plástico pesados. | |||
| Solución salina tamponada con fosfato (PBS) 10 X, 1 L | 80 g de NaCl | agua destilada a 1 L | RT | Ajuste el pH a 7.4 y filtre la solución. | |||
| 2 g KCl | |||||||
| 11,5 g Na2HPO4· 7H2O | |||||||
| 2 g KH2PO4 | |||||||
| Ácido tetraacético etilendiamina (EDTA), 0.5 M pH 8.0, 1 L | 186,1 g Na2EDTA· 2H2O | agua destilada a 1 L | RT | La sal disódica de EDTA no es soluble en agua neutra o solución hasta que el pH de la solución se ajusta a aproximadamente 8.0 mediante la adición de NaOH. Ajuste el pH a 8.0 y esterilice la solución. | |||
| 10% p/v Azida de Sodio (NaN3), 100 mL | 10 g de NaN3 | agua destilada a 100 mL | RT | ||||
| Búfer de separación, 100 mL | 180 mg de glucosa | PBS 1X a 100 ml | 4 °C | ||||
| 0.6 mL 0.5 M pH 8.0 EDTA | |||||||
| Tampón de tinción de citometría de flujo (tampón FACS), 100 ml | 2 ml de suero fetal bovino (FBS) | PBS 1X a 100 ml | 4 °C | NaN3 se añade como conservante. | |||
| 1 mL 0.5 M pH 8.0 EDTA | |||||||
| 1 ml 10% p/v de azida sódica | |||||||
| 5 mM 2′,7′-DCFH-DA, 1 mL | 2,4 mg dcFH-DA | dimetilsulfóxido a 1 ml | -20 °C protegido de la luz | Mezclar suavemente y alícuota 20 μL en tubos de 1,5 ml. Evite múltiples ciclos de descongelación/congelación. Nuestra recomendación es descartar toda la solución de sonda no utilizada del día experimental. | |||
| 0.4% p/v azul tripano 10 X, 50 mL | 0,2 g de azul tripano | PBS 1X a 50 ml | 4 °C | ||||
Tabla 1: Recetas de búfer
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Discussion
Varias afecciones patológicas, como el cáncer, las enfermedades inflamatorias, la isquemia/reperfusión, la cardiopatía isquémica, la diabetes y las retinopatías, y también situaciones fisiológicas como el envejecimiento, conducen a la sobreproducción de ROS 6,7,8,9,10,11. Por lo tanto, la detección, medición y comprensión de la vía involucrada en la modulación de ROS son objetivos importantes para muchas enfermedades. El uso de sondas para medir los niveles de ROS, como DCFH-DA, es accesible, ampliamente descrito y aceptado en la literatura científica 26,27,28. En este artículo, describimos un protocolo detallado y reproducible para medir y cuantificar los niveles de ROS por citometría de flujo en MGC.
Una ventaja del uso de este método es que, una vez que la sonda DCFH-DA es oxidada por ROS y genera un producto DCF fluorescente; esto se puede medir en un lector de placas, microscopio confocal o citómetro de flujo. La desventaja del lector de placas es que mide la fluorescencia total. En consecuencia, el lector de placas no distingue la fluorescencia intracelular de la extracelular generada por reacciones químicas en el medio de cultivo. La microscopía confocal es una herramienta útil porque las células se pueden cargar con la sonda DCFH-DA y ver en tiempo real en cámaras de cultivo a 37 ° C. La morfología y la ubicación de las ROS en la célula se pueden detectar con esta metodología, pero los niveles de ROS carecen de una medición cuantitativa. La fuerza de la citometría de flujo radica en su capacidad para medir la fluorescencia intracelular en células vivas. Se pueden obtener datos cuantitativos sobre el número de células que emiten fluorescencia, así como los medios geométricos de fluorescencia25.
Es importante tener en cuenta lo que realmente se mide cuando se utiliza la sonda DCFH-DA. Como mencionamos anteriormente, DCFH-DA mide múltiples especies de ROS, por lo que la fluorescencia resultante de la sonda verde no se puede usar para discriminar entre tipos de especies de ROS29. En este sentido, se sabe que diferentes sondas pueden discernir el tipo de ROS. Por ejemplo, la sonda de dihidroetida de dihidroetida (DHE) es oxidada por superóxido para producir el producto fluorescente 2-hidroxietilidio (excitación a 518 nm y emisión a 605 nm), pero este producto no se puede distinguir sin el uso de técnicas que consumen más tiempo, como HPLC 30,31. Otra sonda es un indicador de superóxido mitocondrial (ver Tabla de Materiales), que es una nueva sonda fluorogénica para la detección altamente selectiva de superóxido en las mitocondrias de células vivas31,32. Sin embargo, a los efectos de la medición de los niveles totales de ROS y los aumentos de ROS después de un insulto o la evaluación de la capacidad antioxidante de diferentes productos, el uso de la sonda DCFH-DA junto con los controles apropiados es conveniente y aceptable 25,28,29.
Un tema muy importante es la selección y el uso de controles experimentales adecuados: control de autofluorescencia (células sin sonda DCFH-DA), control basal (células no estimuladas), control positivo (células tratadas con un inductor de ROS), control negativo (células tratadas con compuesto antioxidante) y problema de muestra (células tratadas con compuesto antioxidante e inductor de ROS). Un consejo útil es usar medio sin rojo fenol para reducir la interferencia con las sondas fluorescentes.
También recomendamos cargar las células con la sonda DCFH-DA 30 minutos antes de finalizar el tratamiento experimental. La estandarización de la concentración de DCFH-DA, en nuestro caso 5 μM, es conveniente y podría diferir según el tipo de célula y el estado de activación celular. Nuestro consejo es configurar las concentraciones de la sonda, a partir de 5μM y 10 μM, y comprobar la eficacia de la tinción en los experimentos.
En resumen, analizar el equilibrio redox en la salud o la enfermedad es fundamental para establecer métodos confiables para medir la respuesta al estrés oxidativo. Por lo tanto, este protocolo es una herramienta simple, rápida y poderosa para cuantificar los niveles de ROS en MGC vivos mediante citometría de flujo.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer a María Pilar Crespo y Paula Alejandra Abadie del CIBICI (Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología, CONICET-UNC, Córdoba, Argentina) por su asistencia en citometría de flujo y a Gabriela Furlan y Noelia Maldonado por su asistencia en cultivo celular. También agradecemos a Víctor Díaz (Pro-Secretario de Comunicación Institucional de la FCQ) por la producción y edición del video.
Este artículo fue financiado por subvenciones de la Secretaría de Ciencia y Tecnología, Universidad Nacional de Córdoba (SECyT-UNC) Consolidar 2018-2021, Fondo para la Investigación Científica y Tecnológica (FONCyT) y Proyecto de Investigación en Ciencia y Tecnología (PICT) 2015 N° 1314 (todos a M.C.S.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2′,7′-DCFH-DA | Sigma | 35845-1G | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Gibco by life technologies | 15630-080 | |
| BD FACSCanto II flow cytometer | BD Biosciences | FACSCanto | |
| BD FACSDiva software | BD Biosciences | ||
| Cell Culture Dishes 100x20 mm | Cell Star- Greiner Bio-One | 664 160 | |
| Centrifuge | Thermo | Sorvall legend micro 17 R | |
| Centrifuge Tubes (15 ml) | BIOFIL | CFT011150 | |
| Centrifuge Tubes (50 ml) | BIOFIL | CFT011500 | |
| Cryovial | CRYO.S - Greiner Bio-One | 126263 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | W387520-1KG | |
| Disodium-hydrogen-phosphate heptahydrate | Merck | 106575 | |
| DMEM without phenol red | Gibco by life technologies | 31053-028 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Gibco by life technologies | 11995065 | |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA), Disodium Salt, Dihydrate | Merck | 324503 | |
| Fetal Bovine Serum | Internegocios | ||
| FlowJo v10 Software | BD Biosciences | ||
| Glucose | Merck | 108337 | |
| hemocytometer, Neubauer chamber | BOECO,Germany | ||
| Laminar flow hood | ESCO | AC2-6E8 | |
| L-glutamine (GlutaMAX) | Gibco by life technologies | A12860-01 | |
| MitoSOX Red | Invitrogen | M36008 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco by life technologies | 15140-122 | |
| Potassium Chloride | Merck | 104936 | |
| Potassium-dihydrogen phosphate | Merck | 4878 | |
| Round polystyrene tubes 5 ml (flow cytometry tubes) | Falcon - Corning | BD-352008 | |
| Sodium Azide | Merck | 822335 | |
| Sodium Chloride | Merck | 106404 | |
| Sodium Hydroxide | Merck | 106462 | |
| SPINWIN Micro Centrifuge Tube 1.5 ml | Tarson | 500010-N | |
| Tissue Culture Plate 6 well | BIOFIL | TCP011006 | |
| Trypan Blue | Merck | 111732 | |
| Trypsin-EDTA 0.5% 10X | Gibco by life technologies | 15400-054 | |
| Vortex Mixer | Labnet International, Inc. |
References
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