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Cuantificación de especies reactivas de oxígeno utilizando sonda de dicacetato de 2′,7′-diclorofluoresceína y citometría de flujo en células gliales de Müller
Chapters
Summary May 13th, 2022
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Aquí, proponemos un protocolo sistematizado, accesible y reproducible para detectar especies reactivas celulares de oxígeno (ROS) utilizando una sonda de dicacetato de 2′,7′-diclorofluoresceína (DCFH-DA) en células gliales de Müller (MGC). Este método cuantifica los niveles totales de ROS celulares con un citómetro de flujo. Este protocolo es muy fácil de usar, adecuado y reproducible.
Transcript
Existen varios métodos para medir la producción de ROS o estrés oxidativo en las células. Entre estos, la sonda de dicato de diclorofluoresceína 2'7'es una de las técnicas más utilizadas para medir directamente el estado redox. Esta sonda es lipofílica y no fluorescente. La difusión de esta sonda a través de la membrana celular permite que las esterasas intracelulares se escindan en los dos enlaces éster, produciendo un producto relativamente polar e impermeable a la membrana celular. Estas moléculas no fluorescentes se acumulan intracelularmente, y la posterior oxidación por ROS produce el producto altamente fluorescente diclorofluoresceína. La oxidación de la sonda es el producto de la acción de múltiples tipos de ROS. Que se puede detectar mediante citometría de flujo o microscopía confocal. En este artículo, hemos utilizado una sonda de diclorofluoresceína diacetato para medir y cuantificar ROS por citometría de flujo. Transfiera las placas de 6 pocillos a una campana de flujo laminar desde la incubadora. Aspirar el sobrenadante. Y lave las células una vez con PBS. Agregue 2 ml de DMEM sérico bajo por pozo. E incubar la placa de 6 pocillos durante dos horas en la incubadora. Trate las células con el antioxidante durante seis horas. Trate las células con el inductor de ROS, A o B, durante 30 minutos. Aspirar el sobrenadante. Y lave la célula tres veces con PBS para eliminar todos los estímulos. Apague la luz de la campana de flujo laminar y trabaje en la oscuridad. Añadir 1 ml de sonda de diclorofluoresceína de diacetato en DMEM sin rojo fenol. Añadir 1 ml de DMEM sin rojo fenol a las células de control de autofluorescencia de control. Incubar la placa de 6 pocillos durante 30 minutos en la incubadora. Transfiera las placas sobre hielo al laboratorio. Lave las células tres veces con 2 ml de PBS frío por pozo. Agregue 0.5 ml de tampón de separación en frío a cada pozo. Cosecha las células canalizando suavemente hacia arriba y hacia abajo usando una pipeta P1000. Recójalos en un tubo etiquetado de 1,5 ml. Y centrífuguelos a 600 x g durante cinco minutos a 4 C.Deseche el sobrenadante con cuidado y disocie suavemente el pellet con golpeteo. Agregue 1 ml de tampón FACS para lavar las células a cada tubo etiquetado. Si es necesario, use el vórtice en la intensidad más baja para la disociación completa del pellet. Centrifugarlos a 600 x g durante cinco minutos a 4 C.Repita este paso dos veces más. Tres lavados en total. Pellets de células resuspend en 200 L de tampón FACS. Disociar suavemente completamente el pellet en cada tubo mediante el uso de vórtice. Y transfiera a 5 ml etiquetados para tubos de citómetro de flujo. Mantenga los tubos en hielo hasta que se analicen en el citómetro de flujo. Usando el software de citometría de flujo, cree un nuevo experimento. Haga clic en la muestra y se abrirá una lista de tubos. Haga doble clic y cámbiele el nombre. Coloque el tubo de control de autofluorescencia en el brazo del aspirador, moviendo la base con cuidado solo hacia la izquierda. Haga clic en Adquirir datos y, a continuación, en Registrar datos y, a continuación, seleccione la condición de detención deseada. Dibuje una puerta alrededor de las celdas de interés, excluyendo las células muertas y los escombros. Retire el tubo. Haga clic en Siguiente tubo y ejecute la muestra de control basal. Haga clic en Adquirir datos y, a continuación, en Record Data.Abra el software. Agregue los ejemplos mediante el botón de acción Agregar ejemplos. Haga clic en Agregar muestra.Seleccione la carpeta Fecha experimental y haga clic en Elegir.Haga doble clic en la primera muestra del área de trabajo, control de autofluorescencia en este caso. Dibuje una puerta poligonal para aislar la celda de interés, excluyendo las células muertas y los escombros. Cambiar la trama a un histograma. Haga doble clic dentro de la M
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