Summary
ניתוח סטריאוטקסי למיקוד אתרי מוח בעכברים כולל בדרך כלל גישה דרך עצמות הגולגולת ומונחה על ידי ציוני דרך בגולגולת. כאן אנו מתווים גישה סטריאוטקסית חלופית כדי להתמקד בגזע המוח הקאודלי ובחוט השדרה הצווארי העליון באמצעות ה-cisterna magna המסתמך על הדמיה ישירה של ציוני דרך של גזע המוח.
Abstract
ניתוח סטריאוטקסי למיקוד אתרי מוח בעכברים מונחה בדרך כלל על ידי ציוני דרך של גולגולת. לאחר מכן מתקבלת הגישה באמצעות חורי בור שנקדחו דרך הגולגולת. גישה סטנדרטית זו יכולה להיות מאתגרת עבור מטרות בגזע המוח הקאודלי ובחוט הצוואר העליון בשל אתגרים אנטומיים ספציפיים מכיוון שאתרים אלה מרוחקים מציוני דרך של גולגולת, מה שמוביל לחוסר דיוק. כאן אנו מתארים גישה סטריאוטקסית חלופית באמצעות ה-cisterna magna ששימשה כדי להתמקד באזורים בדידים בעלי עניין בגזע המוח הקאודלי ובחוט הצוואר העליון. הציסטרנה מגנה משתרעת מהעצם העורפית ועד האטלס (כלומר, עצם החוליה השנייה), מלאה בנוזל מוחי, ומכוסה על ידי דורה מאטר. גישה זו מספקת נתיב גישה ניתן לשחזור למבנים נבחרים של מערכת העצבים המרכזית (CNS) שאחרת קשה להגיע אליהם בשל מחסומים אנטומיים. יתר על כן, הוא מאפשר הדמיה ישירה של ציוני דרך בגזע המוח בסמיכות לאתרי המטרה, מה שמגדיל את הדיוק בעת אספקת נפחי הזרקה קטנים לאזורי עניין מוגבלים בגזע המוח הקאודלי ובחובר הצוואר העליון. לבסוף, גישה זו מספקת הזדמנות להימנע המוח הקטן, אשר יכול להיות חשוב עבור מחקרים מוטוריים וסנסו-מוטוריים.
Introduction
ניתוח סטריאוטקסי סטנדרטי לאיתור אתרי מוח בעכברים1 כולל בדרך כלל קיבוע של הגולגולת באמצעות סט של מוטות אוזניים ומוט פה. הקואורדינטות נאמדות לאחר מכן על סמך אטלסים ייחוס 2,3, ונקודות ציון של הגולגולת, כלומר, bregma (הנקודה שבה התפרים של העצמות המצחיות והקודקודיות מתאחדות) או למבדה (הנקודה שבה התפרים של העצמות הקודקודיות והאוציפיטליות מתאחדות; איור 1א,ב). דרך חור בור לתוך הגולגולת שמעל המטרה המשוערת, ניתן להגיע לאזור המטרה, בין אם לצורך אספקת מיקרו-אינטגרציות או מכשור עם צינוריות או סיבים אופטיים. בשל שונות באנטומיה של תפרים אלה וטעויות בלוקליזציה של bregma או lambda 4,5, המיקום של נקודות אפס ביחס למוח משתנה מחיה לחיה. בעוד שטעויות קטנות במיקוד, הנובעות מהשתנות זו, אינן מהוות בעיה עבור מטרות גדולות או קרובות, השפעתן גדולה יותר עבור אזורי עניין קטנים יותר המרוחקים מנקודות האפס במישורים האנטרופוסטריוריים או הגביים ו/או כאשר חוקרים בעלי חיים בגדלים משתנים בשל גיל, מתח ו/או מין. ישנם מספר אתגרים נוספים שהם ייחודיים למדולה אובלונגטה ולחוט הצוואר העליון. ראשית, שינויים קטנים בקואורדינטות אנטרופוסטריות קשורים לשינויים משמעותיים בקואורדינטות הגב-ונטרליות ביחס לדורה, בשל המיקום והצורה של המוח הקטן (איור 1Bi)2,6,7. שנית, חוט הצוואר העליון אינו כלול בתוך הגולגולת2. שלישית, תנוחת ההטיה של העצם העורפית והשכבה העליונה של שרירי הצוואר2 הופכת את הגישה הסטריאוטקסית הסטנדרטית למאתגרת עוד יותר עבור מבנים הממוקמים בסמוך למעבר בין גזע המוח לחוט השדרה (איור 1Bi). לבסוף, מטרות רבות של עניין בגזע המוח הקאודלי ובחובר צוואר הרחם הן קטנות2, הדורשות זריקות מדויקות וניתנות לשחזור 8,9.
גישה חלופית באמצעות הציסטרנה מגנה עוקפת את הבעיות הללו. הציסטרנה מגנה היא חלל גדול המשתרע מהעצם העורפית ועד האטלס (איור 1A, כלומר עצם החוליה השנייה)10. הוא מלא בנוזל שדרתי ומכוסה על ידי דורה מאטר10. רווח זה בין העצם העורפית לבין האטלס נפתח בעת אנטרופלקסינג של הראש. ניתן לגשת אליו על ידי ניווט בין הבטן הזוגית העליונה של שריר הלונגוס קפיטיס, וחושף את פני השטח הגביים של גזע המוח הקאודלי. לאחר מכן ניתן להתמקד באזורים מעניינים על סמך ציוני הדרך של אזורים אלה עצמם אם הם ממוקמים בסמוך לפני השטח הגביים; או על ידי שימוש ב-obex, הנקודה שבה התעלה המרכזית נפתחת לחדר IV, כנקודת אפס לקואורדינטות כדי להגיע למבנים עמוקים יותר. גישה זו שימשה בהצלחה במגוון מינים, כולל חולדה11, חתול12, עכבר 8,9, ופרימט לא אנושי13 כדי להתמקד בקבוצת הנשימה הגחונית, היווצרות רשתית מדיאלית מדולרית, גרעין דרכי הבודדות, אזור פוסטרמה או גרעין היפוגלוסלי. עם זאת, גישה זו אינה נמצאת בשימוש נרחב מכיוון שהיא דורשת ידע באנטומיה, ערכת כלים מיוחדת וכישורים כירורגיים מתקדמים יותר בהשוואה לגישה הסטריאוטקסית הסטנדרטית.
כאן אנו מתארים גישה כירורגית שלב אחר שלב כדי להגיע לגזע המוח ולחוט הצוואר העליון דרך הציסטרנה מגנה, לדמיין ציוני דרך, להגדיר את נקודת האפס (איור 2), ולהעריך ולמטב את קואורדינטות המטרה להעברה סטריאוטקסית של מיקרו-איניג'מנטים לתוך גזע המוח הבדיד ואזורי העניין של חוט השדרה (איור 3). לאחר מכן נדון ביתרונות ובחסרונות הקשורים לגישה זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
המחבר מצהיר כי הפרוטוקול תואם את הנחיות הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים במרכז הרפואי בית ישראל.
1. הכנת כלי ניתוח ומסגרת סטריאוטקסית
הערה: הניתוח מבוצע בתנאים אספטיים. הסטריליות נשמרת באמצעות טכניקת הקצה הסטרילית.
- התקינו את הזרוע הסטריאוטקסית באמצעות מיקרופיפט או מזרק מלא בהזרקה לפי בחירה (וירוס הקשור לאדנו (AAV) או עוקבים קונבנציונליים) על המסגרת הסטריאוטקסית והכינו את מתאם העכבר (איור 2A).
- מכינים כלי ניתוח אוטוקלביים (טבלת חומרים) ומניחים אותם על משטח סטרילי.
2. אינדוקציה של הרדמה והכנת עכבר
- הפעילו את O2 ב-0.5 ליטר לדקה והגדירו את מכשיר האידוי איזופלורן ל-4.0, וודאו שזרימת O2 מגיעה לתיבת האינדוקציה.
אזהרה: ודא שתיבת האינדוקציה של האיזופלורן ממוקמת במכסה המנוע ושהאיזופלורן נטרף הרחק מאתר הניתוח. - מקם את העכבר (C57BL/6J זכר בן 10 שבועות) בתא האינדוקציה.
- לאחר שהאשימה הואטה, פתחו את תא האינדוקציה והרימו מעט את העכבר. השתמשו בקוצץ כדי להסיר את השיער מהראש אל הכתפיים.
3. מיקום העכבר במסגרת הסטריאוטקסית
- הזיזו את העכבר למסגרת הסטריאוטקסית והניחו את האף בחרוט אף גמיש. בשלב זה, ודא שזרימת O2 מופנית כעת לחרוט האף.
- מקם את העכבר במסגרת הסטריאוטקסית באמצעות סרגלי אוזניים בלבד.
הערה: ודא שסורגי האוזניים אחידים והראש מאוזן. - Anteroflex את ראש העכבר לזווית של 90° על ידי הכוונה ידנית של האף. כדי לאבטח את המיקום הזה, הניחו מחסום פלסטיק בין עמודי מוט האוזן של מתאם העכבר, במקביל לעמודים. החלק השטוח של הגולגולת משמש כהתייחסות, בדומה לגישת הגולגולת השטוחה בניתוח סטריאוטקסי קונבנציונלי.
הערה: אין להגמיש את הראש יתר על המידה (כלומר מעבר לזווית של 90° בין מישור עצם הגולגולת הקדמית למישור פני השטח של השולחן) מכיוון שהדבר מעכב את זרימת האוויר דרך דרכי הנשימה העליונות. אם זרימת האוויר נפגעת, מקם מחדש את העכבר, וודא שהגוף נתמך מתחת לתא המטען וכרטיס פלסטיק מוגדר ב-90° בין מישור עצם הגולגולת המצחית למישור פני השטח של השולחן כפי שמתואר באיור 2A,C. - מניחים את כרית החימום מתחת לעכבר, ולאחר מכן מוודאים שהצוואר ושאר הגוף ממוקמים באותה רמה (כלומר, בערך 180° או במקביל לשולחן). ארגז הכלים שמחזיק את מספרי הקפיץ יכול לשמש להרמת הגוף לתנוחה זו.
הערה: שלב זה חשוב מכיוון שגזע המוח הקאודלי וחבל הצוואר העליון נעים בהתאם למיקום, בניגוד לחלקים רוסטרליים יותר של מערכת העצבים המרכזית המוחזקים במקומם על ידי הגולגולת. - הזריקו מנה אחת של 4 מ"ג/ק"ג מלוקסיקם בשחרור איטי (SR) תת עורית (s.c.) בנפח של 2 μL/g משקל גוף והניחו את חומר הסיכה על העיניים.
- נקו את אתר החתך הניתוחי תחילה עם כרית הכנה של 70% אלכוהול, לאחר מכן עם כרית הכנה לבטאדין, ואז שוב עם כרית הכנה לאלכוהול והניחו להתייבש.
- מניחים וילון מתחת לגוף.
- יש לחטא את הידיים וללבוש כפפות סטריליות.
- הניחו וילון באתר הניתוח.
4. ניתוח לגישה לציסטרנה מגנה
- ודא שהעכבר מורדם כראוי על ידי צביטה של הבהונות או בדיקת רפלקס הקרנית.
- הפחת את האיזופלורן לרמות תחזוקה (2.0).
- יש לבצע חתך של 1-1.2 ס"מ עם להב כירורגי מס' 10 מקצה העצם העורפית לכיוון הכתפיים בתנועה חלקה אחת.
- לעשות חתך בקו האמצע של שריר הטרפז. זה חושף את שרירי הלוגוס קאפיטיס הזוגיים.
הערה: בעכברים, שריר הטרפז הוא שריר דק מאוד, כמעט שקוף. הקפידו להישאר בקו האמצע ולא לחתוך לשרירים הבסיסיים מכיוון שהדבר יגרום לדימום מיותר. - מניחים את שני הווים הנסוגים בין שרירי הלוגוס קאפיטיס הזוגיים, אחד מכוון שמאלה והשני ימינה. משקלם של ההמוסטאטים מספק מתח לקרסים הנסוגים אשר ניתן לשנותו על ידי התאמה מחדש של מיקום ההמוסטאטים.
- מקם את המיקרוסקופ הכירורגי במקומו כדי לדמיין טוב יותר את שדה הניתוח.
- השתמש במלקחיים הלמינקטומיה הבוטים כדי להפריד בין הבטן השמאלית והימנית של שריר הלוגוס קפיטיס הזוגי, החל מהאוקסיפוט, שם קו האמצע נראה בקלות. הנח את המלקחיים הבוטים על פני עצם העורף בקו האמצע עד למקום שבו הוא פוגש את הדורה מאטר הציסטרנלית, ולאחר מכן המשך על פני הדורה מאטר אל האטלס.
הערה: אין צורך לחתוך את שרירי הלוגוס קאפיטיס הזוגיים מכיוון ששום דבר לא מחזיק אותם יחד בקו האמצע; פעולה זו תגרום לדימום מיותר. - מקם מחדש את הנסוגים והתאים את המתח על ידי מיקום מחדש של ההמוסטטים, ופתח את הנוף של הציסטרנה מגנה.
- השתמש במלקחיים הלמינקטומיה הבוטים כדי להפריד את השרירים עוד יותר בקו האמצע כדי לקבל חלון צפייה טוב של גזע המוח והמוח הקטן.
- חזור על שלבים 4.7-4.9 לפי הצורך עד שהמוח הקטן וגזע המוח יופיעו מתחת לדורה.
- באמצעות מלקחיים למינכטומיה קהים, נקו את הדורה מהגדילים הקטנים של רקמת החיבור על ידי הזזת המלקחיים מקו האמצע בכיוון רוחבי, עד שיש מבט ברור על גזע המוח וכדי ליצור מרחב רוחבי יותר, לפי הצורך עבור המטרה.
5. פתיחת קרום הציסטרנלי
- השתמש במלקחיים הזוויתיים של דומונט (#4/45) כדי לתפוס את הדורה, המשתרעת מהעצם העורפית ועד האטלס. תפסו את הדורה ליד העצם העורפית והשתמשו במספריים הקפיץ כדי ליצור פתח קטן (כ-0.5 עד 1.5 מ"מ) בדורה.
הערה: במיקום רוסטרלי זה, הרווח בין גזע המוח לבין הדורה העליונה הוא הרחב ביותר, ומספק מספיק מקום למניפולציה בטוחה של הדורה. - השתמשו במספריים הקפיץ כדי להרים את הדורה ולפתוח את הדורה עוד יותר. גודל החלון תלוי במטרה.
הערה: יהיה צורך בחלון גדול יותר בעת ביצוע זריקות אורך מרובות או זריקות דו-צדדיות; חלון קטן יספיק בעת ביצוע זריקות חד צדדיות או קו אמצע בודדות. - לאחר פתיחת הדורה, יש לנקז עודפי נוזל מוחי עם קצה רמז סטרילי.
6. זיהוי ציוני דרך ונקודת אפס
- צפו במשטח הגבי של גזע המוח עם ציוני דרך מפורטים דרך הדורה הפתוחה. האובקס, הנקודה שבה התעלה המרכזית נפתחת לחדר IV, היא נקודת האפס הקדמית-אחורית והמדיולטרלית הסטנדרטית.
7. קואורדינטות יעד
הערה: עבור מטרות שונות, כללנו רשימה של קואורדינטות סטנדרטיות עם קואורדינטות אחוריות קדמיות (AP) ומדיולטרליות (ML) ביחס לקואורדינטות bregma ו- cisterna magna של נקודת אפס עם קואורדינטות AP ו- ML ביחס ל- zero point obex כדי להקל על המעבר בין מתודולוגיות (טבלה 1). קואורדינטות Dorsoventral (DV) הן יחסית לפני השטח של המוח או המוח הקטן (גישה סטנדרטית) או פני השטח של גזע המוח או כבל צוואר הרחם העליון (גישת cisterna magna) בנקודת הכניסה AP ו- ML. התכנון צריך להיעשות לפני הניתוח.
- השתמש בשלוש קבוצות הקואורדינטות כדי לקבוע את היעד: AP, ML ו- DV. בשל מיקום הראש, האוריינטציה היחסית של מבני גזע המוח משתנה בהתאם למיקום.
- עבור מרחק המטרה >0.4 מ"מ מ-caudal ל-obex (איור 1B, ירוק) בצע את הפעולות הבאות.
- AP: השתמש בכל אטלס ייחוס סטריאוטקסי סטנדרטי (לדוגמה, אטלס פקסינוס ופרנקלין2) או בסדרת רקמות שנחתכה במישור הרוחבי כדי להעריך את מרחק ה-AP בין obex למטרה.
- ML: השתמש בכל אטלס ייחוס סטריאוטקסי סטנדרטי או בסדרת רקמות שנחתכו במישור הרוחבי כדי להעריך את מרחק ה- ML בין obex לבין המטרה.
- DV: אומדן קואורדינטות ביחס לפני השטח של המוח או המוח הקטן בנקודת המטרה AP ו- ML. השתמש בכל אטלס ייחוס סטריאוטקסי סטנדרטי או בסדרת רקמות שנחתכו במישור הרוחבי כדי להעריך את המרחק בין משטח גזע המוח בקואורדינטות AP ו- ML הרצויות לבין המטרה.
- עבור מרחק המטרה <0.4 מ"מ מ-caudal ל-obex (איור 1B, כתום) בצע את הפעולות הבאות.
- AP: התאם קואורדינטות כך שיתחשבו באנטרופלקסיה של גזע המוח. עבור קואורדינטות גחוניות ורוסטרליות, נקודת הכניסה של גזע המוח AP תהיה קאודלית יותר ביחס לקואורדינטות AP של המטרה במישור הסטנדרטי.
- ML: גזור קואורדינטות מטרה מאטלס ייחוס סטריאוטקסי סטנדרטי או מסדרת רקמות שנחתכו במישור הרוחבי. הקואורדינטות יהיו יחסית לקו האמצע המוצג באופן חזותי ברמת AP היעד.
- DV: אומדן קואורדינטות ביחס לפני השטח של גזע המוח בנקודת המטרה AP ו- ML. התאם את ה- DV כדי להסביר את האנטרופלקסיה של גזע המוח. עבור קואורדינטות גחוניות ורוסטרליות, קואורדינטות ה- DV יהיו גדולות יותר מהמרחק מהמשטח הגבי של גזע המוח במישור הסטנדרטי.
- עבור מרחק המטרה >0.4 מ"מ מ-caudal ל-obex (איור 1B, ירוק) בצע את הפעולות הבאות.
8. הזרקת המטרה
- הורידו את הפיפטה או המזרק אל המטרה באמצעות הזרוע הסטריאוטקסית והזריקו תמיסה כמו בגישות סטריאוטקסיות סטנדרטיות. השאר במקום למשך 1-5 דקות לאחר ההזרקה, כדי להימנע ממסלול מחט בעת שימוש בנפחים בין 3-50 nL. לאחר מכן, הרימו את הפיפטה או המזרק באמצעות הזרוע הסטריאוטקסית.
- חזור על שלב 8.1. עבור מטרות מרובות.
9. סגירת השדה הכירורגי
- הסר את הווים בזהירות משדה הניתוח. שרירי הלונגוס קאפיטיס הזוגיים ייפלו בחזרה לתנוחה נייטרלית, ויכסו באופן מלא את הציסטרנה מגנה. אין לסגור את שריר הטרפז ואת דורה מאטר בקו האמצע מכיוון שהם שבירים מכדי להחזיק תפרים.
- סגור את העור עם שלושה תפרים ניילון או פוליפרופילן (5-0 או 6-0).
10. טיפול לאחר הניתוח
- כבה את האיזופלורן והסר את העכבר מהמסגרת הסטריאוטקסית. מניחים את העכבר בכלוב נקי על כרית חימום ומתבוננים עד שהוא מתעורר וזז.
- עקוב אחר מצב הבריאות, המשקל והתפרים בימים שלאחר הניתוח 1-3. הסר תפרים ביום 10 אם עדיין לא הוסרו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
גישת ה-cisterna magna מאפשרת למקד את גזע המוח הקאודלי ואת המבנים של חוטי הצוואר העליונים שקשה להגיע אליהם בדרך אחרת באמצעות גישות סטריאוטקסיות סטנדרטיות או שהם מועדים למיקוד לא עקבי. הניתוח כדי להגיע לציסטרנה מגנה דורש חתכים של העור, שכבה דקה של שריר טרפז, ופתיחת הדורה מאטר ולכן הוא נסבל היטב על ידי עכברים. היא יעילה במיוחד ופחות פולשנית כאשר היא מתמקדת באתרים מרובים (מפוזרים לאורך או דו-צדדיים), שכן היא אינה דורשת קידוח של חורי בור מרובים כמו בגישות סטריאוטקסיות סטנדרטיות. בעכברים, יש לנו מבנים ממוקדים באופן שגרתי כגון הגרעין ההיפוגלוסלי9, קבוצת הנשימה הגחונית8, והיווצרות רשתית סמוכה8 בגזע המוח הקאודלי באמצעות גישת הציסטרנה מגנה, כפי שאנו ממחישים עוד יותר עבור הגרעין ההיפוגלוסלי והמדולה הגחונית (GiV) באיור 3. לדוגמה, הגרעין ההיפוגלוסלי הוא טור דק אך מוארך באופן רוסטרוקודי של מוטונורונים במדולה אובלונגטה הגבית והקוטב הרוסטרלי שלו יכול להיות ממוקד באמצעות גישה סטנדרטית. עם זאת, מכיוון שקואורדינטות ה-DV (כ-4.5 מ"מ) מוכתבות בעיקר על ידי המוח הקטן שמעל הזרוע, כאשר רק 1.2-1.4 מ"מ נכנסים לגזע המוח, הבדל קטן יחסית במיקום ראש העכבר עלול לגרום בקלות לזריקה שאינה במקומה. בשל קרבתה של מטרה זו לאובקס של נקודת האפס, ניתן למקד אותה באופן אמין יותר באמצעות גישת cisterna magna. יתר על כן, הקצה הקאודלי של הגרעין ההיפוגלוסלי המשתרע עד למעבר בין גזע המוח לחוט השדרה יכול להיות ממוקד על ידי אותה גישה ציסטרנה מגנה, בעוד שהגישה הסטנדרטית תצטרך להשתנות כדי להגיע לאתר קאודלי כזה על ידי זווית גישת AP והתאמת קואורדינטות כדי למנוע את העצם העורפית ושרירי הצוואר העליונים.
על מנת לקבוע את הדיוק של גישת הציסטרנה מגנה לעומת הגישה הסטנדרטית, מדדנו את המרחק בין אתרי המטרה המיועדים והממשיים במישורים האנטרופוסטריים, הבינוניים והדורסו-ונטרליים עבור גחון (מדולה גחונית; Gia/V; N = 10) וגבה (NuXII; N = 16) אזורים. המדידות נעשו בקטעים רוחביים של גזע המוח הקאודלי (איור 3). התוצאות (איור 4) מראות שגיאות קטנות משמעותית במישורים האנטרופוסטריים, הבינוניים ובעיקר הגב-ונטרליים עבור גישת הציסטרנה מגנה בהשוואה לגישה הסטנדרטית. תוצאות אלה מדגישות את הדיוק המשופר של גישת cisterna magna עבור מטרות אלה. כללנו קואורדינטות סטריאוטקסיות סטנדרטיות (יחסית לברגמה, שמקורן בפאקסינוס ופרנקלין 2, אך מותאמות למחקרים שלנו) וקואורדינטות ציסטרנה מגנה (יחסית לאובקס) בטבלה 1. כל הקואורדינטות האלה עברו אופטימיזציה ואומתו כפי שמוצג עבור הגרעין ההיפוגלוסלי והמדולה הוונטרומדיאלית באיור 3.
איור 1: ייצוג סכמטי של ציוני דרך מרכזיים, אזורי מטרה ומישור הגישה הסטריאוטקסית cisterna magna. (A) ציוני דרך אנטומיים מרכזיים ומיקום במישור הסגיטלי. (B) תחומים שניתן להגיע אליהם באמצעות הגישה הסטריאוטקסית הסטנדרטית לעומת הגישה הסטריאוטקסית של ציסטרנה מגנה והיחס לנקודות הייחוס שלהם. i) הגישה הסטנדרטית עושה שימוש בציוני דרך גרמיים bregma ו- lambda, המרוחקים מאזורי מטרה במג'נטה ובסגול. האזור במג'נטה (caudal medulla oblongata וכבל צוואר הרחם העליון) מאתגר להגיע אליו בשל שרירי העצם והצוואר העורפיים הנטויים. האזור בסגול (rostral medulla oblongata) נוטה לתנועה ומרוחק מציוני דרך מסורתיים. ii) גישת cisterna magna מתאימה לגישה ל- caudal medulla oblongata ולחבל הצוואר העליון ויש לה יתרונות כאשר חוקרים מבני גזע מוח המאורגנים בעמודי אורך המשתרעים מה- caudal medulla oblongata rostrally, עד לרמה של הפונס הקאודלים. (C) שרטוט המישורים של אטלסי ייחוס סטריאוטקסיים שונים ביחס לגישת הציסטרנה מגנה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: סקירה סכמטית שלב אחר שלב של גישת ה-cisterna magna הסטריאוטקסית. (A) מתאם עכבר עם מוטות אוזניים הממוקמים באופן שווה ברמה הגבוהה ביותר, מוט הפה במיקום מורד, וכרטיס פלסטיק לאבטחת הראש האנטרופלקסי בזווית של 90°. (B) אבטחו את העכבר לתוך המסגרת הסטריאוטקטית באמצעות מוטות האוזן והתכופפו על הראש ב-90° ושמרו על מיקומו באמצעות כרטיס פלסטיק קשיח, עם המסגרת הסטריאוטקסית כהפניה. (C) ודא שהגוף מוגבה כך שהוא נמצא באותו מישור כמו העורף. מישש ציוני דרך מרכזיים. (D) לבצע חתך בעור מהאוקסיפוט לחלק הרוסטרלי של הכתפיים. (E) לבצע חתך ברפה של שריר הטרפז. הקפידו להישאר בקו האמצע ולא לחתוך את השרירים הבסיסיים. (F) זהה את קו האמצע בין שתי בטנו של שריר הלונגוס קפיטיס, החל מהאוקסיפוט, והנחה את מלקחיים הלמינכטומיה בכיוון קאודלי. (G) מניחים כל אחד מהווים של הפצע בין בטנו של שריר הלונגוס קאפיטיס ומניחים מחדש עד שהציסטרנה מגנה נכנסת לתמונה. (H) לזהות ציוני דרך גרמיים (עצם העורפית, אטלס), הדורה מאטר המשתרעת בין המבנים הגרמיים האלה, לבין המוח הקטן וגזע המוח שבבסיסו. נקו את הדורה מאטר לפי הצורך כדי לחשוף את רמת המטרה. (I) שימוש במספריים קפיץ ומלקחיים עדינים פותח את הדורה. (J) זהה את ה- obex, המהווה את נקודת האפס AP ו- ML. העבר את הפיפטה לקואורדינטות ה-AP וה-ML הנבחרות. הנמיכו את הפיפטה עד שהיא מגיעה לפני השטח הגביים של גזע המוח. זוהי נקודת האפס של DV. הנמיכו את הפיפטה לקואורדינטות הרצויות. (K) הסר את הפיפטה ואת ווי הפצע ותן לשרירי הלונגוס קאפיטיס לחזור למקומם המקורי. (L) לסגור את הפצע ולהסיר את העכבר מהמסגרת הסטריאוטקסית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: הערכת קואורדינטות מטרה. פוטומיקרוגרפיות בהגדלה נמוכה של גזע המוח הקאודלי. (A) הזרקת תת-יחידה של רעלן כולרה מסוג tracegrade b (CTb; כחול) לתוך הגרעין ההיפוגלוסלי של עכבר כתב ChAT-cre L10 GFP (ירוק) (נקבה, בת 6 חודשים). שים לב כי הזרקת CTb מוגבלת לגרעין ההיפוגלוסלי. (B) טרנספקציה של תאים גלוטמטרגיים של עכבר GFP vGluT2-ires-cre L10 (ירוק) (זכר, בן חודשיים) עם עוקב אנטרוגרד מותנה (magenta) בחלק הגחוני של ה-caudal medial medulla oblongata (קוטב קאודלי של אזור GiV). (C) מעקב מתריס מותנה בעכבר vGLuT2-ires-cre (זכר, בן חודשיים) המציג טרנספקציה של TVA (מג'נטה) של נוירונים גלוטמטרגיים וזיהום כלבת שונה (ירוק) ב-medulla oblongata המדיאלי הקאודלית (קוטב קאודלי של אזור GiV). נגיף הכלבת הוזרק לחוט השדרה הצווארי העליון. ציוני דרך פנימיים משמשים כהנחיה. קיצורים-cAmb: גרעין קומפקטי של קומפלקס Ambiguus; Ap: אזור פוסטרמה; DMV: הגרעין המוטורי הגבי של הוואגוס; GiV: גרעין גיגנטו-תאי, חלק גחוני; IO: זית נחות; IRt: גרעין רשתי ביניים; LRN: גרעין רשתי לרוחב; NuXII- גרעין היפוגלוסאלי; סול: גרעין הדרך הבודדת; Sp5: גרעין טריגמינלי של עמוד השדרה; VRG: קבוצת הנשימה הגחונית. סרגל קנה מידה: 200 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: השוואה בין הדיוק בין גישת התקן לגישות cisterna magna. המרחק הממוצע בין מרכז המטרה המיועדת לבין מרכז האתר הממשי במישור האנטרופוסטריורי (A), במישור הבינוני (B) ובמישור הדורסובנטרלי (C). הנתונים התקבלו מ-N = 13 עכברים בוגרים בגישה סטנדרטית ו-N = 13 עכברים בוגרים באמצעות גישת cisterna magna. רדיוס המטרה נקבע על 30 מיקרומטר. התוצאות מראות דיוק גבוה יותר במישור האנטרופוסטריורי (t(24) = 2.08, p = 0.049; מבחן t דו-זנב; אלפא 0.05), מישור בינוני (t(24) = 2.55, p = 0.018; מבחן t דו-זנב; אלפא 0.05) ומישור דורסו-וונטרלי (t(24) = 4.33, p = 0.0002; מבחן t דו-זנב; אלפא 0.05). גרפי עמודות מייצגים את הממוצע עם סטיית תקן ונקודות בודדות מייצגות ערכים בכל עכבר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
טבלה 1: סקירה כללית של קואורדינטות סטריאוטקסיות סטנדרטיות וציסטרנה מגנה כדי להתמקד במבנים של גזע המוח הקאודלי. שימו לב שגם עבור הגישה הסטנדרטית וגם עבור הגישה של ציסטרנה מגנה, קואורדינטות מאטלס פקסינוס ופרנקלין2 הותאמו עד שאזורי העניין הותאמו כראוי כפי שאומתו על ידי היסטולוגיה (איור 3). כמו כן, שים לב כי אזורים במבנה הרשתי חסרים גבולות מוגדרים היטב והם מסומנים כאן כמו בפאקסינוס ופרנקלין2. קיצורים-AP: anteroposterior. מ"ל: בינוני. DV: dorsoventral. ChAT: כולין אצטילטרנספראז; ו: נקבה; מ: זכר; M&F: זכר ונקבה; NA: לא ישים; Pet1: פלזמציטומה ביטאה גורם שעתוק 1; סרט: טרנספורטר סרוטונין, vGaT: טרנספורטר GABA שלפוחיתי; vGluT2: טרנספורטר גלוטמט שלפוחיתי 2; WT: סוג פראי. כל הקואורדינטות הן במילימטר (מ"מ). אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ניתוח סטריאוטקסי סטנדרטי מסתמך בדרך כלל על ציוני דרך של גולגולת כדי לחשב את הקואורדינטות של אתרי המטרה ב- CNS1. לאחר מכן ניגשים לאתרי המטרה דרך חורי בור שנקדחים דרך הגולגולת1. שיטה זו אינה אידיאלית לגזע המוח הקאודלי, שכן אתרי המטרה ממוקמים הרחק מציוני הדרך של הגולגולת במישורים האנטרופוסטריים והדורסו-בנטרליים2 וכאשר האנטומיה של הגולגולת והשרירים העליונים הופכים את הגישה למאתגרת6 (איור 1Bi). המחקר שלנו מתאר גישה סטריאוטקסית חלופית לגישה לאתרי מטרה בגזע המוח הקאודלי ובחוט השדרה העליון הנקראת גישת ציסטרנה מגנה. תכונות עיקריות שהופכות את השיטה הזו לשונה מגישה סטריאוטקטית סטנדרטית הן מיקום, עם אנטרופלקסיה של הראש כדי לפתוח את הציסטרנה מגנה, ושימוש בציוני דרך מרכזיים של גזע המוח במשטח הגבי של גזע המוח כנקודות ייחוס כגון obex. התוצאות שלנו מצביעות על כך שגישה זו מתאימה למסירה של נפחים קטנים (5-50 nL) של עוקבים או וירוסים הקשורים לאדנו (AAVs) למבנים בדידים של גזע המוח. יתר על כן, השימוש בנקודת ייחוס המייצגת נקודת ציון של מערכת העצבים המרכזית, ולא מבנה גרמי, ונמצא בסמיכות ליעד המיועד מגביר את יכולת השכפול והדיוק של מטרות קטנות ונפחי הזרקה קטנים, כפי שרלוונטי למיפוי מעגלים ולמחקרים כימוגנטיים (איור 3)14,15.
כמו בכל פרוטוקול, לגישת cisterna magna יש שלבים שהם קריטיים על מנת להשיג יכולת שכפול. כמו בכל גישה סטריאוטקסית התלויה בקואורדינטות בשלושה מישורים שונים (אנטרופוסטריור, מדיולטרלי ודורסו-וונטרלי), המיקום הוא קריטי. עבור גישת cisterna magna, זה כרוך לא רק את המיקום של הראש, אשר צריך להיות anteroflexed ב 90 ° אלא גם את זה של הגוף, אשר צריך להיות מורם כך גזע המוח caudal וחוט צוואר הרחם העליון נמצאים באותו מישור. צעד קריטי נוסף הוא להימנע ממניפולציות מיותרות הגורמות לדימום, שכן הדבר יפגע בהדמיה של ציוני דרך מרכזיים. ישנן שתי מניפולציות הנושאות סיכון גבוה לדימום. ראשית, הדורה מאטר המכסה את הציסטרנה מגנה מכוסה בשריר גדול יחסית (לונגוס קפיטיס). מכיוון שמדובר בשריר זוגי, עם בטן אחת משני צדי קו האמצע, שתי הבטן של שריר זה יצטרכו להיות מופרדות בעדינות רק בקו האמצע. חתך של שרירים אלה אינו הכרחי ויגרום לדימום. שנית, בפתיחה המוצלחת של הדורה מאטר, מספר משתנה של ורידים עם מסלול משתנה ייראה על גבי המשטח הגבי של גזע המוח הקאודלי וחבל הצוואר העליון. יש להימנע מוורידים אלה על ידי החלת התאמות קלות בקואורדינטות (עד 0.1 מ"מ) או, אם פרדיגמת הניסוי מאפשרת זאת, על ידי בחירת מטרה אחרת.
יתרון מרכזי של גישת ה-cisterna magna הוא שהיא מספקת גישה לגזע המוח ולמבנים הצוואריים העליונים שמאתגרים להגיע אליהם בעת שימוש במישור הסטריאוטקסי הסטנדרטי מכיוון שהם ממוקמים בסמוך לקצה הקאודל של העצם העורפית או סתם קאודלית. יתר על כן, עבור מטרות ב medulla oblongata הגישה נמנעת המוח הקטן ולכן השפעות נגע המוח הקטן או תיוג מופרך באמצעות מערכת מחט, אשר יכול להשפיע על תוצאות המחקר בעת שימוש במתודולוגיה סטנדרטית אינם מהווים דאגה. יתרון נוסף של גישת cisterna magna הוא שהמשטח הגבי של גזע המוח הופך גלוי לעין. זה מספק את ההזדמנות להשתמש בנקודת ציון על המשטח הגבי כנקודת ייחוס לקואורדינטות. יתר על כן, הגישה גמישה וניתן לייעל אותה בהתאם למטרה. לדוגמה, השתמשנו בנקודת ציון של קו האמצע, ה- obex, כנקודת ההתייחסות. עם זאת, כאשר מתמקדים במבנים הגביים, מבנה העניין עצמו עשוי להכתיב את הנוף של המשטח הגבי. לדוגמה, גרעין ה-cuneate החיצוני בולט באופן דורסי, ולכן ניתן לדמיין אותו ולהזריק אותו ישירות. עבור מטרות רוחביות, כגון קבוצת הנשימה הגחונית או קומפלקס מעורפל, ניתן להגדיל את חלון cisterna magna בכיוון רוחבי. כמו כן, עבור מיקוד של מבנים צוואריים עליונים, ניתן להרחיב את החלון לכיוון האטלס. בעוד שהשתמשנו במתאם עכבר הממוקם במסגרת סטריאוטקטית גדולה של בעלי חיים, ניתן להתאים את הגישה בקלות למסגרות או הגדרות אחרות, כל עוד מתבצעים השלבים המרכזיים. לדוגמה, במקום כרטיס פלסטיק, מוט הפה יכול להיות ממוקם על גשר האף כדי לשמור על הראש במצב anteroflexed יציב. ראוי לציין כי קואורדינטות של אתרי מטרה בגזע המוח עם האובקס כנקודת אפס, כפי שנקבע בטבלה 1, משמשות כהפניה, וניתן להצביע על התאמות על סמך זן העכבר, גיל, מין, כיול הזרוע הסטריאוטוקסית וטכניקת המיקום, בדומה להתאמות שיש לבצע בעת הפקת קואורדינטות מטרה לגישה סטנדרטית מאטלס ייחוס. זה דורש תובנה לגבי מישור הגישה, במיוחד עבור מטרות רוסטרליות יותר כפי שמודגם באיור 1. בדיקה של קואורדינטות יכולה להיעשות באמצעות עוקבים שונים, לדוגמה, חרוזים פלואורסצנטיים או תת-יחידה b של Cholera Toxin המתויגת על ידי פלואורסצנט עבור קואורדינטות שונות באותו עכבר. ניתוחים היסטולוגיים של מקטעי גזע המוח/רקמת עמוד השדרה (שאינם מכוסים בפרוטוקול זה) מספקים משוב על לוקליזציה ביחס לציוני דרך פנימיים אובייקטיביים 8,9,11,16 או לצורך השוואה עם אטלס ייחוס. לאחר מכן ניתן להתאים את הקואורדינטות, לבדוק אותן שוב ולסיים אותן.
גם לגישת ה-cisterna magna יש מגבלות. אזורי CNS שניתן להגיע אליהם באמצעות גישה זו מוגבלים לפונס קאודלי, מדולה אובלונגטה וחוט צוואר הרחם העליון. בעוד שניתן לגשת בקלות לפונס הקאודלים באמצעות הגישה הסטנדרטית, לגישת cisterna magna יש יתרונות כאשר בוחנים תת-חלוקות של מבנים בעלי אוריינטציה אורכית המשתרעים מהמדולה אובלונגטה אל תוך הפונס הקאודלים, כפי שקורה עבור תת-חלוקות בתוך היווצרות הרשתית. מגבלה יחסית נוספת מתרחשת כאשר משתמשים בגישה זו בפעם השנייה באותו עכבר, למשל, במעקב אחר כלבת שונה14. נוכחות של רקמת צלקת עשויה להאריך את משך הניתוח או לטשטש ציוני דרך קלים. עם זאת, בידינו, שיטה זו עדיין הייתה עדיפה על הגישה הסטריאוטקסית הסטנדרטית במקרה זה, שכן ניתן לתעד את אתר ההזרקה הראשונה ביחס למיקום הוורידים של ציוני דרך ייחודיים אחרים, מה שמקל על מציאת נקודת הכניסה המדויקת בחזרה. בעוד שגישה זו עדיפה על מחקרי מעקב במדולה הקאודלית ובחוט השדרה העליון, לא ניתן להשתמש בה כדי להשתיל חומרה כרונית. לכן, עבור אופטוגנטיקה in-vivo ומחקרי הדמיית סידן הדורשים השתלה של סיבים אופטיים17 ניתן להשתמש בגישת cisterna magna תחילה כדי להעביר AAV לאתר המטרה, ולאחר מכן ניתוח שני באמצעות גישה סטנדרטית למכשיר עכברים עם סיבים או צינוריות. גישה זו מאפשרת לשמור על אתר היעד בדיד, בעוד שמיקום הסיבים/חומרה סלחני יותר (כלומר, יכול להיות פחות מדויק), בשל גודלה הגדול יחסית של החומרה. לבסוף, גישת הציסטרנה מגנה דורשת מיומנויות כירורגיות מתקדמות יותר מאשר גישה סטריאוטקסית סטנדרטית. במקום להכיר בציוני דרך גרמיים פשוטים, היא דורשת תובנה לגבי ציוני דרך מורכבים יותר של גזע המוח והשלד והשרירים. כמו כן, כמו בכל ניתוח עדין, ההצלחה והיעילות של ההליך תלויות בארגז כלים תקין שנמצא במצב מצוין. פרוטוקול זה מטפל בבעיות האחרונות ויכול לשמש כמדריך מפורט על ידי נסיינים.
לסיכום, גישת cisterna magna משלימה את הגישה הסטריאוטקסית הסטנדרטית ומספקת יתרונות מרובים כאשר מתמקדים בגזע המוח הקאודלי ובחובר הצוואר העליון, אשר אינם נגישים בקלות באמצעות גישה סטריאוטקסית סטנדרטית. הוא משתמש בנקודות ייחוס שהן CNS ולא בציוני דרך גרמיים שנמצאים בסמיכות ליעדים המיועדים, מה שמגדיל את יכולת השכפול והדיוק. זה הופך את הגישה לבעלת ערך רב במיוחד כאשר יש צורך להעביר נפחי הזרקה קטנים לאתרים בדידים בהקשר של מיפוי מפורט או מחקרים כימוגנטיים. גישה זו רלוונטית גם לגישות כימוגנטיות תפקודיות, אופטוגנטיות, פוטומטריה של סיבים או נגעים, שבהן נגיף AAV או רעלן מועברים למטרה בעלת תפקוד מוטורי או אינטגרציה סנסו-מוטורית כקריאה: היא נמנעת ממסלול דרך המוח הקטן למטרות במדולה אובלונגטה ולכן מגבילה את התערבותה בתוצאות המחקר. מנקודת מבט של רווחת בעלי חיים, ההליך אינו דורש קידוח חורי בור מרובים כדי לגשת לאתרים באופן דו-צדדי או אורכי, ובכך מקצר את משך הניתוח ואת הפולשנות של ההליך. בעוד שהתווינו את הגישה בפירוט עבור עכברים, אותם עקרונות חלים על מינים אחרים 11,12,13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי R01 NS079623, P01 HL149630 ו- P01 HL095491.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcohol pad | Med-Vet International | SKU: MDS090735Z | skin preparation for the prevention of surgical site infection |
| Angled forceps, Dumont #5/45 | FST | 11251-35 | only to grab dura |
| Betadine pad | Med-Vet International | SKU:PVP-PAD | skin preparation for the prevention of surgical site infection |
| Cholera toxin subunit-b, Alexa Fluor 488/594 conjugate | Thermo Fisher Scientific | 488: C34775, 594: C22842 | Fluorescent tracer |
| Clippers | Wahl | Model MC3, 28915-10 | for shaving fur at surgical site |
| Electrode holder with corner clamp | Kopf | 1770 | to hold glass pipette |
| Flowmeter | Gilmont instruments | model # 65 MM | to regulate flow of isoflurane and oxygen to mouse on the surgical plane |
| Fluorescent microspheres, polystyrene | Thermo Fisher Scientific | F13080 | Fluorescent tracer |
| Heating pad | Stoelting | 53800M | thermoregulation |
| Induction chamber with port hook up kit | Midmark Inc | 93805107 92800131 | chamber providing initial anasthesia |
| Insulin Syringe | Exelint International | 26028 | to administer saline and analgesic |
| Isoflurane | Med-Vet International | SKU:RXISO-250 | inhalant anesthetic |
| Isoflurane Matrix VIP 3000 vaporizer | Midmark Inc | 91305430 | apparatus for inhalant anesthetic delivery |
| Laminectomy forceps, Dumont #2 | FST | 11223-20 | only to clean dura |
| Medical air, compressed | Linde | UN 1002 | used with stimulator & PicoPump for providing air for precision solution injection |
| Meloxicam SR | Zoo Pharm LLC | Lot # MSR2-211201 | analgesic |
| Microhematocrit borosilicate glass pre calibrated capillary tube | Globe Scientific Inc | 51628 | for transfection of material to designated co-ordinates |
| Mouse adaptor | Stoelting | 0051625 | adapting rat stereotaxic frame for mouse surgery |
| Needle holder, Student Halsted- Mosquito Hemostats | FST | 91308-12 | for suturing |
| Oxygen regulator | Life Support Products | S/N 909328, lot 092109 | regulate oxygen levels from oxygen tank |
| Oxygen tank, compressed | Linde | USP UN 1072 | provided along with isoflurane anasthesia |
| Plastic card | not applicable | not applicable | any firm plastic card, cut to fit the stereotactic frame (e.g. ID card) |
| Pneumatic PicoPump ( or similar) | World Precision Instruments (WPI) | SYS-PV820 | For precision solution injection |
| Saline, sterile | Mountainside Medical Equipment | H04888-10 | to replace body fluids lost during surgery |
| Scalpel handle, #3 | FST | 10003-12 | to hold scalpel |
| Scissors, Wagner | FST | 14070-12 | to cut polypropylene suture |
| Spring scissors, Vannas 2.5mm with accompanying box | FST | 15002-08 | scissors only to open dura, box to elevate body |
| Stereotactic micromanipulator | Kopf | 1760-61 | attached to electrode holder to adjust position based on co-ordinates |
| Stereotactic 'U' frame assembly and intracellular base plate | Kopf | 1730-B, 1711 | frame for surgery |
| Sterile cotton tipped applicators | Puritan | 25-806 10WC | absorbing blood from surgical field |
| Sterile non-fenestrated drapes | Henry Schein | 9004686 | for sterile surgical field |
| Sterile opthalmic ointment | Puralube | P1490 | ocular lubricant |
| Stimulator & Tubing | Grass Medical Instruments | S44 | to provide controlled presurred air for precision solution injection |
| Surgical Blade #10 | Med-Vet International | SKU: 10SS | for skin incision |
| Surgical forceps, Extra fine Graefe | FST | 11153-10 | to hold skin |
| Surgical gloves | Med-Vet International | MSG2280Z | for asceptic surgery |
| Surgical microscope | Leica | Model M320/ F12 | for 5X-40X magnification of surgical site |
| Suture 5-0 polypropylene | Oasis | MV-8661 | to close the skin |
| Tegaderm | 3M | 3M ID 70200749250 | provides sterile barrier |
| Universal Clamp and stand post | Kopf | 1725 | attached to stereotactic U frame and intracellular base plate |
| Wound hook with hartman hemostats | FST | 18200-09, 13003-10 | to separate muscles and provide surgical window |
References
- JoVE.
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press. (2001).
- Lein, E. S., et al. Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain. Nature. 445 (7124), 168-176 (2007).
- Rangarajan, J. R., et al. Image-based in vivo assessment of targeting accuracy of stereotactic brain surgery in experimental rodent models. Scientific Reports. 6 (1), 38058 (2016).
- Blasiak, T., Czubak, W., Ignaciak, A., Lewandowski, M. H. A new approach to detection of the bregma point on the rat skull. Journal of Neuroscience Methods. 185 (2), 199-203 (2010).
- Popesko, P., Rajtova, V., Horak, J. A Colour Atlas of the Anatomy of Small Laboratory Animals, Volume 2: Rat, Mouse and Golden Hamster. 2, Wolfe Publishing Ltd. (1992).
- Allen Mouse Brain Atlas. Allen Institute for Brain Science. , Available from: https://mouse.brain-map.org/experiment/thumbnails/100042147?image_type=atlas (2004).
- Vanderhorst, V. G. J. M. Nucleus retroambiguus-spinal pathway in the mouse: Localization, gender differences, and effects of estrogen treatment. The Journal of Comparative Neurology. 488 (2), 180-200 (2005).
- Yokota, S., Kaur, S., VanderHorst, V. G., Saper, C. B., Chamberlin, N. L. Respiratory-related outputs of glutamatergic, hypercapnia-responsive parabrachial neurons in mice. Journal of Comparative Neurology. 523 (6), 907-920 (2015).
- Anselmi, C., et al. Ultrasonographic anatomy of the atlanto-occipital region and ultrasound-guided cerebrospinal fluid collection in rabbits (Oryctolagus cuniculus). Veterinary Radiology & Ultrasound. 59 (2), 188-197 (2018).
- Herbert, H., Moga, M. M., Saper, C. B. Connections of the parabrachial nucleus with the nucleus of the solitary tract and the medullary reticular formation in the rat. The Journal of Comparative Neurology. 293 (4), 540-580 (1990).
- Vanderhorst, V. G., Holstege, G. Caudal medullary pathways to lumbosacral motoneuronal cell groups in the cat: evidence for direct projections possibly representing the final common pathway for lordosis. The Journal of Comparative Neurology. 359 (3), 457-475 (1995).
- Vanderhorst, V. G., Terasawa, E., Ralston, H. J., Holstege, G. Monosynaptic projections from the nucleus retroambiguus to motoneurons supplying the abdominal wall, axial, hindlimb, and pelvic floor muscles in the female rhesus monkey. The Journal of Comparative Neurology. 424 (2), 233-250 (2000).
- Wall, N. R., Wickersham, I. R., Cetin, A., De La Parra, M., Callaway, E. M. Monosynaptic circuit tracing in vivo through Cre-dependent targeting and complementation of modified rabies virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21848-21853 (2010).
- Krashes, M. J., et al. Rapid, reversible activation of AgRP neurons drives feeding behavior in mice. The Journal of Clinical Investigation. 121 (4), 1424-1428 (2011).
- Ganchrow, D., et al. Nucleus of the solitary tract in the C57BL/6J mouse: Subnuclear parcellation, chorda tympani nerve projections, and brainstem connections. The Journal of Comparative Neurology. 522 (7), 1565-1596 (2014).
- Ung, K., Arenkiel, B. R. Fiber-optic implantation for chronic optogenetic stimulation of brain tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (68), e50004 (2012).
